RU2056057C1 - Способ получения иммобилизованного иммуноглобулина на твердой фазе - Google Patents
Способ получения иммобилизованного иммуноглобулина на твердой фазе Download PDFInfo
- Publication number
- RU2056057C1 RU2056057C1 SU5059277A RU2056057C1 RU 2056057 C1 RU2056057 C1 RU 2056057C1 SU 5059277 A SU5059277 A SU 5059277A RU 2056057 C1 RU2056057 C1 RU 2056057C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- immunoglobulin
- fibrinogen
- solid phase
- tifa
- immobilized immunoglobulin
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Использование: в медицине и микробиологии. Сущность: проводят обработку твердой фазы комплексом "иммуноглобулин - фибриноген", полученным обработкой 1 %-ным глутаровым альдегидом в течение 3 - 4 ч в 0,1 М фосфатно-буферном растворе, pH 7,4 или 0,05 М карбонатно-бикорбонатном буфере, pH 9,5, при соотношении иммуноглобулин: фибриноген 1:1 и 1:2. 3 табл.
Description
Изобретение относится к медицине, более конкретно к микробиологии, и может быть использовано в лабораторной диагностике.
Известно, что критическим фактором, определяющим успешное применение твердофазного иммуноферментного анализа в целях поиска антигенов, является адсорбция антител на твердофазном носителе.
На практике твердофазного ИФА вошел метод физической адсорбции антител на поверхности микроплат из полистирола. Связь белков с матрицей в данном случае осуществляется в основном за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий, эта связь лабильна. Однако легкость разделения компонентов по окончании реакции, достигаемая простой промывкой плат, обеспечивает этому методу широкое применение. Количество адсорбированного вещества зависит от многих факторов (температуры, рН, ионной силы, времени инкубации и т. д.) и изменяется при их варьировании.
Для улучшения адсорбирующей способности пластин (планшетов) исследователи используют различные способы это предварительная обработка ультрафиолетовым светом, этилхлорформатом, диоксидом силиция, глютаровым альдегидом, полилизином, полиэтиленгликолем и другие.
Наиболее близким способом (прототипом) является способ обработки лунок полистироловых планшетов при постановке ТИФА на этапе сенсибилизации смесью иммуноглобулина с 4-9% -ным раствором полиэтиленгликоля (Oskan A.N. Пат. 4450231, USA, 1982, кл. 01 G 33/54, 435/7).
Однако эта методика окончательно не решила проблему оптимизации адсорбции иммуноглобулинов на твердую фазу и, особенно, при использовании дефектных планшетов.
Техническим результатом данного изобретения является повышение степени связывания иммуноглобулинов с полистиролом и тем самым стандартизация результатов ТИФА.
Технический результат достигается за счет использования на первом этапе постановки ТИФА фаза сенсибилизации (адсорбции) комплекса[иммуноглобулин-фибриноген] в соотношении 1:1-1:2.
Фракцию иммуноглобулинов класса G изолировали с использованием полиэтиленгликоля.
В качестве фибриногена для метки чумных, сапных, бруцеллезных и сибиреязвенных иммуноглобулинов использовали лиофилизированный препарат Волгоградской областной станции переливания крови МЗ РФ.
Конструирование препарата "иммуноглобулин-фибриноген" осуществляли по принципу одноэтапного глютаральдегидного метода.
Для этого брали 10 мг иммуноглобулина, растворяли его в 1,0 мл 0,1 М фосфатно-буферного раствора (ФБР), рН 6,8 и 7,4 или в 1,0 мл карбонатно-бикарбонатного буфера (КББ), рН 9,5 и добавляли 10, 20 мг фибриногена. При осторожном перемешивании на магнитной мешалке вносили 0,1 мл свежеприготовленного 1%-ного раствора глютарового альдегида. Смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 3 ч. Затем проводили диализ против соответствующего буферного раствора 18-24 ч на холоде. Полученные конъюгаты проверяли на серологическую и сенсибилизирующую активность на испытанных пригодных для ТИФА полистироловых планшетах. Результаты конструирования препаратов "иммуноглобулин-фибриноген" отражены в табл. 1.
Результаты, приведенные в табл. 1 (примере 1) получены путем постановки ТИФА:
сенсибилизацию планшетов проводили комплексом иммуноглобулин-фибриноген, путем внесения 0,1 мл препарата и выдержкой плат в холодильнике +4оС в течение 18-24 ч. Затем лунки планшета промывали двукратно 0,15 M NaCl, рН 6,8 с 0,05% твин-20. Перед использованием открытые участки лунок блокировали путем внесения 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина на 0,05 М КББ, рН 9,5 и планшеты оставляли на 30 мин при 37оС. После этого лунки промывали трехкратно по 3 мин 0,15 М NaCl с твин-20 и подсушивали;
постановка реакции. Из исследуемого материала, содержащего антиген, готовили ряд последовательных разведений в 0,1 М ФБР, рН 7,4 с твин-20 и вносили по 0,1 мл в лунки планшета, инкубировали в термостате при +37оС 1 ч. Затем содержимое лунок выливали, отмывали 0,15 М NaCl с твин-20 трехкратно по 3 мин. На следующем этапе в лунки планшета вносили рабочее разведение конъюгата, приготовленного на 0,1 М ФБР, рН 7,4 с твин-20 и инкубировали планшеты в течение 1 ч в термостате при +37оС. После заключительной отмывки 4-5 кратно по 3 мин в каждую лунку планшета вносили рабочий раствор субстрата. Результаты реакции учитывали визуально по изменению цвета содержимого лунок или на спектрофотометре после внесения рабочего раствора о-фенилендиамина.
сенсибилизацию планшетов проводили комплексом иммуноглобулин-фибриноген, путем внесения 0,1 мл препарата и выдержкой плат в холодильнике +4оС в течение 18-24 ч. Затем лунки планшета промывали двукратно 0,15 M NaCl, рН 6,8 с 0,05% твин-20. Перед использованием открытые участки лунок блокировали путем внесения 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина на 0,05 М КББ, рН 9,5 и планшеты оставляли на 30 мин при 37оС. После этого лунки промывали трехкратно по 3 мин 0,15 М NaCl с твин-20 и подсушивали;
постановка реакции. Из исследуемого материала, содержащего антиген, готовили ряд последовательных разведений в 0,1 М ФБР, рН 7,4 с твин-20 и вносили по 0,1 мл в лунки планшета, инкубировали в термостате при +37оС 1 ч. Затем содержимое лунок выливали, отмывали 0,15 М NaCl с твин-20 трехкратно по 3 мин. На следующем этапе в лунки планшета вносили рабочее разведение конъюгата, приготовленного на 0,1 М ФБР, рН 7,4 с твин-20 и инкубировали планшеты в течение 1 ч в термостате при +37оС. После заключительной отмывки 4-5 кратно по 3 мин в каждую лунку планшета вносили рабочий раствор субстрата. Результаты реакции учитывали визуально по изменению цвета содержимого лунок или на спектрофотометре после внесения рабочего раствора о-фенилендиамина.
Наряду с опытными реакциями ставили следующие контроли:
реакция с заведомо известным антигеном. Этот контроль проводится для проверки правильности выбора рабочего разведения конъюгата и чувствительности препарата. Положительный контроль;
реакция в лунках, сенсибилизированных одним фибриногеном. Отрицательный контроль;
контроль субстрата. В сенсибилизированную лунку вносили только субстрат. Контроль отрицательный.
реакция с заведомо известным антигеном. Этот контроль проводится для проверки правильности выбора рабочего разведения конъюгата и чувствительности препарата. Положительный контроль;
реакция в лунках, сенсибилизированных одним фибриногеном. Отрицательный контроль;
контроль субстрата. В сенсибилизированную лунку вносили только субстрат. Контроль отрицательный.
Чувствительность теста выражается в микробных клетках на 1 мл 1 · 103-109.
Вывод: конструирование препарата "иммуноглобулин-фибриноген" можно проводить в 0,1 М ФБР, рН 7,4 и 0,05 М КББ, рН 9,5 при соотношении 1:1 и 1: 2.
П р и м е р 1. Использование препарата "иммуноглобулин-фибриноген" для обнаружения возбудителей опасных инфекций. Результаты показаны в табл. 2.
Вывод: препарат Иг:Ф обеспечивает постановку ТИФА на любых полистироловых планшетах без предварительного контроля и при этом реакция воспроизводится стабильно.
П р и м е р 2. Специфичность способа определяли исследованием близкородственных и гетерологичных штаммов (всего 53 штамма) микроорганизмов. При сравнительном изучении классического способа постановки ТИФА и предложенного способа получены аналогичные отрицательные результаты.
Вывод: использование Иг:Ф не снижает специфичность ТИФА.
П р и м е р 3. Воспроизводимость теста определяли путем постановки ТИФА с 10 гомологичными штаммами каждого вида возбудителя она была 100% но чувствительность теста зависела от штамма микроорганизма.
Вывод: воспроизводимость предложенного метода 100%
П р и м е р 4. Для исследования поступило сто проб полевого материала, подозреваемого на зараженность возбудителем чумы. Анализ проводили с помощью коммерческой иммуноферментной системы. На первом этапе сенсибилизацию проводили двух видов планшет (пригодных и непригодных для постановки ТИФА) прилагаемым к коммерческой тест-системе иммуноглобулином и предлагаемым комплексом Иг-Ф. Результаты отражены в табл. 3.
П р и м е р 4. Для исследования поступило сто проб полевого материала, подозреваемого на зараженность возбудителем чумы. Анализ проводили с помощью коммерческой иммуноферментной системы. На первом этапе сенсибилизацию проводили двух видов планшет (пригодных и непригодных для постановки ТИФА) прилагаемым к коммерческой тест-системе иммуноглобулином и предлагаемым комплексом Иг-Ф. Результаты отражены в табл. 3.
Вывод: благодаря предлагаемому способу удалось получить положительные результаты и на непригодных для постановки ТИФА по адсорбционной способности планшетах.
Использование предлагаемого способа по сравнению с известным имеет ряд преимуществ:
создает возможность использования полистироловых планшетов любых марок без предварительного контроля на адсорбирующую способность;
повышается воспроизводимость реакции и в конечном счете стандартизация результатов ТИФА.
создает возможность использования полистироловых планшетов любых марок без предварительного контроля на адсорбирующую способность;
повышается воспроизводимость реакции и в конечном счете стандартизация результатов ТИФА.
Claims (1)
- СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА НА ТВЕРДОЙ ФАЗЕ, включающий обработку твердой фазы сенситином, отличающийся тем, что в качестве сенситина используют комплекс иммуноглобулина с фибриногеном, полученный обработкой 1%-ным глютаровым альдегидом в течение 3-4 ч в 0,1 М фосфатно-буферном растворе, рН 7,4 или 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5 при соотношении иммуноглобулин: фибриноген - 1:1-1:2 соответственно.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5059277 RU2056057C1 (ru) | 1992-08-19 | 1992-08-19 | Способ получения иммобилизованного иммуноглобулина на твердой фазе |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5059277 RU2056057C1 (ru) | 1992-08-19 | 1992-08-19 | Способ получения иммобилизованного иммуноглобулина на твердой фазе |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2056057C1 true RU2056057C1 (ru) | 1996-03-10 |
Family
ID=21611878
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU5059277 RU2056057C1 (ru) | 1992-08-19 | 1992-08-19 | Способ получения иммобилизованного иммуноглобулина на твердой фазе |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2056057C1 (ru) |
-
1992
- 1992-08-19 RU SU5059277 patent/RU2056057C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
US 4450231, G 01N 33/54, 1982. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4332783A (en) | Process for immunologic determination tests | |
US4407943A (en) | Immobilized antibody or antigen for immunoassay | |
US4945042A (en) | Process and reagent for the determination of an antibody | |
EP0123901B1 (en) | Procedure for the irreversible binding of proteins onto polystyrene surfaces with retention of their biological activity, polystyrene surfaces obtained by this procedure, and their use | |
US4474878A (en) | Sandwich EIA for antigen associated with hepatitis | |
US4588680A (en) | Assay for viruses | |
Johnson Jr et al. | Separation of immunoglobulin M (IgM) essentially free of IgG from serum for use in systems requiring assay of IgM-type antibodies without interference from rheumatoid factor | |
US5399500A (en) | Two step process for coating of antibodies to a solid phase | |
US4157280A (en) | Test set for detecting the presence of antigens associated with hepatitis | |
EP0064318B1 (en) | A method and a kit for the assay of antibodies to soluble antigens | |
IE912625A1 (en) | Biologically active reagent, analytical element and methods¹for use of the reagent | |
JP3327488B2 (ja) | 被検体の免疫化学的測定方法 | |
CN112710826A (zh) | 一种提高试剂稳定性的包被和封闭方法 | |
GB1597345A (en) | Diagnostic immunochemical test materials and procedure | |
US6511812B1 (en) | Method and test kit for use in improving immunoassay specificity | |
RU2056057C1 (ru) | Способ получения иммобилизованного иммуноглобулина на твердой фазе | |
JPH01209370A (ja) | 免疫活性物質の測定法及び測定試薬 | |
US7179611B2 (en) | Mono-specific polyclonal antibodies and methods for detecting Clostridium difficile Toxin A | |
AU625344B2 (en) | Chlamydia half-sandwich immunoassay | |
EP0152254A2 (en) | Chromogenic support immunoassay utilizing labeled complement components | |
Kumakura et al. | Immobilization of antibodies and enzyme-labeled antibodies by radiation polymerization | |
AU628293B2 (en) | Self-contained multi-immunoassay diagnostic system | |
EP0485377A1 (en) | Solid phase immuno-assay with labelled conjugate | |
JP2972241B2 (ja) | 全イムノグロブリンクラスの抗原特異的抗体を測定するための1段階イムノアツセイ | |
GB2174807A (en) | Quantitative screening assay of tumor globulin from gastric juices |