CN103675272A - 一种测试痕量特定粒径纳米金粒子的方法 - Google Patents

一种测试痕量特定粒径纳米金粒子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及测试痕量特定粒径纳米金粒子的方法，步骤包括：制备特定粒径纳米金粒子的免疫原，将免疫原注射到动物体内，制得高特异性抗体，用吸光度法测定特定粒径纳米金粒子含量，将抗抗体酶标记制得酶标二抗体，用间接竞争酶联免疫法将标准样品与待测样竞争与抗体的反应，酶标二抗体的酶促使底物液发光，测得吸光度值，通过标准曲线求得待测样浓度。本发明中特定粒径纳米金粒子抗体的特异性强，交叉反应较少，因此其选择性很高，从而简化了样品前处理过程。

Description

一种测试痕量特定粒径纳米金粒子的方法
技术领域
本发明属于纳米材料检测技术领域，特别涉及一种测试痕量特定粒径纳米金粒子的方法。
背景技术
纳米材料被认为是21世纪的新材料。纳米结构材料指其基本组成颗粒尺寸为纳米数量级,处于原子簇和宏观物体交接区域内的粒子,颗粒直径一般为1～100nm之间,微粒可以是晶体,亦可以是非晶体。纳米结构材料具有一系列新异的物理、机械、电子、磁学、光学及化学特性。纳米金为直径0.8～250nm的缔合胶体,具有纳米表面效应、量子效应和宏观量子隧道效应,抗氧化性强,生物相容性好,密度高和光电性能优异等,被广泛用于催化、生物、光电子学、信息存储等领域。如今，随着纳米技术的产业化，各种形式的纳米尺度的物质已经以各种不同的途径进入我们的生活。比如，在药物化学、药剂学等领域，一些纳米物质以其特殊的化学结构、表面性质和微小粒径，成为新型药物载体，而出于医学目的，这些颗粒有可能会直接被注射进入人体内；或在生产、使用、废弃过程中，纳米材料必然会通过各种途径以“三废”形式进入环境，并造成一定的生态效应和人群暴露；也或通过大气环境、食物链进入人体，如吸入，摄取以及皮肤途径。总之，人们在工作和生活中接触到纳米材料的机会越来越多，引起人们对其负面生物效应的关注。因此能监测纳米金在日常生活和药物领域中的应用，将其用量控制在安全范围内，就会显得尤为重要。
目前，对纳米金的痕量检测方法少之又少，有文献报导使用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)对纳米金进行痕量检测，通过将固态的纳米金变成金原子，再将金原子氧化成金离子，最后通过质谱分析检测金离子的信号，从而实现对纳米材料的定量检测。ICP-MS方法成本高，仪器昂贵，并且需要专门的实验人员，样品前处理复杂，特异性差等缺点。并且ICP-MS只能用于检测使用1%HCl（v/v）制备得到的纳米金样品，对于纳米金常用合成方法1%柠檬酸钠还原氯金酸制备得到的纳米金样品的检测回收率只有10%-40%。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种测试痕量特定粒径纳米金粒子的方法，本发明测试方法成本低，操作简便，特异性选择性高，样品前处理简单等优点，同时可以根据粒子粒径帮助判断纳米金粒子的来源。
本发明采用的技术方案是：
一种测试痕量特定粒径纳米金粒子的方法，步骤包括：
a、制备特定粒径纳米金粒子的免疫原；
b、将免疫原注射到动物体内，制得高特异性抗体；
c、用吸光度法测定特定粒径纳米金粒子含量，将抗抗体酶标记制得酶标二抗体，用间接竞争酶联免疫法将标准样品与待测样竞争与抗体的反应，酶标二抗体的酶促使底物液发光，测得吸光度值，通过标准曲线求得待测样浓度。
所述步骤a中特定粒径纳米金粒子的免疫原的制备方法为：
在搅拌下将巯基乙酸（TGA）溶液加入到特定粒径纳米金粒子溶液中，在搅拌15-20min后调节溶液在弱酸条件下，分别加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液，室温避光下搅拌3-4h，然后再调节pH9～10，加入牛血清白蛋白（BSA，sigma公司），4℃下搅拌5-6h后，将反应液装入透析袋，用蒸馏水透析12h以上，避光低温保存。
所述弱酸条件为PH=5.5；所述避光低温保存温度为4℃；
所述巯基乙酸溶液浓度为0.001mol/L，特定粒径纳米金粒子溶液浓度0.4～0.6μg/mL,EDAC溶液浓度为0.2mol/L，NHS溶液浓度为0.05mol/L，BSA浓度为10mg/mL，TGA、EDAC和NHS的物质的量比1:4:2；纳米金粒子、TGA和BSA的质量比为1:1:2000；
所述步骤b中高特异性抗体的制备方法为：
将免疫抗原与弗氏佐剂以体积比1:1混溶,对动物进行多次免疫，制得特定粒径纳米金粒子高特异性抗体。
所述多次免疫方法为：第一次动物免疫将免疫抗原与弗氏完全佐剂混溶，免疫剂量1mL，免疫部位为背部皮下多点注射，免疫三周后，进行五次加强免疫，加强免疫是将免疫抗原与弗氏不完全佐剂混溶，免疫剂量1mL，免疫部位为背部皮下多点注射，五次加强免疫免疫间隔为两周，经五次加强免疫后,从动物心脏采血,血清室温20-25℃静置0.5-1h,在冰箱4℃静置2h后吸取上层澄清的血清，制得高特异性抗体。
所述弗氏佐剂制备方法为：将液体石蜡和羊毛脂按2:1体积比用超声清洗器超声3小时左右，使之完全混匀，制得不完全弗氏佐剂，临用前加杀死的卡介苗即为完全弗氏佐剂。
所述步骤c中吸光度法具体为：
包被：在酶标板中加入5μg/mL的包被抗原，100μL/孔，8组，每组3孔，37℃温育1-3h，或4℃过夜12h，PBST洗涤3次，包被抗原所用稀释液为包被液CB；所述包被抗原的制备方法基本同免疫原的制备方法，不同处在于使用鸡卵白蛋白（OVA，sigma公司）代替BSA；
封闭：加10mg/mL的OVA溶液，200μl/孔，37℃温育15-60min，PBST洗涤3次；
竞争：加入50μl/孔不同浓度特定粒径纳米金粒子溶液，分别加入浓度为30μg/mL抗体，50μl/孔，37℃温育2-4h，PBST洗涤3次；
加酶：加入100μl/孔稀释度为1:500酶标二抗体溶液，37℃温育2-4h，PBST洗涤3次；
显色：加入处理后的底物液100μL/孔，37℃温育温育15-60min；底物液处理方法为：在加处理后的底物液前15-30min向底物液原液加入OPD，加入量为10mL底物液原液中加入4mgOPD，加处理后的底物液前3-5min向底物液原液加入质量分数为30%的H2O2，加入量为底物液原液体积分数的0.15%；
检测：加入终止液50μL/孔，测定吸光度值，绘制标准曲线；
将待测样用同样方法测定吸光度值，通过标准曲线求得待测样浓度。
酶联免疫方法（Elisa）有成本低，操作简便，特异性选择性高，样品前处理简单等优点，并且适用于各种方法制备的纳米金粒子。将其制成试剂盒，使其操作更加简单方便，更加有利于此方法的商业应用。本发明在多功能酶标仪上应用，操作简便，能进行高通量快速化的样品检测，真正实现了对环境水样，医药样品，化妆品等样品中特定粒径纳米金粒子含量的痕量检测。
本发明中特定粒径纳米金粒子抗体的特异性强，交叉反应较少，因此其选择性很高，从而简化了样品前处理过程。本发明最低检测限(3σ)是0.01ng/mL，灵敏度为0.01ng/mL。
具体实施方式
实施例1
1.16nm金粒子全抗原的合成
1）纳米金的合成
取0.01%的氯金酸溶液100mL加热至沸腾，搅动下迅速加入1%柠檬酸三钠水溶液5mL，溶液的颜色迅速地变成黑色，在1分钟内变为紫红色，随着加热时间的增长，直到溶液出现透明的酒红色，约需7-10分钟左右。待颜色稳定后继续回流沸腾15分钟，撤热源持续搅拌，冷却至室温，所得液体为16nm金溶胶，4℃保存备用。
2）纳米金免疫原(GNP-BSA)的制备
在搅拌下将巯基乙酸溶液加入到16nm金粒子溶液中，在磁力搅拌20min后调节溶液在弱酸条件下，分别加入EDAC和NHS溶液，室温避光下搅拌3h，然后再调节pH9～10，加入BSA，4℃下搅拌5h后，将反应液装入透析袋，用蒸馏水透析12h，避光保存在冰箱内。
所述弱酸条件为PH=5.5；所述避光低温保存温度为4℃；
所述巯基乙酸溶液浓度为0.001mol/L，特定粒径纳米金粒子溶液浓度为0.5μg/mL,EDAC溶液浓度为0.2mol/L，NHS溶液浓度为0.05mol/L，BSA浓度为10mg/mL，TGA、EDAC和NHS的物质的量比1:4:2；纳米金粒子、TGA和BSA的质量比为1:1:2000；
3)纳米金包被抗原(GNP-OVA)的制备
包被抗原的制备方法基本同免疫原的制备方法，不同处在于使用OVA代替BSA；
2.16nm金粒子抗体的制备
1)福氏佐剂的制备
将液体石蜡和羊毛脂按2:1体积比用超声清洗器超声3小时左右，使之完全混匀，即滴一滴乳化剂到冰水混合液中半分钟之内不扩散才能算混合完全。此乳化剂称之为不完全佐剂。不完全佐剂低温(0-4℃)贮存，临用前加杀死的卡介苗即为完全佐剂。
2)抗体的制备方法
将免疫抗原与弗氏佐剂以体积比1:1混溶,对三只新西兰大白兔进行多次免疫，第一次免疫将免疫抗原与弗氏完全佐剂混溶，免疫剂量1mL，免疫部位为背部皮下多点注射，免疫三周后，进行五次加强免疫，加强免疫是将免疫抗原与弗氏不完全佐剂混溶，免疫剂量1mL，免疫部位为背部皮下多点注射，五次加强免疫免疫间隔为两周，经五次加强免疫后,从大白兔心脏采血,血清室温25℃静置1h,在冰箱4℃静置2h后吸取上层澄清的血清，制得兔抗16nm金纳米粒子抗体。
3.吸光度法测定特定粒径纳米金粒子含量
包被：在酶标板中加入5μg/mL的包被抗原，100μL/孔，8组，每组3孔，37℃温育2h，PBST洗涤3次，包被抗原所用稀释液为包被液CB；
封闭：加入10mg/mL的OVA溶液，200μL/孔，37℃温育40min，PBST洗涤3次；
竞争：加入50μl/孔浓度分别为0.01,0.02,0.1,0.2,1,2,10,20,100ng/mL16nm金粒子溶液，分别加入浓度为30μg/mL抗体，50μL/孔，37℃温育4h，PBST洗涤3次；
加酶：加入100μL/孔稀释度为1:500酶标羊抗兔抗抗体溶液，37℃温育3h，PBST洗涤3次；
显色：加入处理后的底物液100μL/孔，37℃温育温育40min；底物液处理方法为：在加处理后的底物液前25min向底物液原液加入OPD，加入量为10mL底物液原液中加入4mgOPD，加处理后的底物液前5min向底物液原液加入质量分数为30%的H2O2，加入量为底物液原液体积分数的0.15%；
检测：加入终止液50μL/孔，测定吸光度值，绘制标准曲线；
将待测样用同样方法测定吸光度值，通过标准曲线求得待测样浓度。
标准曲线的线性方程：
A=0.89332-0.22243logC（A—吸光度值，C—待测液浓度）
R2=0.985
实施例中：
氯金酸(HAuCl4·4H2O)，柠檬酸三钠(Na3C6H5O7)·2H2O，巯基乙酸(99%,C2H4O2S)和N-羟基琥珀酰亚胺(98%,C4H5NO3)(NHS)均购买于国药集团化学试剂有限公司；
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(98.5%,C8H17N3·HCl)(EDAC)购买于阿拉丁试剂公司；
液体石腊(上海试剂有限公司)；
羊毛脂(国药集团化学试剂有限公司)；
液体卡介苗(新芜区医院)；
酶标羊抗兔抗抗体（购于合肥博美生物科技有限责任公司）；
包被液CB（碳酸钠缓冲液,0.05mol/L,pH=9.6；Na2CO30.0795g，NaHCO30.147g溶于蒸馏水，定容到50ml），
洗涤液PBST（磷酸盐缓冲液,0.01mol/L，加体积分数0.05%吐温），
底物液原液(柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液,pH=5；柠檬酸0.5106g,Na2HPO4·12H2O1.8408g溶于蒸馏水，定容到50mL)
H2O2(质量分数为30%，实验加底物液前3—5min加入底物液中，加入量为底物液体积分数的0.15%)
OPD（邻苯二胺，实验加底物液前15-30min前加入底物液中，10mL底物液中加入4mgOPD）
终止液（硫酸溶液，2mol/L)
实验试剂都为分析纯，实验用水为三蒸去离子水。
实施例2
1.16nm金粒子全抗原的合成
1）纳米金的合成
取0.01%的氯金酸溶液100mL加热至沸腾，搅动下迅速加入1%柠檬酸三钠水溶液5mL，溶液的颜色迅速地变成黑色，在1分钟内变为紫红色，随着加热时间的增长，直到溶液出现透明的酒红色，约需7-10分钟左右。待颜色稳定后继续回流沸腾15分钟，撤热源持续搅拌，冷却至室温，所得液体为16nm金溶胶，4℃保存备用。
2）纳米金免疫原(GNP-BSA)的制备
在搅拌下将巯基乙酸溶液加入到16nm金粒子溶液中，在磁力搅拌20min后调节溶液在弱酸条件下，分别加入EDAC和NHS溶液，室温避光下搅拌3h，然后再调节pH9～10，加入BSA，4℃下搅拌5h后，将反应液装入透析袋，用蒸馏水透析12h，避光保存在冰箱内。
所述弱酸条件为PH=5.5；所述避光低温保存温度为4℃；
所述巯基乙酸溶液浓度为0.001mol/L，特定粒径纳米金粒子溶液浓度为0.5μg/mL,EDAC溶液浓度为0.2mol/L，NHS溶液浓度为0.05mol/L，BSA浓度为10mg/mL，TGA、EDAC和NHS的物质的量比1:4:2；纳米金粒子、TGA和BSA的质量比为1:1:2000；
4)纳米金包被抗原(GNP-OVA)的制备
包被抗原的制备方法基本同免疫原的制备方法，不同处在于使用OVA代替BSA；
2.16nm金粒子抗体的制备
1)福氏佐剂的制备
将液体石蜡和羊毛脂按2:1体积比用超声清洗器超声3小时左右，使之完全混匀，即滴一滴乳化剂到冰水混合液中半分钟之内不扩散才能算混合完全。此乳化剂称之为不完全佐剂。不完全佐剂低温(0-4℃)贮存，临用前加杀死的卡介苗即为完全佐剂。
2)抗体的制备方法
将免疫抗原与弗氏佐剂以体积比1:1混溶,对三只新西兰大白兔进行多次免疫，第一次免疫将免疫抗原与弗氏完全佐剂混溶，免疫剂量1mL，免疫部位为背部皮下多点注射，免疫三周后，进行五次加强免疫，加强免疫是将免疫抗原与弗氏不完全佐剂混溶，免疫剂量1mL，免疫部位为背部皮下多点注射，五次加强免疫免疫间隔为两周，经五次加强免疫后,从大白兔心脏采血,血清室温20℃静置0.5h,在冰箱4℃静置2h后吸取上层澄清的血清，制得兔抗16nm金纳米粒子抗体。
3.吸光度法测定特定粒径纳米金粒子含量
包被：在酶标板中加入5μg/mL的包被抗原，100μL/孔，8组，每组3孔，37℃温育3h，PBST洗涤3次，包被抗原所用稀释液为包被液CB；
封闭：加10mg/mL的OVA溶液，200μL/孔，37℃温育20min，PBST洗涤3次；
竞争：加入50μL/孔浓度分别为0.01,0.02,0.1,0.2,1,2,10,20,100ng/mL16nm金粒子溶液，加入浓度为30μg/mL抗体，50μl/孔，37℃温育2h，PBST洗涤3次；
加酶：加入100μL/孔稀释度为1:500酶标羊抗兔抗抗体溶液，37℃温育4h，PBST洗涤3次；
显色：加入处理后的底物液100μL/孔，37℃温育温育60min；底物液处理方法为：在加处理后的底物液前15min向底物液原液加入OPD，加入量为10mL底物液原液中加入4mgOPD，加处理后的底物液前3min向底物液原液加入质量分数为30%的H2O2，加入量为底物液原液体积分数的0.15%；
检测：加入终止液50μL/孔，测定吸光度值，绘制标准曲线；
将待测样用同样方法测定吸光度值，通过标准曲线求得待测样浓度。
标准曲线的线性方程：
A=0.92128-0.13976logC（A—吸光度值，C—待测液浓度）
R2=0.988
实施例中：
氯金酸(HAuCl4·4H2O)，柠檬酸三钠(Na3C6H5O7)·2H2O，巯基乙酸(99%,C2H4O2S)和N-羟基琥珀酰亚胺(98%,C4H5NO3)(NHS)均购买于国药集团化学试剂有限公司；
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(98.5%,C8H17N3·HCl)(EDAC)购买于阿拉丁试剂公司；
液体石腊(上海试剂有限公司)；
羊毛脂(国药集团化学试剂有限公司)；
液体卡介苗(新芜区医院)；
酶标羊抗兔抗抗体（购于合肥博美生物科技有限责任公司）；
包被液CB（碳酸钠缓冲液,0.05mol/L,pH=9.6；Na2CO30.0795g，NaHCO30.147g溶于蒸馏水，定容到50mL）；
洗涤液PBST（磷酸盐缓冲液,0.01mol/L，加体积分数0.05%吐温）；
底物液原液(柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液,pH=5；柠檬酸0.5106g,Na2HPO4·12H2O1.8408g溶于蒸馏水，定容到50mL)；
H2O2(质量分数为30%，实验加底物液前3—5min加入底物液中，加入量为底物液体积分数的0.15%)；
OPD（邻苯二胺，实验加底物液前15-30min前加入底物液中，10ml底物液中加入4mgOPD）；
终止液（硫酸溶液，2mol/L)；
实验试剂都为分析纯，实验用水为三蒸去离子水。

Claims (6)

1.一种测试痕量特定粒径纳米金粒子的方法，步骤包括：
a、制备特定粒径纳米金粒子的免疫原；
b、将免疫原注射到动物体内，制得高特异性抗体；
c、用吸光度法测定特定粒径纳米金粒子含量，将抗抗体酶标记制得酶标二抗体，用间接竞争酶联免疫法将标准样品与待测样竞争与抗体的反应，酶标二抗体的酶促使底物液发光，测得吸光度值，通过标准曲线求得待测样浓度。
2.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于：
所述步骤a中特定粒径纳米金粒子的免疫原的制备方法为：
在搅拌下将巯基乙酸溶液加入到特定粒径纳米金粒子溶液中，在搅拌15-20min后调节溶液在弱酸条件下，分别加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温避光下搅拌3-4h，然后再调节pH9～10，加入牛血清白蛋白，4℃下搅拌5-6h后，将反应液装入透析袋，用蒸馏水透析12h以上，避光低温保存。
3.如权利要求2所述的测试方法，其特征在于：所述巯基乙酸溶液浓度为0.001mol/L，特定粒径纳米金粒子溶液浓度为0.4～0.6μg/mL,1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液浓度为0.2mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺溶液浓度为0.05mol/L，牛血清白蛋白浓度为10mg/mL，巯基乙酸、1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的物质的量比1:4:2；纳米金粒子、巯基乙酸和牛血清白蛋白的质量比为1:1:2000。
4.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于：所述步骤b中高特异性抗体的制备方法为：将免疫抗原与弗氏佐剂以体积比1:1混溶,对动物进行多次免疫，制得特定粒径纳米金粒子高特异性抗体。
5.如权利要求4所述的测试方法，其特征在于：所述多次免疫方法为：第一次动物免疫将免疫抗原与弗氏完全佐剂混溶，免疫剂量1mL，免疫部位为背部皮下多点注射，免疫三周后，进行五次加强免疫，加强免疫是将免疫抗原与弗氏不完全佐剂混溶，免疫剂量1mL，免疫部位为背部皮下多点注射，五次加强免疫免疫间隔为两周，经五次加强免疫后,从动物心脏采血,血清室温20-25℃静置0.5-1h,在冰箱4℃静置2h后吸取上层澄清的血清，制得高特异性抗体。
6.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于：所述步骤c中吸光度法具体为：
包被：在酶标板中加入5μg/mL的包被抗原，100μL/孔，8组，每组3孔，37℃温育1-3h，或4°过夜12h，PBST洗涤3次；所述包被抗原的制备方法基本同免疫原的制备方法，不同处在于使用鸡卵白蛋白代替牛血清白蛋白；
封闭：加10mg/mL的OVA溶液，200μl/孔，37℃温育15-60min，PBST洗涤3次；
竞争：加入50μl/孔不同浓度特定粒径纳米金粒子溶液，加入浓度为30μg/mL抗体，50μl/孔，37℃温育2-4h，PBST洗涤3次；
加酶：加入100μl/孔稀释度为1:500酶标二抗体溶液，37℃温育2-4h，PBST洗涤3次；
显色：加入底物液100μL/孔，37℃温育温育15-60min；底物液处理方法为：在加处理后的底物液前15-30min向底物液原液加入OPD，加入量为10mL底物液原液中加入4mg OPD，加处理后的底物液前3-5min向底物液原液加入质量分数为30%的H2O2，加入量为底物液原液体积分数的0.15%；
检测：加入终止液50μL/孔，测定吸光度值，绘制标准曲线；
将待测样用同样方法测定吸光度值，通过标准曲线求得待测样浓度。
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