CN103288965A - 一种多氯联苯单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多氯联苯单克隆抗体的制备方法，首先采用多氯联苯半抗原化学合成完全抗原，然后将完全抗原作为免疫原，通过动物免疫方法制备得到多氯联苯单克隆抗体。其中半抗原合成完全抗原采用碳二亚胺法，动物免疫采用小剂量长周期免疫方案。本发明制备的多氯联苯单克隆抗体特异性强、亲和力好，抗体参数可控、工艺简单，利于放大生产、实用性强。此法制备的多氯联苯抗体效价达2×10⁷，所制备的抗体冻干后，-20℃超低温保存，其稳定性至少可保持12个月以上。

Description

一种多氯联苯单克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗体的制备方法，特别涉及一种水体环境中激素污染物多氯联苯的免疫检测特异性单克隆抗体的制备。 

  

背景技术

多年来，持久性有机污染物(POPS)除了其直接毒性外，还因为其高残留性、高富集性以及对各种生物乃至人类的危害而引起世界性的广泛关注，其中多氯联苯( polychlorinated biphenyls, PCBs)是其中最具有代表性的一类。由于PCBs具有特殊的物理化学性质，从其生产以来就得到广泛应用，但由于消费过程中渗漏或有意、无意的废物排放，己造成了PCBs大范围的污染，并且通过食物链对生物体产生影响。同时由于PCBs的低溶解性、高稳定性和半挥发性等使其能够作远程迁移，从而造成“全球性的环境污染”。多氯联苯具有亲脂性和持久性，在食物网中呈现出很高的生物富集特性。据报道水鸟体内PCBs浓度可达水中浓度的50-100万倍，呆头鱼内的生物浓缩系数为120000~270000倍。动物实验表明，PCBs对皮肤、肝脏、胃肠系统、神经系统、生殖系统、免疫系统等都有诱导效应。而且一些PCBs同类物会影响哺乳动物和鸟类的繁殖，对人类也具有潜在致癌性。因此，多氯联苯作为一种受全球广泛关注的激素类环境污染物，其检测方法一直是科学技术领域的研究热点。目前这类化合物的检测方法多以GC、HPLC 和GC/MS、HPLC/MS 为主，运用上述常规的仪器分析方法进行检测，前处理技术复杂、时间长、费用高，难以满足快速鉴定诊断的需要。近年来，具有特异性强、简单快速、灵敏度高等优点的酶联免疫吸附测定法(ELISA) 受到广泛重视，在环境污染物的快速筛查中显示了其独特的优势。 

基于高特异性抗体的环境污染物免疫检测技术，是目前有毒有害有机污染物（POPs、EDCs等）、藻类毒素、农药残留、生物毒素等快速检测的重要手段。美国在环境免疫检测领域处于国际领先地位，其开发的环境小分子污染物的免疫检测技术数量也位于世界前列。此外，日本、印度和欧盟一些国家也相继开发了一些环境污染物的免疫检测技术并申请了专利，主要为农药类和二恶英等。而多氯联苯化合物作为重要的工业原料或中间体被大量地生产和应用，其免疫检测方面的研究和专利报道却较少，因此，有必要开发这些污染物的应急监测及快速筛查免疫检测技术。高特异性的抗体是免疫检测方法的核心材料，也是影响检测结果灵敏性、选择性的重要因素。由于环境污染物多半是小分子物质（分子量<2，000Da）。其本身不具备免疫原性，免疫学上属于半抗原，不能刺激动物机体产生抗体，只有与大分子物质偶联成完全抗原才能促使动物机体产生免疫反应，从而获得抗体，因此，合成并纯化免疫性能良好的环境污染物的完全抗原，是研究和开发其免疫检测技术首要的关键步骤和技术难点。 

由于多氯联苯的同系物种类繁多，其同族体的物理、化学、生物和毒物学的性质有很大不同。当今文献报道的多氯联苯单体免疫检测研究大多集中于几种毒性较大的同系物上，因此有关前沿研究要求PCBs的分析必须由测定总量的水平提高到测定同系物和异构体的水平上来。因此单个PCBs同族体的定性和定量分析是十分必要的。但是由于多氯联苯的同系物繁多，因此，对于多氯联苯单体及相应的半抗原和抗原的合成研究也成为一类研究的热点。目前，国外的一些研究机构，已经成功的合成出了多种多氯联苯类污染物的多克隆抗体，研究分析其应用与免疫检测的可行性。2003年，美国国家环保局将此类ELISA检测法作为标准方法公布出来，应用于土壤沉积物中多氯联苯的检测。由于多氯联苯存在209种同系物，其同族体的物理、化学、生物和毒理学性质有很大不同，目前所报道的多氯联苯的多克隆抗体或者单克隆抗体，其制备方法具有很大的差异性，免疫特异性根据各自的研究目的也存在很大的差别。如有研究采用6-(2,2', 4', 5'-四氯-4-苯基)-己酸做为半抗原合成免疫原制备了一种多克隆抗体，用4-(2，4， 5- 三氯苯氧基 )-丁酸与牛血清蛋白的偶联物做包被原测定环境中的多氯联苯总量。针对鱼肉中的富集的PCB118的检测，Tomoaki Tsutsumi等制备了一种可以测定环境中具有共平面结构多氯联苯单体的单克隆抗体。 Milan Fránek等报道了抗共平面多氯联苯单体PCB77，126，169 的多克隆抗体。专利CN 102653560 A 报道了基于三种不同的多氯联苯单体的半抗原衍生物制备得相应的免疫原，动物免疫得多克隆多氯联苯的抗体，用于土壤沉积物中多氯联苯的检测。这些研究都从不同的目的出发，制备出了一定有效的多氯联苯抗体，但当前制备出的多氯联苯抗体，不论是多克隆还是单克隆抗体，均是采用一种或多种多氯联苯单体的半抗原衍生物制成相应的免疫原，对动物进行常规的免疫得到的。由于使用的免疫原的不同，得到的抗体的特异性也有很大差别，采用常规的动物免疫方法，制得抗体的特异性有限，且多数研究只注重抗体的制备，没有对抗体各项性能指标进行系统性评价，使得所制备的抗体机理不明，使应用受限。 

  

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种特异性强、亲和力好的多氯联苯单克隆抗体的制备方法，本方法制备的多氯联苯单克隆抗体参数可控、工艺简单利于放大生产、实用性强。 

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案： 

一种多氯联苯单克隆抗体的制备方法，首先采用多氯联苯半抗原化学合成完全抗原，然后将完全抗原作为免疫原，通过动物免疫方法制备得到多氯联苯单克隆抗体；

其中半抗原合成完全抗原采用碳二亚胺法，包括以下步骤：     (1)首先配置浓度为1~3mg/100ul的半抗原TE buffer溶液、浓度为0.2~0.5mg/100ul的牛血清蛋白TE buffer溶液和浓度为20~40mg/100ul的碳二亚胺TE buffer溶液；

(2)磁力搅拌下，将半抗原TE buffer溶液加入含牛血清蛋白TE buffer溶液中得到混合溶液，混合溶液边震荡边滴加碳二亚胺TE buffer溶液，半抗原与牛血清蛋白的反应质量配比为 1:0.1~1:0.5，半抗原与碳二亚胺的质量比为1：16左右，然后将装有三种溶液的容器放于摇床中于35-37℃条件下震荡反应2~4 h，反应得到偶联物，即完全抗原；

(3)用Sephadex柱将步骤(2)容器中反应得到的偶联物和未结合的半抗原小分子分离，然后将分离出来的偶联物溶液装入透析袋透析纯化，在pH为7. 2的0. 01 mol/L 磷酸盐缓冲液PBS中于4℃条件下透析3天，每天换液2次，去除游离小分子化合物，离心分出上清液得 PCB-BSA，经紫外可见分光光度计扫描鉴定后（扫描鉴定是为了根据偶联产物最大吸收峰的位移判断是否偶联成功，同时鉴定多氯联苯和牛血清蛋白的偶联结合比），PCB-BSA偶联物分装后于- 20 ℃保存备用。

所述多氯联苯半抗原为二氯联苯半抗原、三氯联苯半抗原或四氯联苯半抗原及具有类似结构的多氯联苯同族的同系物等。 

所述动物免疫方法包括以下步骤： 

   (1)将PCB-BSA偶联物作为免疫原与等体积完全佐剂充分混匀，直至一小滴在水中不扩散充分乳化后，对Balb/c小鼠进行初次免疫注射，所用免疫原用量为50-200ug/只；每隔一段时间后以等体积的不完全佐剂乳化纯化抗原（纯化抗原即免疫原，是得到的完全抗原的提纯后的产物）进行追加强化免疫，每次免疫一周后取静脉血检测抗体效价，若抗体效价达到10^-4~10^-5，与追加强化免疫同样的方法进行加强免疫，加强免疫后第3天后按步骤（2）进行细胞融合；

  （2）将免疫动物脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)以10:1混合，用50%（w/v）聚乙二醇作融合剂将两种细胞融合，融合细胞悬于20%（w/v）小牛血清的2%（w/v）HAT选择性培养基内，将融合细胞接种于Balb/c小鼠腹腔渗出细胞作滋养层的96孔细胞培养板中，再将细胞培养板置于质量浓度为5%的CO₂培养箱中于37℃下生长；待生长达到1/4~1/3视野时，取上清液进行筛选；融合第6~8天，融合细胞开始形成集落，计算细胞融合率，并进行完全换液，完全换液3~5天后进行第一次ELISA筛选，以筛选到仅与多氯联苯-OVA阳性反应，与BSA、OVA不反应的孔进行亚克隆；亚克隆7~10天后再进行单克隆孔的ELISA筛选，如此亚克隆3~5次，得到稳定分泌单抗的杂交瘤细胞；

   （3）腹水的制备及抗体类及亚类的制备：选取20~22只雌性Balb/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降殖烷，7d后，腹腔注射第（2）步得到的杂交瘤细胞2×10⁶细胞/只，1~2周后待Balb/c小鼠腹部显著膨隆，处死Balb/c小鼠并取出腹水，以10000r/min离心30s，吸出上清液备用；进行抗体的免疫球蛋白及亚类鉴定，纯化抗体后，冻干保存即可。

所述免疫原用量优选 50-100ug/只，免疫时间为60~120天。 

进行强化免疫时，第一次追加强化免疫选择首次免疫后2-4周（优选3周），第一次追加强化免疫所用的免疫原的用量为首次免疫原用量的0.5-1.5倍（优选等量）；以后追加免疫时间间隔为1周左右，追加强化免疫所用的免疫原的用量为首次免疫原用量的0.5-1.5倍，优选等量。 

与现有技术相比，本发明具有以下优点： 

(1)由于环境污染物的分子量都非常小，并且各类物质分子结构和组成高度类似，这些都增加了工作的难度，要想获得高特异性高亲和力的抗体，需要在完全抗原设计和合成、免疫方案、克隆株筛选、交叉反应性等几个方面做大量深入的工作，本发明系统地考察了合成的完全抗原与其免疫原性密切相关的各项理化特性，系统评价完全抗原的免疫性能，所得的抗体实用性强。

(2) 本发明中动物免疫采用小剂量长周期免疫方案，区别于以往的常规剂量免疫，所制得的抗体效价高、稳定性好：此法制备的多氯联苯抗体效价达2×10⁷，所制备的抗体冻干后，-20℃超低温保存，其稳定性至少可保持 12 个月以上。 

  

附图说明    

图1是单抗的亲和层析洗脱曲线。

图2是基于制备的单克隆抗体建立的免疫分析方法多氯联苯ELISA检测应用的标准工作曲线。 

  

具体实施方式

本发明多氯联苯单克隆抗体的制备工艺如下：首先采用多氯联苯半抗原化学合成完全抗原，然后将完全抗原作为免疫原，通过动物免疫方法制备得到多氯联苯单克隆抗体； 

其中半抗原合成完全抗原采用碳二亚胺法，包括以下步骤：     (1)首先配置浓度为1~3mg/100ul的半抗原TE buffer溶液、浓度为0.2~0.5mg/100ul的牛血清蛋白TE buffer溶液和浓度为20~40mg/100ul的碳二亚胺TE buffer溶液；

(2)磁力搅拌下，将半抗原TE buffer溶液加入含牛血清蛋白TE buffer溶液中得到混合溶液，混合溶液边震荡边滴加碳二亚胺TE buffer溶液，半抗原与牛血清蛋白的反应质量配比为 1:0.1~1:0.5，半抗原与碳二亚胺的质量比为1：16左右，然后将装有三种溶液的容器放于摇床中于35-37℃条件下震荡反应2~4 h，反应得到偶联物，即完全抗原；

(3)用Sephadex柱将步骤(2)容器中反应得到的偶联物和未结合的半抗原小分子分离，然后将分离出来的偶联物溶液装入透析袋透析纯化，在pH为7. 2的0. 01 mol/L 磷酸盐缓冲液PBS中于4℃条件下透析3天，每天换液2次，去除游离小分子化合物，离心分出上清液得 PCB-BSA，经紫外可见分光光度计扫描鉴定后（扫描鉴定是为了根据偶联产物最大吸收峰的位移判断是否偶联成功，同时鉴定多氯联苯和牛血清蛋白的偶联结合比），PCB-BSA偶联物分装后于- 20 ℃保存备用。

所述多氯联苯半抗原为二氯联苯半抗原、三氯联苯半抗原或四氯联苯半抗原及具有类似结构的多氯联苯同族的同系物等。 

所述动物免疫方法包括以下步骤： 

   (1)将PCB-BSA偶联物作为免疫原与等体积完全佐剂充分混匀，直至一小滴在水中不扩散充分乳化后，对Balb/c小鼠进行初次免疫注射，所用免疫原用量为50-200ug/只；每隔一段时间后以等体积的不完全佐剂乳化纯化抗原（纯化抗原即免疫原，是得到的完全抗原的提纯后的产物）进行追加强化免疫，每次免疫一周后取静脉血检测抗体效价，若抗体效价达到10^-4~10^-5，与追加强化免疫同样的方法进行加强免疫，加强免疫后第3天后按步骤（2）进行细胞融合；

  （2）将免疫动物脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)以10:1混合，用50%（w/v）聚乙二醇作融合剂将两种细胞融合，融合细胞悬于20%（w/v）小牛血清的2%（w/v）HAT选择性培养基内，将融合细胞接种于Balb/c小鼠腹腔渗出细胞作滋养层的96孔细胞培养板中，再将细胞培养板置于质量浓度为5%的CO₂培养箱中于37℃下生长；待生长达到1/4~1/3视野时，取上清液进行筛选；融合第6~8天，融合细胞开始形成集落，计算细胞融合率，并进行完全换液，完全换液3~5天后进行第一次ELISA筛选，以筛选到仅与多氯联苯-OVA阳性反应，与BSA、OVA不反应的孔进行亚克隆；亚克隆7~10天后再进行单克隆孔的ELISA筛选，如此亚克隆3~5次，得到稳定分泌单抗的杂交瘤细胞；

   （3）腹水的制备及抗体类及亚类的制备：选取20~22只雌性Balb/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降殖烷，7d后，腹腔注射第（2）步得到的杂交瘤细胞2×10⁶细胞/只，1~2周后待Balb/c小鼠腹部显著膨隆，处死Balb/c小鼠并取出腹水，以10000r/min离心30s，吸出上清液备用；进行抗体的免疫球蛋白及亚类鉴定，纯化抗体后，冻干保存即可。

所述免疫原用量优选 50-100ug/只，免疫时间为60~120天。 

进行强化免疫时，第一次追加强化免疫选择首次免疫后2-4周（优选3周），第一次追加强化免疫所用的免疫原的用量为首次免疫原用量的0.5-1.5倍（优选等量）；以后追加免疫时间间隔为1周左右，追加强化免疫所用的免疫原的用量为首次免疫原用量的0.5-1.5倍，优选等量。 

    本发明免疫注射的部位和方式可为静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下或淋巴结内注射，这些方法可以单独使用或多种组合使用，优选背部皮下多点注射、皮内多点注射。 

    本发明所述的抗体效价的测定方法可为双向免疫扩散试验、试管凝集试验、放射免疫分析、酶联免疫吸附分析或荧光免疫分析，优选酶联免疫吸附分析。 

    本发明抗体纯化可采用硫酸铵盐析法、辛酸盐析法、DEAE 纤维素离子交换层析法、 Protein A Sepharose 4B亲和层析法，QAE 纤维素离子交换层析法或亲和层析法，优选Protein A Sepharose 4B亲和层析法纯化抗体。 

本发明所述的佐剂可为可为胞壁酸二肤、多糖类物质、弗氏佐剂或明矾，优选弗氏佐剂，弗氏佐剂包括不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。 

以下结合具体实施例以帮助理解本发明。 

 1.首先通过半抗原合成完全抗原： 

   （1)称取10mg三氯联苯半抗原，加入500ul TE buffer（pH 8.0），充分震荡使其溶解，配置为抗原的浓度为2mg/100ul TE buffer溶液；

 (2)称取5mg的牛血清蛋白(BSA)，加入500ul TE buffer（pH 8.0），充分震荡使其溶解，配置为BSA的浓度为1mg/100ul TE buffer溶液；

   (3)称取158mg的碳二亚胺（EDC·HCl），加入500ul TE buffer（pH 8.0），充分震荡使其溶解，配置为EDC·HCl的浓度为31.6mg/100ul TE buffer溶液；

(4)磁力搅拌下，将半抗原溶液加入含牛血清蛋白小锥形瓶中，混合溶液边震荡边滴加EDC溶液，半抗原与牛血清蛋白的反应质量配比为 1:0.5，放于37℃摇床中震荡反应2h；

   (5)待反应充分后，将步骤(4)制备得到的产物用Sephadex柱分离偶联产物和未结合的半抗原小分子，然后将得到的溶液装入透析袋透析纯化，在0. 01 mol/L PBS ( pH 7. 2)中4 ℃条件下透析3天，每天换液2次，去除游离小分子化合物，离心分出上清液得 PCB-BSA，经紫外可见分光光度计扫描鉴定后，PCB-BSA偶联物分装后于- 20 ℃保存备用。

    2.紫外光谱鉴定结合比： 

牛血清蛋白上共价结合了半抗原后，明显具备了半抗原的紫外吸收光谱特征，并在280nm处的摩尔吸光系数明显增加，表明半抗原与载体蛋白质有效偶联。根据半抗原、载体蛋白和人工抗原在280 nm处的摩尔吸光系数ε，按结合比=(ε偶联物-ε载体蛋白) /ε半抗原的公式计算半抗原与载体蛋白质的结合比，半免疫原的偶联比对抗体特异性有影响，一般认为偶联比在5：1～30：1范围内能产生较高特异性的抗体。本发明合成的完全抗原的偶联比为26：1，具有较高的结合比，满足了产生特异性抗体的免疫要求。

    3.动物免疫单克隆抗体的制备： 

用免疫原皮下多点免疫Balb/c小鼠，每只100 μg。每隔3周进行1次加强免疫。每次免疫后1周后取小鼠尾静脉血用ELISA方法检测抗体效价，当抗体效价达到10^-4~10^-5，就可以开始融合。融合前3天尾静脉加强免疫。第3天进行细胞融合。免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)以10：1混合，用50%聚乙二醇(PEG)作融合剂将这两种细胞融合，融合细胞悬于含20%小牛血清的2% HAT选择性培养基内，分种于加有昆明小鼠腹腔渗出细胞作滋养层的96孔细胞培养板中，37 ℃下置于5% CO₂培养箱中培养，生长达1/3~1/4视野时，取上清液筛选。融合后第6～8 天，融合细胞开始形成集落，计算细胞融合率，并进行全换液，3～5 天后进行第一次ELISA筛选。以筛选到仅与吡虫啉-OVA阳性反应，与BSA、OVA不反应的孔进行亚克隆。一般亚克隆后第7～10 天再进行单克隆孔的ELISA筛选，如此亚克隆 3～5次。然后扩大培养，建株，冻存并制备腹水。

    4.腹水的制备及抗体类及亚类测定： 

选取20～22只雌性Balb/c小鼠，每只腹腔注射降殖烷 0.5 mL。1周后，腹腔注射杂交瘤细胞 2×10⁶ 细胞/只。7～14 天后待小鼠腹部显著膨隆，处死小鼠并取出腹水，10⁴ r/min 离心30 秒，吸出上清备用。抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定采用抗体亚类鉴定试剂盒（492 nm处测定吸光度值）。其鉴定结果如表1所示。经过融合、筛选、4次亚克隆及建株，经BSA、OVA、多氯联苯-BSA、多氯联苯-OVA包被物进一步筛选培养后，得到五株稳定分泌抗体的杂交瘤8C4、4E3、10F5、10G3、3H5，通过表1可见所制备的单抗均为IgG₁亚型，轻链为κ链。经测定4E3的腹水效价为2×10⁷，其余4株单抗的腹水效价均为2×10⁵，故选择4E3建立间接竞争方法和用于实际水样的检测。

表1  吸光度法鉴定五株单抗的类和亚类 

    5.抗体的纯化：

    单抗4E3为IgG₁亚型，故选用高盐 Protein A Sepharose 4B亲和层析法纯化。Protein  A是从金黄色葡萄球菌中分离出来的蛋白，能与多种系的IgG分子Fc部分可逆地结合，将小鼠腹水上样流过ProteinA-Sepharose-4B柱后，洗脱回收在已加入50μL、1 mol/L Tris（pH 8.0）的1.5 mL的离心管内，500μL/管，大约收集24管。用紫外分光光度计测各管OD ₂₈₀值，纯化曲线如图1所示。

    6.抗体的应用 

    本发明制备的多氯联苯单克隆抗体，主要应用于水体环境中多氯联苯的免疫检测的核心材料。其主要用途之一就是在单克隆抗体基础上建立多氯联苯的免疫测定方法。

    ELISA免疫检测间接竞争方法的建立： 

首先采用混合酸酐法交联工艺将多氯联苯与卵清蛋白(OVA)偶联制备包被抗原（PCB-OVA）。反应液在0. 01 mol/L PBS ( pH 7. 2)中4℃透析3天，每天换液2次，去除游离小分子化合物，偶联物分装后于- 20 ℃保存。紫外光谱扫描鉴定得其PCB-OVA的结合比为16:1，经方阵试验优化筛选，水体中多氯联苯间接竞争ELISA测定最佳工作条件为：包被抗原为0.5 μg/ml包被酶标板，4 ℃过夜；单克隆抗体用6000倍PBS缓冲液稀释，进行竞争反应前，抗体与待测样品预反应0.5 h；待测样品及包被抗原与抗体竞争性反应时间为1 h，反应温度为37 ℃，加酶标二抗反应时间为1 h。按上述标准试验条件建立多氯联苯检测的间接竞争方法，图2为采用四参数的Logistic模型拟合的多氯联苯的间接竞争标准曲线：标准曲线的IC₅₀值为(13.02±1.07) μg/L，计算得到间接竞争检测曲线的检测限为(1.24±0.001)μg/L。应用建立的间接竞争方法测定了加入三氯联苯标准品的饮用水、重庆理工大学自来水（即地下水）和重庆市花溪河的地表水，并采用添加乙醇，BSA的反应缓冲体系来削弱样品基质效应对检测结果的干扰。不同来源水样中分别添加50、10、5 μg/L的多氯联苯，每浓度作5次重复测定，以同一块酶标板上建立的标准曲线进行定量，当原水样(添加浓度为0 μg/L)计算浓度均小于0.10 μg/L，超出本方法的检测限，视为未检出，因此均按照x₀ = 0 μg/L（初始浓度为0 μg/L）计算回收率。计算样品添加回收率。结果见表2。所得水样的平均添加回收率分别为101.3%、92%和81%，回收率符合国家环保总局的标准（痕量有机污染物定量检测结果回收率应在70％~130％）。

表2 不同水样中添加多氯联苯标准品的回收率 

本发明采用不同方法合成多氯联苯的免疫抗原和用于检测抗体的包被抗原，在偶联反应之后，综合考察了合成的完全抗原的与其免疫原性密切相关的各项理化特性，系统评价完全抗原的免疫性能，这对于获得效价高、特异性强的抗体具有重要的指导意义。且动物免疫实验，采取小剂量长周期免疫方案，约为现有报道的1/10，有利于获得特异性强，对多氯联苯同族同系污染物亲和性性优异的特异性单克隆抗体。

Claims (5)

1.一种多氯联苯单克隆抗体的制备方法，其特征在于：首先采用多氯联苯半抗原化学合成完全抗原，然后将完全抗原作为免疫原，通过动物免疫方法制备得到多氯联苯单克隆抗体；

其中半抗原合成完全抗原采用碳二亚胺法，包括以下步骤：     (1)首先配置浓度为1~3mg/100ul的半抗原TE buffer溶液、浓度为0.2~0.5mg/100ul的牛血清蛋白TE buffer溶液和浓度为20~40mg/100ul的碳二亚胺TE buffer溶液；

(2)磁力搅拌下，将半抗原TE buffer溶液加入含牛血清蛋白TE buffer溶液中得到混合溶液，混合溶液边震荡边滴加碳二亚胺TE buffer溶液，半抗原与牛血清蛋白的反应质量配比为 1:0.1~1:0.5，半抗原与碳二亚胺的质量比为1：16左右，然后将装有三种溶液的容器放于摇床中于35-37℃条件下震荡反应2~4 h，反应得到偶联物，即完全抗原；

(3)用Sephadex柱将步骤(2)容器中反应得到的偶联物和未结合的半抗原小分子分离，然后将分离出来的偶联物溶液装入透析袋透析纯化，在pH为7. 2的0. 01 mol/L 磷酸盐缓冲液PBS中于4℃条件下透析3天，每天换液2次，去除游离小分子化合物，离心分出上清液得 PCB-BSA，经紫外可见分光光度计扫描鉴定后，PCB-BSA偶联物分装后于- 20 ℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的多氯联苯单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述多氯联苯半抗原为二氯联苯半抗原、三氯联苯半抗原或四氯联苯半抗原及具有类似结构的多氯联苯同族的同系物等。

3.根据权利要求1所述的多氯联苯单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述动物免疫方法包括以下步骤：

   (1)将PCB-BSA偶联物作为免疫原与等体积完全佐剂充分混匀，直至一小滴在水中不扩散充分乳化后，对Balb/c小鼠进行初次免疫注射，所用免疫原用量为50-200ug/只；每隔一段时间后以等体积的不完全佐剂乳化纯化抗原进行追加强化免疫，每次免疫一周后取静脉血检测抗体效价，若抗体效价达到10^-4~10^-5，与追加强化免疫同样的方法进行加强免疫，加强免疫后第3天后按步骤（2）进行细胞融合；

  （2）将免疫动物脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)以10:1混合，用50%（w/v）聚乙二醇作融合剂将两种细胞融合，融合细胞悬于20%（w/v）小牛血清的2%（w/v）HAT选择性培养基内，将融合细胞接种于Balb/c小鼠腹腔渗出细胞作滋养层的96孔细胞培养板中，再将细胞培养板置于质量浓度为5%的CO₂培养箱中于37℃下生长；待生长达到1/4~1/3视野时，取上清液进行筛选；融合第6~8天，融合细胞开始形成集落，计算细胞融合率，并进行完全换液，完全换液3~5天后进行第一次ELISA筛选，以筛选到仅与多氯联苯-OVA阳性反应，与BSA、OVA不反应的孔进行亚克隆；亚克隆7~10天后再进行单克隆孔的ELISA筛选，如此亚克隆3~5次，得到稳定分泌单抗的杂交瘤细胞；

   （3）腹水的制备及抗体类及亚类的制备：选取20~22只雌性Balb/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降殖烷，7d后，腹腔注射第（2）步得到的杂交瘤细胞2×10⁶细胞/只，1~2周后待Balb/c小鼠腹部显著膨隆，处死Balb/c小鼠并取出腹水，以10000r/min离心30s，吸出上清液备用；进行抗体的免疫球蛋白及亚类鉴定，纯化抗体后，冻干保存即可。

4.根据权利要求 3所述的多氯联苯单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述免疫原用量优选 50-100ug/只，免疫时间为60~120天。

5.根据权利要求3所述的多氯联苯单克隆抗体的制备方法，其特征在于：进行强化免疫时，第一次追加强化免疫选择首次免疫后2-4周，第一次追加强化免疫所用的免疫原的用量为首次免疫原用量的0.5-1.5倍；以后追加免疫时间间隔为1周，追加强化免疫所用的免疫原的用量为首次免疫原用量的0.5-1.5倍。

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