CN111333731A - CdTe标记抗体的制备方法、应用及检测四氯联苯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种CdTe标记抗体以及利用其检测四氯联苯的方法，首先制得CdTe标记抗体，通过待测样品与CdTe标记抗体进行竞争反应，洗涤除去多余的游离标记抗体，置于荧光酶标仪上读数。当CdTe标记抗体量一定时，若待测样品中的四氯联苯含量越多，与固相抗原结合的CdTe标记抗体就越少，荧光值越低，抑制率越高，反之，则荧光值越高，抑制率降低，根据事先得到的四氯联苯的标准曲线和待测样品的抑制率，可计算出待测样品中的四氯联苯的含量。本发明公开的的检测方法特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、安全可靠，不需要贵重仪器和复杂的前处理过程同时对分析人员的专业技术要求不高,容易普及和推广。

Description

CdTe标记抗体的制备方法、应用及检测四氯联苯的方法
技术领域
本发明涉及四氯联苯检测领域，具体涉及一种CdTe标记抗体的制备方法、应用及检测四氯联苯的方法。
背景技术
四氯联苯是众所周知的持久性有毒污染物，多氯联苯的监测分析、迁移转化和污染控制是国内外环境科学技术研究领域的热点课题。现有检测方法有气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等，其中，最常用的是气相色谱-质谱法。由于GC和GC-MS分析方法灵敏度较低，都易产生假阳性，HRGC-HRMS的仪器设备贵、对环境条件和人员要求高，不适于方法的推广。而使用GC-MS/MS进行检测时，二级质谱扫描的母离子一般选择一级质谱上丰度最高的离子，母离子再通过四极杆后产生特征子离子，形成离子对，通过监测一个或多个离子对，使化合物分析的准确度和精确度进一步提高但也存在都存在同时分析和色谱柱容易污染等问题。
以上方法存在的问题是前处理步骤复杂,操作费时,分析成本高,需要熟练的技术人员及较长的分析周期，对大批复杂试样不能及时报出结果。因此，建立选择性更强、更灵敏、检出限更低的痕量污染物检测方法尤为重要。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于现有技术中四氯联苯检测方法步骤复杂,操作费时,分析成本高，对环境条件和人员要求高等缺陷，从而提供了一种CdTe标记抗体的制备方法、应用及检测四氯联苯的方法。
为此，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种CdTe标记抗体的制备方法，包括如下步骤：
对3,3',4,4'-四氯联苯依次进行硝化和还原后，再与牛血清白蛋白进行偶联，制成四氯联苯抗原，最后对四氯联苯抗原进行动物免疫实验，制得四氯联苯抗体；
向CdTe量子点溶液中加入交联剂，并静置，然后再向其中加入四氯联苯抗体，于3-5℃反应40-60h，用磷酸盐缓冲溶液透析后，制得CdTe标记抗体。
进一步地，所述四氯联苯抗原的制备具体为，
使半抗原、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺在N,N-二甲基甲酰胺搅拌反应6-10h，在3-5℃过夜，然后将反应产物离心分离得到上清液，与牛血清白蛋白在pH值为7-8的磷酸盐缓冲溶液中，冰浴条件下反应3-5h，之后使用生理盐水透析5-7d，得到四氯联苯抗原，其中半抗原、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和牛血清白蛋白的摩尔比为1:0.5-1:0.5-1:0.5-1；
所述动物免疫实验为选择成年健康雄性新西兰白兔，将四氯联苯抗原经过与弗氏完全佐剂充分混合后，对大白兔进行颈部和背部点状注射免疫，经过加强免疫后，采用试管法和双白琼脂扩散试验考察其抗血清效价，获得四氯联苯抗体，其中四氯联苯抗原和弗氏完全佐剂的摩尔比是1:0.5-1。
进一步地，半抗原可以通过如下方法制备得到：使硝基四氯联苯和氯化亚锡在浓盐酸和二氯甲烷环境中在25-35℃水浴上搅拌反应2-4h，反应结束后加入NaOH固体，搅拌至溶液呈强碱性，然后把反应混合物倾入蒸馏水的烧杯中，加入乙醚分次萃取取有机层，用饱和食盐水洗涤有机层，然后用无水MgSO4干燥，蒸去乙醚，得到半抗原，其中硝基四氯联苯和氯化亚锡的摩尔比为1:7-10。
优选地，所述CdTe量子点溶液的摩尔浓度为1×10-3-2×10-3mol/L；四氯联苯抗体的浓度为0.5-2.0g/L；
CdTe量子点溶液、四氯联苯抗体和交联剂的体积比为5-10:10-20:0.5-1；
进一步地，所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基丁二酰亚胺溶液的混合溶液，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与所述N-羟基丁二酰亚胺溶液的体积比为1:(0.5-2)，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与所述N-羟基丁二酰亚胺溶液的摩尔浓度均为0.05-0.2mol/L。
进一步地，CdTe量子点溶液中CdTe量子点的制备方法，包括如下步骤：将CdCl2·2.5H2O和巯基乙酸在惰性气氛下溶于水中，调节pH值至11.5-12.5，然后加入NaHTe溶液，控制CdCl2·2.5H2O、NaHTe溶液和巯基乙酸的比例为0.05-0.1g：50-100μL：50-100μL，得到CdTe量子点前躯体；
将所述的CdTe量子点前驱体于140-160℃加热5-60min后，在依次进行冷却、洗涤和离心，制得CdTe量子点。
本发明还提供一种制备方法制得的CdTe标记抗体检测四氯联苯的方法，包括如下步骤：
S1：包被：以0.03-0.06mol/L pH值9-10的碳酸盐缓冲溶液将四氯联苯抗原稀释至1-10μg/mL，然后加至荧光酶标板，加入量90-120μL/孔，4-5℃过夜；
S2：封闭：将包被好的标板取出，待其恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤，然后加入卵清蛋白含量为2-4％的磷酸盐缓冲溶液150-250μL/孔进行封闭，最后在35-40℃温育0.5-1h；
S3：制备四氯联苯的标准抑制曲线：将封闭后的标板取出，待恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤，使用一系列标准浓度的四氯联苯标准溶液样品与CdTe标记抗体进行竞争反应，取出反应后的标板，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤，用荧光酶标仪测定荧光强度，然后根据抑制率对四氯联苯浓度作图，得到四氯联苯的标准抑制曲线；
S4：测量待测样品：重复步骤S2和步骤S3，将封闭后的板取出，待恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤，使用待测样品与CdTe标记抗体进行竞争反应，然后在35-40℃温育0.5-2h；取出温育后的标板，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤，用荧光酶标仪测定荧光强度，将待测样品的荧光强度代入四氯联苯的标准抑制曲线中，计算得知待测样品中四氯联苯的含量。
进一步地，步骤S3中，一系列标准浓度的四氯联苯标准溶液样品为浓度分别为0.001mg/mL、0.0001mg/mL、0.00001mg/mL、0.000001mg/mL、0.0000001mg/mL和0.000000001mg/mL的磷酸盐缓冲溶液。
进一步地，步骤S3中，使用一系列标准浓度的四氯联苯标准溶液样品与CdTe标记抗体进行竞争反应，包括，标板各孔依次加入50μL浓度分别为0.001mg/mL、0.0001mg/mL、0.00001mg/mL、0.000001mg/mL、0.0000001mg/mL和0.000000001mg/mL的四氯联苯标准溶液样品和50μL0.125 mg/L的标记抗体，对照孔加入50μL磷酸盐缓冲溶液和50μL0.125 mg/L的标记抗体，然后在35-40℃下温育0.5-2h；
步骤S4中，所述待测样品与CdTe标记抗体进行竞争反应为，标板各孔依次加入50μL待测样品溶液和50μL0.125 mg/L的标记抗体，对照孔加入50μL磷酸盐缓冲溶液和50μL0.125 mg/L的标记抗体，然后在35-40℃下温育0.5-2h。
优选地，所述荧光酶标仪的激发波长λex＝365nm，发射波长λem＝410nm。
所述磷酸盐吐温缓冲溶液为吐温-20含量为0.04-0.06wt％的磷酸盐缓冲溶液。
其中，所述待测样品为鸡蛋。
所述鸡蛋的处理方法为，取蛋液于玻璃离心管中，加入二氯甲烷萃取，收集有机相，加入无水Na2SO4脱水，置于旋转蒸发仪中浓缩，取0.5mL浓缩用PBS定容至5mL。
本发明技术方案，具有如下优点：
(1)本发明通过待测样品与CdTe标记抗体进行竞争反应，洗涤除去多余的游离标记抗体，至于荧光酶标仪上读数。当CdTe标记抗体量一定时，若待测样品中的四氯联苯含量越多，与固相抗原结合的CdTe标记抗体就越少，荧光值越低，抑制率越高，反之，则荧光值越高，抑制率降低，根据已知的四氯联苯的标准曲线和待测样品的抑制率，可计算出待测样品中的四氯联苯的含量。本发明使用的检测方法特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、安全可靠，不需要贵重仪器和复杂的前处理过程同时对分析人员的专业技术要求不高,可以满足简单、快速、灵敏地检测环境激素的要求，容易普及和推广。
(2)本发明中标记后的标记抗体，稳定性较好，三周内不会发生淬灭，且经过稀释后的线性方程具有良好的线性关系，同时将该标记物用于竞争免疫分析测定四氯联苯的研究，可以得到良好的线性关系，比单个荧光分子有高很多的发光强度和光化学稳定性，成功建立了持久性有机污染物的荧光免疫分析方法。
(3)本发明中，CdTe量子点在EDC和NHS联合交联剂的作用下，实现了CdTe表面的羧基与抗体上氨基的共价链接。并且形成类似于(CdTe)x(PBB)1-x的核壳结构，这种核壳结构降低了CdTe量子点的表面电荷数减少，从而消除了部分非辐射弛豫途径，使得体系的吸光度和荧光强度逐渐增强。
(4)本发明中标记抗体的于4℃环境放置三周后，最大发射峰和强度并没有见明显变化，而取该标记抗体逐级稀释后测其荧光，发现荧光强度和试剂浓度的稀释比有着良好的线性关系，其制得的标记抗体分散性、稳定性良好。
(5)本发明使用的方法，回收率稳定且偏差较低，同时经过精密度试验，日内的差异则相对较小，所以批内误差较低。
(6)本发明使用的方法，经过特异性分析，选择进行抗体的交叉反应实验，当四氯联苯对抗原抗体反应的抑制率为50％，四氯联苯与类似结构的PCBs单体的交叉反应率都比较低，可以认为对结果没有影响。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例4中得到的四氯联苯的标准抑制曲线；
图2为本发明试验例1中功能性CdTe量子点及其标记抗体的紫外可见吸收光谱；
图3为本发明试验例1中功能性CdTe量子点及其标记抗体的荧光光谱；
图4为本发明试验例2中标记抗体的荧光强度与试剂浓度的稀释比的关系曲线。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。
本发明使用的试剂和仪器如下：79-1磁力搅拌加热器(江苏金坛市金城国胜实验仪器厂)；LS55荧光光度计(美国PE公司)；紫外可见阵列二极管分光光度计(美国惠普公司)；pHS-3C酸度计(上海雷磁公司)；荧光酶标仪(SpectraMax i3X，美国moleculardevices公司)；96孔黑色酶标板(Costar)。
卵清蛋白(OVA，上海华美生物制品公司)；各种缓冲试剂和吐温-20(上海化学试剂公司)；DM27mm透析袋(上海奔大生物科技公司)；水为超纯水，待测样品鸡蛋为江西新农园实业有限公司的叶尔宝贝蛋，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品，所述磷酸盐吐温缓冲溶液为吐温-20质量比为0.05wt％的溶液。
以下具体实施例是对本发明的进一步说明，所举案例并不能列举出本发明的全部实施方式，仅以其中部分实施方式为例进行说明，具体实施例如下：
实施例1
本实施例制备一种CdTe标记抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)在盛有4mL的小玻璃瓶中，加入0.1276g Te粉和0.1123g NaHB4，迅速用自封袋封住封口，用注射针头与外界相通，强磁力搅拌和冰水浴中反应4-6小时，待溶液颜色逐渐变成淡粉色，反应瓶内出现白色晶体时为制的NaHTe溶液；
(2)往圆底烧瓶中加入0.059g的CdCl2·2.5H2O和50μL巯基乙酸于180mL的高纯水中，通高纯氮气30min，用1.00mol·L-1的NaOH溶液调节到pH值为12.0左右，通高纯氮气30min，然后在氮气保护下加入上述制备的NaHTe溶液50μL，溶液颜色立刻变成淡黄色，得到CdTe量子点前躯体；将所述的CdTe量子点前驱体在150℃加热30min，经冷却、洗涤、离心即得CdTe量子点；
(3)称取3.8g 2-硝基-3,3',4,4'-四氯联苯，10g氯化亚锡，放入100mL三口圆底烧瓶中，加入20mL浓盐酸和40mL二氯甲烷，在30℃水浴上搅拌反应3h，用TLC法监测反应。反应结束后向反应容器中加入NaOH固体,搅拌至溶液呈强碱性，然后把反应混合物倾入装有400mL蒸馏水的烧杯中，搅拌均匀后用200mL乙醚分次萃取，用饱和食盐水洗涤有机层，然后用无水MgSO4干燥，蒸去乙醚，得棕色晶体为半抗原；
(4)称取0.4mmo1半抗原，置于洁净干燥的小锥形瓶中，加入400μLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)使之溶解，称取0.4mmo1二环己基碳二亚胺(DCC)与0.4mmo1 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于200-300μL DMF,在磁力搅拌下逐滴加到小锥形瓶中,室温搅拌反应8h，4℃过夜；将反应产物以9000r/min，离心15min分离.称取0.4mmol牛血清白蛋白(BSA)溶于10mL0.02mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，逐滴加入400μL上清液,于冰浴条件下反应4h，将溶液装入透析袋，自来水冲洗48h，0.9％生理盐水透析5d，离心分出上清液，得到四氯联苯抗原；
(5)选择2只成年健康雄性新西兰白兔，将四氯联苯抗原经过与弗氏完全佐剂充分混合后，对大白兔进行颈部和背部点状注射免疫，其中四氯联苯抗原和弗氏完全佐剂的摩尔比是1:1，经过7次加强免疫后，采用试管法和双白琼脂扩散试验考察其抗血清效价，分别达到1∶320(1∶32)和1∶640(1∶64)，获得四氯联苯抗体；
(6)取0.5mL1.4×10-3mol/L的CdTe量子点于试管中，向其中加入50μL 0.10mol/L1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC-HC1)和50μL 0.10mol/L N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，室温放置15min后，加入1.0mL 1.0g/L抗四氯联苯抗体，于4℃反应48h，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)透析完全后，于4℃保存，得到CdTe标记抗体。
实施例2
本实施例制备一种CdTe标记抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)在盛有4mL的小玻璃瓶中，加入0.1276g Te粉和0.1123g NaHB4，迅速用自封袋封住封口，用注射针头与外界相通，强磁力搅拌和冰水浴中反应5小时，待溶液颜色逐渐变成淡粉色，反应瓶内出现白色晶体时为制的NaHTe溶液；
(2)往圆底烧瓶中加入0.02g的CdCl2·2.5H2O和25μL巯基乙酸于180mL的高纯水中，通高纯氮气30min，用1.00mol·L-1的NaOH溶液调节到pH值为12.0左右，通高纯氮气30min，然后在氮气保护下加入上述制备的NaHTe溶液20μL，溶液颜色立刻变成淡黄色，得到CdTe量子点前躯体；将所述的CdTe量子点前驱体在160℃加热5min，经冷却、洗涤、离心即得CdTe量子点；
(3)称取3g 2-硝基-3,3',4,4'-四氯联苯，8g氯化亚锡，放入100mL三口圆底烧瓶中，加入20mL浓盐酸和40mL二氯甲烷，在25℃水浴上搅拌反应4h，用TLC法监测反应。反应结束后向反应容器中加入NaOH固体,搅拌至溶液呈强碱性，然后把反应混合物倾入装有400mL蒸馏水的烧杯中，搅拌均匀后用200mL乙醚分次萃取，用饱和食盐水洗涤有机层,然后用无水MgSO4干燥，蒸去乙醚，得棕色晶体为半抗原；
(4)称取0.4mmo1半抗原,置于洁净干燥的小锥形瓶中,加入400μLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)使之溶解，称取0.2mmo1二环己基碳二亚胺(DCC)与0.2mmo1 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于300μL DMF,在磁力搅拌下逐滴加到小锥形瓶中，室温搅拌反应6h，5℃过夜；将反应产物以9000r/min,离心15min分离。称取0.3mmol牛血清白蛋白(BSA)溶于10mL0.02mol/LpH7.4的磷酸盐缓冲溶液，逐滴加入400μL上清液,于冰浴条件下反应5h，将溶液装入透析袋，自来水冲洗48h，0.9％生理盐水透析7d，离心分出上清液，得到四氯联苯抗原；
(5)选择2只成年健康雄性新西兰白兔，将四氯联苯抗原经过与弗氏完全佐剂充分混合后，对大白兔进行颈部和背部点状注射免疫，其中四氯联苯抗原和弗氏完全佐剂的摩尔比是1:0.5，经过7次加强免疫后，采用试管法和双白琼脂扩散试验考察其抗血清效价，分别达到1∶320(1∶32)和1∶640(1∶64)，获得四氯联苯抗体；
(6)取1.0mL 1×10-3mol/L的CdTe量子点于试管中，向其中加入20μL 0.10mol/L1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC-HC1)和40μL 0.10mol/L N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，室温放置15min后，加入2.0mL1.0 g/L抗四氯联苯抗体，于3℃反应60h，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)透析完全后，于4℃保存，得到CdTe标记抗体。
实施例3
本实施例制备一种CdTe标记抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)在盛有4mL的小玻璃瓶中，加入0.1276g Te粉和0.1123g NaHB4，迅速用自封袋封住封口，用注射针头与外界相通，强磁力搅拌和冰水浴中反应5小时，待溶液颜色逐渐变成淡粉色，反应瓶内出现白色晶体时为制的NaHTe溶液；
(2)往圆底烧瓶中加入0.04g的CdCl2·2.5H2O和35μL巯基乙酸于180mL的高纯水中，通高纯氮气30min，用1.00mol·L-1的NaOH溶液调节到pH值为12.0左右，通高纯氮气30min，然后在氮气保护下加入上述制备的NaHTe溶液40μL，溶液颜色立刻变成淡黄色，得到CdTe量子点前躯体；将所述的CdTe量子点前驱体在140℃加热60min，经冷却、洗涤、离心即得CdTe量子点；
(3)称取5g 2-硝基-3,3',4,4'-四氯联苯，15g氯化亚锡，放入100mL三口圆底烧瓶中，加入20mL浓盐酸和40mL二氯甲烷，在35℃水浴上搅拌反应2h，用TLC法监测反应。反应结束后向反应容器中加入NaOH固体，搅拌至溶液呈强碱性，然后把反应混合物倾入装有400mL蒸馏水的烧杯中，搅拌均匀后用200mL乙醚分次萃取，用饱和食盐水洗涤有机层，然后用无水MgSO4干燥，蒸去乙醚，得棕色晶体为半抗原；
(4)称取0.4mmo1半抗原，置于洁净干燥的小锥形瓶中,加入400μLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)使之溶解，称取0.3mmo1二环己基碳二亚胺(DCC)与0.3mmo1 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于300μL DMF,在磁力搅拌下逐滴加到小锥形瓶中,室温搅拌反应10h,3℃过夜；将反应产物以9000r/min,离心15min分离.称取0.2mmol牛血清白蛋白(BSA)溶于10mL0.02mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，逐滴加入400μL上清液，于冰浴条件下反应3h，将溶液装入透析袋，自来水冲洗48h，0.9％生理盐水透析6d，离心分出上清液，得到四氯联苯抗原；
(5)选择2只成年健康雄性新西兰白兔，将四氯联苯抗原经过与弗氏完全佐剂充分混合后，对大白兔进行颈部和背部点状注射免疫，其中四氯联苯抗原和弗氏完全佐剂的摩尔比是1:0.75，经过7次加强免疫后，采用试管法和双白琼脂扩散试验考察其抗血清效价，分别达到1∶320(1∶32)和1∶640(1∶64)，获得四氯联苯抗体；
(6)取0.5mL1.4×10-3mol/L的CdTe量子点于试管中，向其中加入60μL 0.10mol/L1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC-HC1)和30μL 0.10mol/L N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，室温放置15min后，加入1.0mL1.0 g/L抗四氯联苯抗体，于5℃反应40h，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)透析完全后，于4℃保存，得到CdTe标记抗体。
实施例4
本实施例公开一种利用实施例1所得CdTe标记抗体检测四氯联苯的方法，包括如下步骤：
S1：包被：以0.05mol/L pH值9.6的碳酸盐缓冲溶液(CBS)将抗原稀释至工作浓度，然后加至荧光酶标板，加入量100μL/孔，4℃过夜；
S2：封闭：将包被好的标板取出，待其恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液(PBST)洗涤3次，加入3.0％卵清蛋白(OVA)200μL/孔进行封闭，37℃温育1h；
S3：得到四氯联苯的标准抑制曲线：将封闭后的标板取出，待恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤3次，标板各孔依次加入50μL浓度分别为0.001mg/mL、0.0001mg/mL、0.00001mg/mL、0.000001mg/mL、0.0000001mg/mL和0.000000001mg/mL的四氯联苯标准溶液样品和50μL0.125mg/L的标记抗体，对照孔加入50μL磷酸盐缓冲溶液和50μL0.125mg/L的标记抗体，在37℃温育1h；
取出温育后的标板，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤5次；用荧光酶标仪测定荧光强度F，其中荧光酶标仪的λex＝365nm，λem＝410nm；
然后根据抑制率对四氯联苯浓度作图，得到四氯联苯的标准抑制曲线，如图1所示，得到线性回归方程为I＝(F对-Fs/F对)*100％＝4.2189lgC+118.76(I为抑制率，C为多溴联苯的浓度，F对为对照孔的荧光值；Fs为加多溴联苯标样时的荧光值)，相关系数为R2＝0.9988，检出限IC20＝5.32pg/mL，IC50＝18.35ng/mL；
S4：制备待测样品：取鸡蛋蛋液5mL于玻璃离心管中，加入二氯甲烷萃取3次，收集有机相，加入无水Na2SO4脱水，置于旋转蒸发仪中浓缩，取0.5mL浓缩用PBS定容至5mL，待测样品溶液；
S5：测量待测样品：重复步骤S3和步骤S4，然后将封闭后的板取出，待恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤3次，每空依次加入50μL待测样品溶液和50μL0.125 mg/L的标记抗体，对照孔加入50μL磷酸盐缓冲溶液和50μL0.125 mg/L的标记抗体，在37℃温育1h；
取出温育后的标板，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤5次；用荧光酶标仪测定荧光强度与对照孔荧光值F对相同，即待测样品不含有四氯联苯，其中荧光酶标仪的λex＝365nm，λem＝410nm，同时进行加标样的加标回收实验。
实施例5
本实施例公开一种利用实施例1所得CdTe标记抗体检测四氯联苯的方法，包括如下步骤：
S1：包被：以0.03mol/L pH值10的碳酸盐缓冲溶液(CBS)将抗原稀释至工作浓度，然后加至荧光酶标板，加入量120μL/孔，5℃过夜；
S2：封闭：将包被好的标板取出，待其恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液(PBST)洗涤3次，加入4％卵清蛋白(OVA)150μL/孔进行封闭，40℃温育0.5h；
S3：得到四氯联苯的标准抑制曲线：将封闭后的标板取出，待恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤3次，标板各孔依次加入50μL浓度分别为0.001mg/mL、0.0001mg/mL、0.00001mg/mL、0.000001mg/mL、0.0000001mg/mL和0.000000001mg/mL的四氯联苯标准溶液样品和50μL0.125 mg/L的标记抗体，对照孔加入50μL磷酸盐缓冲溶液和50μL0.125 mg/L的标记抗体，在40℃温育0.5h；
取出温育后的标板，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤5次；用荧光酶标仪测定荧光强度F，其中荧光酶标仪的λex＝365nm，λem＝410nm；
然后根据抑制率对四氯联苯浓度作图，得到四氯联苯的标准抑制曲线；
S4：制备待测样品：取鸡蛋蛋液5mL于玻璃离心管中，加入二氯甲烷萃取3次，收集有机相，加入无水Na2SO4脱水，置于旋转蒸发仪中浓缩，取0.5mL浓缩用PBS定容至5mL，待测样品溶液；
S5：测量待测样品：重复步骤S3和步骤S4，然后将封闭后的板取出，待恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤3次，每空依次加入50μL待测样品溶液和50μL0.125mg/L的标记抗体，对照孔加入50μL磷酸盐缓冲溶液和50μL0.125mg/L的标记抗体，在40℃温育0.5h；
取出温育后的标板，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤5次；用荧光酶标仪测定荧光强度值，然后计算样品中的四氯联苯含量，其中荧光酶标仪的λex＝365nm，λem＝410nm。
实施例6
本实施例公开利用实施例1所得CdTe标记抗体检测四氯联苯的方法，包括如下步骤：
S1：包被：以0.06mol/L pH值9的碳酸盐缓冲溶液(CBS)将抗原稀释至工作浓度，然后加至荧光酶标板，加入量90μL/孔，4℃过夜；
S2：封闭：将包被好的标板取出，待其恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液(PBST)洗涤3次，加入2％卵清蛋白(OVA)250μL/孔进行封闭，35℃温育1h；
S3：得到四氯联苯的标准抑制曲线：将封闭后的标板取出，待恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤3次，标板各孔依次加入50μL浓度分别为0.001mg/mL、0.0001mg/mL、0.00001mg/mL、0.000001mg/mL、0.0000001mg/mL和0.000000001mg/mL的四氯联苯标准溶液样品和50μL经磷酸盐缓冲溶液稀释的标记抗体，对照孔加入50μL磷酸盐缓冲溶液和50μL标记抗体，在35℃温育2h；
取出温育后的标板，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤5次；用荧光酶标仪测定荧光强度F，其中荧光酶标仪的λex＝365nm，λem＝410nm；
然后根据抑制率对四氯联苯浓度作图，得到四氯联苯的标准抑制曲线；
S4：制备待测样品：取鸡蛋蛋液5mL于玻璃离心管中，加入二氯甲烷萃取3次，收集有机相，加入无水Na2SO4脱水，置于旋转蒸发仪中浓缩，取0.5mL浓缩用PBS定容至5mL，待测样品溶液；
S5：测量待测样品：重复步骤S3和步骤S4，然后将封闭后的板取出，待恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤3次，每空依次加入50μL待测样品溶液和50μL0.125mg/L的标记抗体，对照孔加入50μL磷酸盐缓冲溶液和50μL0.125mg/L的标记抗体，在35℃温育2h；
取出温育后的标板，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤5次；用荧光酶标仪测定荧光强度，然后计算样品中的四氯联苯含量，其中荧光酶标仪的λex＝365nm，λem＝410nm。
试验例1
测试实施例1中的CdTe量子点及其标记抗体的紫外可见吸收光谱，如图2所示，可以看出，加入适量的抗四氯联苯抗体反应后，体系的吸收强度明显增大，而且最大吸收峰位发生了红移。图3为CdTe量子点及其标记抗体的荧光光谱，如图3所示，标记后荧光免疫试剂荧光强度有显著的增强，且半峰宽基本不变。同时发现，CdTe量子点在EDC和NHS联合交联剂的作用下，CdTe表面能够更好的进行活化，使得CdTe量子点的荧光强度明显的高于交联剂EDC和NHS单独作用。
试验例2
本试验例测试实施例1所得到的标记抗体的稳定性。所制得的标记抗体的颜色依然是淡黄色，而且没有沉淀浑浊现象出现。于4℃环境放置三周后，最大发射峰和强度并没有见明显变化。取该标记抗体逐级稀释后测其荧光，发现荧光强度和试剂浓度的稀释比有着良好的线性关系。如图4所示线性方程为I＝1135.5C+299.13，线性范围是1︰2.5－1︰96相关系数R2＝0.9972；进一步说明制备的标记抗体分散性、稳定性良好。
试验例3
对所实施例4中的待测样品进行荧光免疫分析实验及加标回收实验检验检测结果见表1：
表1直接竞争荧光免疫检测待测样品的四氯联苯的回收实验
Figure BDA0002427445050000181
由上表可知，本试验回收率稳定，偏差较低。
试验例4
本试验例为对实施例4的精密度试验，精密度的表示通常用变异系数法来描述实验的重复性，以批内(同一板孔间)和批间(板与板之间)误差来表示。按高中低原则配制3个浓度的标准溶液，每个浓度设3个重复，分别进行间接竞争FIA实验。以变异系数(CV)来描述实验的重复性。
批内误差：批内测定为一块板上5个重复孔平均值。在同一块板上同时测定，比较孔间差异。以标准缺陷的批内变异系数CVw表示。
批间误差：以4块重复操作的板上测定结果进行平均，求得总的批间变异系数CVb。
平均批内CVw％和批间CVb％计算:
CVW％＝(SDW/I)×100％；CVb％＝(SDb/I)×100％
其中：SD-平均标准偏差；I-平均抑制率
通过对多次的批内和批间的重复实验，得到抗体包被荧光免疫分析方法检测四氯联苯的变异系数如表2所示：
表2抗原包被荧光免疫分析法检测四氯联苯的精密度实验结果
Figure BDA0002427445050000191
由上表可知，批间的变异系数相对较高，可能的原因是日间的操作对抗体抗原的反应产生的结合上的差异，而日内的差异则相对较小，所以批内误差相对较低。
试验例5
本试验例为对实施例4的特异性分析，特异性用其他相近结构物质的交叉反应来考察。将化学结构相近的其他类似物稀释成系列浓度，取代待测物质的标准溶液，按实验方法测定各自的交叉反应率，以此来评价方法的特异性。交叉反应率＝(IC50FL/IC50。其它结构类似物)×100％，IC50为最大淬灭荧光强度50％时对应的被测类似物的浓度。
如下表3所示，选择进行抗体的交叉反应实验，当四氯联苯对抗原抗体反应的抑制率为50％，四氯联苯与类似结构的PCBs单体的交叉反应率都比较低，可以认为对结果没有影响。
表3四氯联苯的结构类似物的交叉反应率
Figure BDA0002427445050000201
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种CdTe标记抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:
对硝基四氯联苯还原后，再与牛血清白蛋白进行偶联，制成四氯联苯抗原，最后对四氯联苯抗原进行动物免疫实验，制得四氯联苯抗体；
向CdTe量子点溶液中加入交联剂，并静置，然后再向其中加入四氯联苯抗体，于3-5℃反应40-60h，用磷酸盐缓冲溶液透析后，制得CdTe标记抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述四氯联苯抗原的制备具体为使半抗原、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺在N,N-二甲基甲酰胺搅拌反应6-10h，在3-5℃过夜，然后将反应产物离心分离得到上清液，与牛血清白蛋白在pH值为7-8的磷酸盐缓冲溶液中，冰浴条件下反应3-5h，之后使用生理盐水透析5-7d，得到四氯联苯抗原，其中半抗原、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和牛血清白蛋白的摩尔比为1:0.5-1:0.5-1:0.5-1；
所述动物免疫实验为选择成年健康雄性新西兰白兔，将四氯联苯抗原经过与弗氏完全佐剂充分混合后，对大白兔进行颈部和背部点状注射免疫，经过加强免疫后，采用试管法和双白琼脂扩散试验考察其抗血清效价，获得四氯联苯抗体，其中四氯联苯抗原和弗氏完全佐剂的摩尔比是1:0.5-1。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述CdTe量子点溶液的摩尔浓度为1×10-3-2×10-3mol/L；四氯联苯抗体的浓度为0.5-2.0g/L；
CdTe量子点溶液、四氯联苯抗体和交联剂的体积比为5-10:10-20:0.5-1；
优选地，所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基丁二酰亚胺溶液的混合溶液，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与所述N-羟基丁二酰亚胺摩尔比为1:(0.5-2)，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与所述N-羟基丁二酰亚胺溶液的摩尔浓度均为0.05-0.2mol/L。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，CdTe量子点溶液中CdTe量子点的制备方法，包括如下步骤：将CdCl2·2.5H2O和巯基乙酸在惰性气氛下溶于水中，调节pH值至11.5-12.5，然后加入NaHTe溶液，控制CdCl2·2.5H2O、NaHTe溶液和巯基乙酸的比例为0.02-0.6g:20-50μL:25-50μL，得到CdTe量子点前躯体；
将所述的CdTe量子点前驱体于140-160℃加热5-60min后，在依次进行冷却、洗涤和离心，制得CdTe量子点。
5.权利要求1-4所述的任一项所述的制备方法制得的CdTe标记抗体在检测四氯联苯中的应用。
6.一种利用权利要求1-4所述的任一项所述的制备方法制得的CdTe标记抗体检测四氯联苯的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：包被：以0.03-0.06mol/L pH值9-10的碳酸盐缓冲溶液将四氯联苯抗原稀释至1-10μg/mL，然后加至荧光酶标板，加入量90-120μL/孔，4-5℃过夜；
S2：封闭：将包被好的标板取出，待其恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤，然后加入卵清蛋白含量为2-4wt％的磷酸盐缓冲溶液150-250μL/孔进行封闭，最后在35-40℃温育0.5-1h；
S3：制备四氯联苯的标准抑制曲线：将封闭后的标板取出，待恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤，使用一系列标准浓度的四氯联苯标准溶液样品与CdTe标记抗体进行竞争反应，取出反应后的标板，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤，用荧光酶标仪测定荧光强度，然后根据抑制率对四氯联苯浓度作图，得到四氯联苯的标准抑制曲线；
S4：测量待测样品：重复步骤S2和步骤S3，将封闭后的板取出，待恢复至室温，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤，使用待测样品与CdTe标记抗体进行竞争反应，然后在35-40℃温育0.5-2h；取出温育后的标板，使用磷酸盐吐温缓冲溶液洗涤，用荧光酶标仪测定荧光强度，将待测样品的荧光强度代入四氯联苯的标准抑制曲线中，计算得知待测样品中四氯联苯的含量。
7.根据权利要求6所述的检测四氯联苯的方法，其特征在于，步骤S3中，一系列标准浓度的四氯联苯标准溶液样品为浓度分别为0.001mg/mL、0.0001mg/mL、0.00001mg/mL、0.000001mg/mL、0.0000001mg/mL和0.000000001mg/mL的磷酸盐缓冲溶液。
8.根据权利要求7所述的检测四氯联苯的方法，其特征在于，步骤S3中，使用一系列标准浓度的四氯联苯标准溶液样品与CdTe标记抗体进行竞争反应，包括，标板各孔依次加入50μL浓度分别为0.001mg/mL、0.0001mg/mL、0.00001mg/mL、0.000001mg/mL、0.0000001mg/mL和0.000000001mg/mL的四氯联苯标准溶液样品和50μL0.125mg/L的标记抗体，对照孔加入50μL磷酸盐缓冲溶液和50μL0.125 mg/L的标记抗体，然后在35-40℃下温育0.5-2h。
9.根据权利要求7或8所述的检测四氯联苯的方法，其特征在于，步骤S4中，所述待测样品与CdTe标记抗体进行竞争反应为，标板各孔依次加入50μL待测样品溶液和50μL经磷酸盐缓冲溶液稀释的标记抗体，对照孔加入50μL磷酸盐缓冲溶液和50μL标记抗体，然后在35-40℃下温育0.5-2h。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述荧光酶标仪的λex＝365nm，λem＝410nm；
所述磷酸盐吐温缓冲溶液为吐温-20含量为0.04-0.06wt％的磷酸盐缓冲溶液。
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