CN112578128A - 一种检测β-hCG含量直接化学发光试剂盒及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测游离β‑hCG(人绒毛膜促性腺激素)含量的磁微粒直接化学发光试剂盒及其使用方法，试剂盒包括包被链霉亲和素的磁性微球，生物素标记的β‑hCG抗体，β‑hCG标品，吖啶酯标记的具有β‑hCG不同识别位点的抗体，洗涤缓冲液，吖啶酯标抗体稀释液，标品稀释液，激发液A，含有1％‑2％的Triton X‑100和乙醇的激发液B。本发明结合了磁性微球与链霉亲和素蛋白偶联技术，生物素抗体标记技术，吖啶酯抗体标记技术，特别是对激发液成分和比例进行调试和改进后，让试剂盒具有灵敏度高、特异性强、准确性与重复性高的各种特性。此试剂盒可用来检测磁微粒的直接化学发光性能以及更好的检测游离β‑hCG(人绒毛膜促性腺激素)的含量。

Description

一种检测β-hCG含量直接化学发光试剂盒及使用方法
技术领域
本发明涉及试剂盒技术领域，具体涉及一种检测β-hCG含量直接化学发光试剂盒及使用方法。
背景技术
人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)是由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，由α和β两个亚单位以非共价键形式结合而成。分子量为36700的糖蛋白激素。hCG由胎盘和胞体滋养层细胞产生，其α亚单位与糖蛋白激素家族的其他激素(如LH、FSH和TSH)的α亚单位氨基酸系列相同，而β亚单位具有特异性。
在临床检测中，hCG主要用于诊断早孕、葡萄胎和宫外孕等。而β-hCG的检测主要用于唐氏综合征的筛查和作为肿瘤标志物用于肿瘤的筛查。hCG与β-hCG检测方法类似，多采用化学发光免疫分析法检测，也有使用放射免疫分析(RIA)法或酶联免疫吸附分析(ELISA)法测定。
吖啶酯直接化学发光系统因不需要催化剂，发光系统简单，在检测β-hCG时被广泛使用。为了更高的信噪比，一般都会在激发液中加入一些表面活性剂来增强信号，但增强剂的使用也增加了体系起泡的风险，使测试数值变异增大，体系不稳定。
对于磁微粒研发企业，一款稳定的性能稳定的化学发光试剂盒尤为重要，它是检测磁微粒性能的标尺之一。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出了一种含有全新激发液配方的检测β-hCG含量直接化学发光试剂盒及制备方法，本发明涉及的试剂盒特异性强，重复性高，可以适用各种直接化学发光仪。
本发明的技术方案如下：
一方面，本发明公开了一种检测β-hCG含量直接化学发光试剂盒，所述试剂盒包括链霉亲和素磁性微球，生物素化β-hCG抗体，β-hCG标品，吖啶酯标记的具有β-hCG不同识别位点的抗体，洗涤缓冲液，吖啶酯标记抗体稀释液，标品稀释液，激发液。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述链霉亲和素磁性微球原始浓度为10mg/ml，使用时按1：20-40进行稀释，生物素化β-hCG抗体原始浓度为1mg/ml，使用时按1：1000-2000进行稀释，吖啶酯标记β-hCG抗体原始浓度为1mg/ml，使用时按1；1000-2000稀释。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述激发液包括A液和B液；A液的组成及配制浓度为：H2O2的质量分数为1.5-3％，HNO3的浓度为0.1-0.2mol/L；B液的组成及配制浓度为：Triton X-100的质量分数为1.0-2.0％，NaOH的浓度为0.5-1.0mol/L，乙醇质量分数为1.0％-2.0％。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述洗涤缓冲液为TBST溶液，由20mM Tris，30mM NaCl，0.1％Tween 20构成。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述啶酯标记抗体稀释液和标品稀释液为含5％BSA和0.1％Tween-20的10mM PBS溶液
另一方面，本发明公开了上述检测β-hCG含量直接化学发光试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1、将所述链霉亲和素磁性微球、生物素化β-hCG抗体、吖啶酯标记β-hCG抗体稀释至上述的使用浓度；即
S2、在反应管里加入链霉亲和素磁性微球、生物素抗体、标品、吖啶酯抗体，混合均匀，在37℃孵育20min，形成磁性微球-标品复合物；
S3、孵育结束后，用洗涤缓冲液将磁性微球-标品复合物清洗3遍；
S4、洗涤完成后每个反应管加激发液，在化学发光仪上读值。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S2具体包括在反应管里加入50μl链霉亲和素磁性微球，50u1生物素抗体，20u1标品，50ul吖啶酯抗体，混合均匀，37℃孵育20min，形成磁性微球-标品复合物。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S4中在每个反应管加激发液的具体步骤包括：洗涤完成后每管加激发液A液100ul，后每管泵B液100ul。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明提供一款的检测β-hCG含量直接化学发光试剂盒。本试剂盒能够准确测试磁珠的化学发光性能，而且适用性强，还可以大大减少外购试剂盒和委托检测的费用，为企业节省研发成本；
2)本发明以双抗夹心直接化学发光免疫检测法为基础，选择合适的抗体对来配制的β-hCG化学发光试剂盒。用质控链霉亲和素磁性微球检测标准曲线有良好线性，R2≥0.99，S1/S0＞2.6，S6/S0＞500，相同样品检测10次CV值≤10％。可以很好的评价磁微粒原料。
附图说明
图1为本发明实施例提供的不同稀释比例吖啶酯抗体发光值均值比较；
图2为本发明实施例提供的β-hCG直接化学发光标准曲线。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均可从正规渠道商购获得。
下面结合附图详细说明本发明的优选实施方式。
本发明公开了一种检测β-hCG含量直接化学发光试剂盒，所述试剂盒包括链霉亲和素磁性微球，生物素化β-hCG抗体，β-hCG标品，吖啶酯标记的具有β-hCG不同识别位点的抗体，洗涤缓冲液，吖啶酯标记抗体稀释液，标品稀释液，激发液。
其中，链霉亲和素磁性微球为粒径1μm的SA beads，或者需要检测的其他链霉亲和素磁性微球。
链霉亲和素磁性微球原始浓度为10mg/ml，使用时按1∶20-40进行稀释，生物素化β-hCG抗体原始浓度为1mg/ml，使用时按1∶1000-2000进行稀释，吖啶酯标记β-hCG抗体原始浓度为1mg/ml，使用时按1；1000-2000稀释。
优选地，激发液包括A液和B液；A液的组成及配制浓度为：H2O2的质量分数为1.5-3％，HNO3的浓度为0.1-0.2mol/L；B液的组成及配制浓度为：Triton X-100的质量分数为1.0-2.0％，NaOH的浓度为0.5-1.0mol/L，乙醇质量分数为1％-2％。
在本发明实施例中，洗涤缓冲液为TBST溶液，由20mM Tris，30mM NaCl，0.1％Tween 20构成。
洗涤缓冲液的配置包括以下步骤：先配置2L 5×的母液TBS溶液：称取24.228gTris粉末，17.532g NaCl粉末，置于一个带磁力搅拌子的2L烧杯中；倒入1600mL纯化水，将烧杯置于磁力搅拌器上，调节转速，室温搅拌至粉末试剂完全溶解；插入pH计电极，逐滴加入1M盐酸，调至pH＝8.0±0.1，室温(25℃)旋转搅拌3分钟；最后用容量瓶定容到2L。
其中，吖啶酯标记抗体稀释液和标品稀释液为PBST。
本发明公开了上述检测β-hCG含量直接化学发光试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1、将所述链霉亲和素磁性微球、生物素化β-hCG抗体、吖啶酯标记β-hCG抗体稀释至上述的使用浓度；即
S2、在反应管里加入链霉亲和素磁性微球、生物素抗体、标品、吖啶酯抗体，混合均匀，在37℃孵育20min，形成磁性微球-抗体-标品复合物；
S3、孵育结束后，用洗涤缓冲液将磁性微球-抗体-标品复合物清洗3遍；
S4、洗涤完成后每个反应管加激发液，在化学发光仪上读值。
其中，步骤S2具体包括在反应管里加入50μl链霉亲和素磁性微球，50ul生物素抗体，20ul标品，50ul吖啶酯抗体，混合均匀，37℃孵育20min，形成磁性微球-标品复合物。
其中，步骤S4中在每个反应管加激发液的具体步骤包括：洗涤完成后每管加激发液A液100ul，后每管泵B液100ul。
在前期试剂的准备中，生物素化β-hCG抗体标记方法具体包括以下步骤：
所述生物素化β-hCG抗体标记由以下步骤制备得到：将500μgβ-hCG抗体加到超滤管中4℃、12000转离心，10min/次，反复三次，除净原有缓冲液后，加入500μ LPBS，放置冰浴中；将3.1mg sulfo-NHS-Biotin溶于700μL无水DMF中，得10mM Biotin/DMF溶液；向抗体溶液中加入16.7μL 10mM Biotin/DMF溶液，快速混匀，冰上反应2h；反应结束后，将反应液4℃、12000转离心，10min/次，反复三次，除尽未反应的及水解的biotin等小分子；加入500μLPBS，反复吹打10min，取出，以每管50μL进行分装，4℃保存。
吖啶酯标记β-hCG抗体方法具体包括以下步骤：
β-hCG抗体标记吖啶酯方法如下：将500μg antibody加到超滤管中4℃、12000转离心，10min/次，反复三次，除净原有buffer后，加入500μLCBS，放置冰浴中；将1mg吖啶酯(NSP-DMAE-NHS)溶于500μL无水DMF中，得2mg/ml溶液；向抗体溶液中加入10μL2mg/ml NSP-DMAE-NHS/DMF溶液，快速混匀，室温避光孵育2h；反应结束后，将反应液4℃、12000转离心，10min/次，反复三次，除尽未反应的及水解的NSP-DMAE-NHS等小分子；加入250μLPBS，反复吹打10min，取出，再加入250μL甘油，以每管50μL进行分装，4℃保存。
β-hCG标准抗原采购自fitzgerald，浓度依次为4000，2000，500，100，20，10，0mIU/ml。用PBST稀释。
先配置2L 5×的母液TBS溶液：称取24.228g Tris粉末，17.532g NaCl粉末，置于一个带磁力搅拌子的2L烧杯中；倒入1600mL纯化水，将烧杯置于磁力搅拌器上，调节转速，室温搅拌至粉末试剂完全溶解；插入pH计电极，逐滴加入1M盐酸，调至pH＝8.0±0.1，室温(25℃)旋转搅拌3分钟；最后用容量瓶定容到2L。取一经过灭菌、洁净处理的2L蓝盖试剂瓶，装上抽滤器和0.22μm过滤膜，将溶液加入到抽滤器中进行过滤。最后在蓝盖瓶身上贴上标签。使用是时稀释5倍，并加入0.1％的Tween 20。
激发液的配制
吖啶酯作为一种重要的化学发光试剂，在化学发光发光免疫分析中有着重要的作用。其发光为闪光型，发光快速集中且强度大，方便实现快速检测，并且对于仪器的要求相对简单，便于实现全自动化操作。以上优点使得吖啶酯直接化学发光系统得到了广泛的应用。为了使吖啶酯的发光效率最大化，激发液的成分和比例也要反复测试。最优的激发液不仅要增强吖啶酯的发光能力，还要使整个发光体系保持稳定。所以本发明在激发液里，添加了增强剂和稳定剂。最后本发明确定激发液为A液：H2O2的质量分数为1.5％，HNO3的浓度为0.1mol/L；B液：Triton X-100的质量分数为1.0％，NaOH的浓度为0.8mol/L，乙醇的质量分数为2％。其中Triton X-100为增强剂，乙醇为消泡剂即稳定剂。经测试，此配方能使吖啶酯发光值达到较高水平，且发光体系保持稳定。
需要说明的是，本发明选择了Meridian的鼠抗人Anti-β-hCG单克隆抗体对，并按其推荐，选择货号E86820M的抗体来进行生物素标记，选择货号E86308M的抗体来进行吖啶酯标记。
本发明选择截留分子量为50KD的Millpore
Figure BDA0002811602250000071
Ultra-4滤管来进行去除游离生物素。把反应溶液4℃、12000转离心，10min/次，反复三次，即可除尽未反应的及水解的biotin等小分子。此方法不仅操作简便，节约时间，而且损失很少。
具体例
实例1：β-hCG抗体标记生物素
试剂耗材：
1.PBS：10mM PBS，pH7.4
2.无水DMF(使用前一天先除水)
3.Sulfo-NHS-Biotin(BBI Life sciences)C100213 50mg粉末
4.Monoclonal Antibody to β-hCG：Meridian货号E86308M浓度5.3mg/ml
5.超滤管Millpore
Figure BDA0002811602250000081
Ultra-4MWCO为50KD。超滤管使用前需无菌PBS进行预清洗。超滤离心管中的滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。
6.分子筛，5A型，3-5mm。
实验步骤：
1.将超滤管用无菌PBS预清洗几次。提前打开制冰机，准备冰盒。提前把Sulfo-NHS-Biotin从-20℃取出，平衡至室温，防止称量时水吸附。
2.将95μL antibody(E86308M，5.3mg/mL)加在405μL PBS中即稀释到1mg/m1，超滤管中4℃、9000转离心，10min/次，反复三次，后两次每次加入500μLPBS再离心，除净原有buffer后，加入500μLPBS，放置冰浴中；
3.将3.1mg sulfo-NHS-Biotin溶于700μL无水DMF中，得10mM Biotin/DMF溶液。
4.按生物素的量为抗体的50倍计算，向抗体溶液中加入16.7μL10mM Biotin/DMF溶液，快速混匀，冰上反应2h；
5.反应结束后，将反应液4℃、10000转离心，10min/次，反复三次，除尽未反应的及水解的biotin等小分子；
6.加入500μLPBS，反复吹打10min，取出，以每管50μL进行分装，4℃保存。超滤管里继续加500μLPBS保持润湿，防止抗体没有吹出来。
实例2：β-hCG抗体标记吖啶酯
试剂耗材
1.偶联缓冲液：：0.05mol/L pH 9.6的CBS(Na2 CO3-NaHCO3缓冲液)。
2.无水DMF(最好使用前一天先除水)，除水方法参照分子筛使用方法。
3.吖啶酯(NSP-DMAE-NHS)：苏州亚科货号Y0266，10mg/管。
4.Monoclonal Antibody to β-hCG：Meridian货号E86308M浓度5.9mg/ml
5.超滤管Millpore
Figure BDA0002811602250000091
Ultra-4MWCO为50KD。超滤管使用前需无菌PBS进行预清洗。
超滤离心管中的滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。
7.分子筛，5A型，3-5mm。
实验步骤
1.准备无菌CBS，将超滤管用无菌CBS预清洗几次，将吖啶酯从冰箱取出恢复至室温。
2.取85μL抗体(500μg)，加在415μLCBS中，超滤管中4℃、9000转离心，10min/次，反复三次，离心除去原缓冲液后，加500μL0.5mol/lpH 9.5的CBS，调整抗体浓度为1mg/ml。
3.取1mg吖啶酯溶于500μL无水二甲基甲酰胺(DMF)中配成浓度为2mg/ml的母液。(EP管预先包上锡箔纸)
4.将整根超滤管包上锡箔纸，按抗体与吖啶酯摩尔比例1：10加入10μL吖啶酯母液，吹打混匀，室温避光反应1.5h。
5.反应结束后将反应液在超滤管中4℃、10000转离心，10min/次，反复三次，除尽未反应的及水解的小分子。
6.加入250μLPBS，反复吹打10min，取出后加等量甘油，以每管50μL进行分装，-20℃避光保存。
实例3：吖啶酯标记抗体测试及优化后激发液测试
吖啶酯抗体稀释：1*PBS含0.1％Tween 20(1∶1000 1∶2000 1∶5000)
激发液：A液：H2O2的质量分数为1.5％，HNO3的浓度为0.1mol/L；
B液：Triton X-100的质量分数为1.0％，NaOH的浓度为0.4mol/L，乙醇的质量分数为2％。
1.将吖啶酯抗体按1∶1000 1∶2000，1∶5000稀释，取若干个流式管，每管加5微升吖啶酯抗体，后每管加A液100ul。
2.打开直接化学发光仪(Berthold)，将泵1接口放入B液中，双击打开“FB12Sirius”软件，点击选择“Single Assay”，确保仪器中放有试管，点击软件界面右上方“Priming injectors”，点击“Prime”按钮，泵入370ul x 2次B液(已设置好)，使B液充满管路。
3.测量，点击程序“Sirius”(已设置好程序)，进入测量界面，设置好测量管数，及每管重复数，不可跳，不可更改，每管B液泵100ul，空管(加100ul A液)测三次，空管数值为1000以下。读值(将试管放入仪器内，关上门即开始泵B液并读数)，将结果导出Excel表格。
4.测量结束水洗两次、空洗一次，仪器内要放置一个空管。
结果如下：
Figure BDA0002811602250000101
Figure BDA0002811602250000111
表一：吖啶酯标记抗体用不同激发液化学发光测值。
如图1和表一所示，不同稀释比例吖啶酯抗体发光值均值比较。
结果表明：抗体吖啶酯已经标记上，且标记效率较好。优化后激发液发光值大大提高，且比较稳定。
实例4：链霉亲和素磁性微球试用此化学发光试剂盒
实验试剂：
Wash Buffer：TBST缓冲液(20mM Tris 30mM NaCl 0.1％Tween 20)
吖啶酯抗体稀释：1*PBS含0.1％Tween 20(1：1000)
生物素化抗体稀释：1*PBS含0.1％Tween 20，1：2005ug/ml
标准品稀释：1*PBS含0.1％Tween 20，稀释成0，5，20，100，500，2000，4000mIU/ml。
激发液：A液：H2O2的质量分数为1.5％，HNO3的浓度为0.1mol/L；
B液：Triton X-100的质量分数为1.0％，NaOH的浓度为0.4mol/L，乙醇的质量分数为2％。
SA磁珠：Dynal T1。
实验步骤：
1.SA磁珠1：40稀释，6*3＝18管，每管50ul，需900ul，配1ml。取25ul SA beads，洗两次，用PBST稀释到1ml，得到0.25mg/ml的磁珠悬液。
2.配制标准品：取5.2u1标品原液，稀释到1ml，得到160ng/ml标品，并以此梯度稀释，得到各浓度体积为500ul的标品。
3.生物素化抗体稀释：取5ul β-hCG生物素标记抗体用PBST稀释到1ml。
4.吖啶酯抗体稀释：取1ul β-hCG吖啶酯抗体用PBST稀释到1ml。
5.准备18个流式管，做好标记，各加50ul磁珠，50ul生物素抗体，20ul标品，50ul吖啶酯抗体。
6.混合均匀，37℃孵育20min。
7.孵育时间到后，300ul PBST每管洗3遍，洗的过程磁吸3min。
8.洗涤完成后每管加A液100ul。
9.打开直接化学发光仪(Berthold)，将泵1接口放入B液中，双击打开“FB12Sirius”软件，点击选择“Single Assay”，确保仪器中放有试管，点击软件界面右上方“Priming injectors”，点击“Prime”按钮，泵入370ul x 2次B液(已设置好)，使B液充满管路。空管(加100ul A液)测三次，空管数值为1000以下。
10.测量，点击程序“Sirius”(已设置好程序)，进入测量界面，设置好测量管数，及每管重复数，不可跳，不可更改，每管B液泵100ul，读值(将试管放入仪器内，关上门即开始泵B液并读数)，将结果导出Excel表格。
11.测量结束水洗两次、空洗一次，仪器内要放置一个空管。
结果如下：
表二：不同浓度标准品对应的发光值。
Figure BDA0002811602250000121
Figure BDA0002811602250000131
表三：不同浓度标准品的分离度。
分离度 Dynal(T1)
S1/S0 6.687
S2/S0 13.707
S3/S0 55.831
S4/S0 285.207
S5/S0 820.748
S6/S0 1284.190
如图2所示，结果表明：β-hCG直接化学发光检测试剂盒标准曲线有良好线性，R2≥0.99，S1/S0＞2.6，S6/S0＞500，是成熟稳定的化学发光检测试剂盒。可以通过与对照链霉亲和素磁性微球的比较，来评价待试用的其他链霉亲和素磁性微球的化学发光性能
本发明以双抗夹心直接化学发光免疫检测法为基础，选择合适的抗体对来配制的β-hCG化学发光试剂盒。用质控链霉亲和素磁性微球检测标准曲线有良好线性，R2≥0.99，S1/S0＞2.6，S6/S0＞500，相同样品检测10次CV值≤10％。可以很好的评价磁微粒原料。
以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种检测β-hCG含量直接化学发光试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括链霉亲和素磁性微球，生物素化β-hCG抗体，β-hCG标品，吖啶酯标记的具有β-hCG不同识别位点的抗体，洗涤缓冲液，吖啶酯标记抗体稀释液，标品稀释液，以及优化的激发液。
2.根据权利要求1所述的检测β-hCG含量直接化学发光试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素磁性微球原始浓度为10mg/ml，使用时按1：20-40进行稀释，生物素化β-hCG抗体原始浓度为1mg/ml，使用时按1：1000-2000进行稀释，吖啶酯标记β-hCG抗体原始浓度为1mg/ml，使用时按1；1000-2000稀释。
3.根据权利要求1所述的检测β-hCG含量直接化学发光试剂盒，其特征在于，所述激发液包括A液和B液；A液的组成及配制浓度为：H2O2的质量分数为1.5-3％，HNO3的浓度为0.1-0.2mol/L；B液的组成及配制浓度为：NaOH的浓度为0.5-1.0mol/L，Triton X-100的质量分数为1.0-2.0％，乙醇质量分数为1.0％-2.0％。
4.根据权利要求1所述的检测β-hCG含量直接化学发光试剂盒，其特征在于，所述洗涤缓冲液为TBST溶液，由20mM Tris，30mM NaCl，0.1％Tween 20构成。
5.根据权利要求1所述的检测β-hCG含量直接化学发光试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯标记抗体稀释液和标品稀释液为含5％BSA和0.1％Tween-20的10mM PBS溶液。
6.一种检测β-hCG含量直接化学发光试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将所述链霉亲和素磁性微球、生物素化β-hCG抗体、吖啶酯标记β-hCG抗体稀释至权利要求2所述的使用浓度；
S2、在反应管里加入链霉亲和素磁性微球、生物素抗体、标品、吖啶酯抗体，混合均匀，在37℃孵育20min，形成磁性微球-抗体-标品复合物；
S3、孵育结束后，用洗涤缓冲液将磁性微球-抗体-标品复合物清洗3遍；
S4、洗涤完成后每个反应管加激发液，在化学发光仪上读值。
7.根据权利要求6所述的检测β-hCG含量直接化学发光试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括在反应管里加入50μl链霉亲和素磁性微球，50ul生物素抗体，20ul标品，50ul吖啶酯抗体，混合均匀，37℃孵育20min，形成磁性微球-抗体-标品复合物。
8.根据权利要求6所述的检测β-hCG含量直接化学发光试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤S4中在每个反应管加激发液的具体步骤包括：洗涤完成后每管加激发液A液100ul，后每管泵B液100ul。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114280289A (zh) * 2021-12-20 2022-04-05 南京诺唯赞医疗科技有限公司 一种磁微粒化学发光检测试剂盒及其检测方法
CN115436621A (zh) * 2022-09-29 2022-12-06 江苏奥雅生物科技有限公司 一种吖啶酯抗体结合物的稀释液
CN116068206A (zh) * 2023-03-15 2023-05-05 安徽惠邦生物工程有限公司 一种髓鞘碱性蛋白检测试剂盒及其检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000111552A (ja) * 1998-09-30 2000-04-21 Dainichiseika Color & Chem Mfg Co Ltd β−ｈＣＧの免疫学的測定方法
JP2007003412A (ja) * 2005-06-24 2007-01-11 Sekisui Chem Co Ltd 生物学的測定方法
CN105158235A (zh) * 2014-06-06 2015-12-16 厦门万泰凯瑞生物技术有限公司 一种吖啶酯增强发光系统
CN107796803A (zh) * 2017-11-03 2018-03-13 太原瑞盛生物科技有限公司 一种游离β人绒毛膜促性腺激素的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法
CN109709336A (zh) * 2018-12-26 2019-05-03 张嘉庆 一种血管内皮生长因子的检测试剂盒及检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000111552A (ja) * 1998-09-30 2000-04-21 Dainichiseika Color & Chem Mfg Co Ltd β−ｈＣＧの免疫学的測定方法
JP2007003412A (ja) * 2005-06-24 2007-01-11 Sekisui Chem Co Ltd 生物学的測定方法
CN105158235A (zh) * 2014-06-06 2015-12-16 厦门万泰凯瑞生物技术有限公司 一种吖啶酯增强发光系统
CN107796803A (zh) * 2017-11-03 2018-03-13 太原瑞盛生物科技有限公司 一种游离β人绒毛膜促性腺激素的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法
CN109709336A (zh) * 2018-12-26 2019-05-03 张嘉庆 一种血管内皮生长因子的检测试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
滕文锋 等: "《检验仪器分析技术》", 人民军医出版社, pages: 172 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114280289A (zh) * 2021-12-20 2022-04-05 南京诺唯赞医疗科技有限公司 一种磁微粒化学发光检测试剂盒及其检测方法
CN114280289B (zh) * 2021-12-20 2023-10-10 南京诺唯赞医疗科技有限公司 一种磁微粒化学发光检测试剂盒及其检测方法
CN115436621A (zh) * 2022-09-29 2022-12-06 江苏奥雅生物科技有限公司 一种吖啶酯抗体结合物的稀释液
CN116068206A (zh) * 2023-03-15 2023-05-05 安徽惠邦生物工程有限公司 一种髓鞘碱性蛋白检测试剂盒及其检测方法

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