CN103308677A - 一种雌二醇纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种雌二醇纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒,所述试剂盒包括:雌二醇校准品;偶联有链霉亲和素的纳米磁微粒悬浮液;生物素标记的雌二醇抗体;雌二醇抗体酶结合物,所用的酶为辣根过氧化物酶,辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0,活性≥250U/mL;雌二醇质控品;化学发光液A液和B液;20倍浓缩洗液;反应管。另外本发明还公开了本发明试剂盒的制备方法。本发明试剂盒与现有试剂盒相比操作简便,安全无环境污染。此外,本发明还具有稳定性好、成本低、检测范围宽等优点。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析医学领域,具体的,本发明提供了一种雌二醇(Estradiol)纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
雌二醇(E2),雌激素主要来源于卵泡内膜细胞和卵泡颗粒细胞。在卵泡发育过程中,先经促黄体生成素(LH)刺激卵泡内膜分泌睾酮,再经颗粒细胞在促卵泡激素(FSH)刺激下转化为雌二醇,雌二醇是妇女体内生物活性最强的雌激素。雌二醇值增高的病理病因1)卵巢疾患:卵巢颗粒层细胞瘤、卵巢胚瘤、卵巢脂肪样细胞瘤、性激素生成瘤等,均表现卵巢功能亢进,雌二醇分泌量增加。2)心脏病:心肌梗塞、心绞痛、冠状动脉狭窄。3)其它:系统性红斑狼疮、肝硬化、男性肥胖症。雌二醇降低的病理原因1)卵巢疾病:卵巢缺如或发育低下,原发性卵巢衰竭、卵巢囊肿。2)垂体性闭经或不孕。3)其它:甲低或甲亢、柯兴氏综合征、阿狄森氏病、恶性肿瘤、较大范围的感染、肾功能不全、脑及垂体的局灶性病变等。
目前常用的检测雌二醇的方法有:
(1)放射免疫分析技术(RIA):较早的临床定量检测方法,灵敏度高,特异性高,但因为有放射性污染,且操作繁琐,市场逐渐萎缩。
(2)酶联免疫分析法(ELISA):RIA之后出现的分析方法,因操作简单,无放射性污染,价格较低,现在有一定的市场占有率,但ELISA灵敏度不如RIA。
(3)化学发光免疫分析(CLIA):CLIA为当今最为敏感的微量免疫测定法,具有灵敏度高、稳定性好,无污染等优点,目前以广泛应用到基础和临床医学的各个领域,但是多以化学发光板为载体,检测的灵敏度和准确度还是不高。
目前已有多件磁微粒化学发光方法检测雌二醇的专利申请,如申请号(200910200391)的专利申请是化学发光板的方法,板间差异较大,申请号(201110227587和201110257932)的专利申请使用的是微米级磁微粒,检测灵敏度较低。
发明内容
本发明要解决的问题是提供雌二醇的化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法,避免了放射性免疫分析的试剂有效期短、存在放射性污染、操作繁琐等缺点,且解决了灵敏度低,检测范围窄,成本高的缺陷。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:雌二醇纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒,包括:雌二醇校准品;偶联有链霉亲和素的纳米磁微粒悬浮液;生物素标记的雌二醇抗体;雌二醇酶结合物,所用的酶为辣根过氧化物酶,辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0,活性≥250U/mL;雌二醇质控品;化学发光液A液和B液;20倍浓缩洗液;反应管。
进一步,所述的发光液A液的主要成分为鲁米诺,B液的主要成分是过氧化脲;A液中鲁米诺的质量-体积浓度为0.7g/L,B液中过氧化脲的质量-体积浓度为0.675g/L。
进一步,所述的纳米磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁,粒径0.3-0.5um。
进一步,所述的雌二醇质控品包括低值质控品和高值质控品,低值质控品的浓度是10pg/mL、高值质控品的浓度是500pg/mL。
进一步,所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。
试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
(1)雌二醇校准品的配制:
将雌二醇抗原用含1%牛血清白蛋白(BSA)的校准品稀释液配制成校准品浓储液,以国家校准品进行定标,将校准品浓储液用校准品稀释液稀释至工作浓度,分别为0,30,100,300,1000,3500pg/mL;
(2)雌二醇质控品的配制:
用校准品稀释液将上述(1)配制的校准品浓储液分别稀释至10pg/mL和500pg/mL;10pg/mL作为低值质控品,500pg/mL作为高值质控品;
(3)纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备,配制1L:
A、四氧化三铁纳米磁微粒制备
采用沉淀法制备四氧化三铁纳米磁微粒,具体制备方法如下:1)将FeCl3·6H2O和FeCl2.4H2O以摩尔比2:1加入到蒸馏水中,剧烈搅拌溶解;2)在氮气氛下加0.5M氨水于上述铁盐溶液中,调pH9-10,反应温度65℃,反应时间45min;3)反应结束后,用蒸馏水洗涤至中性,弃上清,于60℃烘干,即得10-50nm的四氧化三铁纳米磁微粒;
B、纳米磁珠表面羧基的偶联
采用分散聚合法进行偶联,具体制备方法如下:取上述制备的纳米磁微粒超声分散在10%聚乙二醇(PEG8000)溶液中,得磁流体溶液,向磁流体溶液中按体积比1:10加入无水乙醇,搅拌30min后,移入带有搅拌器,冷凝管,氮气入口的三颈瓶中,加入交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺,用量不能超过磁流体的5%;在氮气的保护下,升温至60±1℃,恒温搅拌30min,之后依次加入过氧化苯甲酰、苯乙烯、丙烯酸,过氧化苯甲酰用量为磁流体用量3%,苯乙烯体积同磁流体溶液,丙烯酸体积为磁流体溶液的1/4,搅拌速度约为500rpm保持氮气气流,其余与上述条件保持不变,反应8-10h,所得产物静置,用蒸馏水反复洗涤,再用盐酸调节pH=1,浸泡24h,静置;再用蒸馏水反复洗涤,除去未包覆的Fe3O4磁粉,把沉淀下来的产品放入真空干燥箱中50℃下干燥24h,得到表面联有羧基的纳米磁微粒;
C、纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备,配制1L,方法如下:
取100mL0.1M2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液,加入10mg表面联有羧基的纳米磁微粒,室温搅拌40min,之后加入3.5mg链霉亲和素,然后加入8mg/mL碳二亚胺(EDC)溶液,2-8℃反应1h后,用0.01M PBS缓冲液洗涤3次,最后用0.01M PBS定溶至1L即可;
(4)生物素标记的雌二醇抗体的制备
取1mg雌二醇抗体,用硼酸盐缓冲液在2~8℃下透析1~3h;将透析后的抗体加入55ug生物素,同时加入二甲基亚砜,使二甲基亚砜最终质量浓度为5-10%,2-8℃缓慢振荡,避光反应2h;在上述溶液中加入250uL1M氯化铵溶液,常温避光反应45min;用0.01M PBS溶液在2~8℃下透析2天,期间换液3次;
(5)雌二醇抗原酶结合物的制备
A、酶稀释液配制:其成分包括5g/LMES,10mL/L2M NaOH,15g/L NaCl,10g/LBSA,5g/L Dextran T-2000,1.05g/L Triton X-100,2.5mL/L硫酸庆大霉素,1mL/L胭脂红,2g/LTween20,1mL/L ProClin300;
B、采用改良高碘酸钠氧化法将雌二醇抗原与辣根过氧化物酶进行偶联后,用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:4500,并加入12%酶稳定剂,储存于2~8℃;
改良过碘酸钠氧化法步骤包括:
A:HRP活化
1)配置10mg/mL HRP溶液;
2)配置12.8mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液;
3)将上述1)和2)配制溶液按体积比1:1混匀,4℃避光反应30min;
4)配置浓度为20uL/mL的乙二醇水溶液,与上述溶液3)以相同体积混合,常温避光反应20min,活化即完成,放-20℃保存(保存时间不超过3个月)。
B、雌二醇抗原标记
1)将待标记原料装入透析袋中,用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液,透析30min;
2)将标记原料与活化的HRP按质量比1:2进行混合,之后用0.05M碳酸盐缓冲液于4℃透析24h(期间换液2-3次);
3)配置浓度为2mg/mL的NaBH4水溶液,按1mgHRP加80uL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合,并于4℃避光反应2h;
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01M PBS于4℃透析24h,加入等体积甘油,-20℃保存。
(6)20倍浓缩洗液的配制
20倍浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠,5.92g/L磷酸二氢钠,180g/L NaCl,10mL/LTween-20和2%Proclin300;
(7)化学发光液A液和B液的配制
A液为0.7g/L鲁米诺,0.165g/L对碘酚,缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl,避光保存;B液为0.675g/L过氧化脲,用工艺用水配制;A液和B液在使用前5min混合;
(8)组装:将上述试剂组装成盒,储存于2~8℃;
(9)对采用该方法制备的试剂盒进行物理检查,对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品浓度和稳定性进行测定。
本发明的原理是,本试剂盒采用竞争法原理测定血清或血浆中的雌二醇,血样中的雌二醇与酶标雌二醇竞争数量有限的生物素-雌二醇抗体,该抗体与纳米磁微粒链霉亲和素结合,纳米磁微粒在外加磁场中直接沉淀,将免疫反应形成的纳米磁微粒-亲和素-生物素-雌二醇抗体-雌二醇-HRP复合物与未结合的其它物质分离。洗掉游离成分,加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解,形成不稳定的激发态中间体,当激发态中间体回到基态时便发出光子,于第5分钟测定各加样孔的发光值RLU。样本中的雌二醇浓度依据由校准品雌二醇浓度和对应的RLU建立的Log(X)-Logit(Y)数学模型进行定量,从而检测人血清、血浆中的雌二醇含量。
本专利发明的雌二醇纳米磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒,具有以下优点:
(1)以纳米磁微粒(直径20-50nm)作为载体,相比微米级磁微粒具有更高的比表面积,大大增加了抗原、抗体的接触面积及底物发光面积,加之旋转磁场的灵活应用,较之酶标板或化学发光板、微米级磁微粒载体具有更高的灵敏度、更快的检测速度和更好的重复性;分析灵敏度高,本产品的分析灵敏度不低于10pg/mL。
(2)检测范围宽,0-3500pg/mL;
(3)使用单克隆抗体,提高了反应的特异性,与雌三醇(E3)、睾酮(P)、孕酮(P)的交叉反应系数小于1%。
(4)精密度好,本产品批内不精密度不高于5%,批间不精密度不高于10%。
(5)链酶亲和素与生物素级联放大体系,纳米磁微粒联链霉亲和素,生物素联单克隆抗体,较磁珠直接联雌二醇抗体,大大提高了反应效率,操作简单,产品易得,同时增加了试剂盒的有效期,经37℃加速稳定性及2~8℃真实稳定性试验证实,本产品在37℃可存放7天以上,在2~8℃可存放2年,稳定性良好,测值上更精确,检测范围更宽(0-3500pg/mL)。
(6)成本低,与市场上同类产品比较,本试剂盒性能良好,成本低,具有临床应用价值。
附图说明
图1是本发明的试剂盒测定雌二醇与雅培试剂盒测定雌二醇的测定结果比较图,其中纵坐标为本发明试剂盒测得的雌二醇值,横坐标为雅培测定雌二醇值,两种方法相关系数(r)=0.9780,直线方程y=0.9573x+10.848.
具体实施方式
实施例1:制备雌二醇磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒
(1)雌二醇校准品的配制:
将雌二醇抗原(Fitzgerald公司生产)用含1%牛血清白蛋白(BSA)的校准品稀释液配制成校准品浓储液,以国家校准品(批号:100182-200404,规格:100mg/支)进行定标,将校准品浓储液用校准品稀释液稀释至工作浓度,分别为0,30,100,300,1000,3500pg/mL;
(2)雌二醇质控品的配制:
用校准品稀释液将上述(1)配制的校准品浓储液分别稀释至10pg/mL和500pg/mL;10pg/mL作为低值质控品,500pg/mL作为高值质控品;
(3)纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备,配制1L:
A、四氧化三铁纳米磁微粒制备
采用沉淀法制备四氧化三铁纳米磁微粒,具体制备方法如下:1)将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O以摩尔比2:1加入到蒸馏水中,剧烈搅拌溶解;2)在氮气氛下加0.5M氨水于上述铁盐溶液中,调pH9-10,反应温度65℃,反应时间45min;3)反应结束后,用蒸馏水洗涤至中性,弃上清,于60℃烘干,即得10-50nm的四氧化三铁纳米磁微粒;
B、纳米磁珠表面羧基的偶联
采用分散聚合法进行偶联,具体制备方法如下:取上述制备的纳米磁微粒超声分散在10%PEG8000溶液中,得磁流体溶液,向磁流体溶液中按体积比1:10加入无水乙醇,搅拌30min后,移入带有搅拌器,冷凝管,氮气入口的三颈瓶中,加入交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺,用量不能超过磁流体的5%;在氮气的保护下,升温至60±1℃,恒温搅拌30min,之后依次加入过氧化苯甲酰、苯乙烯、丙烯酸,过氧化苯甲酰用量为磁流体用量3%,苯乙烯体积同磁流体溶液,丙烯酸体积为磁流体溶液的1/4,搅拌速度约为500rpm保持氮气气流,其余条件保持不变,反应8-10h,所得产物静置,用蒸馏水反复洗涤,再用盐酸调节pH=1,浸泡24h,静置;再用蒸馏水反复洗涤,除去未包覆的Fe3O4磁粉,把沉淀下来的产品放入真空干燥箱中50℃下干燥24h,得到表面联有羧基的纳米磁微粒;
C、纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备,配制1L,方法如下:
取100mL0.1M MES缓冲液,加入10mg表面联有羧基的纳米磁微粒,室温搅拌40min,之后加入3.5mg链霉亲和素,然后加入8mg/mLEDC溶液,2-8℃反应1h后,用0.01M PBS缓冲液洗涤3次,最后用0.01M PBS定溶至1L即可;
(4)生物素标记的雌二醇抗体的制备
取1mg雌二醇抗体(Fitzgerald公司生产),用硼酸盐缓冲液在2~8℃下透析1~3h;将透析后的抗体加入55ug生物素,同时加入二甲基亚砜,使二甲基亚砜质量终浓度为5-10%,2-8℃缓慢振荡,避光反应2h;在上述溶液中加入250uL1M氯化铵溶液,常温避光反应45min;用0.01M PBS溶液在2~8℃下透析2天,期间换液3次;
(5)雌二醇抗原酶结合物的制备
A、酶稀释液配制:其成分包括5g/LMES,酶稀释液中包括10mL/L2M NaOH,15g/LNaCl,10g/LBSA,5g/L葡聚糖T-2000(Dextran T-2000)(购自Sigma公司),1.05g/L聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)(购自Sigma公司),2.5mL/L硫酸庆大霉素,1mL/L胭脂红(胭脂红为粉末固体,配制成浓度40mg/mL以后使用),2g/L Tween-20(购自Sigma公司),1mL/L ProClin300(购自Sigma公司);
B、采用改良高碘酸钠氧化法将雌二醇抗原与辣根过氧化物酶进行偶联后,用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:4500,并加入12%酶稳定剂,储存于2~8℃;
(6)20倍浓缩洗液的配制
20倍浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠,5.92g/L磷酸二氢钠,180g/L NaCl,10mL/LTween-20和2%Proclin300;
(7)化学发光液A液和B液的配制
A液为0.7g/L鲁米诺,0.165g/L对碘酚,缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl,避光保存;B液为0.675g/L过氧化脲,用工艺用水配制;A液和B液在使用前5min混合;
(8)组装:将上述试剂组装成盒,储存于2~8℃;
(9)对采用该方法制备的试剂盒进行物理检查,对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品浓度和稳定性进行测定。
实施例2:本发明试剂盒的检查
(1)物理检查:液体组分应澄清,无沉淀或絮状物;其他组分应无包装破损。
(2)准确性:试剂盒校准品与企业标准品系列同时进行分析测定,用双对数数学模型拟合,要求两条剂量-反应曲线不明显偏离平行(t检验,|t|<2.447);以雌二醇企业标准品为对照品,对本试剂盒校准品进行测值,实测值与标示值比值的平均值应在0.90~1.10范围内。
(3)剂量-反应曲线的线性:用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合,剂量-反应曲线在10-3000pg/mL浓度范围内,相关系数r绝对值不低于0.9900。
(4)分析灵敏度:试剂盒分析灵敏度不高于10pg/mL。
(5)精密度:10孔平行测定高值和低值质控品,计算测定结果的平均浓度与标准差(SD),批内不精密度使用3批产品进行3次试验,计算测定结果的平均浓度与标准差(SD),批间不精密度结果应符合批内不精密度(CV%)应不高于5%;批间不精密度(CV%)应不高于10%。
(6)质控品的测定值:平行测定10孔高值和低值的质控品,用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合,质控品测值应在允许范围内,低值质控品为8-12pg/mL,高值质控品为400-600pg/mL。
(7)特异性:交叉反应符合下表要求:
(8)稳定性:37℃放置7天,测定值应符合上述各项要求。
实施例3:本发明试剂盒的使用方法
(1)将待检试剂盒在室温(18~25℃)下平衡30分钟。
(2)配制洗液:用蒸馏水将浓缩洗液按1:20稀释(1mL洗液加19mL蒸馏水)。若浓缩洗液有结晶,可将浓缩洗液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。
(3)配制发光液:使用前5分钟取适量发光液A与发光液B等体积混合。
(4)将反应管编号,向试管中依次加入25uL校准品或血清标本、50uL纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液、50uL生物素-雌二醇抗体结合物、50uL雌二醇酶结合物,37℃下振荡反应30min,将试管架置于磁分离器上分离5min,倒出上清液,加入500uL洗液,充分混匀后,于磁分离器上分离,倒出洗液,重复3次,在各管中加入化学发光底物液100uL,充分混匀,暗置5min,在管式化学发光仪上测定各管的发光值(RLU),以校准品浓度的Log值为横坐标,以发光值的Logit为纵坐标,绘制标准曲线,根据血清标本的发光值即可计算出雌二醇的浓度。
实施例4:本试剂盒的方法学评价结果
检测范围:范围为0~3500pg/mL,对于浓度大于3500pg/mL的标本应先进行稀释后再进行测定。
灵敏度:10pg/mL。
精密度:小于5%。
准确性:回收率的平均值在0.90~1.10范围内。
特异性:与雌三醇(E3)、睾酮(T)、孕酮(P)的交叉反应系数小于1%。
质控品测值:QcL(低值质控品)和QcH(高值质控品)的测值均在允许范围内。
稳定性:将试剂盒中各试剂组分于37℃下放置7d,稳定性良好。
实施例5:本试剂盒的临床对比实验
本专利发明的试剂盒已进行了临床考核,本次临床试验的样本总数116例,先以雌二醇雅培试剂盒测试后,再用本专利发明的试剂盒进行测定,结果表明,直线方程为y=0.9573x+10.848,相关系数为R=0.9780。可见本方法制备的试剂盒与医院测值有较好的一致性。以SPSS13.0统计分析软件对相关系数进行t检验(检验水准α=0.05),P<0.001,两种方法测定的雌二醇值的相关密切程度是显著性的,可见两种方法测定的雌二醇值密切相关。灵敏度(真阳性率)为98.32%、特异性(真阴性率)为97.52%,都较高;而假阳性率(误诊率)为2.20%、假阴性率(漏诊率)为1.69%,都较低,可见本试剂盒的测量值与实际值(原测值)的符合程度良好。粗一致性反映试剂盒诊断病人与非病人的能力,本试剂盒的粗一致性为98.43%,接近于1,说明试剂盒的诊断能力较强。
为了确定本试剂盒的临床参考值,对478份正常人血清、血浆样本采用本试剂盒进行了检测,结果表明本试剂盒的参考值(参考范围)为男性:12~58pg/mL;女性:卵泡期:20~217pg/mL、排卵期:35~630pg/mL、黄体期:20~330pg/mL、绝经期:0~28pg/mL。
Claims (6)
1.一种雌二醇纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒,其特征在于所述试剂盒包括:
1)雌二醇校准品;
2)偶联有链霉亲和素的纳米磁微粒悬浮液;
3)生物素标记的雌二醇抗体;
4)雌二醇抗原酶结合物,所用的酶为辣根过氧化物酶,辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0,活性≥250U/mL;
5)雌二醇质控品;
6)化学发光液A液和B液;
7)20倍浓缩洗液;
8)反应管。
2.根据权利要求1所述的雌二醇纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒,其特征在于,所述的发光液A液的主要成分为鲁米诺,B液的主要成分是过氧化脲;A液中鲁米诺的质量-体积浓度为0.7g/L,B液中过氧化脲的质量-体积浓度为0.675g/L。
3.根据权利要求1所述的雌二醇纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒,其特征在于,所述的纳米磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁,粒径20-50nm。
4.根据权利要求1所述的雌二醇纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒,其特征在于,所述的雌二醇质控品包括低值质控品和高值质控品,低值质控品的浓度是10pg/mL、高值质控品的浓度是500pg/mL。
5.根据权利要求1所述的雌二醇纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒,其特征在于,所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。
6.一种制备权利要求1-5任一权利要求所述试剂盒的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)雌二醇校准品的配制:
将雌二醇抗原用含1%BSA的校准品稀释液配制成校准品浓储液,以国家校准品进行定标,将校准品浓储液用校准品稀释液稀释至工作浓度,分别为0,30,100,300,1000,3500pg/mL;
(2)雌二醇质控品的配制:
用校准品稀释液将上述(1)配制的校准品浓储液分别稀释至10pg/mL和500pg/mL;10pg/mL作为低值质控品,500pg/mL作为高值质控品;
(3)纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备,配制1L:
A、四氧化三铁纳米磁微粒制备
采用沉淀法制备四氧化三铁纳米磁微粒,具体制备方法如下:1)将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O以摩尔比2:1加入到蒸馏水中,剧烈搅拌溶解;2)在氮气氛下加0.5M氨水于上述铁盐溶液中,调pH9-10,反应温度65℃,反应时间45min;3)反应结束后,用蒸馏水洗涤至中性,弃上清,于60℃烘干,即得10-50nm的四氧化三铁纳米磁微粒;
B、纳米磁珠表面羧基的偶联
采用分散聚合法进行偶联,具体制备方法如下:取上述制备的纳米磁微粒超声分散在10%PEG8000溶液中,得磁流体溶液,向磁流体溶液中按体积比1:10加入无水乙醇,搅拌30min后,移入带有搅拌器,冷凝管,氮气入口的三颈瓶中,加入交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺,用量不能超过磁流体的5%;在氮气的保护下,升温至60±1℃,恒温搅拌30min,之后依次加入过氧化苯甲酰、苯乙烯、丙烯酸,过氧化苯甲酰用量为磁流体用量3%,苯乙烯体积同磁流体溶液,丙烯酸体积为磁流体溶液的1/4,搅拌速度约为500rpm保持氮气气流,其余与上述条件保持不变,反应8-10h,所得产物静置,用蒸馏水反复洗涤,再用盐酸调节pH=1,浸泡24h,静置;再用蒸馏水反复洗涤,除去未包覆的Fe3O4磁粉,把沉淀下来的产品放入真空干燥箱中50℃下干燥24h,得到表面联有羧基的纳米磁微粒;
C、纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备,配制1L,方法如下:
取100mL0.1M MES缓冲液,加入10mg表面联有羧基的纳米磁微粒,室温搅拌40min,之后加入3.5mg链霉亲和素,然后加入8mg/mLEDC溶液,2-8℃反应1h后,用0.01M PBS缓冲液洗涤3次,最后用0.01M PBS定溶至1L即可;
(4)生物素标记的雌二醇抗体的制备
取1mg雌二醇抗体,用硼酸盐缓冲液在2~8℃下透析1~3h;将透析后的抗体加入55ug生物素,同时加入二甲基亚砜,使二甲基亚砜终质量浓度为5-10%,2-8℃缓慢振荡,避光反应2h;在上述溶液中加入250uL1M氯化铵溶液,常温避光反应45min;用0.01MPBS溶液在2~8℃下透析2天,期间换液3次;
(5)雌二醇抗原酶结合物的制备
A、酶稀释液配制:其成分包括5g/LMES,10mL/L2M NaOH,15g/L NaCl,10g/LBSA,5g/L Dextran T-2000,1.05g/L Triton X-100,2.5mL/L硫酸庆大霉素,1mL/L胭脂红,2g/LTween20,1mL/L ProClin300;
B、采用改良高碘酸钠氧化法将雌二醇抗原与辣根过氧化物酶进行偶联后,用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:4500,并加入12%酶稳定剂,储存于2~8℃;
(6)20倍浓缩洗液的配制
20倍浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠,5.92g/L磷酸二氢钠,180g/L NaCl,10mL/LTween-20和2%Proclin300;
(7)化学发光液A液和B液的配制
A液为0.7g/L鲁米诺,0.165g/L对碘酚,缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl,避光保存;B液为0.675g/L过氧化脲,用工艺用水配制;A液和B液在使用前5min混合;
(8)组装:将上述试剂组装成盒,储存于2~8℃;
(9)对采用该方法制备的试剂盒进行物理检查,对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品浓度和稳定性进行测定。
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