CN105462933B - 一株五氯苯酚单克隆抗体杂交瘤细胞株2c3及其应用 - Google Patents

一株五氯苯酚单克隆抗体杂交瘤细胞株2c3及其应用 Download PDF

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Abstract

一株五氯苯酚单克隆抗体杂交瘤细胞株2C3及其应用，属于食品安全免疫学检测领域。本发明五氯苯酚单克隆抗体杂交瘤细胞株2C3已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.10871。其制备方法为：五氯苯酚完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。将高效价低IC50的小鼠的脾细胞通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株2C3。此细胞株分泌的单克隆抗体，对五氯苯酚具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为0.2μg/L），可以用于食品安全中五氯苯酚的残留检测。

Description

一株五氯苯酚单克隆抗体杂交瘤细胞株2C3及其应用
技术领域
本发明涉及一株五氯苯酚单克隆抗体杂交瘤细胞株2C3及其应用，属于食品安全免疫学检测领域。
背景技术
五氯苯酚别名五氯酚，五氯酚用途广泛，作为农药主要为其钠盐，可用作杀菌剂、防腐剂、除草剂，还可作为木材的防腐剂，还有一部分作为溶剂、热交换工业生产的废弃物被释放到自然环境中。从上世纪50年代开始，我国将五氯酚及其钠盐作为杀虫剂杀灭血吸虫中间宿主钉螺的主要药剂，在我国长江中下游11个省、市、自治区，很大面积的稻田和池塘中持续施用了几十年，直到上世纪八十年代才对其施用逐步加以控制。然而，由于我国南方部分地区的血吸虫并没有得到有效的根除，近年来部分地区疫情有所发展，并且我国申请特许使用五氯酚作为用于“灭螺”的特效农药。因此部分地区又出现大剂量违规使用五氯酚钠进行灭螺的现象，继续对水体和土壤造成污染。五氯酚的苯环上五个位点均被氯取代，表现出很强的极性，因此有较强的脂溶性和水溶性，易在动植物的脂肪组织中富集，直接施入水体和土壤中，会在水体和土壤积累，并能够长时间的滞留在环境中，造成水环境中鱼类的污染。
目前检测五氯苯酚的方法主要是气相色谱法(GC)，液相色谱法(HPLC)，分光光度法、导数同步荧光法、薄层层析-分光光度法、气质联用等仪器方法，但是这些方法存在操作繁琐、耗时、费用比较贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测，因此建立一种快速简便的五氯苯酚检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高特异性和高灵敏度的单克隆单体是免疫学检测的前提，其中人工抗原的合成是重要的一步。
发明内容
本发明的目的是提供一株抗五氯苯酚单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对五氯苯酚具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立五氯苯酚的免疫学检测方法。
本发明的技术方案：本发明的五氯苯酚单克隆抗体，是由保藏号为 CGMCCNo.10871的小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株2C3所分泌。
上述小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株2C3，已于2015年5月 19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No.10871 。该小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株 2C3也属于本发明的保护范围。
本发明提供的2C3细胞株的制备基本步骤为：
1）半抗原的合成：向250mL圆底三口烧瓶中加入丙酮溶剂约100mL，在氮气保护下，加入3g（12.15mmol）四氯对二苯酚和10g（72.5mmol）碳酸钾，搅拌使尽量溶解，将1.58g（8.1mmol）4-溴丁酸乙酯溶于少量丙酮中，逐滴加入到反应液中，开始加热回流，大约12h。经薄层液相色谱（TLC）检测，反应完全，减压脱去丙酮溶剂。反应物用50mL去离子水溶解，再加入30mL乙酸乙酯，充分振荡，静置分层，保留水相。在水相中加入稀盐酸溶液调节pH至3，用乙酸乙酯50mL萃取水相，萃取2次，合并有机相，有机相用50mL水洗涤，脱去溶剂，得到粗品对羟基四氯苯氧丁酸乙酯。将制得的粗品对羟基四氯苯氧丁酸乙酯0.5g加入反应器中，加入10％的氢氧化钠溶液10mL，再加入20mL甲醇溶液，在38℃下加热回流4h，进行脱酯化。经TLC检测反应完成后，脱去溶剂，经柱层析分离得到目标产物对羟基四氯苯氧丁酸；
2）完全抗原的制备：称取33.4mg（0.1mmol）对羟基四氯苯氧丁酸，EDC 57.5mg，NHS34.5mg，用1mL无水DMF溶解（称为A液），室温搅拌反应8h。称取BSA 170mg溶于20mL pH 7.4的0.01M PBS中（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；
3）小鼠的免疫：五氯苯酚完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。最后一次用五氯苯酚完全抗原（不含佐剂）冲击免疫；通过间接ELISA检测血清效价和抑制；
4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株2C3；
5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ELISA法测定灵敏度和特异性。
本发明的有益效果：本发明获得的抗五氯苯酚单克隆抗体细胞株，对五氯苯酚有较好的检测灵敏度和特异性（IC50值为0.2μg/L）。
生物材料样品保藏：一株五氯苯酚单克隆抗体杂交瘤细胞株2C3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2015年5月 19日，保藏编号为CGMCC No.10871，分类命名为单克隆细胞株。
附图说明
图1. 2C3单克隆抗体的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。
本发明通过将五氯苯酚完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对五氯苯酚有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
实施例 1：杂交瘤细胞株2C3的制备
（1）完全抗原的合成：
向250mL圆底三口烧瓶中加入丙酮溶剂约100mL，在氮气保护下，加入3g（12.15mmol）四氯对二苯酚和10g（72.5mmol）碳酸钾，搅拌使尽量溶解，将1.58g（8.1mmol）4-溴丁酸乙酯溶于少量丙酮中，逐滴加入到反应液中，开始加热回流，大约12h。经薄层液相色谱（TLC）检测，反应完全，减压脱去丙酮溶剂。反应物用50mL去离子水溶解，再加入30mL乙酸乙酯，充分振荡，静置分层，保留水相。在水相中加入稀盐酸溶液调节pH至3，用乙酸乙酯50mL×2萃取水相，合并有机相，有机相用50mL水洗涤，脱去溶剂，得到粗品对羟基四氯苯氧丁酸乙酯。将制得的粗品对羟基四氯苯氧丁酸乙酯0.5g加入反应器中，加入10％的氢氧化钠溶液10mL，再加入20mL甲醇溶液，在38℃下加热回流4h，进行脱酯化。经TLC检测反应完成后，脱去溶剂，经柱层析分离得到目标产物。称取33.4mg（0.1mmol）对羟基四氯苯氧丁酸，EDC 57.5mg，NHS 34.5mg，用1mL无水DMF溶解（称为A液），室温搅拌反应8h。称取BSA 170mg溶于20mL pH 7.4的0.01M PBS中（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定。
（2）动物免疫
选择健康的6～8周龄的BALB/C小鼠进行免疫。取五氯苯酚完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。三免后7天采血，使用间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在四免后18天冲击免疫，不使用佐剂，腹腔注射。
（3）细胞融合
在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照1︰10 的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清，2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37 ℃，5%CO2的培养箱中培养。
（4）细胞筛选与细胞株建立
在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用五氯苯酚为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对五氯苯酚标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株2C3。
（5）单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于 -20℃保存。
使用间接竞争ELISA，测定单克隆抗体五氯苯酚的IC50为0.2μg/L，说明对五氯苯酚有很好的灵敏度，可用于五氯苯酚免疫分析检测。
（6）抗体应用
将杂交瘤细胞株2C3通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于五氯苯酚的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：
a、包被：将包被原对羟基四氯苯氧丁酸-OVA用0.05M pH 9.6 碳酸盐缓冲液从2μg/mL开始稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
b、洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
c、封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
d、加样：将抗血清从1:1000开始稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应1h；
e、显色：取出酶标板，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
f、终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值；
g、结果判读：以OD450值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价；
h、添加回收及样品前处理：称取1g粉碎的鱼肉样品置入100mL三角瓶中，分别添加10μg、3μg及1μg五氯苯酚。向样品加入10mL丙酮震荡均匀后，超声提取15min，净置后上清用N2吹干，再用甲醇溶解，采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为110.9%，95.3%，89%。
所述2C3单克隆抗体的交叉反应率如表1所示。
表1.2C3单克隆抗体的交叉反应率
溶液的配置：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12 H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05% 吐温20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60 mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (3)

1.一株五氯苯酚单克隆抗体杂交瘤细胞株2C3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.10871。
2.五氯苯酚单克隆抗体，其特征在于：它由保藏编号为CGMCC No.10871的五氯苯酚单克隆抗体杂交瘤细胞株2C3分泌产生。
3.权利要求2所述五氯苯酚单克隆抗体的应用，其特征在于：其在食品安全中五氯苯酚残留检测中的应用。
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