CN117105875A - 一种腈菌唑半抗原、抗原、抗体及制备方法和应用 - Google Patents

一种腈菌唑半抗原、抗原、抗体及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫分析技术领域，提供了一种腈菌唑半抗原、抗原、抗体及制备方法和应用。本发明在腈菌唑的苯环上氯原子的间位引入活性基团，对比于现有的半抗原，本发明提供的半抗原完全模拟了腈菌唑的结构，增强了抗原的免疫原性。本发明提供的腈菌唑半抗原与载体蛋白偶联后，所得抗原免疫原性强，经小鼠注射免疫后，产生的抗体效价为5.0×104，半抑制浓度(IC50)为50ppb左右，胶体金对干烟叶样品中腈菌唑的最低检测限为2.5μg/g左右。

Description

一种腈菌唑半抗原、抗原、抗体及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种腈菌唑半抗原、抗原、抗体及制备方法和应用。
背景技术
腈菌唑是一类具保护和治疗活性的内吸性三唑类杀菌剂。主要对病原菌的麦角甾醇的生物合成起抑制作用，对子囊菌、担子菌均具有较好的防治效果。该杀菌剂持效期长，对作物安全，有一定刺激生长作用，同时具有强内吸性、药效高、对作物安全的特点。
目前食品和农产品中腈菌唑常用的检测方法包括液相色谱法、液质联用法、免疫分析法等，免疫分析法主要包括竞争酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金法。液相色谱法和液质联用法虽然检测结果准确，但是需要昂贵的仪器设备，并且操作复杂，多限于专业实验室内使用；与以上两种方法相比，ELISA试剂盒法或胶体金法操作简便、快速，无需专业人员操作，仅需配备基础仪器设备即可，同时由于其适合大批量样本筛选，可广泛应用于食品加工企业的原料安全把关以及工商执法部门的现场监管，是非常具有推广价值的食品安全快速筛查方法。
但是，目前对于腈菌唑的免疫分析法，普遍存在抗体检测灵敏度不足，效价低的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种腈菌唑半抗原、抗原、抗体及制备方法和应用。本发明提供的腈菌唑半抗原和载体蛋白偶联后所得抗原经宿主动物免疫后，能够产生效价高、灵敏度高的抗体，为ELISA试剂盒法和胶体金法快速检测腈菌唑提供了优质的原料。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种腈菌唑半抗原，具有式I所示结构：
本发明还提供了上述方案所述腈菌唑半抗原的制备方法，包括以下步骤：
将腈菌唑、三氯化铝、丁二酸酐和有机溶剂混合进行傅克酰基化反应，得到所述腈菌唑半抗原。
优选的，所述腈菌唑、三氯化铝和丁二酸酐的摩尔比为1:(2～3):(1～1.2)；
所述傅克酰基化反应的温度为80～90℃，时间为4～5h。
本发明还提供了一种腈菌唑抗原，由上述方案所述的腈菌唑半抗原或上述方案所述的制备方法制备得到的腈菌唑半抗原与载体蛋白偶联得到。
优选的，所述载体蛋白为卵清蛋白；所述载体蛋白为卵清蛋白时，所述腈菌唑抗原的结构式如式II所示：
优选的，所述载体蛋白为牛血清蛋白；所述载体蛋白为牛血清蛋白时，所述腈菌唑抗原的结构式如式III所示：
本发明还提供了上述方案所述腈菌唑抗原的制备方法，包括以下步骤：
将上述方案所述的腈菌唑半抗原、偶联剂和极性溶剂混合进行活化，得到活化的半抗原溶液；
将所述活化的半抗原溶液和载体蛋白的缓冲溶液混合进行偶联反应，得到所述腈菌唑抗原。
本发明还提供了一种腈菌唑抗体，由上述方案所述的腈菌唑抗原免疫宿主动物得到。
本发明还提供了一种检测腈菌唑的试纸或试剂盒，含有上述方案所述的腈菌唑抗体。
本发明还提供了上述方案所述腈菌唑抗体或上述方案所述的试纸或试剂盒在检测腈菌唑中的应用。
本发明提供了一种腈菌唑半抗原，结构式如式I所示。本发明在腈菌唑的苯环上氯原子的间位引入活性基团，对比于现有的半抗原，本发明提供的半抗原完全模拟了腈菌唑的结构，增强了抗原的免疫原性。
本发明还提供了上述方案所述腈菌唑半抗原的制备方法，本发明通过傅克酰基化反应得到腈菌唑半抗原，合成路线短、原料易得、条件温和、操作简单，且产物纯度高。
本发明还提供了腈菌唑抗原，由上述方案所述的腈菌唑半抗原与载体蛋白偶联得到。本发明提供的腈菌唑半抗原与载体蛋白偶联后，所得抗原免疫原性强，经小鼠注射免疫后，产生的抗体效价为5.0×104，半抑制浓度(IC50)为50ppb左右，胶体金对干烟叶样品中腈菌唑的最低检测限为2.5μg/g左右。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的腈菌唑半抗原的核磁共振氢谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种腈菌唑半抗原，具有式I所示结构：
本发明还提供了上述方案所述腈菌唑半抗原的制备方法，包括以下步骤：
将腈菌唑、三氯化铝、丁二酸酐和有机溶剂混合进行傅克酰基化反应，得到腈菌唑半抗原。
在本发明中，所述腈菌唑、三氯化铝和丁二酸酐的摩尔比优选为1:(2～3):(1～1.2)，更优选为1:(2.2～2.5):(1～1.1)；所述三氯化铝优选为无水三氯化铝；所述傅克酰基化反应的温度优选为80～90℃，时间优选为4～5h；所述有机溶剂优选为氯代甲烷，更优选为无水二氯甲烷；在本发明的具体实施例中，所述傅克酰基化反应优选在回流条件下进行，并采用TLC法监测反应进程。
在本发明的具体实施例中，优选先将三氯化铝溶于有机溶剂中，加入丁二酸酐，搅拌25～30min后再加入腈菌唑，之后在回流条件下进行反应。
在本发明中，所述傅克酰基化反应的反应式如式A所示：
所述傅克酰基化反应结束后，本发明优选将所得反应液冷却至室温后倒入冰块中搅拌10～15min，之后分层得到有机层，水层用二氯甲烷萃取，萃取所得有机层和分层所得有机层合并后蒸干，所得残余物进行柱层析分离，得到腈菌唑半抗原；所述柱层析分离的上柱方式优选为干法拌样上柱；所述柱层析分离优选包括依次进行第一洗脱和第二洗脱，所述第一洗脱的洗脱剂优选为石油醚和乙酸乙酯按照15:1的体积比混合得到的有机溶剂；所述第二洗脱的洗脱剂优选为乙酸乙酯和石油醚按照1:2的体积比混合得到的有机溶剂；本发明优选第一洗脱冲出杂质，再用第二洗脱冲出腈菌唑半抗原，第二洗脱所得洗脱液蒸干溶剂即可得到腈菌唑半抗原。
本发明还提供了一种腈菌唑抗原，由上述方案所述的腈菌唑半抗原或上述方案所述的制备方法制备得到的腈菌唑半抗原与载体蛋白偶联得到。
在本发明中，所述载体蛋白为卵清蛋白；所述载体蛋白为卵清蛋白时，所述腈菌唑抗原的结构式如式II所示：
在本发明的具体实施例中，式II所示结构的腈菌唑抗原为腈菌唑包被原。
在本发明中，所述载体蛋白为牛血清蛋白；所述载体蛋白为牛血清蛋白时，所述腈菌唑抗原的结构式如式III所示：
在本发明的具体实施例中，式III所示结构的腈菌唑抗原为腈菌唑免疫原。
本发明还提供了上述方案所述腈菌唑抗原的制备方法，包括以下步骤：
将上述方案所述的腈菌唑半抗原、偶联剂和极性溶剂混合进行活化，得到活化的半抗原溶液；
将所述活化的半抗原溶液和载体蛋白的缓冲溶液混合进行偶联反应，得到所述腈菌唑抗原。
本发明将上述方案所述的腈菌唑半抗原、偶联剂和极性溶剂混合进行活化，得到活化的半抗原溶液。在本发明中，所述极性溶剂优选为二氧六环或二甲基亚砜，所述腈菌唑半抗原和所述极性溶液的用量比优选为10mg：100μL；所述偶联剂优选为二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，或为氯甲酸异丁酯，当所述偶联剂为氯甲酸异丁酯时，活化过程中优选还加入三丙胺，所述三丙胺起到缚酸剂的作用；所述活化的温度优选为25～27℃，更优选为25℃，所述活化的时间优选为12～24h。
在本发明的具体实施例中，制备所述腈菌唑包被原(式II)时，采用的偶联剂优选为氯甲酸异丁酯(同时加入三丙胺)，采用的有机溶剂优选为二氧六环；所述三丙胺和腈菌唑半抗原的用量比优选为40μL:10mg；所述氯甲酸异丁酯和腈菌唑半抗原的摩尔比优选为(1～1.2):1。在本发明的具体实施例中，优选将腈菌唑半抗原溶于二氧六环中，然后加入三丙胺，再在冰浴条件下加入氯甲酸异丁酯的二氧六环溶液，反应0.5～1h后，转移至室温进行活化，活化完成后无需任何处理，即得到活化的半抗原溶液。
在本发明中，制备所述腈菌唑免疫原(式III)时，采用的活化剂优选为DCC和NHS，采用的有机溶剂优选为二甲基亚砜；所述DCC和腈菌唑半抗原的摩尔比优选为(2～2.5):1，所述NHS和腈菌唑半抗原的摩尔比优选为(1～1.2):1；在本发明的具体实施例中，优选先将腈菌唑半抗原溶于二甲基亚砜中，然后加入NHS和DCC进行活化，活化完成后，优选将所得活化产物抽滤，去除二环己基脲，所得澄清透明滤液为所述活化的半抗原溶液。
得到活化的半抗原溶液后，本发明将所述活化的半抗原溶液和载体蛋白的缓冲溶液混合进行偶联反应，得到所述腈菌唑抗原。在本发明中，当制备所述腈菌唑包被原时，采用的载体蛋白优选为OVA，制备所述腈菌唑免疫原时，采用的载体蛋白优选为BSA；所述载体蛋白和所述腈菌唑半抗原的摩尔比优选为(45～50):1；所述载体蛋白的缓冲溶液优选由载体蛋白溶解于BB缓冲溶液中得到，所述BB缓冲液的浓度优选为0.02mol/L；本发明优选将活化的半抗原溶液逐滴加入所述载体蛋白的缓冲溶液中，加入完毕后在室温下进行反应。
在本发明中，所述偶联反应的温度优选为25～27℃，更优选为25℃，所述偶联反应的时间优选为2～3h。
在本发明中，所述腈菌唑包被原(式II)的合成过程如式B所示：
在本发明中，所述腈菌唑免疫原(式III)的合成过程如式C所示：
偶联反应完成后，本发明优选将所得反应液离心，吸取上清液，将所述上清液透析，得到所述腈菌唑抗原。在本发明中，所述透析用透析袋的截留分子量优选为8000～14000，所述透析袋优选采用EDTA溶液处理，并用蒸馏水洗净后使用；所述EDTA溶液的浓度优选为0.2mol/L；当制备所述腈菌唑包被原时，所述透析用透析液优选为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的浓度优选为0.02mol/L；当制备所述腈菌唑免疫原时，所述透析用透析液优选为PB缓冲液，所述PB缓冲液的浓度优选为0.02mol/L；所述透析的时间优选为3天，每天更换2次透析液。透析结束后，优选将透析袋中的溶液析出，分装冻存备用。
本发明还提供了一种腈菌唑抗体，由上述方案所述的腈菌唑抗原免疫宿主动物得到；所述宿主动物优选为小鼠；本发明对所述免疫的方法没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的方法即可；在本发明的具体实施例中，优选使用不完全弗氏佐剂将腈菌唑免疫原稀释液乳化后再对宿主动物进行免疫；所述腈菌唑免疫原稀释液采用的稀释剂优选为灭菌后的1％氯化钠溶液。
在本发明的具体实施例中，制备腈菌唑抗体的过程优选如下：
采用乳化后的腈菌唑免疫原对宿主动物进行免疫，得到免疫动物，利用ELISA方法对免疫动物进行血清测试，当血清参数达到需求后按单抗制备方法进行单抗制备；
提取所述免疫动物的脾细胞并和同系骨髓瘤细胞进行融合，得到融合细胞；
对所述融合细胞进行杂交瘤筛选；
采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养，采用免疫学方法筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。
本发明还提供了一种检测腈菌唑的试纸或试剂盒，含有上述方案所述的腈菌唑抗体。
本发明还提供了上述方案所述腈菌唑抗体或上述方案所述的试纸或试剂盒在检测腈菌唑中的应用；所述检测腈菌唑的方法优选为ELLSA试剂盒法或胶体金法。采用本发明的腈菌唑抗原免疫小鼠，所得抗体效价高、灵敏度高，将其应用于腈菌唑的检测中，能够提高检测方法的准确度和灵敏度。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
腈菌唑半抗原的合成：
将6.37g无水三氯化铝溶于100mL二氯甲烷中，加入2.28g丁二酸酐，反应30min，加入腈菌唑5.52g，然后油浴加热回流反应4h，反应完全后，将反应液冷却至室温，然后将反应液倒入冰块中，充分搅拌10min，用分液漏斗分出下层溶液，用二氯甲烷萃取水层一次，合并有机相，蒸干，干法拌样上柱，用乙酸乙酯：石油醚＝1:2溶剂冲出产品，蒸干溶剂即为腈菌唑半抗原，经高效液相色谱测定，其纯度为96.1％，图1为所得腈菌唑半抗原的核磁共振氢谱图，根据图1可以确定，产物具有目标结构。
腈菌唑包被原的合成：
将20mg腈菌唑半抗原溶于200μL 1,4-二氧六环中，加入80μL三丙胺，冰浴下加入200μL氯甲酸异丁酯的1,4-二氧六环溶液，其中含有8.15mg的氯甲酸异丁酯，反应1h，然后恢复室温反应过夜，得到活化的半抗原溶液；称取30mg OVA溶于1.5mL、0.02mol/L的BB缓冲液中，澄清后，逐滴加入制备好的活化的半抗原溶液，加毕，室温反应2h，然后将反应液离心，吸取上清液，加入透析袋中透析3天，透析液为0.02mol/L的PBS缓冲液，每天更换2次透析液，透析结束后，将透析袋中的溶液吸出，分装冻存备用。
腈菌唑免疫原的合成：
将20mg半抗原溶于200μL DMSO中，加入15.9mg NHS和17mg DCC，25℃反应过夜，次日，将反应液抽滤，除去二环己基脲，得澄清透明液体，即为活化的半抗原溶液；称取40mgBSA溶于3mL 0.02mol/L的PB缓冲液中，澄清后，逐滴加入制备好的活化的半抗原溶液，加毕，室温反应2h，然后将反应液离心，吸取上清液，加入透析袋中透析3天，透析液为0.02mol/L的PB缓冲液，每天更换2次透析液，透析结束后，将透析袋中的溶液吸出，分装冻存备用。
实施例2
半抗原的合成：
将7g无水三氯化铝溶于100mL二氯甲烷，加入2.52g丁二酸酐，反应30min，加入腈菌唑6.07g，然后油浴加热回流反应4h，反应完全后，反应液冷却至室温，然后将反应液倒入冰块中，充分搅拌10min，用分液漏斗分出下层溶液，用二氯甲烷萃取水层一次，合并有机相，蒸干，干法拌样上柱，用乙酸乙酯：石油醚＝1:2溶剂冲出产品，蒸干溶剂即为腈菌唑半抗原，经高效液相色谱测定，其纯度为97.5％。
腈菌唑包被原的合成：
将30mg腈菌唑半抗原溶于300μL 1,4-二氧六环，加入120μL三丙胺，冰浴下加入200μL氯甲酸异丁酯的1,4-二氧六环溶液，其中含有12.2mg氯甲酸异丁酯，反应1h，然后恢复室温反应过夜，得到活化的半抗原溶液；称取70.6mg OVA溶于1.5mL、0.02mol/L的BB缓冲液中，澄清后，逐滴加入制备好的活化的半抗原溶液，加毕，室温反应2h，然后将反应液离心，吸取上清液，加入透析袋中透析3天，透析液为PBS，每天更换2次透析液，透析结束后，将透析袋中的溶液吸出，分装冻存备用。
腈菌唑免疫原的合成：
将30mg腈菌唑半抗原溶于300mL DMSO中，加入10.3mg NHS和30.8mg DCC，25℃反应过夜，次日，将反应液抽滤，除去二环己基脲，得澄清透明液体，即为活化的半抗原溶液；称取110mg BSA溶于3mL、0.02mol/lPB缓冲液中，澄清后，逐滴加入制备好的活化的半抗原溶液，加毕，室温反应2h，然后将反应液离心，吸取上清液，加入透析袋中透析3天，透析液为0.02mol/L的PB缓冲液，每天更换2次透析液，透析结束后，将透析袋中的溶液吸出，分装冻存备用。
实施例3
腈菌唑半抗原的合成：
将6.87g无水三氯化铝溶于100mL二氯甲烷，加入2.47g丁二酸酐，反应30min，加入腈菌唑5.96g，然后油浴加热回流反应4h，反应完全后，反应液冷却至室温，然后将反应液倒入冰块中，充分搅拌10min，用分液漏斗分出下层溶液，用二氯甲烷萃取水层一次，合并有机相，蒸干，干法拌样上柱，用乙酸乙酯：石油醚＝1:2溶剂冲出产品，蒸干溶剂即为腈菌唑半抗原，经高效液相色谱测定，其纯度为95％。
腈菌唑包被原的合成：
将15mg半抗原溶于150μL 1,4-二氧六环，加入90μL三丙胺，冰浴下加入200μL氯甲酸异丁酯的1,4-二氧六环溶液，其中含有氯甲酸异丁酯6.1mg，反应1h，然后恢复室温反应过夜，得到活化的半抗原溶液；称取36mg OVA溶于1.5mL、0.02mol/L的BB缓冲液中，澄清后，逐滴加入制备好的活化的半抗原溶液，加毕，室温反应2h，然后将反应液离心，吸取上清液，加入透析袋中透析3天，透析液为0.02mol/L的PBS缓冲液，每天更换2次透析液，透析结束后，将透析袋中的溶液吸出，分装冻存备用。
腈菌唑免疫原的合成：
将15mg半抗原溶于150μL DMSO中，加入5.15mgNHS和15.3mgDCC，25℃反应过夜，将反应液抽滤，除去二环己基脲，得澄清透明液体，即为活化的半抗原溶液；称取51.6mg BSA溶于3mL、0.02mol/L的PB缓冲液中，澄清后，逐滴加入制备好的活化的半抗原溶液，加毕，室温反应2h，然后将反应液离心，吸取上清液，加入透析袋中透析3天，透析液为0.02mol/L的PB缓冲液，每天更换2次透析液，透析结束后，将透析袋中的溶液吸出，分装冻存备用。
测试例1ELISA测试
对小鼠进行免疫：
选择纯种BALB/c小鼠15只，年龄4-6周，分别用不同颜色标注1-5号，取6只2mL体积注射器，3支吸取不完全弗氏佐剂0.5mL，另3只分别吸取含有腈菌唑免疫原50μg、100μg、200μg的腈菌唑免疫原溶液0.5mL(用灭菌后1％氯化钠溶液稀释)，分别标注好号后一支不完全弗氏佐剂注射器和一支免疫原注射器的注射头用输液管连接一起(长度以把两个注射器头连接对在一起为宜)，然后两只手分别来回推注射器直至完全乳化(乳化标注为内部液体为白色乳状，推动过程中能感觉稍微阻力，滴水中成小滴不扩散)，乳化过程中直至乳化好中途不能停止。乳化完成后，对小鼠进行皮下(背部和腹部)多点注射，每只小鼠大概注射0.2mL左右。同样方法每间隔2周重复一次，完成3次后开始进行采血测试；
采血方法：左手拇指、食指和中指抓取小鼠的颈部头皮，小指和无名指固定尾巴；轻压需要摘取的眼部皮肤，使眼球充血突出；用玻璃毛细管从小鼠眼球突出处垂直插入，轻轻左右转动，直至毛细管中流入血(大概毛细管2/3处)，取出用洗耳球把毛细管中血吹入0.5mL离心管中(低温存放)；采血完成后放入37℃烤箱烤30min，后放入低温高速离心机中(10000转/min)离心10min，分离出血清用于ELISA方法测试。
单抗制备过程：
细胞融合
采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
选择性培养
选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化
在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。
单克隆抗体的大量制备
取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5mL液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。
ELISA测试使用到的试剂配方如下：
封闭液(1L体积)：脱脂奶粉2.5g，氯化钠8g，磷酸二氢钾0.6g，磷酸氢二钠5.8g，蔗糖50g，氯化钾0.9g，防腐剂0.5mL，牛血清50mL，余量为水。
酶稀(16L)：氯化钠128g，磷酸二氢钾9.48g，磷酸氢二钠92.8g，甘油800mL，牛血清3200mL，防腐剂12mL，余量为水。
样稀(4L)：氯化钠23.38g，氯化钾0.118g，磷酸二氢钾3.48g，磷酸二氢钠2.19g，磷酸氢二钠20.64g，曲拉通40mL，防腐剂1.5mL，余量为水。
底物A液(100mL)：柠檬酸0.48g，过氧化尿素0.05g，冰醋酸90毫升，余量为水。
底物B液(400mL)：柠檬酸0.164g，盐酸盐TMB 0.2g，N-N 4mL，甲醇14mL，1mol/L盐酸160μL，余量为水。
20×浓缩洗液(40L)：氯化钠2560g，磷酸氢二钠928g，磷酸二氢钾80g，氯化钾1.44g，防腐剂12mL，吐温20 800mL，余量为水。
具体测试方法如下：
(1)抗原包被：用CB缓冲液把腈菌唑包被原稀释为1K比例，稀释后按100μL/孔加入酶标板微孔板中，盖盖板膜放37℃中包被2h。
(2)封闭：包被完后取出泼掉包被液后用洗涤工作液(20×浓缩洗液稀释为1×)，250μL/孔或用洗壶洗1次，浸泡30s，泼掉后用吸水纸或毛巾拍干，加入封闭液150μL/孔，放入37℃恒温培养箱中反应2h，取出泼掉封闭液拍干待用。
(3)不同标准品浓度的稀释：用0.02mol/L PBS缓冲液把直接购买的100μg/mL的腈菌唑高标稀释成0ppb(直接为PBS缓冲液)、10ppb、50ppb、500ppb。
(4)酶标二抗工作液的稀释：用酶稀缓冲液把直接把购买酶标二抗原液稀释成1:1K的浓度。
(5)血清或单抗工作液的稀释：用样稀缓冲液把血清或制备单抗按1:1K、1:5K、1:10K、1:20K的浓度进行稀释。
(6)检测步骤：按棋盘法方案进行测试，具体操作步骤如下：
1)加标准品/样本：加入标准品/样本50μL到对应的微孔中。
2)加血清或单抗工作液：加血清或单抗工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。
3)洗板加酶二抗工作液：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)，加酶标二抗工作液100μL/孔，用盖板膜盖板后置于37℃避光环境中反应30min。
4)洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。
5)显色：加入底物A液和B液各50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应15min。
6)测定：加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔OD值。
在满足相关技术参数情况下，OD值为2.0左右时，抗体的最大稀释倍数为抗体效价；以标准品浓度为横坐标，以对应吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，并根据标准曲线计算腈菌唑的半数抑制浓度(IC50值)。
测试结果如表1～表5所示。
表1 1免疫后采血清测试数据
表2 2免疫后采血清测试数据
表3 3免疫后采血清测试数据
表4 采全血清测试数据
表5 制备单抗测试数据
根据表1～表3中的数据可以看出，随着免疫次数的增加，血清中腈菌唑抗体的浓度逐渐增加；根据表4中的数据可以看出，血清中腈菌唑抗体浓度已经基本达到5W，IC50已小于50ppb；根据表5中的结果进行计算，结果显示，制备单抗的效价为5×104，半抑制浓度(IC50)为50ppb以内。
测试例2胶体金测试
测试方法如下：
(1)划板：用pH值为7.2，0.02mol/L的PB缓冲液按照1:10，1:20，1:50，1:100的比例分别稀释包被抗原，作为T线包被液，用pH值为7.2，0.02mol/L的PB+10％BSA缓冲液按照1:60稀释二抗作为C线包被液，均按1μL/cm量进行划板，划完后放37℃烤12h(背板用上海杰一30×6cm2线PVC板、吸水纸用上海捷宁Spec30*20cm、NC膜用上海捷宁JN-140)。
(2)金标垫处理标准：上海杰一普通玻璃纤维切成30×1cm2尺寸，用pH值为7.2，0.02mol/L的PB+10％BSA缓冲液每条按1.5mL量进行处理，放37℃干燥过夜(12h以上)。
(3)样品垫处理标准：上海捷宁SF-06无纺布切成30*1.7cm2尺寸，用pH值7.2，0.02mol/L的PB+0.5％吐温-20+1％蔗糖缓冲液每条按2mL量进行处理，放37℃干燥过夜(12h以上)。
(4)标金：用纯净水先将血清或单抗进行1:10倍稀释混匀，分别取4管1mL 40nm大小颗粒的胶体金溶液，分别加入0.02mol/L的K2CO330μL调pH，混匀后分别加入稀释好的血清或单抗稀释液10μL、20μL、30μL、40μL，混匀后室温放置反应30min，然后分别加入封闭液(20％BSA水溶液)25μL，室温放置反应20min，于10000转/分钟低温(2～8℃)离心10min，去除上清，剩余物加100μL复溶液进行复溶(复溶液为离心后上清液1mL+50μl40％蔗糖水溶液混匀)，按3μL/cm量进行喷金，于37℃烤2h。
(5)干烟叶样品前处理方法
1)检测前将干烟叶样品烘干后粉成细粉。
2)称取1±0.05g样品放至10mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL甲醇中，盖上盖子，手动振荡30s，静置分层。
3)取样品上清液100μL加入2mL聚苯乙烯离心管中，加入1800μL稀释液(pH7.2，0.02mol/L的PB)，振荡混匀即为样品待检液。
(6)干烟叶样品检测方法
1)取样品待检液70μL或用滴管垂直滴3滴于加样孔中。
2)液体流动时开始计时，反应10min，利用分析软件、胶体金读数仪或目测判读结果；本发明采用5个干烟叶样品，分别记为1#、2#、3#、4#和5#；在干烟叶样品中添加腈菌唑标准品，控制1g干烟叶中腈菌唑的添加浓度分别为0ppb、2500ppb、5000ppb和10000ppb。测试结果如表6所示。
表6 制备单抗制备胶体金干烟叶检测限测试数据
取干烟叶样品4#，进行5次平行测试，测试结果见表7。
表7 制备单抗制备胶体金干烟叶平行性测试数据
表6中的结果表明，采用本发明的制备单抗制备胶体金，对干烟叶样品中腈菌唑的最低检测限为2500ng/g左右，灵敏度高；根据表7中的数据可以看出，本发明提供的检测方法平行性好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种腈菌唑半抗原，其特征在于，具有式I所示结构：
2.权利要求1所述腈菌唑半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将腈菌唑、三氯化铝、丁二酸酐和有机溶剂混合进行傅克酰基化反应，得到所述腈菌唑半抗原。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述腈菌唑、三氯化铝和丁二酸酐的摩尔比为1:(2～3):(1～1.2)；
所述傅克酰基化反应的温度为80～90℃，时间为4～5h。
4.一种腈菌唑抗原，其特征在于，由权利要求1所述的腈菌唑半抗原或权利要求2或3所述的制备方法制备得到的腈菌唑半抗原与载体蛋白偶联得到。
5.根据权利要求4所述的腈菌唑抗原，其特征在于，所述载体蛋白为卵清蛋白；所述载体蛋白为卵清蛋白时，所述腈菌唑抗原的结构式如式II所示：
6.权利要求4所述的腈菌唑抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清蛋白；所述载体蛋白为牛血清蛋白时，所述腈菌唑抗原的结构式如式III所示：
7.权利要求4～6任意一项所述腈菌唑抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1所述的腈菌唑半抗原、偶联剂和极性溶剂混合进行活化，得到活化的半抗原溶液；
将所述活化的半抗原溶液和载体蛋白的缓冲溶液混合进行偶联反应，得到所述腈菌唑抗原。
8.一种腈菌唑抗体，其特征在于，由权利要求4～6任意一项所述的腈菌唑抗原免疫宿主动物得到。
9.一种检测腈菌唑的试纸或试剂盒，其特征在于，含有权利要求8所述的腈菌唑抗体。
10.权利要求8所述腈菌唑抗体或权利要求9所述的试纸或试剂盒在检测腈菌唑中的应用。
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