CN117105806A - 一种联苯菊酯半抗原、抗原、抗体及制备方法和应用 - Google Patents

一种联苯菊酯半抗原、抗原、抗体及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫分析技术领域，提供了一种联苯菊酯半抗原、抗原、抗体及制备方法和应用。本发明提供的联苯菊酯半抗原完全保留了联苯菊酯的分子结构，与载体蛋白偶联后，所得抗原的免疫原性得到大幅度的提高，所制备的抗体特异性更强，灵敏度更高。实施例结果表明，本发明提供的联苯菊酯半抗原与载体蛋白偶联，所得抗原经小鼠注射免疫后，产生的抗体效价为1×104，半抑制浓度(IC50)为20ppb左右，胶体金对干烟叶样品中联苯菊酯的最低检测限为1.25μg/g左右。

Description

一种联苯菊酯半抗原、抗原、抗体及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种联苯菊酯半抗原、抗原、抗体及制备方法和应用。
背景技术
联苯菊酯是一种拟除虫菊酯类杀虫杀螨剂，用于防治农作物害虫以及家里出现的白蚁、羊毛虫等害虫以及茶园出现的害虫等。联苯菊酯可通过直接接触、呼吸道吸入或消化道摄入等途径对皮肤及黏膜、神经系统、消化系统等造成一定危害。目前，联苯菊酯残留常用的检测方法主要为仪器分析法，如高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)以及色质谱联用法(HPLC-MS-MS和GC-MS)等。使用仪器对联苯菊酯进行检测具有准确、灵敏的优点。但是仪器检测存在如下缺点：(1)样品处理需要对其衍生化，前处理程序繁琐；(2)检测所需仪器昂贵，检测成本较高，对于一些中小城市甚至农村的检测条件很苛刻；(3)从事检测的人员需经过特别的培训，具有相关专业的水平；(4)仪器维护成本较高；(5)不适用于现场抽检等快速检测工作。
酶联反应吸附分析法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的检测方法，该方法是基于抗体与抗原或半抗原之间的高选择性反应而建立起来的一种生物化学分析方法。酶联反应吸附分析法具有简单、快速、成本低的优势，特别适用于大批量样品的检测，近年来发展迅速。
对于联苯菊酯的酶联反应吸附分析法已有报道，但是目前的酶联反应吸附分析法中，所用抗原的免疫原性普遍不强，导致抗体的特异性和灵敏度较差，进而影响检测结果的准确性。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种联苯菊酯半抗原、抗原、抗体及制备方法和应用。本发明提供的联苯菊酯半抗原和载体蛋白偶联后所得抗原免疫原性强，利用其对宿主动物进行免疫后，所得抗体特异性强，灵敏度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种联苯菊酯半抗原，具有式I所示结构：
本发明提供了上述方案所述联苯菊酯半抗原的制备方法，包括以下步骤：
将对氨基苯硼酸、3-溴-2-甲基苯甲醇、碱性试剂、钯催化剂和有机溶剂混合进行铃木反应，得到第一中间体；所述第一中间体的结构如式A所示；
将所述第一中间体、吡啶、三氟氯菊酰氯和有机溶剂混合进行第一偶联反应，得到第二中间体，所述第二中间体的结构如式B所示；
将所述第二中间体、吡啶、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶混合进行第二偶联反应，得到具有式I所示结构的联苯菊酯半抗原。
优选的，所述对氨基苯硼酸和3-溴-2-甲基苯甲醇的摩尔比为1:(1～1.2)；所述对氨基苯硼酸和碱性试剂的摩尔比为1:(0.5～1)；所述对氨基苯硼酸和钯催化剂的摩尔比为1:(0.5～1)；
所述第一中间体和三氟氯菊酰氯的摩尔比为1:(1～1.2)；
所述第二中间体和丁二酸酐的摩尔比为1:(1～1.2)。
优选的，所述铃木反应的温度为78～80℃，时间为16～18h；
所述第一偶联包括依次进行第一阶段和第二阶段，所述第一阶段的反应温度为0～5℃，反应时间为2～2.5h；所述第二阶段的反应温度为室温，反应时间优选为4～5h；
所述第二偶联反应的温度为120～125℃，时间为12～24h。
本发明还提供了一种联苯菊酯抗原，由上述方案所述的联苯菊酯半抗原或上述方案所述的制备方法制备得到的联苯菊酯半抗原与载体蛋白偶联得到。
优选的，所述载体蛋白为卵清蛋白或牛血清蛋白；当所述载体蛋白为卵清蛋白时，所述联苯菊酯抗原的结构式如式II所示：
当所述载体蛋白为牛血清蛋白时，所述联苯菊酯抗原的结构式如式III所示：
本发明还提供了上述方案所述联苯菊酯抗原的制备方法，包括以下步骤：
将上述方案所述的联苯菊酯半抗原、偶联剂和极性溶剂混合进行活化，得到活化的半抗原溶液；
将所述活化的半抗原溶液和载体蛋白的缓冲溶液混合进行偶联反应，得到所述联苯菊酯抗原。
本发明还提供了一种联苯菊酯抗体，由上述方案所述的联苯菊酯抗原免疫宿主动物得到。
本发明还提供了一种检测联苯菊酯的试纸或试剂盒，含有上述方案所述的联苯菊酯抗体。
本发明还提供了上述方案所述联苯菊酯抗体或上述方案所述的试纸或试剂盒在检测联苯菊酯中的应用。
本发明提供了一种联苯菊酯半抗原，结构式如式I所示。已报道的联苯菊酯分子修饰的方案通常是在菊酸位点进行修饰，或者以联苯醇进行衍生化，没有完全保留联苯菊酯全部的分子结构，导致抗原的免疫原性不强，而本发明从联苯菊酯的末端苯环引入羧基，用于和载体蛋白偶联制备抗原，本发明提供的联苯菊酯半抗原完全保留了联苯菊酯的分子结构，与载体蛋白偶联后，所得抗原的免疫原性得到大幅度的提高，所制备的抗体特异性更强，灵敏度更高。
本发明还提供了上述方案所述联苯菊酯半抗原的制备方法，本发明以对氨基苯硼酸和3-溴-2-甲基苯甲醇为原料，通过铃木反应合成第一中间体(联苯醇的氨基衍生物)，再和三氟氯菊酸偶联，得到第二中间体，最后和丁二酸酐偶联，得到所述联苯菊酯半抗原。本发明提供的制备方法步骤简单，容易操作，且产物纯度高。
本发明还提供了联苯菊酯抗原，由上述方案所述的联苯菊酯半抗原与载体蛋白偶联得到。本发明提供的联苯菊酯半抗原与载体蛋白偶联后，所得抗原免疫原性强，经小鼠注射免疫后，产生的抗体效价为1×104，半抑制浓度(IC50)为50ppb左右，胶体金针对干烟叶样品中联苯菊酯的最低检测限为1.25μg/g左右。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的联苯菊酯半抗原的核磁共振氢谱。
具体实施方式
本发明提供了一种联苯菊酯半抗原，具有式I所示结构：
本发明还提供了上述方案所述联苯菊酯半抗原的制备方法，包括以下步骤：
将对氨基苯硼酸、3-溴-2-甲基苯甲醇、碱性试剂、钯催化剂和有机溶剂混合进行铃木反应，得到第一中间体；所述第一中间体的结构如式A所示；
将所述第一中间体、吡啶、三氟氯菊酰氯和有机溶剂混合进行第一偶联反应，得到第二中间体，所述第二中间体的结构如式B所示；
将所述第二中间体、吡啶、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶混合进行第二偶联反应，得到具有式I所示结构的联苯菊酯半抗原。
在本发明中，所述联苯菊酯半抗原的合成路线如Chem1所示：
下面结合Chem1对联苯菊酯半抗原的合成方法进行详细说明。
本发明将对氨基苯硼酸、3-溴-2-甲基苯甲醇、碱性试剂、钯催化剂和有机溶剂混合进行铃木反应，得到第一中间体；所述第一中间体的结构如式A所示。在本发明中，所述对氨基苯硼酸和3-溴-2-甲基苯甲醇的摩尔比优选为1:(1～1.2)，更优选为1:(1～1.1)；所述对氨基苯硼酸和碱性试剂的摩尔比优选为1:(0.5～1)，更优选为1:(0.6～0.8)；所述对氨基苯硼酸和钯催化剂的摩尔比优选为1:(0.5～1)，更优选为1:(0.6～0.8)；所述碱性试剂优选为碳酸钾，所述碳酸钾优选以碳酸钾水溶液的形式使用，所述碳酸钾水溶液的浓度优选为2mol/L；所述钯催化剂优选为四三苯基膦钯；所述铃木反应的有机溶剂优选为无水乙醇、甲醇、乙腈、DMF、DMSO、丙酮或二氯甲烷，更优选为无水乙醇。
在本发明中，所述铃木反应的温度优选为0～5℃，时间优选为16～18h；所述铃木反应优选在氮气保护下进行；在本发明的具体实施例中，所述铃木反应优选在回流条件下进行，反应过程中优选采用TLC进行监测。
在本发明的具体实施例中，优选先将对氨基苯硼酸溶于有机溶剂中，之后加入3-溴-2-甲基苯甲醇、碱性试剂和钯催化剂，封闭反应体系后，用氮气置换体系内空气，之后加热进行铃木反应。
铃木反应完成后，本发明优选将所得反应液冷却至室温，减压蒸馏去除有机溶剂，将剩余物和水混合，将所得混合液的pH值调节至6.6～7，之后采用乙酸乙酯进行提取，得到有机相；将所述有机相用无水硫酸钠干燥后减压蒸馏去除溶剂，得到第一中间体；调节所述混合液pH值采用的试剂优选为盐酸，所述盐酸的浓度优选为2mol/L。
得到第一中间体后，本发明将所述第一中间体、吡啶、三氟氯菊酰氯和有机溶剂混合进行第一偶联反应，得到第二中间体，所述第二中间体的结构如式B所示。在本发明中，所述第一中间体和吡啶的摩尔比优选为1:1，所述吡啶为缚酸剂；所述第一中间体和三氟氯菊酰氯的摩尔比优选为1:(1～1.2)；所述第一偶联反应的有机溶剂优选为氯代甲烷，更优选为二氯甲烷。
在本发明中，所述第一偶联反应优选包括依次进行第一阶段和第二阶段，所述第一阶段的反应温度优选为0～5℃，反应时间优选为2～2.5h，在本发明的具体实施例中，所述第一阶段优选在冰浴条件下进行；所述第二阶段优选在室温下进行，反应时间优选为4～5h；本发明优选采用TLC法监测反应进程。
在本发明的具体实施例中，优选先将第一中间体溶于有机溶剂中，将所得溶液冷却至0～5℃，然后用氮气置换反应装置中的空气，再在氮气保护下滴加三氟氯菊酰氯的有机溶液，滴加完毕后，依次进行第一阶段和第二阶段反应。
第一偶联反应结束后，本发明优选将所得反应液进行减压蒸馏，去除体系中的有机溶剂和吡啶，将剩余物用乙酸乙酯溶解后进行柱层析分离，得到第二中间体；所述柱层析分离所得提纯物中目标组分为从上至下第三个紫外吸收点，本发明优选先用第一展开剂冲出前两个组分，再用第二展开剂冲出目标组分，所得目标组分的洗脱液减压蒸馏，即可得到第二中间体；所述第一洗展开剂优选为乙酸乙酯和石油醚按照体积比为1:15混合得到的溶剂，所述第二展开剂为乙酸乙酯和石油醚按照体积比为1:5混合得到的溶剂。
得到第二中间体后，本发明将所述第二中间体、吡啶、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶(DMAP)混合进行第二偶联反应，得到具有式I所示结构的联苯菊酯半抗原。在本发明中，所述第二中间体和丁二酸酐的摩尔比为1:1～1.2；所述第二中间体和4-二甲氨基吡啶的摩尔比优选为1:0.1～0.12，所述4-二甲氨基吡啶为催化剂；所述吡啶作为溶剂，溶解第二中间体，同时作为缚酸剂；所述第二中间体在吡啶中的物质的量浓度为3～3.5mol/l；所述吡啶优选为无水吡啶。
在本发明中，所述第二偶联反应的温度优选为120～125℃，时间优选为12～24h；在本发明的具体实施例中，所述第二偶联反应优选在回流条件下进行。
第二偶联反应结束后，本发明优选将所得反应液减压蒸馏，将所得剩余物用水溶解，将所得溶解液的pH值调节至6.5～7.5后，用乙酸乙酯进行提取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除乙酸乙酯，再用乙酸乙酯溶解剩余物，加入和剩余物相同质量的硅胶，减压蒸馏去除乙酸乙酯，产品吸附在硅胶上呈粉末状，将此粉末进行装柱，柱子中的空白硅胶长度到柱子有效长度的三分之二处左右，随后进行硅胶柱层析提纯产品，得到联苯菊酯半抗原；所述硅胶柱层析提纯所得提纯物优选先用第一展开剂去除产品点上方的杂质，再用第二展开剂收集目标产物；所述第一展开剂优选为石油醚和乙酸乙酯按照10:1的体积比混合得到的溶剂，所述第二展开剂优选为石油醚和乙酸乙酯按照3:1的体积比混合得到的溶剂。
本发明还提供了一种联苯菊酯抗原，由上述方案所述的联苯菊酯半抗原或上述方案所述的制备方法制备得到的联苯菊酯半抗原与载体蛋白偶联得到。
优选的，所述载体蛋白为卵清蛋白或牛血清蛋白；当所述载体蛋白为卵清蛋白时，所述联苯菊酯抗原的结构式如式II所示：
当所述载体蛋白为牛血清蛋白时，所述联苯菊酯抗原的结构式如式III所示：
在本发明的具体实施例中，式II所示的联苯菊酯抗原为联苯菊酯包被原，式III所示的联苯菊酯抗原为联苯聚酯免疫原。
本发明还提供了上述方案所述联苯菊酯抗原的制备方法，包括以下步骤：
将上述方案所述的联苯菊酯半抗原、偶联剂和极性溶剂混合进行活化，得到活化的半抗原溶液；
将所述活化的半抗原溶液和载体蛋白的缓冲溶液混合进行偶联反应，得到所述联苯菊酯抗原。
本发明将上述方案所述的联苯菊酯半抗原、偶联剂和极性溶剂混合进行活化，得到活化的半抗原溶液。在本发明中，所述极性溶剂优选为DMF，所述联苯菊酯半抗原和所述极性溶液的用量比优选为10mg：30～50μL；所述偶联剂优选为二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，或为氯甲酸异丁酯，当所述偶联剂为氯甲酸异丁酯时，活化过程中优选还加入三丙胺，所述三丙胺起到缚酸剂的作用；所述活化的温度优选为室温，时间优选为12～24h。
在本发明中，制备所述联苯菊酯包被原(式II)时，采用的偶联剂优选为DCC和NHS；所述DCC和联苯菊酯半抗原的摩尔比优选为(1.5～2):1，所述NHS和联苯菊酯半抗原的摩尔比优选为(1～1.2):1；在本发明的具体实施例中，优选先将联苯菊酯半抗原溶于DMF中，然后加入NHS和DCC进行活化，活化完成后，优选将所得活化产物抽滤，去除二环己基脲，所得澄清透明滤液为所述活化的半抗原溶液。
在本发明中，制备所述联苯菊酯免疫原(式III)时，采用的偶联剂优选为氯甲酸异丁酯(同时加入三丙胺)；所述三丙胺和联苯菊酯半抗原的用量比优选为150～200μL:1mmol；所述氯甲酸异丁酯和联苯菊酯半抗原的摩尔比优选为(1～1.2):1。在本发明的具体实施例中，优选将联苯菊酯半抗原溶于DMF中，然后加入三丙胺，再在冰浴条件下加入氯甲酸异丁酯的DMF溶液，反应1h后，转移至室温下进行活化。
得到活化的半抗原溶液后，本发明将所述活化的半抗原溶液和载体蛋白的缓冲溶液混合进行偶联反应，得到所述联苯菊酯抗原。在本发明中，当制备所述联苯菊酯包被原时，采用的载体蛋白优选为OVA，制备所述联苯菊酯免疫原时，采用的载体蛋白优选为BSA；所述载体蛋白和所述联苯菊酯半抗原的摩尔比优选为(40～50):1；所述载体蛋白的缓冲溶液优选由载体蛋白溶解于CB缓冲溶液中得到，所述CB缓冲液的浓度优选为0.02mol/L；本发明优选将活化的半抗原溶液逐滴加入所述载体蛋白的缓冲溶液中，加入完毕后在室温下进行反应。
在本发明中，所述偶联反应的温度优选为室温，时间优选为2～2.5h。
在本发明中，所述联苯菊酯包被原(式II)的合成过程如Chem2所示：
在本发明中，所述联苯菊酯免疫原(式III)的合成过程如Chem3所示：
偶联反应完成后，本发明优选将所得反应液离心，吸取上清液，将所述上清液透析，得到所述联苯菊酯抗原。在本发明中，所述透析用透析袋的截留分子量优选为8000～14000，所述透析袋优选采用EDTA溶液处理，并用蒸馏水洗净后使用；所述EDTA溶液的浓度优选为0.2mol/L；透析用透析液优选为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的浓度优选为0.02mol/L；所述透析的时间优选为3天，每天更换2次透析液。透析结束后，优选将透析袋中的溶液析出，分装冻存备用。
本发明还提供了一种联苯菊酯抗体，由上述方案所述的联苯菊酯抗原免疫宿主动物得到；所述宿主动物优选为小鼠；本发明对所述免疫的方法没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的方法即可；在本发明的具体实施例中，优选使用不完全弗氏佐剂将联苯菊酯免疫原稀释液乳化后再对宿主动物进行免疫；所述联苯菊酯免疫原稀释液采用的稀释剂优选为灭菌后的1％氯化钠溶液。
在本发明的具体实施例中，制备联苯菊酯抗体的过程优选如下：
采用乳化后的联苯菊酯免疫原对宿主动物进行免疫，得到免疫动物，利用ELISA方法对免疫动物进行血清测试，当血清参数达到需求后按单抗制备方法进行单抗制备；
提取所述免疫动物的脾细胞并和同系骨髓瘤细胞进行融合，得到融合细胞；
对所述融合细胞进行杂交瘤筛选；
采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养，采用免疫学方法筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。
本发明还提供了一种检测联苯菊酯的试纸或试剂盒，含有上述方案所述的联苯菊酯抗体。
本发明还提供了上述方案所述联苯菊酯抗体或上述方案所述的试纸或试剂盒在检测联苯菊酯中的应用；所述检测联苯菊酯的方法优选为ELLSA试剂盒法或胶体金法。采用本发明的联苯菊酯抗原免疫小鼠，所得抗体效价高、灵敏度高，将其应用于联苯菊酯的检测中，能够提高检测方法的准确度和灵敏度。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
联苯菊酯半抗原的合成：将4.75g对氨基苯硼酸溶于无水乙醇，加入3-溴-2-甲基苯甲醇7.67g、2mol/L的碳酸钾溶液34.7mL和四三苯基膦钯481mg，封闭反应体系，用氮气置换体系内的空气，重复三次，油浴加热回流反应16h，期间用TLC法检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，减压蒸馏去除乙醇，在剩余物中加水，将其pH调节至7，再用乙酸乙酯充分提取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏脱除溶剂，得淡黄色油状液体5.52g，即为第一中间体(式A)。
将5.52g第一中间体溶于二氯甲烷，先冰浴冷却至0℃，再用氮气置换瓶子内的空气，氮气保护下缓慢滴加三氟氯菊酰氯(7.43g)的二氯甲烷溶液和2.04g无水吡啶，加毕，保持冰浴反应2h，再撤去冰浴，继续反应4h，TLC法检测，反应完全后，将二氯甲烷和吡啶减压蒸馏除去，剩余物用乙酸乙酯溶解，干法上样过柱，目标组分为从上至下第三个紫外吸收点，先用EA:PE＝1:15冲出前两个组分，冲出的展开剂无紫外吸收后，换成EA:PE＝1:5冲出第三个组分，减压蒸馏得淡黄色固体8.83g，即为第二中间体(式B)。
将4.26g第二中间体溶于无水吡啶中，加入1.07g丁二酸酐和0.769gDMAP，120℃回流反应过夜，次日，检测反应，原料基本已经反应完全，将反应液减压蒸馏，充分去除吡啶，用水溶解剩余物，调节pH值为7左右，用乙酸乙酯提取，直到无主要的产物点，产品用硅胶柱层析提纯，展开剂为PE:EA＝10:1去除产品点上方的微量杂质，然后将展开剂换为PE:EA＝3:1，收集主要的紫外点，得联苯菊酯半抗原，经高效液相色谱测定，其纯度为92.3％；图1为所得联苯菊酯半抗原的核磁共振氢谱图，根据图1可以确定，产物具有目标结构。
联苯菊酯包被原的合成：
将12mg联苯菊酯半抗原溶于40μL DMF中，加入4.13mg NHS和13.6mg DCC，25℃反应过夜，次日，将反应液抽滤，除去二环己基脲，得澄清透明液体备用，称取29mg OVA溶于0.02mol/L的CB缓冲液中，澄清后，逐滴加入制备好的半抗原的DMF活化溶液，加毕，室温反应2h，然后将反应液离心，吸取上清液，加入用0.2mol/L的EDTA溶液处理过且用蒸馏水洗干净的透析袋中透析3天，透析液为PBS，每天更换2次透析液，透析结束后，将透析袋中的溶液吸出，即为联苯菊酯包被原，分装冻存备用。
联苯菊酯免疫原的合成：
将10mg联苯菊酯半抗原溶于30μL DMF中，加入10μL三丙胺，冰浴下加入34.3mg氯甲酸异丁酯溶于30μL DMF的溶液，反应1h，然后室温反应过夜，次日，称取29mg BSA溶于0.02mol/L的CB缓冲液中，澄清后，逐滴加入制备好的半抗原的DMF活化溶液，加毕，室温反应2h，然后将反应液离心，吸取上清液，加入用0.2mol/L的EDTA溶液处理过且用蒸馏水洗干净的透析袋中透析3天，透析液为0.02mol/L的PBS，每天更换2次透析液，透析结束后，将透析袋中的溶液吸出，即为联苯菊酯的免疫原，分装冻存备用。
实施例2
联苯菊酯半抗原的合成：将2.73g对氨基苯硼酸溶于无水乙醇，加入3-溴-2-甲基苯甲醇4.42g、2mol/L的碳酸钾溶液19.9mL和四三苯基膦钯275mg，封闭反应体系，用氮气置换体系内的空气，重复三次，油浴加热回流反应16h，期间用TLC法检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，减压蒸馏去除乙醇，在剩余物中加水，将其pH调节至7，再用乙酸乙酯充分提取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏脱除溶剂，得淡黄色油状液体3.48g，即为第一中间体(式A)。
将3.48g第一中间体溶于二氯甲烷，先冰浴冷却至0℃，再用氮气置换瓶子内的空气，氮气保护下缓慢滴加三氟氯菊酰氯(4.68g)的二氯甲烷溶液和无水吡啶1.29g，加毕，保持冰浴反应2h，再撤去冰浴，继续反应4h，TLC法检测，反应完全后，将二氯甲烷和吡啶减压蒸馏除去，剩余物用乙酸乙酯溶解，干法上样过柱，目标组分为从上至下第三个紫外吸收点，先用EA:PE＝1:15冲出前两个组分，冲出的展开剂无紫外吸收后，换成EA:PE＝1:5冲出第三个组分，减压蒸馏得淡黄色固体5.35g，即为第二中间体(式B)。
将5.35g第二中间体溶于无水吡啶中，加入1.34g丁二酸酐和0.18gDMAP，120℃回流反应过夜，次日，检测反应，原料基本已经反应完全，将反应液减压蒸馏，充分去除吡啶，用水溶解剩余物，调节pH为7左右，用乙酸乙酯提取，直到无主要的产物点，产品用硅胶柱层析提纯，展开剂为PE:EA＝10:1去除产品点上方的微量杂质，然后将展开剂换为PE:EA＝3:1，收集主要的紫外点，得联苯菊酯半抗原4.49g，经高效液相色谱测定，其纯度为98.4％。
联苯菊酯包被原的合成：
将15mg联苯菊酯半抗原溶于40μL DMF中，加入3.8mg NHS和11.5mg DCC，25℃反应过夜，次日，将反应液抽滤，除去二环己基脲，得澄清透明液体备用，称取31mg OVA溶于0.02mol/L的CB缓冲液中，澄清后，逐滴加入制备好的半抗原的DMF活化溶液，加毕，室温反应2h，然后将反应液离心，吸取上清液，加入用0.2mol/L的EDTA溶液处理过且用蒸馏水洗干净的透析袋中透析3天，透析液为PBS，每天更换2次透析液，透析结束后，将透析袋中的溶液吸出，即为联苯菊酯包被原，分装冻存备用。
联苯菊酯免疫原的合成：
将15mg联苯菊酯半抗原溶于30μL DMF中，加入10μL三丙胺，冰浴下加入4.5mg氯甲酸异丁酯溶于30μL DMF的溶液，反应1h，然后室温反应过夜，次日，称取46mg BSA溶于0.02mol/L的CB缓冲液中，澄清后，逐滴加入制备好的半抗原的DMF活化溶液，加毕，室温反应2h，然后将反应液离心，吸取上清液，加入用0.2mol/L的EDTA溶液处理过且用蒸馏水洗干净的透析袋中透析3天，透析液为0.02mol/L的PBS，每天更换2次透析液，透析结束后，将透析袋中的溶液吸出，即为联苯菊酯的免疫原，分装冻存备用。
实施例3
联苯菊酯半抗原的合成：将5.36g对氨基苯硼酸溶于无水乙醇，加入3-溴-2-甲基苯甲醇8.65g、2mol/L的碳酸钾溶液39mL和四三苯基膦钯540mg，封闭反应体系，用氮气置换体系内的空气，重复三次，油浴加热回流反应16h，期间用TLC法检测反应，反应完全后，将反应液冷却至室温，减压蒸馏去除乙醇，在剩余物中加水，将其pH调节至7，再用乙酸乙酯充分提取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏脱除溶剂，得淡黄色油状液体6.83g，即为第一中间体(式A)。
将6.83g第一中间体溶于二氯甲烷，先冰浴冷却至0℃，再用氮气置换瓶子内的空气，氮气保护下缓慢滴加三氟氯菊酰氯(9.19g)的二氯甲烷溶液和2.53g无水吡啶，加毕，保持冰浴反应2h，再撤去冰浴，继续反应4h，TLC法检测，反应完全后，将二氯甲烷和吡啶减压蒸馏除去，剩余物用乙酸乙酯溶解，干法上样过柱，目标组分为从上至下第三个紫外吸收点，先用EA:PE＝1:15冲出前两个组分，冲出的展开剂无紫外吸收后，换成EA:PE＝1:5冲出第三个组分，减压蒸馏得淡黄色固体2.78g，即为第二中间体(式B)。
将2.78g第二中间体溶于无水吡啶中，加入0.699g丁二酸酐和0.093gDMAP，120℃回流反应过夜，次日，检测反应，原料基本已经反应完全，将反应液减压蒸馏，充分去除吡啶，用水溶解剩余物，调节pH为7左右，用乙酸乙酯提取，直到无主要的产物点，产品用硅胶柱层析提纯，展开剂为PE:EA＝10:1去除产品点上方的微量杂质，然后将展开剂换为PE:EA＝3:1，收集主要的紫外点，得联苯菊酯半抗原1.65g，经高效液相色谱测定，其纯度为95.2％。
联苯菊酯包被原的合成：
将18mg联苯菊酯半抗原溶于40μL DMF中，加入4.6mg NHS和13.6mg DCC，25℃反应过夜，次日，将反应液抽滤，除去二环己基脲，得澄清透明液体备用，称取36.9mg OVA溶于0.02mol/L的CB缓冲液中，澄清后，逐滴加入制备好的半抗原的DMF活化溶液，加毕，室温反应2h，然后将反应液离心，吸取上清液，加入用0.2mol/L的EDTA溶液处理过且用蒸馏水洗干净的透析袋中透析3天，透析液为0.02mol/lPBS，每天更换2次透析液，透析结束后，将透析袋中的溶液吸出，即为联苯菊酯包被原，分装冻存备用。
联苯菊酯免疫原的合成：
将18mg联苯菊酯半抗原溶于30μL DMF中，加入10μL三丙胺，冰浴下加入5.46mg氯甲酸异丁酯溶于30μL DMF的溶液，反应1h，然后室温反应过夜，次日，称取55mg BSA溶于0.02mol/L的CB缓冲液中，澄清后，逐滴加入制备好的半抗原的DMF活化溶液，加毕，室温反应2h，然后将反应液离心，吸取上清液，加入用0.2mol/L的EDTA溶液处理过且用蒸馏水洗干净的透析袋中透析3天，透析液为0.02mol/L的PBS，每天更换2次透析液，透析结束后，将透析袋中的溶液吸出，即为联苯菊酯的免疫原，分装冻存备用。
测试例1ELISA测试
对小鼠进行免疫：
选择纯种BALB/c小鼠15只，年龄4-6周，分别用不同颜色标注1-5号，取6只2mL体积注射器，3支吸取不完全弗氏佐剂0.5mL，另3只分别吸取含有联苯菊酯免疫原50μg、100μg、200μg的联苯菊酯免疫原溶液0.5mL(用灭菌后1％氯化钠溶液稀释)，分别标注好号后一支不完全弗氏佐剂注射器和一支免疫原注射器的注射头用输液管连接一起(长度以把两个注射器头连接对在一起为宜)，然后两只手分别来回推注射器直至完全乳化(乳化标注为内部液体为白色乳状，推动过程中能感觉稍微阻力，滴水中成小滴不扩散)，乳化过程中直至乳化好中途不能停止。乳化完成后，对小鼠进行皮下(背部和腹部)多点注射，每只小鼠大概注射0.2mL左右。同样方法每间隔2周重复一次，完成3次后开始进行采血测试；
采血方法：左手拇指、食指和中指抓取小鼠的颈部头皮，小指和无名指固定尾巴；轻压需要摘取的眼部皮肤，使眼球充血突出；用玻璃毛细管从小鼠眼球突出处垂直插入，轻轻左右转动，直至毛细管中流入血(大概毛细管2/3处)，取出用洗耳球把毛细管中血吹入0.5mL离心管中(低温存放)；采血完成后放入37℃烤箱烤30min，后放入低温高速离心机中(10000转/min)离心10min，分离出血清用于ELISA方法测试。
单抗制备过程：
细胞融合
采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
选择性培养
选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化
在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。
单克隆抗体的大量制备
取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。
ELISA测试使用到的试剂配方如下：
封闭液(1L体积)：脱脂奶粉2.5g，氯化钠8g，磷酸二氢钾0.6g，磷酸氢二钠5.8g，蔗糖50g，氯化钾0.9g，防腐剂0.5mL，牛血清50mL，余量为水。
酶稀(16L)：氯化钠128g，磷酸二氢钾9.48g，磷酸氢二钠92.8g，甘油800mL，牛血清3200mL，防腐剂12mL，余量为水。
样稀(4L)：氯化钠23.38g，氯化钾0.118g，磷酸二氢钾3.48g，磷酸二氢钠2.19g，磷酸氢二钠20.64g，曲拉通40mL，防腐剂1.5mL，余量为水。
底物A液(100mL)：柠檬酸0.48g，过氧化尿素0.05g，冰醋酸90mL，余量为水。
底物B液(400mL)：柠檬酸0.164g，盐酸盐TMB 0.2g，N-N 4mL，甲醇14mL，1mol/L盐酸160μL，余量为水。
20×浓缩洗液(40L)：氯化钠2560g，磷酸氢二钠928g，磷酸二氢钾80g，氯化钾1.44g，防腐剂12mL，吐温20 800mL，余量为水。
具体测试方法如下：
(1)抗原包被：用CB缓冲液把联苯菊酯包被抗原稀释为1K比例，稀释后按100μL/孔加入酶标板微孔板中，盖盖板膜放37℃中包被2h。
(2)封闭：包被完后取出泼掉包被液后用洗涤工作液(20×浓缩洗液稀释为1×)，250μL/孔或用洗壶洗1次，浸泡30s，泼掉后用吸水纸或毛巾拍干，加入封闭液150μL/孔，放入37℃恒温培养箱中反应2h，取出泼掉封闭液拍干待用。
(3)不同标准品浓度的稀释：用0.02mol/LPBS缓冲液把直接购买的100μg/mL的联苯菊酯高标稀释成0ppb(直接为PBS缓冲液)、5ppb、20ppb、50ppb。
(4)酶标二抗工作液的稀释：用酶稀缓冲液把直接把购买酶标二抗原液稀释成1:1K的浓度。
(5)血清或单抗工作液的稀释：用样稀缓冲液把血清或制备单抗按1:1K、1:5K、1:1W、1:5W的浓度进行稀释。
(6)检测步骤：按棋盘法方案进行测试，具体操作步骤如下：
1)加标准品/样本：加入标准品/样本50μL到对应的微孔中。
2)加血清或单抗工作液：加血清或单抗工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。
3)洗板加酶二抗工作液：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)，加酶标二抗工作液100μL/孔，用盖板膜盖板后置于37℃避光环境中反应30min。
4)洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。
5)显色：加入底物A液和B液各50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应15min。
6)测定：加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔OD值。
在满足相关技术参数情况下，OD值为2.0左右时，抗体的最大稀释倍数为抗体效价；以标准品浓度为横坐标，以对应吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，并根据标准曲线计算联苯菊酯的半数抑制浓度(IC50值)。
测试结果如表1～表5所示。
表1 1免疫后采血清测试数据
表2 2免疫后采血清测试数据
表3 3免疫后采血清测试数据
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表4 采全血清测试数据
表5 制备单抗测试数据
根据表1～表3中的数据可以看出，随着免疫次数的增加，血清中联苯菊酯抗体的浓度逐渐增加；根据表4中的数据可以看出，血清中联苯菊酯抗体浓度已经基本达到1W，IC50小于20ppb；根据表5中的结果进行计算，结果显示，制备单抗的效价为1×104，半抑制浓度(IC50)小于20ppb。
测试例2胶体金测试
测试方法如下：
(1)划板：用pH值为7.2，0.02mol/L的PB缓冲液按照1:10,1:20,1:50,1:100的比例分别稀释包被抗原，作为T线包被液，用pH值为7.2，0.02mol/L的PB+10％BSA缓冲液按照1:60稀释二抗作为C线包被液，均按1μL/cm量进行划板，划完后放37℃烤12h(背板用上海杰一30*6cm2线PVC板、吸水纸用上海捷宁Spec30*20cm、NC膜用上海捷宁JN-140)。
(2)金标垫处理标准：上海杰一普通玻璃纤维切成30*1cm2尺寸，用pH值为7.2，0.02mol/L的PB+10％BSA缓冲液每条按1.5mL量进行处理，放37℃干燥过夜(12h以上)。
(3)样品垫处理标准：上海捷宁SF-06无纺布切成30*1.7cm2尺寸，用pH值7.2，0.02mol/L的PB+0.5％吐温-20+1％蔗糖缓冲液每条按2mL量进行处理，放37℃干燥过夜(12h以上)。
(4)标金：用纯净水先将血清或单抗进行1:10倍稀释混匀，分别取4管1mL 40nm大小颗粒的胶体金溶液，分别加入0.02mol/L的K2CO330μL调pH，混匀后分别加入稀释好的血清或单抗稀释液10μL、20μL、30μL、40μL，混匀后室温放置反应30min，然后分别加入封闭液(20％BSA水溶液)25μL，室温放置反应20min，于10000转/分钟低温(2～8℃)离心10min，去除上清，剩余物加100μL复溶液进行复溶(复溶液为离心后上清液1mL+50μl40％蔗糖水溶液混匀)，按3μL/cm的量进行喷金，于37℃烤2h。
(5)干烟叶样品前处理方法
1)检测前将干烟叶样品烘干后粉成细粉。
2)称取1±0.05g样品放至10mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL甲醇中，盖上盖子，手动振荡30s，静置分层。
3)取样品上清液100μL加入2mL聚苯乙烯离心管中，加入500μL稀释液(pH7.2，0.02mol/L的PB)，振荡混匀即为样品待检液。
(6)干烟叶样品检测方法
1)取样品待检液70μL或用滴管垂直滴3滴于加样孔中。
2)液体流动时开始计时，反应10min，利用分析软件、胶体金读数仪或目测判读结果；本发明采用5个干烟叶样品，分别记为1#、2#、3#、4#和5#；在干烟叶样品中添加联苯菊酯标准品，控制1g干烟叶中联苯菊酯的添加浓度分别为0ppb、1250ppb、2500ppb和5000ppb。测试结果如表6所示。
表6 制备单抗制备胶体金干烟叶检测限测试数据
取干烟叶样品3#，进行5次平行测试，测试结果见表7。
表7 制备单抗制备胶体金干烟叶平行性测试数据
表6中的结果表明，采用本发明的制备单抗制备胶体金，对干烟叶样品中联苯菊酯的最低检测限为1250ng/g左右，灵敏度高；根据表7中的数据可以看出，本发明提供的检测方法平行性好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种联苯菊酯半抗原，其特征在于，具有式I所示结构：
2.权利要求1所述联苯菊酯半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将对氨基苯硼酸、3-溴-2-甲基苯甲醇、碱性试剂、钯催化剂和有机溶剂混合进行铃木反应，得到第一中间体；所述第一中间体的结构如式A所示；
将所述第一中间体、吡啶、三氟氯菊酰氯和有机溶剂混合进行第一偶联反应，得到第二中间体，所述第二中间体的结构如式B所示；
将所述第二中间体、吡啶、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶混合进行第二偶联反应，得到具有式I所示结构的联苯菊酯半抗原。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述对氨基苯硼酸和3-溴-2-甲基苯甲醇的摩尔比为1:(1～1.2)；所述对氨基苯硼酸和碱性试剂的摩尔比为1:(0.5～1)；所述对氨基苯硼酸和钯催化剂的摩尔比为1:(0.5～1)；
所述第一中间体和三氟氯菊酰氯的摩尔比为1:(1～1.2)；
所述第二中间体和丁二酸酐的摩尔比为1:(1～1.2)。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述铃木反应的温度为78～80℃，时间为16～18h；
所述第一偶联反应包括依次进行第一阶段和第二阶段，所述第一阶段的反应温度为0～5℃，反应时间为2～2.5h；所述第二阶段的反应温度为室温，反应时间优选为4～5h；
所述第二偶联反应的温度为120～125℃，时间为12～24h。
5.一种联苯菊酯抗原，其特征在于，由权利要求1所述的联苯菊酯半抗原或权利要求2～4任意一项所述的制备方法制备得到的联苯菊酯半抗原与载体蛋白偶联得到。
6.根据权利要求5所述的联苯菊酯抗原，其特征在于，所述载体蛋白为卵清蛋白或牛血清蛋白；当所述载体蛋白为卵清蛋白时，所述联苯菊酯抗原的结构式如式II所示：
当所述载体蛋白为牛血清蛋白时，所述联苯菊酯抗原的结构式如式III所示：
7.权利要求5或6所述联苯菊酯抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1所述的联苯菊酯半抗原、偶联剂和极性溶剂混合进行活化，得到活化的半抗原溶液；
将所述活化的半抗原溶液和载体蛋白的缓冲溶液混合进行偶联反应，得到所述联苯菊酯抗原。
8.一种联苯菊酯抗体，其特征在于，由权利要求5～6任意一项所述的联苯菊酯抗原免疫宿主动物得到。
9.一种检测联苯菊酯的试纸或试剂盒，其特征在于，含有权利要求8所述的联苯菊酯抗体。
10.权利要求8所述联苯菊酯抗体或权利要求9所述的试纸或试剂盒在检测联苯菊酯中的应用。
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