CN107652345B - 化合物、缀合物、试剂盒及其用途 - Google Patents

化合物、缀合物、试剂盒及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN107652345B
CN107652345B CN201610591144.8A CN201610591144A CN107652345B CN 107652345 B CN107652345 B CN 107652345B CN 201610591144 A CN201610591144 A CN 201610591144A CN 107652345 B CN107652345 B CN 107652345B
Authority
CN
China
Prior art keywords
progesterone
compound
conjugate
analogue
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610591144.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107652345A (zh
Inventor
何飞
李可
唐涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Mindray Bio Medical Electronics Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen Mindray Bio Medical Electronics Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Mindray Bio Medical Electronics Co Ltd filed Critical Shenzhen Mindray Bio Medical Electronics Co Ltd
Priority to CN201610591144.8A priority Critical patent/CN107652345B/zh
Publication of CN107652345A publication Critical patent/CN107652345A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107652345B publication Critical patent/CN107652345B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J7/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms
    • C07J7/0005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21
    • C07J7/001—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group
    • C07J7/0015—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group not substituted in position 17 alfa
    • C07J7/002—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group not substituted in position 17 alfa not substituted in position 16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J7/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms
    • C07J7/0005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21
    • C07J7/001—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group
    • C07J7/004—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group substituted in position 17 alfa
    • C07J7/0045—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group substituted in position 17 alfa not substituted in position 16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C12Y111/01007—Peroxidase (1.11.1.7), i.e. horseradish-peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03001—Alkaline phosphatase (3.1.3.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones

Abstract

本发明公开了化合物、缀合物、检测孕酮或其类似物的试剂盒及试剂盒在检测孕酮或其类似物中的用途。所述化合物具有下列之一的结构，其中，L表示连接臂，R11、R21、R12、R22、R13、R23、R14、R24、R15、R25、R16和R26分别独立地为氢基、羟基、C1～3烷基、C1～3烷氧基、C2～3烯基或C2～3炔基。本发明的化合物能够准确地对孕酮或其类似物进行检测。

Description

化合物、缀合物、试剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及分析领域。具体地，本发明涉及化合物、缀合物、试剂盒及其在检测孕酮或其类似物中的用途。更具体地，本发明涉及化合物、缀合物、检测孕酮或其类似物的试剂盒及检测孕酮或其类似物的试剂盒在检测孕酮或其类似物中的用途。
背景技术
孕酮类似物是指与孕酮具有相似结构的物质，即具有如下母核结构单元。
Figure DEST_PATH_GDA0001124598900000011
目前，利用免疫法对孕酮或其类似物检测的原理为：由于孕酮或其类似物上没有可以直接连接上标记分子的官能团，需要经过化学合成的方法引入可以直接连接上标记分子的结构(称为连接臂，可以为羧基、氨基等)，得到孕酮衍生物。接着，通过化学方法将孕酮衍生物的连接臂连接到标记分子上，制备成孕酮标记分子。在检测过程中，孕酮标记分子与待测样本中的孕酮或其类似物竞争结合抗体，利用标记分子直接或者间接产生的光信号，经过校准获得待测孕酮或其类似物的浓度值，从而完成对待测样本中的孕酮或其类似物含量的测定。
然而，目前适用的孕酮衍生物仍有待开发。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
孕酮或其类似物上引入连接臂的位置选择是难点，既需要保证孕酮或其类似物能够与抗体特异性结合，又要保证连接臂连接稳定，不易丢失。进而，本发明的发明人通过对孕酮或其类似物的结构进行深入研究发现，通过在孕酮或其类似物结构的6、7、11或12位碳上引入连接臂得到孕酮衍生物。引入的连接臂不会破坏其抗原决定簇的结构和空间位阻，且孕酮衍生物能够有效地与相应抗体特异性结合，达到准确检测孕酮或其类似物含量的目的。
有鉴于此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种化合物。根据本发明的实施例，所述化合物具有下列之一的结构，其中，L表示连接臂，R11、R21、R12、R22、R13、R23、R14、R24、R15、R25、R16和R26分别独立地为氢基、羟基、C1～3烷基、C1～3烷氧基、C2～3烯基或C2～3炔基。发明人经过大量实验发现，通过在孕酮或其类似物结构的6、7、11或12位碳上修饰合成出连接臂，得到本发明的化合物——孕酮衍生物，引入的连接臂不会破坏抗原决定簇的结构和空间位阻，能够有效地与相应抗体特异性结合，且结合率较高。此外，根据本发明的实施例，该化合物容易获得，且生产成本低，易于推广应用。
Figure DEST_PATH_GDA0001124598900000021
在本发明的第二方面，本发明提出了一种缀合物。根据本发明的实施例，所述缀合物包括前面所描述的化合物和标记分子，所述标记分子与所述化合物的连接臂相连。根据本发明实施例的缀合物能够有效地与抗体特异性结合，通过标记分子直接或者间接与检测底物进行反应产生的可检测信号，以准确地确定孕酮或其类似物的含量。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种检测孕酮或其类似物的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前面所描述的缀合物。发明人发现，利用本发明的试剂盒，基于缀合物能够有效地与抗体特异性结合，通过标记分子直接或者间接与检测底物进行反应产生的可检测信号，以准确地确定孕酮或其类似物的含量。
在本发明的第四方面，本发明提出了前面描述的试剂盒在检测孕酮或其类似物中的用途。如前所述，根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒能够准确有效地对孕酮或其类似物进行检测。
此外，根据本发明的实施例，化合物、缀合物、检测孕酮或其类似物的试剂盒以及所述试剂盒在检测孕酮或其类似物的用途具有下列优点的至少之一：
通过在孕酮或其类似物结构的6、7、11或12位碳上引入连接臂得到的本发明的化合物—孕酮衍生物，引入的连接臂不会破坏抗原决定簇的结构和空间位阻，能够有效地与相应抗体特异性结合，且结合率较高，该化合物容易获得，且生产成本低，易于推广应用。此外，该化合物能够连接到标记分子上，得到缀合物，并将其应用于孕酮或其类似物的检测，能够基于免疫检测原理(如显色、光信号变化等)准确地检测样本中孕酮或其类似物的含量。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的检测孕酮的过程示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的曲线图；
图3显示了根据本发明另一个实施例的曲线图；
图4显示了根据本发明又一个实施例的标准曲线图；
图5显示了根据本发明又一个实施例的标准曲线图；
图6显示了根据本发明一个实施例的曲线图；
图7显示了根据本发明一个实施例的检测17α-羟基孕酮的过程示意图；
图8显示了根据本发明另一个实施例的曲线图；
图9显示了根据本发明又一个实施例的曲线图；
图10显示了根据本发明又一个实施例的曲线图；以及
图11显示了根据本发明又一个实施例的曲线图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明提出了化合物、缀合物、检测孕酮或其类似物的试剂盒及检测孕酮或其类似物的试剂盒在检测孕酮或其类似物中的用途，下面将分别对其进行详细描述。
化合物
在本发明的第一方面，本发明提出了一种化合物。根据本发明的实施例，该化合物具有式(1)或(2)所示的结构，其中，L表示连接臂，R11、R21、R12、R22、R13、R23、R14、R24、R15、R25、R16和R26分别独立地为氢基、羟基、C1～3烷基、C1～3烷氧基、C2～3烯基或 C2～3炔基。
Figure DEST_PATH_GDA0001124598900000041
需要说明的是，关于式(1)所示化合物的连接臂L衍生位点的确定，发明人进行了大量实验研究。
具体地，首先，如下式所示：
Figure DEST_PATH_GDA0001124598900000042
发明人发现，以6、7、11或12位碳设置为衍生位点，能够较容易地引入连接臂L，不会破坏抗原决定簇的结构，且合成的化合物稳定性强，L不易丢失。在该位点引入L所得到的化合物能够有效地与抗原进行特异性结合，进而能够准确地对孕酮或其类似物进行检测。然而，以其他位点引入连接臂所得到的化合物对孕酮或其类似物检测的效果不佳。进而，发明人以6、7、11或12位碳设置为衍生位点，引入连接臂，从而得到本申请的化合物—孕酮衍生物。
需要说明的是，参见式(b)所示化合物，取代基L画一个键连接到中心的环上所形成的环体系代表取代基L取代环上面6位碳上的氢(如式(b1)所示化合物)或7位碳上的氢(如式(b2)所示化合物)。同理地，参见式(c)所示化合物，取代基L画一个键连接到中心的环上所形成的环体系代表取代基L取代环上面11位碳上的氢(如式(c1)所示化合物)或12位碳上的氢(如式(c2)所示化合物)。
Figure DEST_PATH_GDA0001124598900000051
根据本发明的实施例，R11、R12、R13、R14、R21、R23和R24分别独立地为氢基，R15、R16、R25和R26分别独立地为羟基，R22为氢基或羟基。根据本发明的另一个实施例，该化合物具有以下之一的结构：
Figure DEST_PATH_GDA0001124598900000052
根据本发明的实施例，该化合物具有以下之一的结构：
Figure DEST_PATH_GDA0001124598900000053
Figure DEST_PATH_GDA0001124598900000061
缀合物
在本发明的第二方面，本发明提出了一种缀合物。本发明化合物可作为式(1)或式(2)所示化合物的缀合物的形式使用。本文中使用的“缀合物”是指本发明作为式(1)或式(2)所示化合物通过其连接臂以共价键与标记分子连接而形成的化合物。根据本发明实施例的缀合物能够有效地与抗体特异性结合，通过标记分子直接或者间接与检测底物进行反应产生的可检测信号，以准确地确定孕酮或其类似物的含量。
根据本发明的实施例，对标记分子的种类不作严格限定。根据本发明的一些实施例，标记分子为生物素、酶、吖啶酯或其类似物、吡啶钌或其类似物、异鲁米诺或其类似物、异硫氰酸荧光素或其类似物。
根据本发明的实施例，对酶的种类不作严格限定。其中，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或乙酰蛋白酶与催化底物特异性结合能力强，用于免疫检测时效率高，检测结果准确可靠。因而，根据本发明的一些优选实施例，酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或乙酰蛋白酶。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对化合物所描述的特征和优点同样适用于该缀合物，在此不再赘述。
检测孕酮或其类似物的试剂盒
在本发明的第三方面，本发明提出了一种检测孕酮或其类似物的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前面所描述的缀合物。发明人发现，利用本发明的试剂盒，基于缀合物能够有效地与抗体特异性结合，且基于其携带的标记分子能够直接或者间接地与检测底物发生反应，产生可检测信号，从而能够准确地检测样本中孕酮或其类似物的含量。
根据本发明的实施例，孕酮类似物为17α-羟基孕酮。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对缀合物所描述的特征和优点同样适用于该检测孕酮或其类似物的试剂盒，在此不再赘述。
检测孕酮或其类似物的试剂盒在检测孕酮或其类似物中的用途
在本发明的第四方面，本发明提出了一种检测孕酮或其类似物的试剂盒在检测孕酮或其类似物中的用途。如前所述，根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒能够准确有效地对孕酮或其类似物进行检测。
根据本发明的实施例，试剂盒是采用竞争结合法对孕酮或其类似物进行检测。试剂盒中的衍生物结构与孕酮或其类似物具有几乎相同的特异性结合的结构，将竞争性地结合抗体。根据本发明的具体实施例，可以先将含有孕酮或其类似物的样本、抗体、固相载体及缀合物一起进行孵育，使缀合物所携带的衍生物与样本中的孕酮或其类似物竞争性结合抗体，得到缀合物-抗体-固相载体复合物及孕酮或其类似物-抗体-固相载体复合物，洗涤游离的孕酮或其类似物和缀合物，再将复合物与检测底物混合，使标记分子与检测底物产生可检测信号(如光信号)，从而确定样本中孕酮或其类似物的含量。具体地，固相载体可以为磁微粒、胶体金或纤维素膜。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对检测孕酮或其类似物的试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于该检测孕酮或其类似物的试剂盒在检测孕酮或其类似物中的用途，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
在该实施例中，按照下列过程合成式(3)所示的化合物：
Figure DEST_PATH_GDA0001124598900000071
合成路线如下所示：
Figure DEST_PATH_GDA0001124598900000081
1、合成化合物2：
投料4.72g(0.015mol)孕酮于250mL干燥圆底烧瓶中，加入120mL苯搅拌溶解。加入2.5g(0.04mol)乙二醇、0.6g TsOH(对甲苯磺酸)。升温加热回流分水。反应2小时，约分出0.5mL水。定时取样，利用薄层色谱(体系为正己烷/乙酸乙酯＝6/1，磷钼酸显色)对样品进行检测，待显示原料消失时，停止加热。回到室温后，将反应液转至分液漏斗中，冰饱和食盐水洗4次，无水硫酸钠干燥，浓缩，抽干，得6.3g油状的化合物2，反应产率104.3％。
MS：正离子峰：403.6，425.6(+Na峰)。
2、合成化合物3：
投料上一步得到的化合物2粗品6.3g，加入100mL四氯化碳溶解，升温到40℃。搅拌下，分批加入3.56g(0.02mol)NBS，3次加完，再继续反应1.5小时。停止反应，回到室温后，将反应液转至分液漏斗中，冰饱和食盐水洗两次，饱和NaHCO3溶液洗两次。无水硫酸钠干燥，浓缩，抽干，得红棕色油状物6.9g。过柱纯化，得到4.6g化合物3，两步反应产率63.7％。
MS：正离子峰：480.4，482.4。
3、合成化合物4：
NaH处理：取20g 60％NaH于250mL干燥烧瓶，用重蒸正己烷洗三次，弃去正己烷层，固体NaH用油泵抽干，冲入氮气保护。
投料1.85g(14mmol)4-羟基丁酸乙酯于100mL干燥冷却三口瓶，氮气保护下加入50mL DMF，搅拌均匀，冰水浴冷却。0.44g(18mmol)NaH(处理过)加入到反应瓶中。加完后，继续搅拌40分钟。4.5g(9.35mmol)化合物3溶解于10mL DMF中，缓慢滴加到反应瓶中，滴加完毕，继续搅拌1小时。撤去冰水浴，室温搅拌过夜。
次日，将反应液倒入冰水中，乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得化合物4粗品4.7g。
MS：正离子峰：533.7，555.7(+Na峰)。
4、合成式(3)所示化合物：
投料化合物4粗品4.7g，加入40mL甲醇溶解，滴加10mL 2M NaOH溶液，滴加完毕，继续搅拌1小时。加入20mL水，减压除去甲醇。剩余水层用甲基叔丁基醚洗三次，留水层转移至反应瓶中。
加入40mL甲醇，搅拌下，滴加1M HCl，调pH＝2，继续搅拌2小时，旋转蒸发除去甲醇，有白色固体析出。置4度冰箱静置1小时，抽滤得到粗品，重结晶得到式(3)所示化合物2.2g，两步总产率约为56.5％。
MS：正离子峰：417.5；负离子峰：415.5。
实施例2
在该实施例中，按照下列过程合成式(4)所示的化合物：
Figure DEST_PATH_GDA0001124598900000091
合成路线如下所示：
Figure DEST_PATH_GDA0001124598900000101
1、合成化合物7：
投料5g(0.015mol)17a-羟基孕酮于250mL干燥圆底烧瓶中，加入120mL苯搅拌溶解。加入2.5g(0.04mol)乙二醇、0.6g TsOH(对甲苯磺酸)。升温加热回流分水。反应2小时，约分出0.5mL水。定时取样，利用薄层色谱(体系为正己烷/乙酸乙酯＝6/1，磷钼酸显色)对样品进行检测，待显示原料消失时，停止加热。回到室温后，将反应液转至分液漏斗中，冰饱和食盐水洗4次，无水硫酸钠干燥，浓缩，抽干，得6.7g油状化合物7，反应产率106.7％。
MS：正离子峰：419.6，441.7(+Na峰)。
2、合成化合物8：
投料化合物7粗品6.7g，加入100mL四氯化碳溶解，升温到40℃。搅拌下，分批加入3.56g(0.02mol)NBS，3次加完，再继续反应1.5小时。停止反应，回到室温后，将反应液转至分液漏斗中，冰饱和食盐水洗两次，饱和NaHCO3溶液洗两次。无水硫酸钠干燥，浓缩，抽干，得红棕色油状物7.1g。过柱纯化，得到4.1g化合物8，两步反应产率54.47％。
MS：正离子峰：498.5，520.5(+Na峰)。
3、合成化合物9：
NaH处理：取20g 60％NaH于250mL干燥烧瓶，用重蒸正己烷洗三次，弃去正己烷层，固体NaH用油泵抽干，冲入氮气保护。
投料1.59g(12mmol)4-羟基丁酸乙酯于100mL干燥冷却三口瓶，氮气保护下加入50mLDMF，搅拌均匀，冰水浴冷却。0.29g(18mmol)NaH(处理过)加入到反应瓶中。加完后， 继续搅拌40分钟。4.0g(8mmol)化合物8溶解于10mL DMF中，缓慢滴加到反应瓶中，滴加完毕，继续搅拌1小时。撤去冰水浴，室温搅拌过夜。
次日，将反应液倒入冰水中，乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得化合物9粗品4.5g。
MS：正离子峰：549.7，571.7(+Na峰)。
4、合成式(4)所示化合物：
投料化合物9粗品4.5g，加入40mL甲醇溶解，滴加10mL 2M NaOH溶液，滴加完毕，继续搅拌1小时。加入20mL水，减压除去甲醇。剩余水层用甲基叔丁基醚洗三次，留水层转移至反应瓶中。
加入40mL甲醇，搅拌下，滴加1M HCl，调pH＝2，继续搅拌2小时，旋转蒸发除去甲醇，有白色固体析出。置4度冰箱静置1小时，抽滤得到粗品，重结晶得到式(4)所示化合物2.1g，两步总产率约为60.38％。
MS：正离子峰：433.6；负离子峰：455.6。
实施例3
在该实施例中，按照下列过程合成式(5)所示的化合物：
Figure DEST_PATH_GDA0001124598900000111
合成路线如下所示：
Figure DEST_PATH_GDA0001124598900000112
合成式(5)所示化合物：
投料0.66g(2mmol)化合物11于50mL干燥冷却反应瓶中，加入20mL二氯甲烷，搅拌溶解，加入0.1g DMAP、0.3g(3mmol)丁二酸酐，室温搅拌反应过夜(16小时)。将反应液转入分液漏斗，水洗四次，无水硫酸钠干燥，浓缩，过柱纯化，得0.65g式(5)所示化合物，产率75.6％。
MS：正离子峰：430.7，453.7(+Na峰)；负离子峰：429.6。
实施例4
在该实施例中，按照下列过程合成式(6)所示的化合物：
Figure DEST_PATH_GDA0001124598900000121
合成路线如下所示：
Figure DEST_PATH_GDA0001124598900000122
合成式(6)所示化合物：
0.625g(2mmol)化合物13于50mL干燥冷却反应瓶，加入20mL二氧六环，搅拌溶解。加入0.225g 3-巯基丙酸，升温至40℃，搅拌反应6小时，定时取样，利用薄层色谱(体系为正己烷/乙酸乙酯＝6/1，磷钼酸显色)对样品进行检测，待显示原料基本消失，同时产生新点，停止加热。旋转除去溶剂，得油状物。加入5mL乙醚，溶解均匀，再加入5mL正己烷，置冰箱静置过夜。
次日，有白色固体析出，滤出固体，用正己烷/乙酸乙酯＝6/1溶液洗，抽干，得到式(6)所示化合物0.28g，产率34.6％。
MS：正离子峰：419.2，431.4(+Na峰)；负离子峰：417.5。
实施例5
分别将实施例1～4所得到的化合物按照下列步骤标记碱性磷酸酶，得到缀合物1～4。
具体步骤如下：
向Mes(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液(pH＝4.5)中加入化合物，终浓度为0.2mg/mL；加入碱性磷酸酶(ALP)，终浓度为0.2mg/mL，混匀；再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)，终浓度为2mg/mL，混匀；加入氮羟基琥珀酰亚胺(NHS)，终浓度为2mg/mL，混匀；25℃下，反应2小时；以pH＝7.5的Tris缓冲液，超滤置换三次，纯化去除过量的孕酮衍生物和交联剂，得到缀合物。
实施例6
在该实施例中，选取孕酮浓度分别为：0、1、4、10、20、40ng/mL的6个样本作为孕酮校准品，分别记为C0、C1、C2、C3、C4和C5。设置四个实验组，每组实验组中孕酮抗体不同，分别利用实施例5中式(3)、式(5)、式(6)所示化合物对应的缀合物1、3和4对不同孕酮校准品进行检测，主要过程示意图如图1所示。具体步骤如下：
样品组：
(1)将孕酮校准品(25μL)、羊抗鼠抗体磁珠(0.1g/L，50μL)、缀合物(100μg/L，50μL)和孕酮鼠单抗(0.2mg/L，50μL)混匀后37℃孵育11分钟，形成磁珠-羊抗鼠二抗-孕酮鼠单抗-孕酮复合物和磁珠-羊抗鼠二抗-孕酮鼠单抗-缀合物复合物的混合物。其中孕酮与缀合物相互竞争结合孕酮鼠单抗，存在反比例函数关系。然后洗涤磁珠以除去未结合的孕酮和缀合物，得到磁珠-羊抗鼠二抗-孕酮鼠单抗-孕酮复合物和磁珠-羊抗鼠二抗-孕酮鼠单抗-缀合物复合物的混合物。
(2)向反应体系中加入发光底物液(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷，简称为AMPPD)(200L)，37℃孵育12分钟，磁珠-羊抗鼠二抗-孕酮鼠单抗-缀合物复合物所携带的碱性磷酸酶可以催化底物发光，且发光值与碱性磷酸酶含量成正比例关系。记录发光读数。
按照上述(1)和(2)的步骤对不同浓度孕酮校准品依次进行检测。
以孕酮校准品中孕酮浓度为横坐标，以该校准品发光读数/C0发光读数的比值(斜率)为纵坐标，绘制标准曲线，如图2～5所示。其中，图2是以羊抗鼠MR-1801为抗体，图3是羊抗鼠MR-1803为抗体，4是以羊抗鼠MR-1807为抗体，图5是以羊抗鼠MR-1812为抗体，均为市售获得。
结果表明，本发明的缀合物1、3和4对抗体具有较强的普适性，能够与多种抗体特异性结合，从而准确地测定样本中的孕酮含量。
方法学比对测试：
分别采用下列两种方式测定46个待测样本中孕酮含量：
方式(1)：利用缀合物1，按照上述方法采用迈瑞CL-2000i全自动化学发光免疫分析系统进行孕酮含量检测。
方式(2)：利用市售获得罗氏的孕酮试剂，按照该试剂的说明书采用罗氏COBAS-e411分析系统进行孕酮含量检测。
结果展示在图6中，其中，可以确定相关系数R2为0.9767，接近1.000，说明本发明的缀合物能够有效地测定样本中的孕酮含量，检测结果与业内认可的试剂盒的检测结果具有很好的相关性。
实施例7
在该实施例中，选取17α-羟基孕酮浓度分别为：0、0.25、1.0、5.0、20、40ng/mL的6个样本作为17α-羟基孕酮校准品，分别记为C0、C1、C2、C3、C4和C5。设置三个实验组，每组实验组中17α-羟基孕酮抗体不同，分别利用实施例5中式(4)所示化合物对应的缀合物2对不同17α-羟基孕酮校准品进行检测，主要过程示意图如图7所示。具体步骤如下：
(1)将17α-羟基孕酮校准品(10μL)、羊抗兔抗体磁珠(0.1g/L，50μL)、缀合物(125μg/L，50μL)和17α-羟基孕酮兔多抗(50μL)混匀后37℃孵育11分钟，形成磁珠-羊抗兔二抗-17α-羟基孕酮兔多抗-17α-羟基孕酮复合物和磁珠-羊抗兔二抗-17α-羟基孕酮兔多抗-缀合物复合物的混合物。其中17α-羟基孕酮与缀合物相互竞争结合17α-羟基孕酮兔多抗，存在反比例函数关系。然后洗涤磁珠以除去未结合的17α-羟基孕酮和缀合物，得到磁珠-羊抗兔二抗-17α-羟基孕酮兔多抗-17α-羟基孕酮复合物和磁珠-羊抗兔二抗-17α-羟基孕酮兔多抗-缀合物复合物的混合物。
(2)向反应体系中加入发光底物液(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷，简称为AMPPD)(200L)，37℃孵育12分钟，磁珠-羊抗兔二抗-17α-羟基孕酮兔多抗-缀合物复合物所携带的碱性磷酸酶，可以催化底物发光，且发光值与碱性磷酸酶含量成正比例关系。记录发光读数。
按照上述(1)和(2)的步骤对不同浓度17α-羟基孕酮校准品依次进行检测。
以17α-羟基孕酮校准品中17α-羟基孕酮浓度为横坐标，以该校准品发光读数/C0发光读数的比值(斜率)为纵坐标，绘制标准曲线，如图8～10所示。其中，图8是以羊抗兔MR-1818为抗体，图9是以羊抗兔MR-1823为抗体，图10是以羊抗兔MR-1827为抗体，均为市售获得。
结果表明，本发明的缀合物2对抗体具有较强的普适性，能够与多种抗体特异性结合，从而准确地测定样本中的17α-羟基孕酮含量。
方法学比对测试：
分别采用下列两种方式测定27个待测样本中17α-羟基孕酮含量：
方式(1)：利用缀合物2，按照上述方法采用迈瑞CL-2000i全自动化学发光免疫分析系统进行17α-羟基孕酮含量检测。
方式(2)：利用市售获得的17α-羟基孕酮DRG酶免试剂，按照该试剂的说明书采用EPOCH Biotek take3酶标分析仪进行17α-羟基孕酮含量检测。
结果展示在图11中，其中，可以确定相关系数R2为0.9699，接近1.000，说明本发明的缀合物能够有效地测定样本中的17α-羟基孕酮含量，检测结果与业内认可的试剂盒的检测结果具有很好的相关性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种化合物，其特征在于，具有以下之一的结构：
Figure FDA0002421366980000011
2.一种缀合物，其特征在于，包括权利要求1所述的化合物和标记分子，所述标记分子与所述化合物的连接臂相连。
3.根据权利要求2所述的缀合物，其特征在于，
所述标记分子为生物素、酶、吖啶酯、吡啶钌、异鲁米诺或异硫氰酸荧光素。
4.根据权利要求3所述的缀合物，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或乙酰蛋白酶。
5.一种检测孕酮或其类似物的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2～4任一项所述的缀合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述孕酮类似物为17α-羟基孕酮。
7.权利要求5或6所述的试剂盒在检测孕酮或其类似物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述试剂盒是采用竞争结合法对孕酮或其类似物进行检测。
CN201610591144.8A 2016-07-25 2016-07-25 化合物、缀合物、试剂盒及其用途 Active CN107652345B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610591144.8A CN107652345B (zh) 2016-07-25 2016-07-25 化合物、缀合物、试剂盒及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610591144.8A CN107652345B (zh) 2016-07-25 2016-07-25 化合物、缀合物、试剂盒及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107652345A CN107652345A (zh) 2018-02-02
CN107652345B true CN107652345B (zh) 2020-09-15

Family

ID=61126852

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610591144.8A Active CN107652345B (zh) 2016-07-25 2016-07-25 化合物、缀合物、试剂盒及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107652345B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4225485A (en) * 1978-07-24 1980-09-30 Miles Laboratories, Inc. Chemiluminescent naphthalene-1,2-dicarboxylic acid hydrazide-labeled polypeptides and proteins
US5338847A (en) * 1987-12-31 1994-08-16 London Diagnostics, Inc. Hydrolytically stable chemiluminescent labels and their conjugates, and assays therefrom by adduct formation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4225485A (en) * 1978-07-24 1980-09-30 Miles Laboratories, Inc. Chemiluminescent naphthalene-1,2-dicarboxylic acid hydrazide-labeled polypeptides and proteins
US5338847A (en) * 1987-12-31 1994-08-16 London Diagnostics, Inc. Hydrolytically stable chemiluminescent labels and their conjugates, and assays therefrom by adduct formation

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
125I孕酮和免疫原间联接同或异桥、位对抗原一抗体结合的影响;丁文静等;《核技术》;19881231(第1期);27页 *
孕酮酶免疫测定法;朱云林等;《福建医学院学报》;19911231;第25卷(第1期);79-82页 *
朱云林等.孕酮酶免疫测定法.《福建医学院学报》.1991,第25卷(第1期),79-82页. *
类固醇性激素化学发光免疫分析方法的研究;辛天兵;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20120215;E060-44页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107652345A (zh) 2018-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6975816B2 (ja) リポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定する方法及び試薬キット
US5573904A (en) 5(6)-Methyl substituted fluorescein derivatives
CA1339490C (en) Method for detection of an analyte using acridinium esters and liposomes
JP2727127B2 (ja) 求核性多置換アリールアクリジニウムエステルとその製造方法およびそれを用いたアッセイ
Xu et al. Production and characterization of a broad-specificity polyclonal antibody for O, O-diethyl organophosphorus pesticides and a quantitative structure–activity relationship study of antibody recognition
JP3264757B2 (ja) 蛍光化合物
CN107652343B (zh) 化合物、缀合物、试剂盒及其在检测雌醇中的用途
GB2111476A (en) Substituted carboxy- fluoresceins and their use in fluorescence polarization immunoassay
US4886744A (en) Fluorescent conjugates and biological diagnostic assay system
JPH0819117B2 (ja) テトラヒドロカンナビノール誘導体
JP6681350B2 (ja) ビタミンｄエピマーのためのアッセイ
JPH08504751A (ja) ビオチニル化した化学発光性標識、結合体、測定法及び測定法キット
JP2008143888A (ja) アフラトキシンに対する抗体、その抗体を用いた担体、アフラトキシンの免疫学的検出方法、ならびにアフラトキシンの濃縮および精製方法
CN107652344B (zh) 化合物、缀合物、试剂盒及其在检测睾酮或其类似物中的用途
US4150105A (en) 3-Ketosteroid antigenic conjugates, their preparation, antibodies and use
JP6749253B2 (ja) ビタミンｄアッセイにおけるビタミンｄエピマーに特異的な結合パートナー
US5851781A (en) Reagents and methods for the detection and quantification of testosterone in fluid samples
CN107652345B (zh) 化合物、缀合物、试剂盒及其用途
US5756771A (en) 5(6)-methyl substituted fluorescein derivatives
JP2005247822A (ja) コプラナーｐｃｂハプテン、コプラナーｐｃｂに対する抗体およびそれを用いる免疫学的測定方法
CN106124783B (zh) 改性心磷脂包被的纳米磁珠及其制备方法
CN107652302B (zh) 化合物、缀合物、试剂盒及其用途
CN114456124B (zh) 一种新利司他半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用
US5003054A (en) Ouabain triacetate derivative compounds
JP2007204394A (ja) テブフェノジドおよびその類似化合物に対する抗体の製造方法、抗体、ハイブリドーマ、その免疫学的測定方法および測定キット

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20180202

Assignee: Shenzhen Mindray Animal Medical Technology Co.,Ltd.

Assignor: SHENZHEN MINDRAY BIO-MEDICAL ELECTRONICS Co.,Ltd.

Contract record no.: X2022440020009

Denomination of invention: Compounds, conjugates, kits and uses thereof

Granted publication date: 20200915

License type: Common License

Record date: 20220804

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract