JP2727127B2 - 求核性多置換アリールアクリジニウムエステルとその製造方法およびそれを用いたアッセイ - Google Patents
求核性多置換アリールアクリジニウムエステルとその製造方法およびそれを用いたアッセイInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規な求核性多置換アリールアクリジニウム
エステルに関する。本発明はまた、新規な求核性多置換
アリールアクリジニウムエステルから作られる複合体
（conjugate）に関する。本発明はさらに、新規な求核
性多置換アリールアクリジニウムエステルおよびその複
合体（conjugate）を用いたアッセイに関する。
エステルに関する。本発明はまた、新規な求核性多置換
アリールアクリジニウムエステルから作られる複合体
（conjugate）に関する。本発明はさらに、新規な求核
性多置換アリールアクリジニウムエステルおよびその複
合体（conjugate）を用いたアッセイに関する。
（従来技術） アクリジニウムエステルを臨床検査のケミルミネセン
トラベルに使用することが知られている。例えば，ヨー
ロッパ特許出願第82306557.8号は、イムノアッセイのケ
ミルミネセントラベルとしてＮ−スクシンイミジル部分
に結合したアリールアクリジニウムエステルの使用を開
示している。米国特許第4,745,181号および同時係属の
米国特許出願第133,792号は、イムノアセッイおよび核
酸ハイブリダイゼーションアッセイに有用な多置換アリ
ールアクリジニウムエステルを記載している。米国特許
出願第226,639号は、臨床検査、特にリポソームを必要
とするアッセイに有用な親水性多置換アリールアクリジ
ニウムエステルとその複合体（conjugate）を開示して
いる。
トラベルに使用することが知られている。例えば，ヨー
ロッパ特許出願第82306557.8号は、イムノアッセイのケ
ミルミネセントラベルとしてＮ−スクシンイミジル部分
に結合したアリールアクリジニウムエステルの使用を開
示している。米国特許第4,745,181号および同時係属の
米国特許出願第133,792号は、イムノアセッイおよび核
酸ハイブリダイゼーションアッセイに有用な多置換アリ
ールアクリジニウムエステルを記載している。米国特許
出願第226,639号は、臨床検査、特にリポソームを必要
とするアッセイに有用な親水性多置換アリールアクリジ
ニウムエステルとその複合体（conjugate）を開示して
いる。
Richardson等（Clin.Chem.31/10,1664−1668ページ,1
985年）およびMiller等（Ann.Chin.Biochem.25,27−34
ページ,1988年）は、血漿プロゲステロンのケミルミネ
セントイムノアッセイにおける（２−アミノエチル）−
４−フェニル・アクリジン−９−カルボキシレートの使
用を開示している。
985年）およびMiller等（Ann.Chin.Biochem.25,27−34
ページ,1988年）は、血漿プロゲステロンのケミルミネ
セントイムノアッセイにおける（２−アミノエチル）−
４−フェニル・アクリジン−９−カルボキシレートの使
用を開示している。
しかしながら、従来技術におけるアクリジニウムエス
テルは、ある種の分析物との間で複合体（conjugate）
を効果的に形成し得ないことがしばしばある。それらの
分析物は求核性基を欠いていたり、容易に変化しないカ
ルボキシル基を含んでいる。分析物の免疫活性に対して
効果的に生じる有害作用のため，分析物の求核性基がア
クリジニウムエステルを含む活性基によってアシル化で
きない場合もある。
テルは、ある種の分析物との間で複合体（conjugate）
を効果的に形成し得ないことがしばしばある。それらの
分析物は求核性基を欠いていたり、容易に変化しないカ
ルボキシル基を含んでいる。分析物の免疫活性に対して
効果的に生じる有害作用のため，分析物の求核性基がア
クリジニウムエステルを含む活性基によってアシル化で
きない場合もある。
Richardson等およびMiller等のアクリジンエステル
は、同時に起こるエステルの求核性喪失を伴わずに有用
なアクリジンに変換することができない。このアクリジ
ンは、求核反応を通してまず目的の分析物と複合（conj
ugate）しなければならず、次に、続いてアクリジニウ
ムエステル部分に変換される。アクリジンエステルから
アクリジニウムエステルへの変換の一般的反応条件は非
選択的である。その結果、目標分析物の敏感な基が影響
を受け、得られた複合体（conjugate）の免疫活性が失
われたり低下したりする。
は、同時に起こるエステルの求核性喪失を伴わずに有用
なアクリジンに変換することができない。このアクリジ
ンは、求核反応を通してまず目的の分析物と複合（conj
ugate）しなければならず、次に、続いてアクリジニウ
ムエステル部分に変換される。アクリジンエステルから
アクリジニウムエステルへの変換の一般的反応条件は非
選択的である。その結果、目標分析物の敏感な基が影響
を受け、得られた複合体（conjugate）の免疫活性が失
われたり低下したりする。
（発明の目的） 上記問題に鑑みて、本発明の目的は、新規な求核性多
置換アリールアクリジニウムエステルを提供することで
ある。また、付加的なイオン化できる基を含む新規な求
核性多置換アリールアクリジニウムエステルを提供する
ことも本発明の目的である。
置換アリールアクリジニウムエステルを提供することで
ある。また、付加的なイオン化できる基を含む新規な求
核性多置換アリールアクリジニウムエステルを提供する
ことも本発明の目的である。
本発明のもう１つの目的は、新規な求核性多置換アリ
ールアクリジニウムエステルから作られる複合体（conj
ugate）を提供することである。
ールアクリジニウムエステルから作られる複合体（conj
ugate）を提供することである。
本発明のさらにもう１つの目的は、新規な求核性多置
換アリールアクリジニウムエステルおよびその複合体
（conjugate）を用いたアッセイを提供することであ
る。
換アリールアクリジニウムエステルおよびその複合体
（conjugate）を用いたアッセイを提供することであ
る。
（発明の構成） 本発明は下記の化学式を有する求核性多置換アリール
アクリジニウムエステルに関する。
アクリジニウムエステルに関する。
ここでR1はＯ−20のヘテロ原子（好ましくは窒素，酸
素，リンまたは硫黄）を含むアルキル，アルケニル，ア
ルキニル，アリールまたはアラルキルであり、 R2，R3，R5およびR7は水素，アミノ，アミド，アシ
ル，アルコキシル，ヒドロキシル,,−CO2，ハライド，
ニトロ，−CN,−SO3， または−SCNであって、ここでＲはＯ−20のヘテロ原子
を含むアルキル，アルケニル，アルキニル，アリールま
たはアラルキルであり、 R4およびR8は水素，アルキル，アルケニル，アルキニ
ル，アラルキルまたはアルコキシルであり、 Ｘはアニオン、好ましくはCH3SO4 -，OSO2F-，ハライ
ド，OSO2CF3 -，OSO2C4F3または であり、 R6はＱ−Ｒ−Nu, またはＱ−Nuであって、ここでＱは−Ｏ−，−Ｓ−，−
NH−， であり、Ｒは上記の通りであり、Ｉは−SO3，−OSO3，
−PO3，−OPO3または−CO2であり、Nuは求核基である。
素，リンまたは硫黄）を含むアルキル，アルケニル，ア
ルキニル，アリールまたはアラルキルであり、 R2，R3，R5およびR7は水素，アミノ，アミド，アシ
ル，アルコキシル，ヒドロキシル,,−CO2，ハライド，
ニトロ，−CN,−SO3， または−SCNであって、ここでＲはＯ−20のヘテロ原子
を含むアルキル，アルケニル，アルキニル，アリールま
たはアラルキルであり、 R4およびR8は水素，アルキル，アルケニル，アルキニ
ル，アラルキルまたはアルコキシルであり、 Ｘはアニオン、好ましくはCH3SO4 -，OSO2F-，ハライ
ド，OSO2CF3 -，OSO2C4F3または であり、 R6はＱ−Ｒ−Nu, またはＱ−Nuであって、ここでＱは−Ｏ−，−Ｓ−，−
NH−， であり、Ｒは上記の通りであり、Ｉは−SO3，−OSO3，
−PO3，−OPO3または−CO2であり、Nuは求核基である。
本発明に規定する求核基（求核基性）とは、電子に富
む化学基であり、反応部位として機能する非共有電子対
を有し、他の分子の陽電荷を有する部位あるいは電子不
足の部位を求める化学基をいう。有用な求核性基の例と
しては、強力な電子吸引基に隣接したアミノ，ヒドロキ
シル，メルカプトまたは活性メチレン基などがある。強
力な電子吸引基は強力に電子を引きつける化学基または
置換基であり、従って、その電子吸引基が結合している
炭素原子（またはカルボニウムイオン）の陽電荷を強め
るか、またはその炭素原子（またはカルボニウムイオ
ン）の陰電荷を打ち消す。強力な電子吸引基の例として
は、−NO2，−CN,−SO3H，−Ｎ（Ｒ）3 +，−Ｓ（Ｒ）2 +
および−NH3 +（ここでＲは上記の通り）などがある。
む化学基であり、反応部位として機能する非共有電子対
を有し、他の分子の陽電荷を有する部位あるいは電子不
足の部位を求める化学基をいう。有用な求核性基の例と
しては、強力な電子吸引基に隣接したアミノ，ヒドロキ
シル，メルカプトまたは活性メチレン基などがある。強
力な電子吸引基は強力に電子を引きつける化学基または
置換基であり、従って、その電子吸引基が結合している
炭素原子（またはカルボニウムイオン）の陽電荷を強め
るか、またはその炭素原子（またはカルボニウムイオ
ン）の陰電荷を打ち消す。強力な電子吸引基の例として
は、−NO2，−CN,−SO3H，−Ｎ（Ｒ）3 +，−Ｓ（Ｒ）2 +
および−NH3 +（ここでＲは上記の通り）などがある。
有機金属部分もまた、本発明に係る有用な求核性基で
ある。有機金属部分は、炭素−金属結合を含む有機部分
である。この有機金属部分の例としては、グリニャール
試薬，リチウム化合物およびフェニルナトリウムなどが
ある。
ある。有機金属部分は、炭素−金属結合を含む有機部分
である。この有機金属部分の例としては、グリニャール
試薬，リチウム化合物およびフェニルナトリウムなどが
ある。
R1は１−24の炭素原子を有するアルキル，アルケニ
ル，アルキニル，アリールまたはアラルキルであること
が好ましく； R2，R3，R5およびR7は水素、アミノ，−CO2，−CN,ヒド
ロキシル,1−４の炭素原子を有するアルコキシル，ニト
ロ，ハライド，−SO3，または−SCNであることが好まし
く； R4およびR8は１−８の炭素原子を有するアルキル，アル
ケニル，アルキニルまたはアルコキシルであることが好
ましく； Ｘはハライドであることが好ましい。
ル，アルキニル，アリールまたはアラルキルであること
が好ましく； R2，R3，R5およびR7は水素、アミノ，−CO2，−CN,ヒド
ロキシル,1−４の炭素原子を有するアルコキシル，ニト
ロ，ハライド，−SO3，または−SCNであることが好まし
く； R4およびR8は１−８の炭素原子を有するアルキル，アル
ケニル，アルキニルまたはアルコキシルであることが好
ましく； Ｘはハライドであることが好ましい。
さらに好ましくは、R1が１−10の炭素原子を有するア
ルキルであり；R2，R3，R5およびR7が水素，ニトロ，−
CN,ハライド,1−４の炭素原子を有するアルコキシル，
アミノ，または−SO3であり；R4およびR8が１−４の炭
素原子を有するアルキルである。
ルキルであり；R2，R3，R5およびR7が水素，ニトロ，−
CN,ハライド,1−４の炭素原子を有するアルコキシル，
アミノ，または−SO3であり；R4およびR8が１−４の炭
素原子を有するアルキルである。
最も好ましくは，R1，R4およびR8がメチルであり；
R2，R3，R5およびR7が水素であり;Xが臭化物であり；R6
が−CONH−CH2CH2−NH2または 本発明はまた、アクリジニウムエステルのNu基に共有
結合できる化合物に共有結合された本発明による上記の
アクリジニウムエステルを含む複合体に関する。有用な
複合体を形成するために、前記化合物は，アクリジニウ
ムエステルのNu基に結合能のある少くとも１つの官能基
を有していなければならない。好ましくは、この複合体
は、たん白，核酸，ハプテンその他などの生物活性を有
する化合物から作られる。
R2，R3，R5およびR7が水素であり;Xが臭化物であり；R6
が−CONH−CH2CH2−NH2または 本発明はまた、アクリジニウムエステルのNu基に共有
結合できる化合物に共有結合された本発明による上記の
アクリジニウムエステルを含む複合体に関する。有用な
複合体を形成するために、前記化合物は，アクリジニウ
ムエステルのNu基に結合能のある少くとも１つの官能基
を有していなければならない。好ましくは、この複合体
は、たん白，核酸，ハプテンその他などの生物活性を有
する化合物から作られる。
例えばNuがNH2の場合，本発明の複合体を形成するた
めの適する化合物の例としては、−NH2と結合能のある
下記のような官能基を含むものがある。
めの適する化合物の例としては、−NH2と結合能のある
下記のような官能基を含むものがある。
（１）葉酸，カルボキシル化ビタミンB12，リボース部
分におけるビタミンB12−ヘミスクシネート，T4−メチ
ルエステルおよびT3メチルエステルのＮ−ヘミスクシネ
ート，トロンボキサンB2，カルボキシプロピル−テオフ
ィリン，ペニシリン，コルチゾール−３−カルボキシメ
チルオキシム，エストラジオール−６−カルボキシメチ
ルオキシム，モルヒネ−６−ヘミスクシネートその他な
どにおけるカルボキシレート基； （２）３−ケトジゴキシゲニンなどにおけるケトン基； （３）ジゴキシンジアルデヒドおよびブロモウリジンジ
アルデヒドなどにおけるサルデヒド基； （４）ハプテンおよびたん白のジントロフルオロベンゼ
ンおよびクロロトリアジン誘導体などにおけるハライ
ド；（５）ハプテンおよびたん白のＮ−ヒドロキシスク
シンイミドおよびイミデート誘導体などにおける活性エ
ステル；（６）ハプテンおよびたん白誘導体などにおけ
るイソシアネートおよびチオイソシアネート。
分におけるビタミンB12−ヘミスクシネート，T4−メチ
ルエステルおよびT3メチルエステルのＮ−ヘミスクシネ
ート，トロンボキサンB2，カルボキシプロピル−テオフ
ィリン，ペニシリン，コルチゾール−３−カルボキシメ
チルオキシム，エストラジオール−６−カルボキシメチ
ルオキシム，モルヒネ−６−ヘミスクシネートその他な
どにおけるカルボキシレート基； （２）３−ケトジゴキシゲニンなどにおけるケトン基； （３）ジゴキシンジアルデヒドおよびブロモウリジンジ
アルデヒドなどにおけるサルデヒド基； （４）ハプテンおよびたん白のジントロフルオロベンゼ
ンおよびクロロトリアジン誘導体などにおけるハライ
ド；（５）ハプテンおよびたん白のＮ−ヒドロキシスク
シンイミドおよびイミデート誘導体などにおける活性エ
ステル；（６）ハプテンおよびたん白誘導体などにおけ
るイソシアネートおよびチオイソシアネート。
Nuが−SHの場合、適する化合物の例としては、ハプテ
ンおよびたん白誘導体などに見られるマレイミド，ジチ
オピリジノ，あたはオレフィンなどの、−SHと結合能の
ある官能基を含むものである。
ンおよびたん白誘導体などに見られるマレイミド，ジチ
オピリジノ，あたはオレフィンなどの、−SHと結合能の
ある官能基を含むものである。
Nuが−OHの場合、本発明の複合体を形成するための適
する化合物の例としては、ハプテンおよびたん白誘導体
などに見られるオキシランのような，−OHと結合能のあ
る官能基を含む化合物がある。
する化合物の例としては、ハプテンおよびたん白誘導体
などに見られるオキシランのような，−OHと結合能のあ
る官能基を含む化合物がある。
Nuがグリニャール部分または他の有機金属部分の場
合、本発明の複合体を形成するための適する化合物とし
ては、非プロトン性ハプテンなどに見られるケトンおよ
びアルデヒドのような、上記部分と結合能のある官能基
を含む化合物がある。
合、本発明の複合体を形成するための適する化合物とし
ては、非プロトン性ハプテンなどに見られるケトンおよ
びアルデヒドのような、上記部分と結合能のある官能基
を含む化合物がある。
他の種々の適するNu基も本発明のアクリジニウムエス
テルに用いられることに留意されたい。所望の用途に最
も適するアクリジニウムエステルと複合体化合物の組合
せを選択するのは製造者である。
テルに用いられることに留意されたい。所望の用途に最
も適するアクリジニウムエステルと複合体化合物の組合
せを選択するのは製造者である。
本明細書に用いられる“活性化（または活性化す
る）”なる用語は、ある化合物の官能基を変化させるこ
とを意味し、その変化によって元の官能基から新しい反
応性官能基を生じさせ、その新しい反応性官能基は第２
の化合物の目標とする官能基に結合することができる。
例えば、トロンボキサンB2（下記の構造参照）のカルボ
キシル基（−COOH）は、公知の手順を用いて活性化し、
混合無水物基 を得ることができる．この混合無水物基は次い、たとえ
ば２′,6′−ジメチル−４′−［Ｎ−（２アミノエチ
ル）カルボモイル］フェニル 10−メチルアクリジニウ
ム−９−カルボキシレートブロマイド（DMAE−ED）のア
ミノ基（−NH2）と反応してアミド結合 を形成し、トロンボキサンB2−DMAE−ED複合体（下記の
実施例11参照）を得ることができる。
る）”なる用語は、ある化合物の官能基を変化させるこ
とを意味し、その変化によって元の官能基から新しい反
応性官能基を生じさせ、その新しい反応性官能基は第２
の化合物の目標とする官能基に結合することができる。
例えば、トロンボキサンB2（下記の構造参照）のカルボ
キシル基（−COOH）は、公知の手順を用いて活性化し、
混合無水物基 を得ることができる．この混合無水物基は次い、たとえ
ば２′,6′−ジメチル−４′−［Ｎ−（２アミノエチ
ル）カルボモイル］フェニル 10−メチルアクリジニウ
ム−９−カルボキシレートブロマイド（DMAE−ED）のア
ミノ基（−NH2）と反応してアミド結合 を形成し、トロンボキサンB2−DMAE−ED複合体（下記の
実施例11参照）を得ることができる。
追加例として、アルキルシロキサン被覆の常磁性粒子
（PMP）（Advanced Magnetics社）の表面における自由
アミノ基（−NH2）を、ホモニ官能価グルタルアルデヒ
ド を用いた誘導化によって活性化できる。グルタルアルデ
ヒドの１つの反応性アルデヒド基は、自由アミノ基を有
するシッフ塩基の形成によってPMPと共有結合する。第
２の反応性アルデヒド基はたん白と結合することができ
る。
（PMP）（Advanced Magnetics社）の表面における自由
アミノ基（−NH2）を、ホモニ官能価グルタルアルデヒ
ド を用いた誘導化によって活性化できる。グルタルアルデ
ヒドの１つの反応性アルデヒド基は、自由アミノ基を有
するシッフ塩基の形成によってPMPと共有結合する。第
２の反応性アルデヒド基はたん白と結合することができ
る。
本発明の複合体の調製は、選択されるアクリジニウム
エステルおよび複合する化合物によって変わる。例え
ば、次の説明は、ある化合物および本発明のアクリジニ
ウムエステル上のある好ましいNu基から複合体を形成す
るためのある例示的方法についてのものである。
エステルおよび複合する化合物によって変わる。例え
ば、次の説明は、ある化合物および本発明のアクリジニ
ウムエステル上のある好ましいNu基から複合体を形成す
るためのある例示的方法についてのものである。
（１）Nuが−NH2であり、複合する化合物がカルボキシ
ル基を含んでいる場合は、そのカルボン酸基をまず活性
化してＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル，混合無
水物またはアシルハライドなどの活性エステルとする。
その活性化化合物を次にアクリジニウムエステルと反応
させて複合体とする。（２）Nuが−NH2で複合する化合
物がケトン基またはアルデヒド基を含む場合は、アクリ
ジニウムエステルを直接前記化合物と反応させてシッフ
塩基とすることができる。その複合体を次にソディウム
シアノボロハイドライドなどのハイドライド還元剤と反
応させて結合を安定させる。（３）Nuが−NH2の場合、
アクリジニウムエステルは、ハライド，イソシアネート
またはチオイソシアネートなどの反応性基を含む複合す
る化合物と直接反応させることができる。（４）Nuが−
SHの場合，アクリジニウムエステルと有効に反応させて
複合体を得るために、複合する化合物はマレイミド，ジ
チオピリジノ（dithiopyridino）またはオレフィンなど
のチオ（メルカプト）反応性基を含んでいる必要があ
る。（５）NuがOHの場合、アクリジニウムエステルと有
効に反応させて複合体を得るために、所望の複合する化
合物はオキシラン基を含んでいることが好ましい。
（６）Nuがグリニャールまたは他の有機金属部分である
場合、そのような部分を含むアクリジニウムエステルは
各使用に際して作りたてのものである必要があり、次に
ケトンまたはアルデヒド官能基を含む複合する化合物と
反応させて複合体を得る。
ル基を含んでいる場合は、そのカルボン酸基をまず活性
化してＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル，混合無
水物またはアシルハライドなどの活性エステルとする。
その活性化化合物を次にアクリジニウムエステルと反応
させて複合体とする。（２）Nuが−NH2で複合する化合
物がケトン基またはアルデヒド基を含む場合は、アクリ
ジニウムエステルを直接前記化合物と反応させてシッフ
塩基とすることができる。その複合体を次にソディウム
シアノボロハイドライドなどのハイドライド還元剤と反
応させて結合を安定させる。（３）Nuが−NH2の場合、
アクリジニウムエステルは、ハライド，イソシアネート
またはチオイソシアネートなどの反応性基を含む複合す
る化合物と直接反応させることができる。（４）Nuが−
SHの場合，アクリジニウムエステルと有効に反応させて
複合体を得るために、複合する化合物はマレイミド，ジ
チオピリジノ（dithiopyridino）またはオレフィンなど
のチオ（メルカプト）反応性基を含んでいる必要があ
る。（５）NuがOHの場合、アクリジニウムエステルと有
効に反応させて複合体を得るために、所望の複合する化
合物はオキシラン基を含んでいることが好ましい。
（６）Nuがグリニャールまたは他の有機金属部分である
場合、そのような部分を含むアクリジニウムエステルは
各使用に際して作りたてのものである必要があり、次に
ケトンまたはアルデヒド官能基を含む複合する化合物と
反応させて複合体を得る。
前記説明は例示であり、種々の他の複合体も、公知の
手順による本発明の新規なアクリジニウムエステルから
作り得ることに留意されたい。
手順による本発明の新規なアクリジニウムエステルから
作り得ることに留意されたい。
本発明の複合体は発光トレーサーとして有用である。
これらの複合体は、抗体／抗原免疫反応，核酸ハイブリ
ダイゼーション反応または配位子／結合たん白相互反応
などの特定の結合現象を用いた発光検定（ルミネセント
アッセイ）に特に有用である。
これらの複合体は、抗体／抗原免疫反応，核酸ハイブリ
ダイゼーション反応または配位子／結合たん白相互反応
などの特定の結合現象を用いた発光検定（ルミネセント
アッセイ）に特に有用である。
本発明の１つの実施態様においては、本発明のアクリ
ジニウムエステルと葉酸（folate）または葉酸誘導体と
を用いて複合体が調製される。使用されるアクリジニウ
ムエステルは求核性基と親水性基の両方を含んでいるこ
とが好ましい。この葉酸（folate）−アクリジニウムエ
ステル複合体の調製は、アクリジニウムエステルを下記
の化学式を有する保護された葉酸（folate）中間体（そ
のカルボキシル基の１つまたは両方が活性化されてい
る）と共にインキュベートすることを含む。
ジニウムエステルと葉酸（folate）または葉酸誘導体と
を用いて複合体が調製される。使用されるアクリジニウ
ムエステルは求核性基と親水性基の両方を含んでいるこ
とが好ましい。この葉酸（folate）−アクリジニウムエ
ステル複合体の調製は、アクリジニウムエステルを下記
の化学式を有する保護された葉酸（folate）中間体（そ
のカルボキシル基の１つまたは両方が活性化されてい
る）と共にインキュベートすることを含む。
ここでＲ′は、Ｏ−20のヘテロ原子（好ましくは窒素，
酸素，リンまたは硫黄）を含む、１−24の炭素原子を有
する随意に枝分かれしたまたは直鎖の飽和または不飽和
アルキルである。Ｒ″はZ2，水素，またはＯ−20のヘテ
ロ原子（好ましくは窒素，酸素，リンまたは硫黄）を含
む、１−24の炭素原子を有する枝分かれしたまたは直鎖
の飽和または不飽和アルキルである。点線は随意の２重
結合である。
酸素，リンまたは硫黄）を含む、１−24の炭素原子を有
する随意に枝分かれしたまたは直鎖の飽和または不飽和
アルキルである。Ｒ″はZ2，水素，またはＯ−20のヘテ
ロ原子（好ましくは窒素，酸素，リンまたは硫黄）を含
む、１−24の炭素原子を有する枝分かれしたまたは直鎖
の飽和または不飽和アルキルである。点線は随意の２重
結合である。
Z1およびZ2は保護基である。Z2は随意のものである。
これらの保護基は、第１アミンおよび第２アミンを葉酸
（folate）の活性化カルボキシル基と分子間または分子
内で反応させないように保護できる基であればどのよう
な基でもよい。これらの保護基は、アクリジニウムエス
テルに、好ましくは酸性環境のもとで悪影響を与えない
条件下で除去可能でなければならない。有用な保護基に
はトリフルオロアセチル基またはｔ−ブチルオキシカル
ボニル基が含まれる。
これらの保護基は、第１アミンおよび第２アミンを葉酸
（folate）の活性化カルボキシル基と分子間または分子
内で反応させないように保護できる基であればどのよう
な基でもよい。これらの保護基は、アクリジニウムエス
テルに、好ましくは酸性環境のもとで悪影響を与えない
条件下で除去可能でなければならない。有用な保護基に
はトリフルオロアセチル基またはｔ−ブチルオキシカル
ボニル基が含まれる。
保護された葉酸中間体をアクリジニウムエステルと複
合化（conjugation）した後、葉酸部分は、保護基を除
去することによってブロック解除（deblock）される。
このブロック解除はHBr/酢酸などの酸性媒質を用いて酸
性環境下で行うのが好ましく、上記酸性媒質は、複合体
（conjugate）の一体性をこわすことなく保護基を除去
することができる。このようにして形成された複合体
は、葉酸を測定するためのアッセイにおけるトレーサー
として使用することができる。
合化（conjugation）した後、葉酸部分は、保護基を除
去することによってブロック解除（deblock）される。
このブロック解除はHBr/酢酸などの酸性媒質を用いて酸
性環境下で行うのが好ましく、上記酸性媒質は、複合体
（conjugate）の一体性をこわすことなく保護基を除去
することができる。このようにして形成された複合体
は、葉酸を測定するためのアッセイにおけるトレーサー
として使用することができる。
本発明のもう１つの実施態様において、本発明のアク
リジニウムエステルとビタミンB12（シアノコバラミ
ン）とを用いて複合体を形成する。ビタミンB12は次の
ような構造を有する。
リジニウムエステルとビタミンB12（シアノコバラミ
ン）とを用いて複合体を形成する。ビタミンB12は次の
ような構造を有する。
ビタミンB12を稀釈酸で処理するとコリン環の1,2およ
び／または３第１プロパンアミド（primary propanamid
e）側鎖を脱アミノ化してカルボキシル官能を生じる。
このカルボキシレート官能は、ビタミンB12を本発明の
求核性アクリジニウムエステルに複合化（conjugate）
するのに使用される。
び／または３第１プロパンアミド（primary propanamid
e）側鎖を脱アミノ化してカルボキシル官能を生じる。
このカルボキシレート官能は、ビタミンB12を本発明の
求核性アクリジニウムエステルに複合化（conjugate）
するのに使用される。
モノカルボキシルビタミンB12（１つのカルボキシレ
ート官能），ジカルボキシルビタミンB12（２つのカル
ボキシレート官能），およびトリカルボキシルビタミン
B12（３つのカルボキシレート官能）の比率は酸濃度と
反応時間に依存する。モノカルボキシルビタミンB12は
本発明の複合体（conjugate）を調製するのに望ましい
生成物である。Allen等のJ.Biol.Chem.247,7695ページ,
1972年に記載される手順のような公知の手順を最大限に
利用することにより、40％までのモノカルボキシルビタ
ミンB12を含むモノ−，ジ−，およびトリカルボキシル
ビタミンB12の混合物を得ることができる（第３および
４図参照）。モノカルボキシルビタミンB12をジ−およ
びトリカルボキシルビタミンB12から分離するために、
従来の手順では強力なアニオン交換体を使用している
（Allen等のJ.Biol.Chem.247,7695ページ,1972年）。
ート官能），ジカルボキシルビタミンB12（２つのカル
ボキシレート官能），およびトリカルボキシルビタミン
B12（３つのカルボキシレート官能）の比率は酸濃度と
反応時間に依存する。モノカルボキシルビタミンB12は
本発明の複合体（conjugate）を調製するのに望ましい
生成物である。Allen等のJ.Biol.Chem.247,7695ページ,
1972年に記載される手順のような公知の手順を最大限に
利用することにより、40％までのモノカルボキシルビタ
ミンB12を含むモノ−，ジ−，およびトリカルボキシル
ビタミンB12の混合物を得ることができる（第３および
４図参照）。モノカルボキシルビタミンB12をジ−およ
びトリカルボキシルビタミンB12から分離するために、
従来の手順では強力なアニオン交換体を使用している
（Allen等のJ.Biol.Chem.247,7695ページ,1972年）。
３つの第１プロパンアミド側鎖のどれが脱アミノ化さ
れたかによって、潜在的に３つの型のモノカルボキシル
ビタミンB12が存在する。これらのモノカルボキシルビ
タミンB12の３つの型を分離することが望ましい。逆相
高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）でカルボキシル化
ビタミンB12の混合物を分離することによって、モノカ
ルボキシルビタミンB12型をジ−およびトリカルボキシ
ルビタミンB12型から互いに分離および単離できること
を予期せず発見した。これにより、従来おような予備的
イオン交換分別工程なしに個々のモノカルボキシルビタ
ミンB12型を高純度で得ることが可能になる。
れたかによって、潜在的に３つの型のモノカルボキシル
ビタミンB12が存在する。これらのモノカルボキシルビ
タミンB12の３つの型を分離することが望ましい。逆相
高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）でカルボキシル化
ビタミンB12の混合物を分離することによって、モノカ
ルボキシルビタミンB12型をジ−およびトリカルボキシ
ルビタミンB12型から互いに分離および単離できること
を予期せず発見した。これにより、従来おような予備的
イオン交換分別工程なしに個々のモノカルボキシルビタ
ミンB12型を高純度で得ることが可能になる。
さらに、ビタミンB12アッセイに使用するに当り、本
発明の複合体におけるモノカルボキシルビタミンB12の
１つの型は他の２つの型より有効であることを予期せず
発見した。
発明の複合体におけるモノカルボキシルビタミンB12の
１つの型は他の２つの型より有効であることを予期せず
発見した。
本発明のさらにもう１つの実施態様において、本発明
のアクリジニウムエステルとエストラジオールとを用い
て複合体を形成する。この複合体は17−ベータ−エスト
ラジオールのアッセイなどに使用できる。
のアクリジニウムエステルとエストラジオールとを用い
て複合体を形成する。この複合体は17−ベータ−エスト
ラジオールのアッセイなどに使用できる。
17−ベータ−エストラジオールは次のような構造を有
する。
する。
ここでＡはCH2である。17−ベータ−エストラジオー
ルの有用な誘導体には６−ケト−17−ベータ−エストラ
ジオール および好ましくは６−カルボキシメチルオキシム−17−
ベータ−エストラジオール が含まれる。
ルの有用な誘導体には６−ケト−17−ベータ−エストラ
ジオール および好ましくは６−カルボキシメチルオキシム−17−
ベータ−エストラジオール が含まれる。
本発明の適するアクリジニウムエステルとの複合（co
njugation）は、17−ベータ−エストラジオールまたは
その誘導体における利用可能な官能基、すなわちフェノ
ール系３−OH基，第２ 17−OH基、あるいはＣ−６位置
にできたカルボキシメチルオキシム基またはケト基など
のいずれにおいても起こり得る。複合のための官能基の
選択は、所望のイムノアッセイ系との適合性、調製され
た複合体（conjugate）の安定性、および調製の容易さ
などの要因に依存する。好ましくは、６−カルボキシメ
チルオキシム−17−ベータ−エストラジオールのカルボ
キシル基を活性化し、次にこの活性化エストラジオール
誘導体を本発明の適するアクリジニウムエステルと反応
させることによって複合体（conjugate）を調製する。
得られた複合体は、17−ベータ−エストラジオール測定
のためのアッセイにおけるトレーサーとして使用でき
る。
njugation）は、17−ベータ−エストラジオールまたは
その誘導体における利用可能な官能基、すなわちフェノ
ール系３−OH基，第２ 17−OH基、あるいはＣ−６位置
にできたカルボキシメチルオキシム基またはケト基など
のいずれにおいても起こり得る。複合のための官能基の
選択は、所望のイムノアッセイ系との適合性、調製され
た複合体（conjugate）の安定性、および調製の容易さ
などの要因に依存する。好ましくは、６−カルボキシメ
チルオキシム−17−ベータ−エストラジオールのカルボ
キシル基を活性化し、次にこの活性化エストラジオール
誘導体を本発明の適するアクリジニウムエステルと反応
させることによって複合体（conjugate）を調製する。
得られた複合体は、17−ベータ−エストラジオール測定
のためのアッセイにおけるトレーサーとして使用でき
る。
本発明のアクリジニウムエステルはコルチゾールとの
有用な複合体（conjugate）を形成するのにも使用でき
る。コルチゾールの次のような構造を有する。
有用な複合体（conjugate）を形成するのにも使用でき
る。コルチゾールの次のような構造を有する。
ここでＢは である。コルチゾールの誘導体には３−カルボキシメチ
ルオキシムコルチゾール がある。本発明の適するアクリジニウムエステルとの複
合（conjugation）は、コルチゾールまたはその誘導体
の利用可能な官能基、すなわち21−OH基,17−OH基,11−
OH基,20−ケト基,3−ケト基，および３−カルボキシメ
チルオキシム基などのいずれにおいても起こり得る。好
ましくは、３−カルボキシメチルオキシムコルチゾール
のカルボキシル基を活性化し、次にこの活性化コルチゾ
ール誘導体を本発明の適するアクリジニウムエステルと
反応させることによって複合体を調製する。得られた複
合体は、コルチゾールのアッセイにおけるトレーサーと
して使用できる。
ルオキシムコルチゾール がある。本発明の適するアクリジニウムエステルとの複
合（conjugation）は、コルチゾールまたはその誘導体
の利用可能な官能基、すなわち21−OH基,17−OH基,11−
OH基,20−ケト基,3−ケト基，および３−カルボキシメ
チルオキシム基などのいずれにおいても起こり得る。好
ましくは、３−カルボキシメチルオキシムコルチゾール
のカルボキシル基を活性化し、次にこの活性化コルチゾ
ール誘導体を本発明の適するアクリジニウムエステルと
反応させることによって複合体を調製する。得られた複
合体は、コルチゾールのアッセイにおけるトレーサーと
して使用できる。
有用な複合体は、本発明のアクリジニウムエステルと
トロンボキサンB2および他のプロスタグランジン類似体
（prostaglandin analogs）との間でも形成できる。ト
ロンボキサンB2は次のような構造を有している。
トロンボキサンB2および他のプロスタグランジン類似体
（prostaglandin analogs）との間でも形成できる。ト
ロンボキサンB2は次のような構造を有している。
本発明の適するアクリジニウムエステルとの複合（co
njugation）は、３つのヒドロキシル基またはソレフィ
ン官能基のいずれかにおいても起こり得る。官能基の選
択は、特定の結合性たん白との相溶性、および目標でな
いプロスタグランジン類似体との小さい交差反応性など
の要因に依存する。好ましくは、トロンボキサンB2の末
端カルボキシル基を活性化し、次に、得られたトロンボ
キサンB2誘導体を本発明の適するアクリジニウムエステ
ルと反応させることによって複合体（conjugate）を調
製する。得られた複合体はトロンボキサンB2のアッセイ
においてトレーサーとして使用できる。
njugation）は、３つのヒドロキシル基またはソレフィ
ン官能基のいずれかにおいても起こり得る。官能基の選
択は、特定の結合性たん白との相溶性、および目標でな
いプロスタグランジン類似体との小さい交差反応性など
の要因に依存する。好ましくは、トロンボキサンB2の末
端カルボキシル基を活性化し、次に、得られたトロンボ
キサンB2誘導体を本発明の適するアクリジニウムエステ
ルと反応させることによって複合体（conjugate）を調
製する。得られた複合体はトロンボキサンB2のアッセイ
においてトレーサーとして使用できる。
本発明はまた、本発明の複合体をケミルミネセントト
レーサー化合物として用いたアッセイに関する。これら
のアッセイは相同性（homogeneous）があっても良く、
または異種起源であっても良い。これらのアッセイは、
例えば測定すべき分析物が一価のハプテンまたは分子で
あるきっ抗阻害アッセイであっても良い。これらのアッ
セイはまた、例えば本発明のアクリジニウムエステルが
抗体またはレセプター分子に複合（conjugated）したサ
ンドイッチアッセイなどの非競合的なものであっても良
い。本発明の複合体を用いたアッセイの成分または試薬
は、得られたアクリジニウムエステルラベルが後の検出
系において測定できるならば、全ての所望する方法また
は順序で互いに混合できる。従って、本発明の複合体を
用いたアッセイは、フォワードモード（forward mod
e），リバースモード（reverse mode）または同時モー
ド（例えば米国特許第4,098,876号および第4,244,940号
参照）で行うことができる。
レーサー化合物として用いたアッセイに関する。これら
のアッセイは相同性（homogeneous）があっても良く、
または異種起源であっても良い。これらのアッセイは、
例えば測定すべき分析物が一価のハプテンまたは分子で
あるきっ抗阻害アッセイであっても良い。これらのアッ
セイはまた、例えば本発明のアクリジニウムエステルが
抗体またはレセプター分子に複合（conjugated）したサ
ンドイッチアッセイなどの非競合的なものであっても良
い。本発明の複合体を用いたアッセイの成分または試薬
は、得られたアクリジニウムエステルラベルが後の検出
系において測定できるならば、全ての所望する方法また
は順序で互いに混合できる。従って、本発明の複合体を
用いたアッセイは、フォワードモード（forward mod
e），リバースモード（reverse mode）または同時モー
ド（例えば米国特許第4,098,876号および第4,244,940号
参照）で行うことができる。
ビタミンB12および葉酸（folate）の検出および測定
のためのアッセイは、本発明の複合体を用いて行うこと
のできるアッセイの実例である。このようなアッセイ
は、本発明のビタミンB12−アクリジニウムエステル複
合体または葉酸（folate）−アクリジニウムエステル複
合体を使用することができる。ビタミンB12および葉酸
のための放射性同位体稀釈アッセイの一般的説明が米国
特許第4,451,571号に示されており、その開示内容は参
考のため本明細書に取り入れられている。
のためのアッセイは、本発明の複合体を用いて行うこと
のできるアッセイの実例である。このようなアッセイ
は、本発明のビタミンB12−アクリジニウムエステル複
合体または葉酸（folate）−アクリジニウムエステル複
合体を使用することができる。ビタミンB12および葉酸
のための放射性同位体稀釈アッセイの一般的説明が米国
特許第4,451,571号に示されており、その開示内容は参
考のため本明細書に取り入れられている。
試料中のビタミンB12または葉酸（folate）を検出ま
たは測定するためのアッセイは、通常、試料中のビタミ
ンB12または葉酸（folate）を内生的結合たん白から遊
離させる試料調製工程を必要とする。ビタミンB12また
は葉酸をそれぞれの結合たん白から遊離する方法は、試
料を加熱または煮沸するか化学的遊離剤を用いることを
含む。典型的な遊離剤はNaOHなどの強塩基から成る。ジ
チオスレイトール（DTT）またはベータ−メルカプトエ
タノールなどのメルカプト化合物も試料調整工程中に加
えられる。このメルカプト化合物は、遊離剤の添加より
前に、より後に、または同時に加えることができる。
たは測定するためのアッセイは、通常、試料中のビタミ
ンB12または葉酸（folate）を内生的結合たん白から遊
離させる試料調製工程を必要とする。ビタミンB12また
は葉酸をそれぞれの結合たん白から遊離する方法は、試
料を加熱または煮沸するか化学的遊離剤を用いることを
含む。典型的な遊離剤はNaOHなどの強塩基から成る。ジ
チオスレイトール（DTT）またはベータ−メルカプトエ
タノールなどのメルカプト化合物も試料調整工程中に加
えられる。このメルカプト化合物は、遊離剤の添加より
前に、より後に、または同時に加えることができる。
ビタミンB12のための１つのアッセイにおいて、試料
調整工程に続いて、ビタミンB12トレーサー化合物を、
試料と固相に固定された精製豚内因子（HIF）とに混合
する。試料とトレーサー化合物は、HIFの結合部位につ
いて競合する。HIFに結合したトレーサー化合物の量は
試料中のビタミンB12の量に反比例する。
調整工程に続いて、ビタミンB12トレーサー化合物を、
試料と固相に固定された精製豚内因子（HIF）とに混合
する。試料とトレーサー化合物は、HIFの結合部位につ
いて競合する。HIFに結合したトレーサー化合物の量は
試料中のビタミンB12の量に反比例する。
葉酸のための１つのアッセイにおいて、試料調整工程
に続いて、葉酸トレーサー化合物を、試料と固相に固定
されたウシラクトグロブリンまたは葉酸結合たん白（FB
P）とに混合する。試料とトレーサー化合物はFBPの結合
部位について競合する。FBPに結合したトレーサー化合
物の量は試料中の葉酸の量に反比例する。
に続いて、葉酸トレーサー化合物を、試料と固相に固定
されたウシラクトグロブリンまたは葉酸結合たん白（FB
P）とに混合する。試料とトレーサー化合物はFBPの結合
部位について競合する。FBPに結合したトレーサー化合
物の量は試料中の葉酸の量に反比例する。
試料調整工程で使用されるメルカプト化合物は、カウ
ンティング（固相に結合されたラベルの量の測定）時に
固相内に残っていることがわかった。固相内の変化する
濃度のメルカプト化合物（特にDTT）の存在によってア
クリジニウムエステルラベルのケミルミネセント反応の
光子出力が抑制され、アッセイの精度が低下したり信号
が減じられたりする。カウンティングの前に、エチルマ
レイミドなどのチオール反応性化合物を含む溶液内で固
相をインキュベートすることによってメルカプト化合物
の抑制効果が減じられるか排除されることが予期せず発
見された。溶液中のチオール反応性化合物の濃度は約0.
01mMから約50mMであることがこのましく、約0.5mMから
約10mMであることがさらに好ましく、約1mMであること
が最も好ましい。
ンティング（固相に結合されたラベルの量の測定）時に
固相内に残っていることがわかった。固相内の変化する
濃度のメルカプト化合物（特にDTT）の存在によってア
クリジニウムエステルラベルのケミルミネセント反応の
光子出力が抑制され、アッセイの精度が低下したり信号
が減じられたりする。カウンティングの前に、エチルマ
レイミドなどのチオール反応性化合物を含む溶液内で固
相をインキュベートすることによってメルカプト化合物
の抑制効果が減じられるか排除されることが予期せず発
見された。溶液中のチオール反応性化合物の濃度は約0.
01mMから約50mMであることがこのましく、約0.5mMから
約10mMであることがさらに好ましく、約1mMであること
が最も好ましい。
（実施例） 本発明を以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明す
る。
る。
実施例１ ２′,6′−ジメチル−４′−［Ｎ−（２−アミノエチ
ル）カルボモイル］フェニル 10−メチルアクリジニウ
ム−９−カルボキシレート ブロマイド（DMAE−ED）の
調製 30mlのジメチルホルムアミド（DMF）中の２′,6′−
ジメチル−４′−カルボキシフェニル 10−メチルアク
リジニウム−９−カルボキシレート ブロマイド（DMA
E,200mg,0.43m mole）（同時係属米国出願第226,639号
参照）溶液を氷浴中で冷却し、トリエチルアミン（0.25
ml,1.72m mole）、エチルクロロホルメート（0.08ml,0.
85m mole）およびクロロホルム30mlで処理して反応混合
物を形成した。20分間の撹拌後、この反応混合物を乾燥
滴下漏斗に移し、10mlのDMF/CHCl3（1:1）中のエチレン
ジアミン溶液に15分間に亘って滴下添加して第２の反応
混合物を形成した。
ル）カルボモイル］フェニル 10−メチルアクリジニウ
ム−９−カルボキシレート ブロマイド（DMAE−ED）の
調製 30mlのジメチルホルムアミド（DMF）中の２′,6′−
ジメチル−４′−カルボキシフェニル 10−メチルアク
リジニウム−９−カルボキシレート ブロマイド（DMA
E,200mg,0.43m mole）（同時係属米国出願第226,639号
参照）溶液を氷浴中で冷却し、トリエチルアミン（0.25
ml,1.72m mole）、エチルクロロホルメート（0.08ml,0.
85m mole）およびクロロホルム30mlで処理して反応混合
物を形成した。20分間の撹拌後、この反応混合物を乾燥
滴下漏斗に移し、10mlのDMF/CHCl3（1:1）中のエチレン
ジアミン溶液に15分間に亘って滴下添加して第２の反応
混合物を形成した。
次にこの第２の反応混合物を室温で一晩撹拌し、次に
アンダーバキュオ（under vacuo:真空下）で乾燥するま
で蒸発させた。蒸発により得られた残分を３−4mlのク
ロロホルム／メタノール／水（65:25:4）に入れ、２つ
の20×20cm分取薄層クロマトグラフィーTLCプレート
（シリカゲル60,F254,メルク社）で純化し、同じ溶媒系
で展開した。生じた黄色の主バンド（Rf＝0.47）（長お
よび短UV光のもとでも検出し得る）をストリッピングし
同じ溶媒系で溶離した。次にこの溶出液を蒸発処理し
た。この蒸発による残分を30mlの10％メタノール／クロ
ロホルムでトリチュレート（triturated）し、Whatman
＃１フィルターペーパーに重力化で通して過した。こ
のようにして得られた液を蒸発処理してDMAE−ED（11
0mg,50％）を得た。陽イオンモードにおける高速原子衝
撃（Fast Atom Bomberdment:FAB）質量分析（Oneida Re
search Servicesにより実施）は428のM+ピークを示し
た。ほぼ同じ強さの同位体臭化物ピーク79,81が陰イオ
ンモードで検出された。
アンダーバキュオ（under vacuo:真空下）で乾燥するま
で蒸発させた。蒸発により得られた残分を３−4mlのク
ロロホルム／メタノール／水（65:25:4）に入れ、２つ
の20×20cm分取薄層クロマトグラフィーTLCプレート
（シリカゲル60,F254,メルク社）で純化し、同じ溶媒系
で展開した。生じた黄色の主バンド（Rf＝0.47）（長お
よび短UV光のもとでも検出し得る）をストリッピングし
同じ溶媒系で溶離した。次にこの溶出液を蒸発処理し
た。この蒸発による残分を30mlの10％メタノール／クロ
ロホルムでトリチュレート（triturated）し、Whatman
＃１フィルターペーパーに重力化で通して過した。こ
のようにして得られた液を蒸発処理してDMAE−ED（11
0mg,50％）を得た。陽イオンモードにおける高速原子衝
撃（Fast Atom Bomberdment:FAB）質量分析（Oneida Re
search Servicesにより実施）は428のM+ピークを示し
た。ほぼ同じ強さの同位体臭化物ピーク79,81が陰イオ
ンモードで検出された。
実施例２ Ｎ−tert−ブチルオキシカルボニル−Ｓ−（３−スルホ
プロピル）システイン（BOC−SulfoCys）の調製 ２−（tert−ブトキシカルボニルオキシイミノ）−２
−フェニルアセトニトリル（BOC−ON）（121mg,0.49m m
ole）（Aldrich chem.社）を、3mlの50％水性ジオキサ
ン中のＳ−（３−スルホプロピル）システイン（SulfoC
ys,100mg,0.41m mole）（U.T.RueggおよびJ.Rudinger,
J.Peptide Protein Res.6,447,1974年の方法により調
製）およびトリエチルアミン（0.18ml,1.23m mole）溶
液に加えて反応混合物を形成した。この反応混合物を50
〜55℃で１時間加熱して黄色溶液を得た。次にこの反応
混合物を冷却し、5mlの水で稀釈し、そして酢酸エチル
（３×10ml）で洗浄した。得られた水性層を、メタノー
ルと共に２度共蒸発することによって、アンダーバァキ
ュオ（under vacuo:真空下）で乾燥まで蒸発処理した。
クロロホルム／メタノール／水（55:40:5）の溶媒系を
用いて、蒸発により得られた残分をTLC（シリカゲル60,
メクル社）分析したところ、SulfoCysが完全にBOC−Sul
foCysに変換されていることがわかった。
プロピル）システイン（BOC−SulfoCys）の調製 ２−（tert−ブトキシカルボニルオキシイミノ）−２
−フェニルアセトニトリル（BOC−ON）（121mg,0.49m m
ole）（Aldrich chem.社）を、3mlの50％水性ジオキサ
ン中のＳ−（３−スルホプロピル）システイン（SulfoC
ys,100mg,0.41m mole）（U.T.RueggおよびJ.Rudinger,
J.Peptide Protein Res.6,447,1974年の方法により調
製）およびトリエチルアミン（0.18ml,1.23m mole）溶
液に加えて反応混合物を形成した。この反応混合物を50
〜55℃で１時間加熱して黄色溶液を得た。次にこの反応
混合物を冷却し、5mlの水で稀釈し、そして酢酸エチル
（３×10ml）で洗浄した。得られた水性層を、メタノー
ルと共に２度共蒸発することによって、アンダーバァキ
ュオ（under vacuo:真空下）で乾燥まで蒸発処理した。
クロロホルム／メタノール／水（55:40:5）の溶媒系を
用いて、蒸発により得られた残分をTLC（シリカゲル60,
メクル社）分析したところ、SulfoCysが完全にBOC−Sul
foCysに変換されていることがわかった。
実施例３ ２′,6′−ジメチル−４′−｛Ｎ−［Ｎ−［２−tert−
ブチルオキシカルボニルアミノ−３−Ｓ−（３′−スル
ホプロピル）−チオプロピオニル）−２−アミノ エチ
ル］カルバモイル｝フェニル10−メチルアクリジニウム
−９−カルボキシレート ブロマイド（BOC−SulfoCys
−ED−DMAE）の調製 110mlのDMF/CHCl3（1:1）中のBOC−SulfoCys（3.42m
mole）（実施例２）およびDMAE−ED（400mg,0.79m mol
e）（実施例１）溶液をジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（325mg,1.57m mole）で処理し、室温で３時間撹拌
し、蒸発乾燥した。蒸発による残分を約15mlのクロロホ
ルム／メタノール／水（65:25:4）に入れ、８つの分取T
LCプレート（シリカゲル60,メクル社）で純化し、同じ
溶媒系で展開した。
ブチルオキシカルボニルアミノ−３−Ｓ−（３′−スル
ホプロピル）−チオプロピオニル）−２−アミノ エチ
ル］カルバモイル｝フェニル10−メチルアクリジニウム
−９−カルボキシレート ブロマイド（BOC−SulfoCys
−ED−DMAE）の調製 110mlのDMF/CHCl3（1:1）中のBOC−SulfoCys（3.42m
mole）（実施例２）およびDMAE−ED（400mg,0.79m mol
e）（実施例１）溶液をジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（325mg,1.57m mole）で処理し、室温で３時間撹拌
し、蒸発乾燥した。蒸発による残分を約15mlのクロロホ
ルム／メタノール／水（65:25:4）に入れ、８つの分取T
LCプレート（シリカゲル60,メクル社）で純化し、同じ
溶媒系で展開した。
約0.55Rfで生じた主黄色バンドをストリッピングし、
同じ溶媒系で溶離した。溶出液をアンダーブァキュオ
（under vacuo:真空下）で乾燥まで蒸発処理し、BOC−S
ulfoCys−ED−DMAE（630mg,90％）を得た。
同じ溶媒系で溶離した。溶出液をアンダーブァキュオ
（under vacuo:真空下）で乾燥まで蒸発処理し、BOC−S
ulfoCys−ED−DMAE（630mg,90％）を得た。
実施例４ ２′,6′−ジメチル−４′−｛Ｎ−［Ｎ−［２−アミノ
−３−Ｓ−（３′−スルホプロピル）−チオプロピオニ
ル）−２−アミノエチル］カルバモイル｝フェニル 10
−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレート ブロ
マイド（SulfoCys−ED−DMAE）の調製 4mlの36％のHBr/酢酸中のBOC−SulfoCys−ED−DMAE
（630mg,0.715m mole）溶液を室温で５時間維持して反
応混合物を形成した。この反応混合物を約30mlの無水エ
チルエーテルに滴下添加して粘着性沈澱物と上清を形成
した。上清を沈澱物から除去した。次に沈澱物を約10ml
のメタノールに溶かし、得られた溶液を約30mlの新鮮な
無水エチルエーテルに滴下添加して、黄色沈澱物を上清
を形成した。この黄色沈澱物と上清を中程度空隙フリッ
トを通して過し、得られた黄色固体残分を無水エチル
エーテルで洗浄し、そして空気乾燥してSulfoCys−ED−
DMAE（438mg,93.7％）を得た。
−３−Ｓ−（３′−スルホプロピル）−チオプロピオニ
ル）−２−アミノエチル］カルバモイル｝フェニル 10
−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレート ブロ
マイド（SulfoCys−ED−DMAE）の調製 4mlの36％のHBr/酢酸中のBOC−SulfoCys−ED−DMAE
（630mg,0.715m mole）溶液を室温で５時間維持して反
応混合物を形成した。この反応混合物を約30mlの無水エ
チルエーテルに滴下添加して粘着性沈澱物と上清を形成
した。上清を沈澱物から除去した。次に沈澱物を約10ml
のメタノールに溶かし、得られた溶液を約30mlの新鮮な
無水エチルエーテルに滴下添加して、黄色沈澱物を上清
を形成した。この黄色沈澱物と上清を中程度空隙フリッ
トを通して過し、得られた黄色固体残分を無水エチル
エーテルで洗浄し、そして空気乾燥してSulfoCys−ED−
DMAE（438mg,93.7％）を得た。
陽イオンモードにおけるFAB質量分析（Oneida Reserc
h ServicesおよびInstitute of Chemical Analysis,Nor
theastern Universityにより実施）は653のM+ピークを
示した。
h ServicesおよびInstitute of Chemical Analysis,Nor
theastern Universityにより実施）は653のM+ピークを
示した。
実施例５ モノカルボキシル ビタミンB12の調製 A.脱アミノ化ビタミンB12の調製 ビタミンB12（1.0g,0.738m mole）（Sigma Chemica
l）を80mlの0.5N HClに加えて反応混合物を形成し、室
温で65時間撹拌した。反応混合物をBio−Rad AG1−X8
（酢酸型）の４×15cmカラム（Bio−Rad Laboratorie
s）,100−200メッシュに装填し、Allen,R.H.そよびMaje
rus,P.W.のJ.Biological Chem.247,7695−7701（1972
年）に記載されるようにパックして溶離した。赤色溶出
液の最初の300mlを集め、真空下で乾燥まで蒸発して、
モノ−，ジ−およびトリカルボキシル化ビタミンB12の
混合物約1gを得た。
l）を80mlの0.5N HClに加えて反応混合物を形成し、室
温で65時間撹拌した。反応混合物をBio−Rad AG1−X8
（酢酸型）の４×15cmカラム（Bio−Rad Laboratorie
s）,100−200メッシュに装填し、Allen,R.H.そよびMaje
rus,P.W.のJ.Biological Chem.247,7695−7701（1972
年）に記載されるようにパックして溶離した。赤色溶出
液の最初の300mlを集め、真空下で乾燥まで蒸発して、
モノ−，ジ−およびトリカルボキシル化ビタミンB12の
混合物約1gを得た。
B.モノカルボキシル化ビタミンB12混合物の調製 Ａで調製したカルボキシル化ビタミンB12の混合物をQ
AE−Sephadex A−25 クロマトグラフィーで分別して、
Allen等により記載された（J.Biol.Chem.247,7695,1972
年）ようなモノカルボキシル化ビタミンB12の混合物を
得た。
AE−Sephadex A−25 クロマトグラフィーで分別して、
Allen等により記載された（J.Biol.Chem.247,7695,1972
年）ようなモノカルボキシル化ビタミンB12の混合物を
得た。
C.カルボキシル化ビタミンB12の分離用分取HPLC 水2ml中のＡにより与えられたモノ−，ジ−およびト
リカルボキシル化ビタミンB12混合物50mgを、ISCO−Fox
yフラクションコレクター,ISCO−2150ピークセパレータ
ー（ISCO社）および300A空隙サイズの15um球状粒子であ
る18接着シリカ（C18−bonded Silica）を装填した30mm
×25mmYMC AP363−15ステンレススチールカラム（YMC
社）を備えたWaters Delta−Prep 3000HPLCシステム（W
aters Associates社）に注入した。
リカルボキシル化ビタミンB12混合物50mgを、ISCO−Fox
yフラクションコレクター,ISCO−2150ピークセパレータ
ー（ISCO社）および300A空隙サイズの15um球状粒子であ
る18接着シリカ（C18−bonded Silica）を装填した30mm
×25mmYMC AP363−15ステンレススチールカラム（YMC
社）を備えたWaters Delta−Prep 3000HPLCシステム（W
aters Associates社）に注入した。
溶媒Ｂとしてアセトニトリルを用い、溶媒Ａとして0.
05Mの酢酸トリエチルアンモニウム,pH4.5を用いた各実
験について、カルボキシル化ビタミンB12を下記のよう
にしてカラムから溶離した。
05Mの酢酸トリエチルアンモニウム,pH4.5を用いた各実
験について、カルボキシル化ビタミンB12を下記のよう
にしてカラムから溶離した。
1.実験１−ステップ−グラディエント （step−gradient）溶離 溶媒B8％／溶液A92％で20分間 次に溶媒B10％／溶媒A90％で10分間 次に溶媒B15％／溶液A85％で50分間 2.実験２−アイソクラティック（isocratic）溶離 溶媒B15％／溶液A85％を使用 3.実験３−ステップ−グラディエント溶離 溶媒B10％／溶媒A90％で10分間 溶媒B15％／溶媒A85％で10分間 4.実験４−アイソシアティック（isociatic）溶離 溶媒B10％／溶媒A90％ カラムの流量は各実験について20ml/分とし、溶出物質
は280nmの波長で検出した。
は280nmの波長で検出した。
第１図は、実験１で得られたカルボキシル化ビタミン
B12混合物の分離を示すグラフである。57のピークが見
られるが、ピーク５の溶出前に予めプログラムした記録
時間が終了してしまったため、ピーク５については記録
されていない。ピーク５は、集った画分の特徴的な赤色
によって決定された。次に、そのピーク５を、グラフ中
のもし記録されていれば位置したであろう所に点線を加
えた。
B12混合物の分離を示すグラフである。57のピークが見
られるが、ピーク５の溶出前に予めプログラムした記録
時間が終了してしまったため、ピーク５については記録
されていない。ピーク５は、集った画分の特徴的な赤色
によって決定された。次に、そのピーク５を、グラフ中
のもし記録されていれば位置したであろう所に点線を加
えた。
第２〜４図は、それぞれ実験２〜４で得られたカルボ
キシル化ビタミンB12混合物の分離を示すグラフであ
る。
キシル化ビタミンB12混合物の分離を示すグラフであ
る。
これらの結果は、適切に選択された溶媒系および分取
HPLCカラムを用いてカルボキシル化ビタミンB12混合物
を分離分布が調整できることを示している。例えば、カ
ルボキシル化ビタミンB12の同じ混合物（下記Ｄ参照）
における分析HPLCの分布を示す第２図および第5A図に見
られるように、第5A図のピーク３（13.84分の保持時
間）は分取カラムを用いてピーク３および４（第２図）
に分かれた。
HPLCカラムを用いてカルボキシル化ビタミンB12混合物
を分離分布が調整できることを示している。例えば、カ
ルボキシル化ビタミンB12の同じ混合物（下記Ｄ参照）
における分析HPLCの分布を示す第２図および第5A図に見
られるように、第5A図のピーク３（13.84分の保持時
間）は分取カラムを用いてピーク３および４（第２図）
に分かれた。
D.カルボキシル化ビタミンB12誘導体の分析HPLC分布 水20ul中のA,BおよびＣの実験２で調製したカルボキ
シル化ビタミンB12混合物５〜20ug各々をBeckman 344 H
PLCシステム（Beckman Instruments社）に注入した。こ
のHPLCシステムは、120A空隙サイズの不規則形状uBonda
pak C18 10um粒子を装填した3.9mm×30cmステンレスス
チールカラム（Waters Associates社）を備えたもので
あった。混合物は各々、10％のアセトニトリルと90％の
0.05M酢酸トリエチルアンモニウム、pH4.5を用いてカラ
ムからアイソクラティックに溶離した。溶離の流量は1.
5ml/分とし、溶出物質を280nmの波長で検出した。
シル化ビタミンB12混合物５〜20ug各々をBeckman 344 H
PLCシステム（Beckman Instruments社）に注入した。こ
のHPLCシステムは、120A空隙サイズの不規則形状uBonda
pak C18 10um粒子を装填した3.9mm×30cmステンレスス
チールカラム（Waters Associates社）を備えたもので
あった。混合物は各々、10％のアセトニトリルと90％の
0.05M酢酸トリエチルアンモニウム、pH4.5を用いてカラ
ムからアイソクラティックに溶離した。溶離の流量は1.
5ml/分とし、溶出物質を280nmの波長で検出した。
第5A図は、Ａから得られたカルボキシル化ビタミンB
12の分離の分布を示している。ピーク１は未反応ビタミ
ンB12を示し、そしてピーク２（11.97分の保持時間）お
よびピーク３（13.84分の保持時間）は混合物中に存在
する３つの不完全分離モノカルボキシル化ビタミンB12
型を示している。第5A図のピーク５はおそらくジカルボ
キシル化ビタミンB12型を示していると考えられる。
12の分離の分布を示している。ピーク１は未反応ビタミ
ンB12を示し、そしてピーク２（11.97分の保持時間）お
よびピーク３（13.84分の保持時間）は混合物中に存在
する３つの不完全分離モノカルボキシル化ビタミンB12
型を示している。第5A図のピーク５はおそらくジカルボ
キシル化ビタミンB12型を示していると考えられる。
第5B〜5F図は、Ｃの実験２で得られた分離ピーク１−
５（第２図）の分析HPLC分布である。第5D図および第5E
図は、第5A図のピーク３および第２図のピーク3,4を形
成する２つの異ったモノカルボキシル化ビタミンB12型
の近接した所持時間（各々13.54分および14.33分）を示
している。
５（第２図）の分析HPLC分布である。第5D図および第5E
図は、第5A図のピーク３および第２図のピーク3,4を形
成する２つの異ったモノカルボキシル化ビタミンB12型
の近接した所持時間（各々13.54分および14.33分）を示
している。
第６図はＢから得られた３つのモノカルボキシル化ビ
タミンB12型混合物の分析HPLC分布を示している。第６
図のピーク１および２は第5A図のピーク２そよび３とほ
ぼ同じ保持時間を有していた。
タミンB12型混合物の分析HPLC分布を示している。第６
図のピーク１および２は第5A図のピーク２そよび３とほ
ぼ同じ保持時間を有していた。
実施例６ モノカルボキシルビタミンB12およびDMAE−EDからの複
合体（B12−ED−DMAE）の調製 実施例５で調製および単離した３つのモノカルボキシ
ルビタミンB12型（今後、それぞれ11.58分,13.54分およ
び14.33分の保持時間を有するモノカルボキシルビタミ
ンB12型I,IIおよびIIIと称する）および実施例１で調製
したDMAE−EDを用いて、下記のトレーサーを調製するた
めに３つの別々なしかし類似した複合反応（conjugatin
g reaction）を実行した。
合体（B12−ED−DMAE）の調製 実施例５で調製および単離した３つのモノカルボキシ
ルビタミンB12型（今後、それぞれ11.58分,13.54分およ
び14.33分の保持時間を有するモノカルボキシルビタミ
ンB12型I,IIおよびIIIと称する）および実施例１で調製
したDMAE−EDを用いて、下記のトレーサーを調製するた
めに３つの別々なしかし類似した複合反応（conjugatin
g reaction）を実行した。
1.8mlのDMF中のモノカルボキシルビタミンB12型Ｉ（1
0mg,7.4u mole）を氷浴中で冷却し、トリエチルアミン
（100ulのDMF中10.5ul,74u mole）およびエチルクロロ
ホルメート（100ulのDMF中2.8ul,30u mole）で処理して
反応混合物を形成した。30分間の撹拌後、反応混合物を
乾燥するまで蒸発し、余分なエチルクロロホルメートを
除去して残分を得た。DMF2ml中のDMAE−ED（3.4mg,6.7u
mole）およびトリエチルアミン（5.2ul,37u mole）を
前記残分に加えて第２の反応混合物を形成した。この第
２の反応混合物を室温で一晩撹拌し、アンダーブァキュ
オ（under vacuo:真空下）で乾燥するまで蒸発した。こ
のようにして得られた生の生成物（crude products）を
１つの分析シリカゲル20×20cmTLCプレート（シリカゲ
ル60,メルク社）で純化して、クロロホルム／メタノー
ル／水（55:40:5）で展開した。
0mg,7.4u mole）を氷浴中で冷却し、トリエチルアミン
（100ulのDMF中10.5ul,74u mole）およびエチルクロロ
ホルメート（100ulのDMF中2.8ul,30u mole）で処理して
反応混合物を形成した。30分間の撹拌後、反応混合物を
乾燥するまで蒸発し、余分なエチルクロロホルメートを
除去して残分を得た。DMF2ml中のDMAE−ED（3.4mg,6.7u
mole）およびトリエチルアミン（5.2ul,37u mole）を
前記残分に加えて第２の反応混合物を形成した。この第
２の反応混合物を室温で一晩撹拌し、アンダーブァキュ
オ（under vacuo:真空下）で乾燥するまで蒸発した。こ
のようにして得られた生の生成物（crude products）を
１つの分析シリカゲル20×20cmTLCプレート（シリカゲ
ル60,メルク社）で純化して、クロロホルム／メタノー
ル／水（55:40:5）で展開した。
Rf0.47−0.57の間に生じた２つの赤色バンド（今後上
部および下部バンドと称する）各々を別々にストリッピ
ングし、同じ溶媒まで溶離した。各溶出液を乾燥するま
で蒸発し、B12−ED−DMAEトレーサーを得た。モノカル
ボキシルビタミンB12型IIおよびIIIについて上記と同じ
手順をくり返した。その結果、３つのモノカルボキシル
ビタミンB12型から合計６つのB12−ED−DMAE複合体（co
njugates）（１〜６と称する）が単離された。複合体１
および２は型Ｉから調製され、３および４は型IIから調
製され、そして５および６は型IVから調製された。各複
合体を0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）と共にリン酸緩
衝生理食塩水（PBS）中で稀釈し、下記の手順を用いて
同時にトレーサー活性（第７図）についてスクリーニン
グした。
部および下部バンドと称する）各々を別々にストリッピ
ングし、同じ溶媒まで溶離した。各溶出液を乾燥するま
で蒸発し、B12−ED−DMAEトレーサーを得た。モノカル
ボキシルビタミンB12型IIおよびIIIについて上記と同じ
手順をくり返した。その結果、３つのモノカルボキシル
ビタミンB12型から合計６つのB12−ED−DMAE複合体（co
njugates）（１〜６と称する）が単離された。複合体１
および２は型Ｉから調製され、３および４は型IIから調
製され、そして５および６は型IVから調製された。各複
合体を0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）と共にリン酸緩
衝生理食塩水（PBS）中で稀釈し、下記の手順を用いて
同時にトレーサー活性（第７図）についてスクリーニン
グした。
１％ヒト血清アルブミン（HSA）0.2％アジ化ナトリウ
ムおよび0.4g/lメルチオレートを含む120mM PBS中にお
ける）中の一連のビタミンB12標準液を1.35MのDTT1/20
容量を加えることによって処理し、処理標準液を得た。
各処理標準液の100ulを12×75mmプラスチックチューブ
に加えた。各チューブに100ulの0.5NNaOHと0.5mlのIF−
PMP（100ug）（懸濁液が3ugのIF/gPMPを含み、加熱応力
工程をはぶき、そしてIF−PMPを、0.16Mの硼酸、10mMの
リン酸塩、0.127MのNaClおよび0.1％のアジ化ナトリウ
ム、pH7.0に再懸濁させることを除いて後述の実施例12A
のように調製した）を加えた。試験されるB12−ED−DMA
E複合体の12−29×106相対光単位（relatiuelight unit
s:RLU）（1RLU＝１光子カウント）を含むPBS/BSA100ul
を各チューブに加え、そのチューブを室温で１時間イン
キュベートした。各チューブの固相を上清から磁気分離
してその上清をデカントした。各チューブの固相を1ml
の水で１回洗浄した。次に固相を100ulの水に再懸濁さ
せ、下記実施例12Bのようにカウントした。表１は得ら
れた結果を示している。第１表中、Ｔは加えた各複合体
の合計RLUを示し、B0は、ビタミンB12の不存在下におけ
る各複合体について最終再懸濁液中の固相に伴う合計RL
Uを示し、B0/Tは、各複合体について、固相に伴って加
えられた合計RLUの割合を示している。
ムおよび0.4g/lメルチオレートを含む120mM PBS中にお
ける）中の一連のビタミンB12標準液を1.35MのDTT1/20
容量を加えることによって処理し、処理標準液を得た。
各処理標準液の100ulを12×75mmプラスチックチューブ
に加えた。各チューブに100ulの0.5NNaOHと0.5mlのIF−
PMP（100ug）（懸濁液が3ugのIF/gPMPを含み、加熱応力
工程をはぶき、そしてIF−PMPを、0.16Mの硼酸、10mMの
リン酸塩、0.127MのNaClおよび0.1％のアジ化ナトリウ
ム、pH7.0に再懸濁させることを除いて後述の実施例12A
のように調製した）を加えた。試験されるB12−ED−DMA
E複合体の12−29×106相対光単位（relatiuelight unit
s:RLU）（1RLU＝１光子カウント）を含むPBS/BSA100ul
を各チューブに加え、そのチューブを室温で１時間イン
キュベートした。各チューブの固相を上清から磁気分離
してその上清をデカントした。各チューブの固相を1ml
の水で１回洗浄した。次に固相を100ulの水に再懸濁さ
せ、下記実施例12Bのようにカウントした。表１は得ら
れた結果を示している。第１表中、Ｔは加えた各複合体
の合計RLUを示し、B0は、ビタミンB12の不存在下におけ
る各複合体について最終再懸濁液中の固相に伴う合計RL
Uを示し、B0/Tは、各複合体について、固相に伴って加
えられた合計RLUの割合を示している。
表 １ 複合体 T B0 B0／T% 1 18×106 3.8×104 0.21 2 29×106 5×104 0.17 3 17.5×106 7.7×104 0.44 4 15.2×106 6.6×104 0.44 5 20.6×106 26.1×104 1.27 6 12×106 20×104 1.67 第７図は、各複合体について、ビタミンB12の濃度に対
するB/B0をプロットしたものである。ここで、Ｂは試料
中のあるビタミンB12濃度について、最終懸濁液の固相
に伴う合計RLUを示し、B0は上記の通りである。最良の
効果（最高のB0/T値）を発揮する複合体はモノカルボキ
シルビタミンB12型IIIから生じる下部バンド（複合体＃
６）に由来した。
するB/B0をプロットしたものである。ここで、Ｂは試料
中のあるビタミンB12濃度について、最終懸濁液の固相
に伴う合計RLUを示し、B0は上記の通りである。最良の
効果（最高のB0/T値）を発揮する複合体はモノカルボキ
シルビタミンB12型IIIから生じる下部バンド（複合体＃
６）に由来した。
100ugのB12−ED−DMAE複合体＃６を、0.05M酢酸トリ
エチルアンモニウム,pH4.5（溶媒Ａ）をアセトニトリル
（溶媒Ｂ）の混合物で40％B/60％Ａから50％B/50％Ａへ
直線勾配（linear gradient）で10分間に亘って溶離す
べく実施例5Dのように分析HPLCシステムで分離した。溶
出液の流量は1ml/分とし、溶出物質を260nmの波長で検
出した。クロマトグラムは２つのピーク（5.66分と7.86
分の保持時間）を示した。単離し、別々に評価した場
合、これら２つのピークは、組合わせても単独でも同様
なアッセイ効果を与えた。
エチルアンモニウム,pH4.5（溶媒Ａ）をアセトニトリル
（溶媒Ｂ）の混合物で40％B/60％Ａから50％B/50％Ａへ
直線勾配（linear gradient）で10分間に亘って溶離す
べく実施例5Dのように分析HPLCシステムで分離した。溶
出液の流量は1ml/分とし、溶出物質を260nmの波長で検
出した。クロマトグラムは２つのピーク（5.66分と7.86
分の保持時間）を示した。単離し、別々に評価した場
合、これら２つのピークは、組合わせても単独でも同様
なアッセイ効果を与えた。
実施例７ Ｎ−トリフルオロアセチル−葉酸（TFA−Fol）の調製 葉酸（1.0g、2.27m mole）と無水トリフルオロ酢酸
（2ml,6.4m mole）を室温で１時間撹拌し、次にアンダ
ーブァキュオ（under vacuo:真空下）で蒸発させた。蒸
発による残分を最少量のメタノールでトリチュレート
（triturate）し、上清を過によって除去した。得ら
れた湿ったケークを乾燥するまで蒸発処理し、クロロホ
ルム／メタノール／水（55:40:5）を用いてTLCプレート
（シリカゲル60,メルク社）でクロマトグラフ分離してR
f0.35のTFA−Folを得た。
（2ml,6.4m mole）を室温で１時間撹拌し、次にアンダ
ーブァキュオ（under vacuo:真空下）で蒸発させた。蒸
発による残分を最少量のメタノールでトリチュレート
（triturate）し、上清を過によって除去した。得ら
れた湿ったケークを乾燥するまで蒸発処理し、クロロホ
ルム／メタノール／水（55:40:5）を用いてTLCプレート
（シリカゲル60,メルク社）でクロマトグラフ分離してR
f0.35のTFA−Folを得た。
実施例８ 葉酸−SulfoCys−ED−DMAE複合体の調製 3.75mlのDMF中のTFA−Fol（27mg、0.05m mole）（実
施例７）溶液を、1.8mlのクロロホルムで稀釈し、氷浴
中で冷却し、トリエチルアミン（0.065ml,0.45m mole）
およびエチルクロロホルメート（0.03ml,0.3m mole）で
処理して反応混合物を形成した。30分間の撹拌後、前記
反応混合物をアンダーブァキュオ（under vacuo:真空
下）で乾燥するまで蒸発させた。蒸発により得られた残
分に4.5mlのDMF/クロロホルム（2:1）、SulfoCys−ED−
DMAE（31mg、0.04m mole）およびトリエチルアミン（0.
035ml、0.24m mole）を加えて第２の反応混合物を形成
した。この第２の反応混合物を室温で一晩撹拌し、蒸発
させて第２の残分を形成した。
施例７）溶液を、1.8mlのクロロホルムで稀釈し、氷浴
中で冷却し、トリエチルアミン（0.065ml,0.45m mole）
およびエチルクロロホルメート（0.03ml,0.3m mole）で
処理して反応混合物を形成した。30分間の撹拌後、前記
反応混合物をアンダーブァキュオ（under vacuo:真空
下）で乾燥するまで蒸発させた。蒸発により得られた残
分に4.5mlのDMF/クロロホルム（2:1）、SulfoCys−ED−
DMAE（31mg、0.04m mole）およびトリエチルアミン（0.
035ml、0.24m mole）を加えて第２の反応混合物を形成
した。この第２の反応混合物を室温で一晩撹拌し、蒸発
させて第２の残分を形成した。
この第２の残分を10×20cmシリカゲル分取TLCプレー
ト（シリカゲル60,メルク社）で純化した。この第２の
残分は、クロロホルム／メタノール／水（55:40:5）で
展開された。
ト（シリカゲル60,メルク社）で純化した。この第２の
残分は、クロロホルム／メタノール／水（55:40:5）で
展開された。
約Rf0.64で生じた黄色バンドをストリッピングし同じ
溶媒系で溶離した。溶出液を蒸発処理して生のTFA−Fol
−SulfoCys−ED−DMAE（11mg）を得た。この生成物のTL
C分析により２つの主要なUV陽性スポット（Rf0.6および
0.5）が示された。Rf0.5のスポットは後のブロック解除
（deblocking）条件に影響されず、従って望ましくない
異物と考えられる。
溶媒系で溶離した。溶出液を蒸発処理して生のTFA−Fol
−SulfoCys−ED−DMAE（11mg）を得た。この生成物のTL
C分析により２つの主要なUV陽性スポット（Rf0.6および
0.5）が示された。Rf0.5のスポットは後のブロック解除
（deblocking）条件に影響されず、従って望ましくない
異物と考えられる。
前記のようにして得られた生のTFA−Fol−SulfoCys−
ED−DMAEを室温において200ulの36％HBr/酢酸で一晩処
理し、第３の反応混合物を形成した。この第３の反応混
合物を約10mlの無水エチルエーテルで処理して沈澱を形
成した。１時間放置後、上清をピペットで沈澱から注意
深く除去した。この沈澱を次に約0.5mlのクロロホルム
／メタノール／水（65:25:4）に溶解し、１つの20×20c
mシリカゲル分析TLCプレート（シリカゲル60,メルク
社）で純化した。このTLCプレートはクロロホルム／メ
タノール／水（55:40:5）で展開された。Rf0.38で生じ
た黄色バンドをストリッピングし同じ展開溶媒系で溶離
した。溶出液を蒸発処理し、葉酸−SulfoCys−ED−DMAE
複合体を得た。
ED−DMAEを室温において200ulの36％HBr/酢酸で一晩処
理し、第３の反応混合物を形成した。この第３の反応混
合物を約10mlの無水エチルエーテルで処理して沈澱を形
成した。１時間放置後、上清をピペットで沈澱から注意
深く除去した。この沈澱を次に約0.5mlのクロロホルム
／メタノール／水（65:25:4）に溶解し、１つの20×20c
mシリカゲル分析TLCプレート（シリカゲル60,メルク
社）で純化した。このTLCプレートはクロロホルム／メ
タノール／水（55:40:5）で展開された。Rf0.38で生じ
た黄色バンドをストリッピングし同じ展開溶媒系で溶離
した。溶出液を蒸発処理し、葉酸−SulfoCys−ED−DMAE
複合体を得た。
実施例９ コルチゾール−３−CMO−ED−DMAE複合体の調製 0.2mlのDMF中の３−カルボキシメチルオキシム−コル
チゾール（コルチゾール−３−CMO,10mg,0.022m mole）
［ステラロイズ（Steraloids）社］溶液を0.8mlのクロ
ロホルムで稀釈し、氷浴中で冷却し、0.2mlのクロロホ
ルム中のジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC,5.5mg,
0.0266m mole）で処理して反応混合物を形成した。10分
間の撹拌後、その反応混合物を0.4mlのDMF中のDMAE−ED
（5.5mg、0.01m mole）溶液で処理して第２の反応混合
物を形成した。この第２の反応混合物を室温において一
晩撹拌し、アンダーブァキュオ（under vacuo）で蒸発
処理した。蒸発による残分を10×20cmシリカゲル分取TL
Cプレート（メルク社）で純化した。この残分は10％メ
タノール／クロロホルムで展開された。Rf0.28で生じた
黄色バンドをストリッピングし20％メタノール／クロロ
ホルムで溶離した。溶出液を蒸発処理してコルチゾール
−３−CMO−ED−DMAE（3.56mg、42％）を得た。陽イオ
ンモードにおけるFAM質量分析（Institute of Chemical
Analysisで行われた）では845のM+ピークを示した。
チゾール（コルチゾール−３−CMO,10mg,0.022m mole）
［ステラロイズ（Steraloids）社］溶液を0.8mlのクロ
ロホルムで稀釈し、氷浴中で冷却し、0.2mlのクロロホ
ルム中のジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC,5.5mg,
0.0266m mole）で処理して反応混合物を形成した。10分
間の撹拌後、その反応混合物を0.4mlのDMF中のDMAE−ED
（5.5mg、0.01m mole）溶液で処理して第２の反応混合
物を形成した。この第２の反応混合物を室温において一
晩撹拌し、アンダーブァキュオ（under vacuo）で蒸発
処理した。蒸発による残分を10×20cmシリカゲル分取TL
Cプレート（メルク社）で純化した。この残分は10％メ
タノール／クロロホルムで展開された。Rf0.28で生じた
黄色バンドをストリッピングし20％メタノール／クロロ
ホルムで溶離した。溶出液を蒸発処理してコルチゾール
−３−CMO−ED−DMAE（3.56mg、42％）を得た。陽イオ
ンモードにおけるFAM質量分析（Institute of Chemical
Analysisで行われた）では845のM+ピークを示した。
実施例10 エストラジオール−６−CMO−ED−DMAE複合体の調製 2mlのDMF/CHCl3（1:1）中の６−カルボキシメチルオ
キシム−17−ベータ−エストラジオール（エストラジオ
ール−６−CMO）（23.1mg,0.062m mole）（ステラロイ
ズ社）溶液を氷浴中で冷却し、DDC（15.4mg,0.074m mol
e）で処理して反応混合物を形成した。10分間の撹拌
後、反応混合物をDMAE−ED（30.1mg、0.059m mole）で
処理して第２の反応混合物を得た。この第２の反応混合
物を室温で一晩撹拌し、アンダーブァキュオ（under va
cuo:真空下）で蒸発させた。蒸発による残分を１つの20
×20cmシリカゲル分取TLCプレートで純化した。残分は
５％メタノール／クロロホルムで展開された。Rf0.17で
生じた黄色バンドをストリッピングし20％メタノール／
クロロホルムで溶離した。溶出液を蒸発処理してエスト
ラジオール−６−CMO−ED−DMAE（11.9mg、26％）を得
た。陽イオンモードにおけるFAB質量分析において789の
M+ピークが示された。
キシム−17−ベータ−エストラジオール（エストラジオ
ール−６−CMO）（23.1mg,0.062m mole）（ステラロイ
ズ社）溶液を氷浴中で冷却し、DDC（15.4mg,0.074m mol
e）で処理して反応混合物を形成した。10分間の撹拌
後、反応混合物をDMAE−ED（30.1mg、0.059m mole）で
処理して第２の反応混合物を得た。この第２の反応混合
物を室温で一晩撹拌し、アンダーブァキュオ（under va
cuo:真空下）で蒸発させた。蒸発による残分を１つの20
×20cmシリカゲル分取TLCプレートで純化した。残分は
５％メタノール／クロロホルムで展開された。Rf0.17で
生じた黄色バンドをストリッピングし20％メタノール／
クロロホルムで溶離した。溶出液を蒸発処理してエスト
ラジオール−６−CMO−ED−DMAE（11.9mg、26％）を得
た。陽イオンモードにおけるFAB質量分析において789の
M+ピークが示された。
実施例11 トロンボキサンB2−ED−DMAE複合物（TxB2−ED−DMAE）
の調製 0.4mlのDMF/CHCl3（1:1）中のトロンボキサンB2（TxB
2）（2.5ml,0.0067m mole）（バイオモル社）溶液を氷
浴で冷却し、トリエチルアミン（6ul、0.04m mole）お
よびエチルクロロホルメート（2ul、0.02m mole）で処
理して反応混合物を形成した。30分間の撹拌後、この反
応混合物を乾燥するまで蒸発させた。蒸発による残分を
0.4mlのDMF/CHCl3（1:1）に溶解し、トリエチルアミン
（6ul,0.04m mole）およびDMAE−ED（4.5mg,0.009m mol
e）で処理して第２の反応混合物を形成した。この第２
の反応混合物を室温で撹拌し、アンダーブァキュオ（un
der vacuo:真空下）で蒸発させて第２の残分を形成し
た。この第２の残分を約0.5mlのクロロホルム／メタノ
ール／水（65:25:4）に入れ、20×20cmシリカゲル分析T
LCプレート（メルク社）で純化した。この残分は15％の
メタノール／クロロホルムで展開された。
の調製 0.4mlのDMF/CHCl3（1:1）中のトロンボキサンB2（TxB
2）（2.5ml,0.0067m mole）（バイオモル社）溶液を氷
浴で冷却し、トリエチルアミン（6ul、0.04m mole）お
よびエチルクロロホルメート（2ul、0.02m mole）で処
理して反応混合物を形成した。30分間の撹拌後、この反
応混合物を乾燥するまで蒸発させた。蒸発による残分を
0.4mlのDMF/CHCl3（1:1）に溶解し、トリエチルアミン
（6ul,0.04m mole）およびDMAE−ED（4.5mg,0.009m mol
e）で処理して第２の反応混合物を形成した。この第２
の反応混合物を室温で撹拌し、アンダーブァキュオ（un
der vacuo:真空下）で蒸発させて第２の残分を形成し
た。この第２の残分を約0.5mlのクロロホルム／メタノ
ール／水（65:25:4）に入れ、20×20cmシリカゲル分析T
LCプレート（メルク社）で純化した。この残分は15％の
メタノール／クロロホルムで展開された。
Rf0.49で生じた主たる黄色バンドをストリッピングし
15％のメタノール／クロロホルムで溶離した。溶出液を
蒸発処理してTxB2−ED−DMAEを得た。
15％のメタノール／クロロホルムで溶離した。溶出液を
蒸発処理してTxB2−ED−DMAEを得た。
実施例12 ビタミンB12アッセイ A.内因子常磁性粒子（IF−PMP）の調製 PMP（Advanced Magnetics社から得られたもの）を米国
特許第4,454,083号に記載されるようにグルタルアルデ
ヒドで活性化した。
特許第4,454,083号に記載されるようにグルタルアルデ
ヒドで活性化した。
5mlの食塩水中の精製ブタ内因子（University of Col
orado Medical CenterのDr.R.H.Allenより購入）（75u
g）を25mlの10mMリン酸ナトリウム,pH7.4中のヒト血清
アルブミン（HSA）（400mg,Immunosearch社）の溶液に
加えてたん白混合物を得た。
orado Medical CenterのDr.R.H.Allenより購入）（75u
g）を25mlの10mMリン酸ナトリウム,pH7.4中のヒト血清
アルブミン（HSA）（400mg,Immunosearch社）の溶液に
加えてたん白混合物を得た。
このたん白混合物を60mlの10mMリン酸ナトリウム中の
活性化PMP（5g）を懸濁液に加え、室温で一晩シェイク
してIF−PMPを得た。
活性化PMP（5g）を懸濁液に加え、室温で一晩シェイク
してIF−PMPを得た。
次にこのIF−PMPを洗浄し、余分な活性化群をグリシ
ンでおさえた。
ンでおさえた。
このIF−PMPを,0.1％のアジ化ナトリウム,0.1％のBSA
および0.001％のBgGと共に200mlの30mM PBS中に再懸濁
させ、50℃で16時間処理し、10mMリン酸ナトリウムで３
回洗浄し、グリシン緩衝液（0.325％グリシン,0.1％ア
ジ化ナトリウム，および0.1％BSA,pH7.8）で３回洗浄
し、グリシン緩衝液（25mg/ml）に再懸濁させ、そして
必要な時まで４℃で保持した。
および0.001％のBgGと共に200mlの30mM PBS中に再懸濁
させ、50℃で16時間処理し、10mMリン酸ナトリウムで３
回洗浄し、グリシン緩衝液（0.325％グリシン,0.1％ア
ジ化ナトリウム，および0.1％BSA,pH7.8）で３回洗浄
し、グリシン緩衝液（25mg/ml）に再懸濁させ、そして
必要な時まで４℃で保持した。
B.同時アッセイ（Simultaneous assay） ６％HSA（0.2％アジ化ナトリウムおよび0.4g/lのメル
チオレートを伴う120mM PBS中の）中の既知の量で増え
るビタミンB12を有する一連の標準液を12×75mmプラス
チックチューブに加えた（100ul/チューブ ）。0.1ml
の遊離剤（releasing ageut）（0.5M NaOH,50ug/mlのKC
N,0.3ug/mlのコビナミド,0.064Mジチオスレイトール）
を前記チューブに加え、それを室温で15分間インキュベ
ートした。Ａで調製したIF−PMPをグリシン緩衝液（80u
g/ml）中で1:312に稀釈した。0.5mlの稀釈IF−PMP（40u
g/チューブ）と、実施例６で調製した0.1mlのB12−ED−
DMAE複合体＃６を0.1％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウ
ムと共にPBS中で稀釈したもの（４×106RLU／チュー
ブ）とを前記チューブに加え、それを室温で60分間イン
キュベートした。
チオレートを伴う120mM PBS中の）中の既知の量で増え
るビタミンB12を有する一連の標準液を12×75mmプラス
チックチューブに加えた（100ul/チューブ ）。0.1ml
の遊離剤（releasing ageut）（0.5M NaOH,50ug/mlのKC
N,0.3ug/mlのコビナミド,0.064Mジチオスレイトール）
を前記チューブに加え、それを室温で15分間インキュベ
ートした。Ａで調製したIF−PMPをグリシン緩衝液（80u
g/ml）中で1:312に稀釈した。0.5mlの稀釈IF−PMP（40u
g/チューブ）と、実施例６で調製した0.1mlのB12−ED−
DMAE複合体＃６を0.1％BSAおよび0.1％アジ化ナトリウ
ムと共にPBS中で稀釈したもの（４×106RLU／チュー
ブ）とを前記チューブに加え、それを室温で60分間イン
キュベートした。
前記チューブを、チューブ内の常磁性粒子の磁気分離
に有用な磁気ラック（Ciba Corning Diagnostics社）内
に置いた。磁界が粒子を上清から分離し、次にその上清
をデカントした。粒子を1mlの水中で１回洗浄し、ポル
テックスし（vortexed）、洗浄物から磁気分離してデカ
ントした。次にその粒子を0.1mlの1mMエチルマレイミド
中に再懸濁させた。
に有用な磁気ラック（Ciba Corning Diagnostics社）内
に置いた。磁界が粒子を上清から分離し、次にその上清
をデカントした。粒子を1mlの水中で１回洗浄し、ポル
テックスし（vortexed）、洗浄物から磁気分離してデカ
ントした。次にその粒子を0.1mlの1mMエチルマレイミド
中に再懸濁させた。
次に前記チューブをルミノメーター（MAGICRLITEアナ
ライザー,Ciba Corning Diagnostics社）内に置いた。
0.1N HNO3中の0.5％過酸化水素溶液0.3mlを各チューブ
に加え、ARQUAD界面活性剤（Armack Chemicals社）を含
む0.25N NaOH0.3mlを加えることによって発光を開始さ
せた。Ｏ標準液のRLU値に対して標準化（normalized）
された各チューブの測定されたRLU値を、第８図に示さ
れるように、それぞれのビタミンB12濃度に対してプロ
ットした。
ライザー,Ciba Corning Diagnostics社）内に置いた。
0.1N HNO3中の0.5％過酸化水素溶液0.3mlを各チューブ
に加え、ARQUAD界面活性剤（Armack Chemicals社）を含
む0.25N NaOH0.3mlを加えることによって発光を開始さ
せた。Ｏ標準液のRLU値に対して標準化（normalized）
された各チューブの測定されたRLU値を、第８図に示さ
れるように、それぞれのビタミンB12濃度に対してプロ
ットした。
C.スプリットインキュベーションアッセイ ５％HSA（0.2％アジ化ナトリウム,2mg/lのアンホテリ
シンおよび24mg/lのゲンタマイシンを伴うPBS中の）中
の既知の量で増えるビタミンB12を有する一連のビタミ
ンB12標準液をチューブに加え（100ul/チューブ）、コ
ビナミドを除いたＢの遊離剤と共にインキュベートし
た。緩衝液に加えられた0.06ug/mlのコビナミドを伴う
Ｂの稀釈IF−PMP（40ug/チューブ）0.5mlを各チューブ
に加え、そのチューブを室温で45分間インキュベートし
た。0.1％のアジ化ナトリウムおよび0.1％のBSAを含む1
0mM PBS,pH7.4で稀釈された実施例６のB12−ED−DMAE複
合体＃６（８×106RLU）0.1mlを各チューブに加え、そ
のチューブを室温で30分間インキュベートした。チュー
ブ内の粒子を磁気分離し、洗浄し、再懸濁させ、そして
Ｂで述べたようにカウントした。各チューブに関するＯ
標準液のRLU値に対して標準化された測定RLU値を、第９
図に示すように、それぞれのビタミンB12濃度に対して
プロットした。
シンおよび24mg/lのゲンタマイシンを伴うPBS中の）中
の既知の量で増えるビタミンB12を有する一連のビタミ
ンB12標準液をチューブに加え（100ul/チューブ）、コ
ビナミドを除いたＢの遊離剤と共にインキュベートし
た。緩衝液に加えられた0.06ug/mlのコビナミドを伴う
Ｂの稀釈IF−PMP（40ug/チューブ）0.5mlを各チューブ
に加え、そのチューブを室温で45分間インキュベートし
た。0.1％のアジ化ナトリウムおよび0.1％のBSAを含む1
0mM PBS,pH7.4で稀釈された実施例６のB12−ED−DMAE複
合体＃６（８×106RLU）0.1mlを各チューブに加え、そ
のチューブを室温で30分間インキュベートした。チュー
ブ内の粒子を磁気分離し、洗浄し、再懸濁させ、そして
Ｂで述べたようにカウントした。各チューブに関するＯ
標準液のRLU値に対して標準化された測定RLU値を、第９
図に示すように、それぞれのビタミンB12濃度に対して
プロットした。
実施例13 葉酸（folate）アッセイ A.試薬 保存剤として24mg/lのゲンタマイシン,4％のHSA,2％
のアジ化ナトリウムおよび2mg/lのアンホテリシンを含
む120mM PBS,pH7.4中に溶解したPGA（プテロイルグルタ
ミン酸）（Sigma Chemical社）を葉酸アッセイの標準液
に使用した。葉酸濃度は0,0.25,0.5,1.0,2.5,5,10,15,2
0および30ngPGA/mlとした。
のアジ化ナトリウムおよび2mg/lのアンホテリシンを含
む120mM PBS,pH7.4中に溶解したPGA（プテロイルグルタ
ミン酸）（Sigma Chemical社）を葉酸アッセイの標準液
に使用した。葉酸濃度は0,0.25,0.5,1.0,2.5,5,10,15,2
0および30ngPGA/mlとした。
遊離剤（Releasing Agent）には64mMジチオスレイト
ールを含む0.5N NaOHを用いた。
ールを含む0.5N NaOHを用いた。
実施例８で得られた葉酸−SulfoCys−ED−DMAE複合体
（8.8×1011RLU）をまず22mlの10％DMF/水に溶解した。
次にその溶液を、0.1％のBSAと0.1％のアジ化ナトリウ
ムを含む325mMグリシンで1:11250に稀釈して第２の溶液
を形成した。この第２の溶液を0.2umのセルロースアセ
テートフィルター（Schleicher and Schuell社）で過
してトレーサー溶液とした。各試験につき500ulのトレ
ーサー溶液を加えた。
（8.8×1011RLU）をまず22mlの10％DMF/水に溶解した。
次にその溶液を、0.1％のBSAと0.1％のアジ化ナトリウ
ムを含む325mMグリシンで1:11250に稀釈して第２の溶液
を形成した。この第２の溶液を0.2umのセルロースアセ
テートフィルター（Schleicher and Schuell社）で過
してトレーサー溶液とした。各試験につき500ulのトレ
ーサー溶液を加えた。
アッセイ中のバインダーには葉酸結合たん白（FBP）
（ウシの乳ラクトグロブリン,University of Colorado
Medical Center のDr.R.H.Allenより購入）を用いた。F
BP−PMPおよびウシ ガンマ グロブリン（BgG）−PMP
を、米国特許第4,454,088号に記載された方法によって
調製した。FBP−PMP（0.96mg/ml）を、0.1％のBSAおよ
び0.1％のアジ化ナトリウムを含む10mM PBS,pH7.4中で
1:60に稀釈した。これを0.4mg/mlのBgG−PMPと共にバル
ク化し、固相バインダーを形成した。この固相バインダ
ー100ulを各試験につき加え、その結果、各試験につき
1.6ugのFBP−PMPおよび40ugのBgG−PMPの添加となっ
た。最終的に、全アッセイ容量800ulにつき、100ulの試
料すなわち標準液、100ulの遊離剤、500ulのトレーサー
溶液、および100ulの固相バインダーを含んでいた。
（ウシの乳ラクトグロブリン,University of Colorado
Medical Center のDr.R.H.Allenより購入）を用いた。F
BP−PMPおよびウシ ガンマ グロブリン（BgG）−PMP
を、米国特許第4,454,088号に記載された方法によって
調製した。FBP−PMP（0.96mg/ml）を、0.1％のBSAおよ
び0.1％のアジ化ナトリウムを含む10mM PBS,pH7.4中で
1:60に稀釈した。これを0.4mg/mlのBgG−PMPと共にバル
ク化し、固相バインダーを形成した。この固相バインダ
ー100ulを各試験につき加え、その結果、各試験につき
1.6ugのFBP−PMPおよび40ugのBgG−PMPの添加となっ
た。最終的に、全アッセイ容量800ulにつき、100ulの試
料すなわち標準液、100ulの遊離剤、500ulのトレーサー
溶液、および100ulの固相バインダーを含んでいた。
B.アッセイ手順 標準液または試料（100ul）を12×75mmポリスチレン
チューブ（Sarstedt社）に加えた。各チューブにＡに記
載の遊離剤100ulを加えた。前記チューブをボルテック
スし（vortexed）、室温で15分間インキュベートした。
Ａのトレーサー溶液（500ul）を各チューブに加え、次
にＡの固相バインダー（100ul）を加えた。チューブを
再びボルテックスし（vortexed）、室温で１時間インキ
ュベートした。次にチューブを３分間磁気分離機にか
け、デカントし、そしてプロットした（blotted）。1ml
の脱イオン水を各チューブに加え、余分な非結合トレー
サーを洗い流した。チューブ内の固相を３分間磁気分離
し、上清をデカントし、そしてチューブを３分間ドレン
（drain）した。得られたチューブ内のペレットに100ul
の1mMエチルマレイミドを加えた。次にチューブをルミ
ノメーター内に置き、実施例12Bで述べたようにしたカ
ウントした。各標準液のRLU値をＯ標準液のRLU値に対し
て標準化し、それぞれの葉酸濃度に対してプロットして
第10図のようなディスプレイスメント曲線を得た。
チューブ（Sarstedt社）に加えた。各チューブにＡに記
載の遊離剤100ulを加えた。前記チューブをボルテック
スし（vortexed）、室温で15分間インキュベートした。
Ａのトレーサー溶液（500ul）を各チューブに加え、次
にＡの固相バインダー（100ul）を加えた。チューブを
再びボルテックスし（vortexed）、室温で１時間インキ
ュベートした。次にチューブを３分間磁気分離機にか
け、デカントし、そしてプロットした（blotted）。1ml
の脱イオン水を各チューブに加え、余分な非結合トレー
サーを洗い流した。チューブ内の固相を３分間磁気分離
し、上清をデカントし、そしてチューブを３分間ドレン
（drain）した。得られたチューブ内のペレットに100ul
の1mMエチルマレイミドを加えた。次にチューブをルミ
ノメーター内に置き、実施例12Bで述べたようにしたカ
ウントした。各標準液のRLU値をＯ標準液のRLU値に対し
て標準化し、それぞれの葉酸濃度に対してプロットして
第10図のようなディスプレイスメント曲線を得た。
実施例14 コルチゾール アッセイ A.試薬の調製 実施例９のコルチゾール−ED−DMAE複合体をメタノー
ルに溶解し、原液として−20℃で保持した。最終コルチ
ゾール−ED−DMAE複合体を、10mMリン酸ナトリウム,pH
7.4,0.1％のウシ血清アルブミン,0.4mg/mlの８−アニリ
ノ−１−ナフタレンスルホネート,0.1％のTritonX−100
および0.05％のアジ化ナトリウムを含む緩衝液中で稀釈
し、トレーサー溶液とした。
ルに溶解し、原液として−20℃で保持した。最終コルチ
ゾール−ED−DMAE複合体を、10mMリン酸ナトリウム,pH
7.4,0.1％のウシ血清アルブミン,0.4mg/mlの８−アニリ
ノ−１−ナフタレンスルホネート,0.1％のTritonX−100
および0.05％のアジ化ナトリウムを含む緩衝液中で稀釈
し、トレーサー溶液とした。
ウサギ抗コルチゾール抗血清をBioclinical Groupか
ら購入した。0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.4のかわ
りに0.01M酢酸ナトリウム緩衝液,pH5.5を使用すること
以外は米国特許第4,554,088号の記載に従って前記抗体
をPMP（Advanced Magnetics社）に固定した。最終PMP湿
性ケークを、0.01Mリン酸ナトリウム,0.1％のウシ血清
アルブミン、4ng/mlの11−デオキシコルチゾールおよび
0.4mg/ml8−アニリノ−１−ナフタレンスルホネートを
含む緩衝液,pH7.4で稀釈してPMP懸濁液（10mg/ml）を得
た。
ら購入した。0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.4のかわ
りに0.01M酢酸ナトリウム緩衝液,pH5.5を使用すること
以外は米国特許第4,554,088号の記載に従って前記抗体
をPMP（Advanced Magnetics社）に固定した。最終PMP湿
性ケークを、0.01Mリン酸ナトリウム,0.1％のウシ血清
アルブミン、4ng/mlの11−デオキシコルチゾールおよび
0.4mg/ml8−アニリノ−１−ナフタレンスルホネートを
含む緩衝液,pH7.4で稀釈してPMP懸濁液（10mg/ml）を得
た。
B.アッセイ手順 ０から750ng/mlの濃度を有するコルチゾール標準液の
各25mlを12×75mmポリスチレン試験チューブ（Sarstedt
社）に加えたものを２つずつ作った。全活性106RLUを有
するＡのトレーサー溶液100ulを前記チューブに加え、
次にＡの稀釈PMP懸濁液500ulを加えた。ボルテックス
（vortex）した後、チューブを室温で１時間インキュベ
ートした。チューブ内のPMPを上清から磁気分離した。
各チューブの上清をデカントし、各チューブ内のPMPを
0.87％の食塩水500ulで１回洗浄し、次に100ulの水に再
懸濁させた。次に前記チューブをルミノメーター内に置
き、実施例12Bのようにカウントした。第11図の標準曲
線は、標準液に加えられたコルチゾールによるPMPに結
合しているトレーサーのディスプレイスメントを示して
いる。ディスプレイスメントは、標準液中のコルチゾー
ルの濃度に反比例している。
各25mlを12×75mmポリスチレン試験チューブ（Sarstedt
社）に加えたものを２つずつ作った。全活性106RLUを有
するＡのトレーサー溶液100ulを前記チューブに加え、
次にＡの稀釈PMP懸濁液500ulを加えた。ボルテックス
（vortex）した後、チューブを室温で１時間インキュベ
ートした。チューブ内のPMPを上清から磁気分離した。
各チューブの上清をデカントし、各チューブ内のPMPを
0.87％の食塩水500ulで１回洗浄し、次に100ulの水に再
懸濁させた。次に前記チューブをルミノメーター内に置
き、実施例12Bのようにカウントした。第11図の標準曲
線は、標準液に加えられたコルチゾールによるPMPに結
合しているトレーサーのディスプレイスメントを示して
いる。ディスプレイスメントは、標準液中のコルチゾー
ルの濃度に反比例している。
実施例15 エストラジオール アッセイ A.試薬調製 実施例10のエストラジオール−ED−DMAE複合体をメタ
ノールに溶解し、原液として−20℃で保持した。この原
液を、0.1％のウシ血清アルブミン,0.15M NaClおよび0.
05％のアジ化ナトリウムを含む0.01Mリン酸ナトリウム
緩衝液,pH7.4で稀釈してトレーサー溶液を作った。
ノールに溶解し、原液として−20℃で保持した。この原
液を、0.1％のウシ血清アルブミン,0.15M NaClおよび0.
05％のアジ化ナトリウムを含む0.01Mリン酸ナトリウム
緩衝液,pH7.4で稀釈してトレーサー溶液を作った。
BSA−エストラジオール複合体で免疫処理し、その後K
ohlerおよびMilsteinによりNature256巻,495−497ペー
ジ（1975年）に記載された手順によってスプレイサイト
（splenocytes）をsp2/0−Ag14ミエローマ細胞と融合さ
せることによって、マウス（A/J）内にモノクローナル
抗エストラジオール抗体を作った。抗エストラジオール
抗体を分泌する雑種細胞を下記の手順で検出した：上記
細胞からの上清を、1mg/mlのウシ血清アルブミンを含む
リン酸緩衝生理食塩水中で1:5に稀釈した。各稀釈上清1
00ulとトレーサーとしてのアクリジニウムエステル標準
化エストラジオール−ニワトリガンマグロブリン100ul
とを試験チューブに加え、室温で１時間インキュベート
した。常磁性粒子に結合されたヤギ抗マウスIgG（goat
anti−mouse IgG）を各チューブに加え、室温でさらに1
0分間インキュベートした。前記粒子を磁気分離し、そ
の粒子に結合したトレーサーをルミノメーターで読み取
った。試験で陽性とでた細胞（すなわちバックグラウン
ドに亘って光子がカウントされた細胞）を0.1細胞／ウ
ェル（well）で培養（plate）し、成長後再試験した。
試験で陽性とでた、前記再成長から得られた細胞をプリ
スタン注入マウス（pristane−primedmice）（CAF1）に
腹腔内注入した。これらのマウスからの腹水を３〜５週
間後に採集した。抗エストラジオール抗体をさらに精製
することなく直接使用した。
ohlerおよびMilsteinによりNature256巻,495−497ペー
ジ（1975年）に記載された手順によってスプレイサイト
（splenocytes）をsp2/0−Ag14ミエローマ細胞と融合さ
せることによって、マウス（A/J）内にモノクローナル
抗エストラジオール抗体を作った。抗エストラジオール
抗体を分泌する雑種細胞を下記の手順で検出した：上記
細胞からの上清を、1mg/mlのウシ血清アルブミンを含む
リン酸緩衝生理食塩水中で1:5に稀釈した。各稀釈上清1
00ulとトレーサーとしてのアクリジニウムエステル標準
化エストラジオール−ニワトリガンマグロブリン100ul
とを試験チューブに加え、室温で１時間インキュベート
した。常磁性粒子に結合されたヤギ抗マウスIgG（goat
anti−mouse IgG）を各チューブに加え、室温でさらに1
0分間インキュベートした。前記粒子を磁気分離し、そ
の粒子に結合したトレーサーをルミノメーターで読み取
った。試験で陽性とでた細胞（すなわちバックグラウン
ドに亘って光子がカウントされた細胞）を0.1細胞／ウ
ェル（well）で培養（plate）し、成長後再試験した。
試験で陽性とでた、前記再成長から得られた細胞をプリ
スタン注入マウス（pristane−primedmice）（CAF1）に
腹腔内注入した。これらのマウスからの腹水を３〜５週
間後に採集した。抗エストラジオール抗体をさらに精製
することなく直接使用した。
ヤギ抗マウスIgG抗血清（goat anti−mouse IgG anti
serum）（Jackson Laboratory）のIgG画分を米国特許第
4,454,088号に記載された方法により常磁性粒子に固定
することにより、ヤギ抗−マウスIgG PMP粒子を調製し
た。最終PMP湿性ケークを、1mg/mlのウシ血清アルブミ
ンを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS/BSA）で稀釈して
最終濃度10mg/mlのPMP懸濁液を作った。
serum）（Jackson Laboratory）のIgG画分を米国特許第
4,454,088号に記載された方法により常磁性粒子に固定
することにより、ヤギ抗−マウスIgG PMP粒子を調製し
た。最終PMP湿性ケークを、1mg/mlのウシ血清アルブミ
ンを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS/BSA）で稀釈して
最終濃度10mg/mlのPMP懸濁液を作った。
B.アッセイ手順 濃度範囲０−2000pg/mlの一連のエストラジオール標
準液各50ulを12×75mmのポリスチレン試験チューブ（Sa
rstedt社）に加え、次に全活性385,000RLUを有するＡの
トレーサー溶液100ulを加えた。
準液各50ulを12×75mmのポリスチレン試験チューブ（Sa
rstedt社）に加え、次に全活性385,000RLUを有するＡの
トレーサー溶液100ulを加えた。
Ａの腹水100ulをPBS/BSA緩衝液中で1:20000に稀釈
し、各チューブに加えた。それらのチューブを全てボル
テックスし（vortexed）、室温で１時間インキュベート
した。ＡのPMP懸濁液をPBS/BSA中で稀釈し、最終濃度80
ug/mlとした。500ulの稀釈PMP懸濁液を各試験チューブ
に加えた。それらのチューブをボルテックスし、室温で
30分間インキュベートした。次に、チューブ内のPMPを
磁気分離した。各チューブ内のPMPを、0.05％のTritonX
−100を含む500ulの食塩水で１回洗浄し、磁気分離し、
上清をデカントした。次に前記PMPを100ulの水に再懸濁
させた。次にチューブをルミノメーター中に置き、実施
例12Bのようにカウントした。第12図のディスプレイス
メント曲線は、光子のカウント数が標準液中のエストラ
ジオール濃度に反比例することを示している。
し、各チューブに加えた。それらのチューブを全てボル
テックスし（vortexed）、室温で１時間インキュベート
した。ＡのPMP懸濁液をPBS/BSA中で稀釈し、最終濃度80
ug/mlとした。500ulの稀釈PMP懸濁液を各試験チューブ
に加えた。それらのチューブをボルテックスし、室温で
30分間インキュベートした。次に、チューブ内のPMPを
磁気分離した。各チューブ内のPMPを、0.05％のTritonX
−100を含む500ulの食塩水で１回洗浄し、磁気分離し、
上清をデカントした。次に前記PMPを100ulの水に再懸濁
させた。次にチューブをルミノメーター中に置き、実施
例12Bのようにカウントした。第12図のディスプレイス
メント曲線は、光子のカウント数が標準液中のエストラ
ジオール濃度に反比例することを示している。
実施例16 トロンボキサンB2（TxB2）アッセイ A.試薬調製 実施例11のTxB2−ED−DMAE複合体をメタノール中で稀
釈し、原液として−80℃で保持した。この原液を、0.1
％のBSA,0.15M NaClおよび0.05％のアジ化ナトリウムを
含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.4で稀釈し、ト
レーサー溶液を作った。Cayman Chemicals社からウサギ
抗TxB2抗血清を購入した。この抗血清を、0.15M塩化ナ
トリウム,1mg/mlのウシ血清アルブミンおよび0.05％の
アジ化ナトリウムを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液,
pH7.4で稀釈した。
釈し、原液として−80℃で保持した。この原液を、0.1
％のBSA,0.15M NaClおよび0.05％のアジ化ナトリウムを
含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.4で稀釈し、ト
レーサー溶液を作った。Cayman Chemicals社からウサギ
抗TxB2抗血清を購入した。この抗血清を、0.15M塩化ナ
トリウム,1mg/mlのウシ血清アルブミンおよび0.05％の
アジ化ナトリウムを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液,
pH7.4で稀釈した。
ヤギ抗ウサギIgG抗血清（goat anti−rabbit IgG ant
iserum）（Jackson Laboratory）のIgG画分を米国特許
第4,454,088号に記載の方法によって常磁性粒子（PMP）
に固定することにより、ヤギ抗ウサギIgG PMPを調製し
た。最終PMP湿性ケークをPBS/BSA緩衝液で稀釈し（10mg
/ml）、PMP懸濁液とした。
iserum）（Jackson Laboratory）のIgG画分を米国特許
第4,454,088号に記載の方法によって常磁性粒子（PMP）
に固定することにより、ヤギ抗ウサギIgG PMPを調製し
た。最終PMP湿性ケークをPBS/BSA緩衝液で稀釈し（10mg
/ml）、PMP懸濁液とした。
B.アッセイ手順 PBS/BSA中の一連のTxB2標準液（０−30mg/ml）各100u
lをポリスチレン試験チューブ（12×75mm,Sarstedt社）
に加えた。全活性350,000RLUを有するＡのトレーサー溶
液100ulを各チューブに加えた。100ulのウサギ抗TxB2抗
血清（ＡにおいてPBS/BSA中で1/40000に稀釈したもの）
を全てのチューブにピペット添加した。全てのチューブ
をボルテックスし（vortexed）、室温で１時間インキュ
ベートした。Ａの稀釈PMP懸濁液500ulを全てのチューブ
に加え、室温で45分間インキュベートした。チューブ内
のPMPを上清から磁気分離した。この上清をデカント
し、そしてPMPを500ulの水で１回洗浄して100ulの水に
再懸濁させた。次に、チューブをルミノメーター中に置
き、実施例12Bのようにカウントした。第13図のディス
プレイスメント曲線は、光子のカウント数が標準液中の
TxB2濃度に反比例することを示している。
lをポリスチレン試験チューブ（12×75mm,Sarstedt社）
に加えた。全活性350,000RLUを有するＡのトレーサー溶
液100ulを各チューブに加えた。100ulのウサギ抗TxB2抗
血清（ＡにおいてPBS/BSA中で1/40000に稀釈したもの）
を全てのチューブにピペット添加した。全てのチューブ
をボルテックスし（vortexed）、室温で１時間インキュ
ベートした。Ａの稀釈PMP懸濁液500ulを全てのチューブ
に加え、室温で45分間インキュベートした。チューブ内
のPMPを上清から磁気分離した。この上清をデカント
し、そしてPMPを500ulの水で１回洗浄して100ulの水に
再懸濁させた。次に、チューブをルミノメーター中に置
き、実施例12Bのようにカウントした。第13図のディス
プレイスメント曲線は、光子のカウント数が標準液中の
TxB2濃度に反比例することを示している。
以下、本発明の実施態様を項分け記載する。
１）下記の化学式を有するアクリジニウムエステルであ
って、 ここでR1は０−20のヘテロ原子を含むアルキル，アル
ケニル，アルキニル，アリールまたはアラルキル基であ
り、 R2，R3，R5およびR7は水素，アミノ，アミド，アシ
ル，アルコキシル，ヒドロキシル，−CO2，ハライド，
ニトロ，−CN,−SO3， または−SCNであって、 ここでＲはＯ−20のヘテロ原子を含むアルキル，アル
ケニル，アルキニル，アリールまたはアラルキルであ
り、 R4およびR8は水素，アルキル，アルケニル，アルキニ
ル，アラルキルまたはサルコキシルであり、 Ｘはアニオンであり、そして R6はＱ−Ｒ−Nu, またはＱ−Nuであって、ここでＱは−Ｏ−，−Ｓ−，−
NH−， であり、Ｒは上記の通りであり、Ｉは−SO3，−OSO3，
−PO3，−POP3または−CO2であり、 Nuは求核基であるアクリジニウムエステル。
って、 ここでR1は０−20のヘテロ原子を含むアルキル，アル
ケニル，アルキニル，アリールまたはアラルキル基であ
り、 R2，R3，R5およびR7は水素，アミノ，アミド，アシ
ル，アルコキシル，ヒドロキシル，−CO2，ハライド，
ニトロ，−CN,−SO3， または−SCNであって、 ここでＲはＯ−20のヘテロ原子を含むアルキル，アル
ケニル，アルキニル，アリールまたはアラルキルであ
り、 R4およびR8は水素，アルキル，アルケニル，アルキニ
ル，アラルキルまたはサルコキシルであり、 Ｘはアニオンであり、そして R6はＱ−Ｒ−Nu, またはＱ−Nuであって、ここでＱは−Ｏ−，−Ｓ−，−
NH−， であり、Ｒは上記の通りであり、Ｉは−SO3，−OSO3，
−PO3，−POP3または−CO2であり、 Nuは求核基であるアクリジニウムエステル。
２）R1が、窒素，酸素，リンおよび硫黄から成る群より
選択された０−20のヘテロ原子を含む、１−24の炭素原
子を有するアルキル，アルケニル，アルキニルまたはア
リールであり、 R2，R3，R5およびR7が水素，アミノ，−CO2，−CN,ヒ
ドロキシル，C1−C4アルコキシ，ニトロ，ハライド，−
SO3または−SCNであり、 R4およびR8が１−８の炭素原子を有するアルキル，ア
ルケニル，アルキニルまたはアルコキシルであり、 Ｘがハライド，CH3SO4 -，OSO2F-，OSO2CF3，OSO3C4F9
-または であり、 Ｒが、窒素，酸素，リンおよび硫黄から成る群より選
択された０−20のヘテロ原子を含む、１−24の炭素原子
を有するアルキル，アルケニル，アルキニル，アリール
またはアラルキルであり、そして Nuがアミノ，ヒドロキシル，メルカプト、活性メチレ
ンまたは有機金属部分であることを特徴とする実施態様
１記載のアクリジニウムエステル。
選択された０−20のヘテロ原子を含む、１−24の炭素原
子を有するアルキル，アルケニル，アルキニルまたはア
リールであり、 R2，R3，R5およびR7が水素，アミノ，−CO2，−CN,ヒ
ドロキシル，C1−C4アルコキシ，ニトロ，ハライド，−
SO3または−SCNであり、 R4およびR8が１−８の炭素原子を有するアルキル，ア
ルケニル，アルキニルまたはアルコキシルであり、 Ｘがハライド，CH3SO4 -，OSO2F-，OSO2CF3，OSO3C4F9
-または であり、 Ｒが、窒素，酸素，リンおよび硫黄から成る群より選
択された０−20のヘテロ原子を含む、１−24の炭素原子
を有するアルキル，アルケニル，アルキニル，アリール
またはアラルキルであり、そして Nuがアミノ，ヒドロキシル，メルカプト、活性メチレ
ンまたは有機金属部分であることを特徴とする実施態様
１記載のアクリジニウムエステル。
３）R1が１−10の炭素原子を有するアルキルであり、 R2，R3，R5およびR7が水素，C1−C4アルコキシル，−
CN,−SO3，ニトロまたはアミノであり、 R4およびR8が１−４の炭素原子を有するアルキルであ
り、そして Ｘがハライドであることを特徴とする実施態様２記載
のアクリジニウムエステル。
CN,−SO3，ニトロまたはアミノであり、 R4およびR8が１−４の炭素原子を有するアルキルであ
り、そして Ｘがハライドであることを特徴とする実施態様２記載
のアクリジニウムエステル。
４）R1，R4そよびR8がメチルであり、 R2，R3，R5およびR7が水素であり、 Ｘがブロマイドであり、そして R6が−CONH−CH2CH2−NH2または であることを特徴とする実施態様３記載のアクリジニウ
ムエステル。
ムエステル。
５） 生物活性を有する分子と共有結合した実施態様１
記載のアクリジニウムエステルを含む発光複合体。
記載のアクリジニウムエステルを含む発光複合体。
６） 生物活性を有する分子と共有結合した実施態様２
記載のアクリジニウムエステルを含む発光複合体。
記載のアクリジニウムエステルを含む発光複合体。
７） 生物活性を有する分子と共有結合した実施態様３
記載のアクリジニウムエステルを含む発光複合体。
記載のアクリジニウムエステルを含む発光複合体。
８） 生物活性を有する分子と共有結合した実施態様４
記載のアクリジニウムエステルを含む発光複合体。
記載のアクリジニウムエステルを含む発光複合体。
９） 前記生物活性を有する分子がたん白，抗原，ハプ
テン，核酸，または核酸を含む分子であることを特徴と
する実施態様５記載の発光複合体。
テン，核酸，または核酸を含む分子であることを特徴と
する実施態様５記載の発光複合体。
10） 生物活性を有する前記分子がビタミンB12または
ビタミンB12の誘導体であることを特徴とする実施態様
９記載の発光複合体。
ビタミンB12の誘導体であることを特徴とする実施態様
９記載の発光複合体。
11） 生物活性を有する前記分子が葉酸または葉酸の誘
導体であることを特徴とする実施態様９記載の発光複合
体。
導体であることを特徴とする実施態様９記載の発光複合
体。
12）（ａ）アミノ反応性化合物と共に葉酸または葉酸の
誘導体をインキュベートしてアシルまたはアルキルオキ
シカルボニル基を葉酸または葉酸の誘導体のＣ−２アミ
ノ基と結合させ、それによって保護された葉酸中間体を
形成し、 （ｂ）（ａ）の保護された葉酸中間体の少なくとも１つ
のカルボキシル基を活性化し、 （ｃ）（ｂ）の活性化された保護葉酸中間体を請求項１
記載のアクリジニウムエステルと共にインキュベートし
てアクリジニウムエステル−保護葉酸中間体複合体を形
成し、 （ｄ）Ｃ−２アミノ基からアミノ保護基を取り除くのに
十分な時間、酸性媒質中で前記アクリジニウムエステル
−保護葉酸中間体複合体をインキュベートし、それによ
ってアクリジニウムエステル−葉酸複合体を形成する各
工程から成る、葉酸または葉酸の誘導体とアクリジニウ
ムエステルとの複合体の製造方法。
誘導体をインキュベートしてアシルまたはアルキルオキ
シカルボニル基を葉酸または葉酸の誘導体のＣ−２アミ
ノ基と結合させ、それによって保護された葉酸中間体を
形成し、 （ｂ）（ａ）の保護された葉酸中間体の少なくとも１つ
のカルボキシル基を活性化し、 （ｃ）（ｂ）の活性化された保護葉酸中間体を請求項１
記載のアクリジニウムエステルと共にインキュベートし
てアクリジニウムエステル−保護葉酸中間体複合体を形
成し、 （ｄ）Ｃ−２アミノ基からアミノ保護基を取り除くのに
十分な時間、酸性媒質中で前記アクリジニウムエステル
−保護葉酸中間体複合体をインキュベートし、それによ
ってアクリジニウムエステル−葉酸複合体を形成する各
工程から成る、葉酸または葉酸の誘導体とアクリジニウ
ムエステルとの複合体の製造方法。
13）（ａ）ビタミンB12またはビタミンB12の誘導体のコ
リン環の第１プロパンアミド側鎖を脱アミノ化するのに
十分な時間、酸性媒質中で、ビタミンB12またはビタミ
ンB12の誘導体をインキュベートして、カルボキシル化
ビタミンB12の混合物を与え、 （ｂ）そのカルボキシル化ビタミンB12の混合物をHPLC
にかけて、トリカルボキシルビタミンB12型，ジカルボ
キシルビタミンB12型および３つのモノカルボキシルビ
タミンB12型を分離し、 （ｃ）モノカルボキシルビタミンB12型の１つを単離
し、 （ｄ）（ｃ）のモノカルボキシルビタミンB12のカルボ
キシル基を活性化し、 （ｅ）（ｄ）の活性化モノカルボキシルビタミンB12を
実施態様１記載のアクリジニウムエステルと共にインキ
ュベートしてアクリジニウムエステル−ビタミンB12複
合体を得る各工程から成る、ビタミンB12またはビタミ
ンB12の誘導体とアクリジニウムエステルとの複合体の
製造方法。
リン環の第１プロパンアミド側鎖を脱アミノ化するのに
十分な時間、酸性媒質中で、ビタミンB12またはビタミ
ンB12の誘導体をインキュベートして、カルボキシル化
ビタミンB12の混合物を与え、 （ｂ）そのカルボキシル化ビタミンB12の混合物をHPLC
にかけて、トリカルボキシルビタミンB12型，ジカルボ
キシルビタミンB12型および３つのモノカルボキシルビ
タミンB12型を分離し、 （ｃ）モノカルボキシルビタミンB12型の１つを単離
し、 （ｄ）（ｃ）のモノカルボキシルビタミンB12のカルボ
キシル基を活性化し、 （ｅ）（ｄ）の活性化モノカルボキシルビタミンB12を
実施態様１記載のアクリジニウムエステルと共にインキ
ュベートしてアクリジニウムエステル−ビタミンB12複
合体を得る各工程から成る、ビタミンB12またはビタミ
ンB12の誘導体とアクリジニウムエステルとの複合体の
製造方法。
14）前記生物活性を有する分子が17−ベータ−エストラ
ジオールまたは17−ベータ−エストラジオールの誘導体
であることを特徴とする実施態様９記載の発光複合体。
ジオールまたは17−ベータ−エストラジオールの誘導体
であることを特徴とする実施態様９記載の発光複合体。
15）前記生物活性を有する分子がコルチゾールまたはコ
ルチゾールの誘導体であることを特徴とする実施態様９
記載の発光複合体。
ルチゾールの誘導体であることを特徴とする実施態様９
記載の発光複合体。
16）前記生物活性を有する分子がトロンボキサンB2また
はプロスタグランジン類似体であることを特徴とする実
施態様９記載の発光複合体。
はプロスタグランジン類似体であることを特徴とする実
施態様９記載の発光複合体。
17）（ａ）17−ベータ−エストラジオールまたは17−ベ
ータ−エストラジオールの誘導体についている官能基を
活性化して活性化エストラジオール中間体を与え、 （ｂ）その活性化エストラジオール中間体を実施態様１
記載のアクリジニウムエステルと共にインキュベートし
てアクリジニウムエステル−17−ベータ−エストラジオ
ール複合体を得る工程から成る、17−ベータ−エストラ
ジオールまたは17−ベータ−エストラジオールの誘導体
とアクリジニウムエステルとの複合体の製造方法。
ータ−エストラジオールの誘導体についている官能基を
活性化して活性化エストラジオール中間体を与え、 （ｂ）その活性化エストラジオール中間体を実施態様１
記載のアクリジニウムエステルと共にインキュベートし
てアクリジニウムエステル−17−ベータ−エストラジオ
ール複合体を得る工程から成る、17−ベータ−エストラ
ジオールまたは17−ベータ−エストラジオールの誘導体
とアクリジニウムエステルとの複合体の製造方法。
18）（ａ）コルチゾールまたはコルチゾールの誘導体に
ついている官能基を活性化して活性化コルチゾール中間
体を与え、 （ｂ）その活性化コルチゾール中間体を実施態様１記載
のアクリジニウムエステルと共にインキュベートしてア
クリジニウムエステル−コルチゾール複合体を得る工程
から成る、コルチゾールまたはコルチゾールの誘導体と
アクリジニウムエステルとの複合体の製造方法。
ついている官能基を活性化して活性化コルチゾール中間
体を与え、 （ｂ）その活性化コルチゾール中間体を実施態様１記載
のアクリジニウムエステルと共にインキュベートしてア
クリジニウムエステル−コルチゾール複合体を得る工程
から成る、コルチゾールまたはコルチゾールの誘導体と
アクリジニウムエステルとの複合体の製造方法。
19）（ａ）トロンボキサンB2またはプロスタグランジン
類似体の末端カルボキシル基を活性化してトロンボキサ
ンB2またはプロスタグランジン類似体の活性化中間体を
与え、 （ｂ）前記活性化中間体を実施態様１記載のアクリジニ
ウムエステルと共にインキュベートしてアクリジニウム
エステル−トロンボキサンB2複合体またはアクリジニウ
ムエステル−プロスタグランジン類似体複合体を得る工
程から成る、トロンボキサンB2またはプロスタグランジ
ン類似体とアクリジニウムエステルとの複合体の製造方
法。
類似体の末端カルボキシル基を活性化してトロンボキサ
ンB2またはプロスタグランジン類似体の活性化中間体を
与え、 （ｂ）前記活性化中間体を実施態様１記載のアクリジニ
ウムエステルと共にインキュベートしてアクリジニウム
エステル−トロンボキサンB2複合体またはアクリジニウ
ムエステル−プロスタグランジン類似体複合体を得る工
程から成る、トロンボキサンB2またはプロスタグランジ
ン類似体とアクリジニウムエステルとの複合体の製造方
法。
20）（ａ）試料中のビタミンB12を内生的ビタミンB12結
合たん白から遊離させる条件下で液体試料をインキュベ
ートして遊離された液体試料を与え、 （ｂ）前記遊離された液体試料を、（ｉ）固体担体上に
固定されたビタミンB12結合たん白を含む複合物および
（ii）実施態様13記載の複合体と共にインキュベートし
て錯体複合物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｅ）（ｄ）の測定から液体試料中のビタミンB12の量
を決定する各工程から成る，液体試料中のビタミンB12
を測定するためのアッセイ。
合たん白から遊離させる条件下で液体試料をインキュベ
ートして遊離された液体試料を与え、 （ｂ）前記遊離された液体試料を、（ｉ）固体担体上に
固定されたビタミンB12結合たん白を含む複合物および
（ii）実施態様13記載の複合体と共にインキュベートし
て錯体複合物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｅ）（ｄ）の測定から液体試料中のビタミンB12の量
を決定する各工程から成る，液体試料中のビタミンB12
を測定するためのアッセイ。
21）（ａ）液体試料を、（ｉ）塩基および（ii）メルカ
プト化合物と共にインキュベートして遊離された液体試
料を与え、 （ｂ）前記遊離された液体試料を、（ｉ）固体担体上に
固定されたビタミンB12結合たん白を含む複合物および
（ii）実施態様13記載の複合体と共にインキュベートし
て錯体複合物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、
（ｄ）前記錯体複合物をチオール反応性化合物と共にイ
ンキュベートし、 （ｅ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｆ）（ｅ）の測定から液体試料中のビタミンB12の量
を決定する各工程から成る、液体試料中のビタミンB12
を測定するためのアッセイ。
プト化合物と共にインキュベートして遊離された液体試
料を与え、 （ｂ）前記遊離された液体試料を、（ｉ）固体担体上に
固定されたビタミンB12結合たん白を含む複合物および
（ii）実施態様13記載の複合体と共にインキュベートし
て錯体複合物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、
（ｄ）前記錯体複合物をチオール反応性化合物と共にイ
ンキュベートし、 （ｅ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｆ）（ｅ）の測定から液体試料中のビタミンB12の量
を決定する各工程から成る、液体試料中のビタミンB12
を測定するためのアッセイ。
22）前記メルカプト化合物がジチオスレイトールである
ことを特徴とする実施態様21記載のアッセイ。
ことを特徴とする実施態様21記載のアッセイ。
23）前記塩基が水酸化ナトリウムであることを特徴とす
る実施態様22記載のアッセイ。
る実施態様22記載のアッセイ。
24）前記チオール反応性化合物がエチルマレイミドであ
ることを特徴とする実施態様21記載のアッセイ。
ることを特徴とする実施態様21記載のアッセイ。
25）（ａ）液体試料中の葉酸を液体試料中の内生的葉酸
結合たん白から遊離させる条件下で前記液体試料をイン
キュベートして遊離された液体試料を与え、 （ｂ）前記遊離された液体試料を、（ｉ）固体担体上に
固定された葉酸結合たん白を含む複合物および（ii）実
施態様12記載の複合体と共にインキュベートして錯体複
合物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｅ）（ｄ）の測定から液体試料中の葉酸の量を決定す
る各工程から成る、液体試料中の葉酸を測定するための
アッセイ。
結合たん白から遊離させる条件下で前記液体試料をイン
キュベートして遊離された液体試料を与え、 （ｂ）前記遊離された液体試料を、（ｉ）固体担体上に
固定された葉酸結合たん白を含む複合物および（ii）実
施態様12記載の複合体と共にインキュベートして錯体複
合物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｅ）（ｄ）の測定から液体試料中の葉酸の量を決定す
る各工程から成る、液体試料中の葉酸を測定するための
アッセイ。
26）（ａ）液体試料を、（ｉ）塩基および（ii）メルカ
プト化合物と共にインキュベートして遊離された液体試
料を与え、 （ｂ）前記遊離された液体試料を、（ｉ）固体担体上に
固定された葉酸結合たん白を含む複合物および（ii）実
施態様12記載の複合体と共にインキュベートして錯体複
合物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物をチオール反応性化合物と共にイ
ンキュベートし、 （ｅ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｆ）（ｅ）の測定から液体試料中の葉酸の量を決定す
る各工程から成る、液体試料中の葉酸を測定するための
アッセイ。
プト化合物と共にインキュベートして遊離された液体試
料を与え、 （ｂ）前記遊離された液体試料を、（ｉ）固体担体上に
固定された葉酸結合たん白を含む複合物および（ii）実
施態様12記載の複合体と共にインキュベートして錯体複
合物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物をチオール反応性化合物と共にイ
ンキュベートし、 （ｅ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｆ）（ｅ）の測定から液体試料中の葉酸の量を決定す
る各工程から成る、液体試料中の葉酸を測定するための
アッセイ。
27）前記メルカプト化合物がジチオスレイトールである
ことを特徴とする実施態様26記載のアッセイ。
ことを特徴とする実施態様26記載のアッセイ。
28）前記塩基が水酸化ナトリウムであることを特徴とす
る実施態様27記載のアッセイ。
る実施態様27記載のアッセイ。
29）前記チオール反応性化合物がエチルマレイミドであ
ることを特徴とする実施態様26記載のアッセイ。
ることを特徴とする実施態様26記載のアッセイ。
30）（ａ）液体試料を、（ｉ）固体担上体に固定された
抗コルチゾール抗体を含む複合物および（ii）実施態様
18記載の複合体と共にインキュベートして錯体複合物を
形成し、 （ｂ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、 （ｃ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｄ）（ｃ）の測定から液体試料中のコルチゾールの量
を決定する各工程から成る、液体試料中のコルチゾール
を測定するためのアッセイ。
抗コルチゾール抗体を含む複合物および（ii）実施態様
18記載の複合体と共にインキュベートして錯体複合物を
形成し、 （ｂ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、 （ｃ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｄ）（ｃ）の測定から液体試料中のコルチゾールの量
を決定する各工程から成る、液体試料中のコルチゾール
を測定するためのアッセイ。
31）（ａ）液体試料を、（ｉ）抗17−ベータ−エストラ
ジオール抗体および（ii）実施態様17記載の複合体と共
にインキュベートして反応混合物を形成し、 （ｂ）抗17−ベータ−エストラジオール抗体の結合能の
ある、固体担体上に固定された抗体を含む複合物と共に
前記反応混合物をインキュベートして錯体複合物を形成
し、 （ｃ）前記錯体複合物を上清から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｅ）（ｄ）の測定から液体試料中の17−ベータ−エス
トラジオールの量を決定する各工程から成る、液体試料
中の17−ベータ−エストラジオールを測定するためのア
ッセイ。
ジオール抗体および（ii）実施態様17記載の複合体と共
にインキュベートして反応混合物を形成し、 （ｂ）抗17−ベータ−エストラジオール抗体の結合能の
ある、固体担体上に固定された抗体を含む複合物と共に
前記反応混合物をインキュベートして錯体複合物を形成
し、 （ｃ）前記錯体複合物を上清から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｅ）（ｄ）の測定から液体試料中の17−ベータ−エス
トラジオールの量を決定する各工程から成る、液体試料
中の17−ベータ−エストラジオールを測定するためのア
ッセイ。
32）（ａ）液体試料を、（ｉ）抗トロンボキサンB2抗体
および（ii）実施態様19記載の複合体と共にインキュベ
ートして反応混合物を形成し、 （ｂ）抗トロンボキサンB2抗体に結合能のある、固体担
体上に固定された固定化抗体を含む複合物と共に前記反
応混合物をインキュベートして錯体複合物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を上清から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｅ）（ｄ）の測定から液体試料中のトロンボキサンB2
の量を決定する各工程から成る、液体試料中のトロンボ
キサンB2を測定するためのアッセイ。
および（ii）実施態様19記載の複合体と共にインキュベ
ートして反応混合物を形成し、 （ｂ）抗トロンボキサンB2抗体に結合能のある、固体担
体上に固定された固定化抗体を含む複合物と共に前記反
応混合物をインキュベートして錯体複合物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を上清から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｅ）（ｄ）の測定から液体試料中のトロンボキサンB2
の量を決定する各工程から成る、液体試料中のトロンボ
キサンB2を測定するためのアッセイ。
第１〜４図は、それぞれ実施例５の実験１〜４で得られ
たカルボキシル化ビタミンB12混合物の分離を示すグラ
フ、 第5A図は実施例５のＡで得られたカルボキシル化ビタミ
ンB12の分離を示すグラフ、 第5B〜5F図は実施例５のＣの実験２で得られたカルボキ
シル化ビタミンB12の分離ピーク１〜５（第２図）の分
析HPLC分布を示すグラフ、 第６図は実施例５のＢにより得られた３つのモノカルボ
キシル化ビタミンB12型混合物の分析HPLC分布を示すグ
ラフ、 第７図は各複合体についてビタミンB12濃度に対するB/B
0を示すグラフ、 第８図はビタミンB12の同時アッセイにおけるビタミンB
12濃度に対するRLU値を示すグラフ、 第９図はビタミンB12のスプリットインキュベーション
アッセイにおけるビタミンB12濃度に対するRLU値を示す
グラフ、 第10図は葉酸アッセイにおける葉酸濃度に対するRLU値
を示すグラフ、 第11図はコルチゾールアッセイにおけるPMPに結合した
トレーサーのディスプレイスメントを示す標準曲線のグ
ラフ、 第12図はエストラジオールアッセイにおけるPMPに結合
したトレーサーのディスプレイスメントを示す標準曲線
のグラフ、 第13図はトロンボキサンB2アッセイにおけるPMPに結合
したトレーサーのディスプレイスメントを示す標準曲線
のグラフである。
たカルボキシル化ビタミンB12混合物の分離を示すグラ
フ、 第5A図は実施例５のＡで得られたカルボキシル化ビタミ
ンB12の分離を示すグラフ、 第5B〜5F図は実施例５のＣの実験２で得られたカルボキ
シル化ビタミンB12の分離ピーク１〜５（第２図）の分
析HPLC分布を示すグラフ、 第６図は実施例５のＢにより得られた３つのモノカルボ
キシル化ビタミンB12型混合物の分析HPLC分布を示すグ
ラフ、 第７図は各複合体についてビタミンB12濃度に対するB/B
0を示すグラフ、 第８図はビタミンB12の同時アッセイにおけるビタミンB
12濃度に対するRLU値を示すグラフ、 第９図はビタミンB12のスプリットインキュベーション
アッセイにおけるビタミンB12濃度に対するRLU値を示す
グラフ、 第10図は葉酸アッセイにおける葉酸濃度に対するRLU値
を示すグラフ、 第11図はコルチゾールアッセイにおけるPMPに結合した
トレーサーのディスプレイスメントを示す標準曲線のグ
ラフ、 第12図はエストラジオールアッセイにおけるPMPに結合
したトレーサーのディスプレイスメントを示す標準曲線
のグラフ、 第13図はトロンボキサンB2アッセイにおけるPMPに結合
したトレーサーのディスプレイスメントを示す標準曲線
のグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０９Ｋ 11/06 Ｃ０９Ｋ 11/06 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｈ Ａ Ｓ 33/532 33/532 Ｂ (72)発明者 セイ ジョン ロー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02090 ウエストウッド フォーブス ロード 15 (72)発明者 クリスティン アン ヴィトコウスカス アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02035 フォックスボロ ハワード ア ヴェニュー 11
Claims (13)
- 【請求項１】下記の化学式を有するアクリジニウムエス
テルであって、 ここでR1はＯ−20のヘテロ原子を含むアルキル，アルケ
ニル，アルキニル，アリールまたはアラルキル基であ
り、 R2，R3，R5およびR7は水素，アミノ，アミド，アシル，
アルコキシル，ヒドロキシル，−CO2，ハライド，ニト
ロ，−CN,−SO3， または−SCNであって、 ここでＲはＯ−20のヘテロ原子を含むアルキル，アルケ
ニル，アルキニル，アリールまたはアラルキルであり、 R4およびR8は水素，アルキル，アルケニル，アルキニ
ル，アラルキルまたはアルコキシルであり、 Ｘはアニオンであり、そして R6はＱ−Ｒ−Nu, またはＱ−Nuであって、ここでＱは−Ｏ−，−Ｓ−，−
NH−， であり、Ｒは上記の通りであり、Ｉは−SO3，−OSO3，
−PO3，−OPO3または−CO2であり、 Nuは以下のものから成る群より選択される求核基である
ことを特徴とするアクリジニウムエステル。 −NO2，−CN,−SO3H，−Ｎ（Ｒ）3 +および−Ｓ（Ｒ）2 +
（ここでＲは上記の通り）から成る群より選択される強
力な電子吸引基に隣接した活性メチレン基、アミノ基、
ヒドロキシル基、メルカプト基；並びにグリニャール試
薬、リチウム化合物およびフェニルナトリウムから成る
群より選択される有機金属部分。 - 【請求項２】（ａ）アミノ反応性化合物と共に葉酸また
は葉酸の誘導体をインキュベートしてアシルまたはアル
キルオキシカルボニル基を葉酸または葉酸の誘導体のＣ
−２アミノ基と結合させ、それによって保護された葉酸
中間体を形成し、 （ｂ）（ａ）の保護された葉酸中間体の少なくとも１つ
のカルボキシル基を活性化し、 （ｃ）（ｂ）の活性化された保護葉酸中間体を請求項１
記載のアクリジニウムエステルと共にインキュベートし
てアクリジニウムエステル−保護葉酸中間体複合体を形
成し、 （ｄ）Ｃ−２アミノ基からアミノ保護基を取り除くのに
十分な時間、酸性媒質中で前記アクリジニウムエステル
−保護葉酸中間体複合体をインキュベートし、それによ
ってアクリジニウムエステル−葉酸複合体を形成する各
工程から成る、葉酸または葉酸の誘導体とアクリジニウ
ムエステルとの複合体の製造方法。 - 【請求項３】（ａ）ビタミンB12またはビタミンB12の誘
導体のコリン環の第１プロパンアミド側鎖を脱アミノ化
するのに十分な時間、酸性媒質中で、ビタミンB12また
はビタミンB12の誘導体をインキュベートして、カルボ
キシル化ビタミンB12の混合物を与え、 （ｂ）そのカルボキシル化ビタミンB12の混合物をHPLC
にかけて、トリカルボキシルビタミンB12型，ジカルボ
キシルビタミンB12型および３つのモノカルボキシルビ
タミンB12型を分離し、 （ｃ）モノカルボキシルビタミンB12型の１つを単離
し、 （ｄ）（ｃ）のモノカルボキシルビタミンB12のカルボ
キシル基を活性化し、 （ｅ）（ｄ）の活性化モノカルボキシルビタミンB12を
請求項１記載のアクリジニウムエステルと共にインキュ
ベートしてアクリジニウムエステル−ビタミンB12複合
体を得る各工程から成る、ビタミンB12またはビタミンB
12の誘導体とアクリジニウムエステルとの複合体の製造
方法。 - 【請求項４】（ａ）17−ベータ−エストラジオールまた
は17−ベータ−エストラジオールの誘導体についている
官能基を活性化して活性化エストラジオール中間体を与
え、 （ｂ）その活性化エストラジオール中間体を請求項１記
載のアクリジニウムエステルと共にインキュベートして
アクリジニウムエステル−17−ベータ−エストラジオー
ル複合体を得る工程から成る、17−ベータ−エストラジ
オールまたは17−ベータ−エストラジオールの誘導体と
アクリジニウムエステルとの複合体の製造方法。 - 【請求項５】（ａ）コルチゾールまたはコルチゾールの
誘導体についている官能基を活性化して活性化コルチゾ
ール中間体を与え、 （ｂ）その活性化コルチゾール中間体を請求項１記載の
アクリジニウムエステルと共にインキュベートしてアク
リジニウムエステル−コルチゾール複合体を得る工程か
ら成る、コルチゾールまたはコルチゾールの誘導体とア
クリジニウムエステルとの複合体の製造方法。 - 【請求項６】（ａ）トロンボキサンB2またはプロスタグ
ランジン類似体の末端カルボキシル基を活性化してトロ
ンボキサンB2またはプロスタグランジン類似体の活性化
中間体を与え、 （ｂ）前記活性化中間体を請求項１記載のアクリジニウ
ムエステルと共にインキュベートしてアクリジニウムエ
ステル−トロンボキサンB2複合体またはアクリジニウム
エステル−プロスタグランジン類似体複合体を得る工程
から成る、トロンボキサンB2またはプロスタグランジン
類似体とアクリジニウムエステルとの複合体の製造方
法。 - 【請求項７】（ａ）試料中のビタミンB12を内生的ビタ
ミンB12結合たん白から遊離させる条件下で液体試料を
インキュベートして遊離された液体試料を与え、 （ｂ）前記遊離された液体試料を、（ｉ）固体担体上に
固定されたビタミンB12結合たん白を含む複合物および
（ii）請求項３記載の複合体と共にインキュベートして
錯体複合物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｅ）（ｄ）の測定から液体試料中のビタミンB12の量
を決定する各工程から成る、液体試料中のビタミンB12
を測定するためのアッセイ。 - 【請求項８】（ａ）液体試料を、（ｉ）塩基および（i
i）メルカプト化合物と共にインキュベートして遊離さ
れた液体試料を与え、 （ｂ）前記遊離された液体試料を、（ｉ）固体担体上に
固定されたビタミンB12結合たん白を含む複合物および
（ii）請求項３記載の複合体と共にインキュベートして
錯体複合物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物をチオール反応性化合物と共にイ
ンキュベートし、 （ｅ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｆ）（ｅ）の測定から液体試料中のビタミンB12の量
を決定する各工程から成る、液体試料中のビタミンB12
を測定するためのアッセイ。 - 【請求項９】（ａ）液体試料中の葉酸を液体試料中の内
生的葉酸結合たん白から遊離させる条件下で前記液体試
料をインキュベートして遊離された液体試料を与え、 （ｂ）前記遊離された液体試料を、（ｉ）固体担体上に
固定された葉酸結合たん白を含む複合物および（ii）請
求項２記載の複合体と共にインキュベートして錯体複合
物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｅ）（ｄ）の測定から液体試料中の葉酸の量を決定す
る各工程から成る、液体試料中の葉酸を測定するための
アッセイ。 - 【請求項１０】（ａ）液体試料を、（ｉ）塩基および
（ii）メルカプト化合物と共にインキュベートして遊離
された液体試料を与え、 （ｂ）前記遊離された液体試料を、（ｉ）固体担体上に
固定された葉酸結合たん白を含む複合物および（ii）請
求項２記載の複合体と共にインキュベートして錯体複合
物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物をチオール反応性化合物と共にイ
ンキュベートし、 （ｅ）前記錯体複合物を結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｆ）（ｅ）の測定から液体試料中の葉酸の量を決定す
る各工程から成る、液体試料中の葉酸を測定するための
アッセイ。 - 【請求項１１】（ａ）液体試料を、（ｉ）固体担体上に
固定された抗コルチゾール抗体を含む複合物および（i
i）請求項５記載の複合体と共にインキュベートして錯
体複合物を形成し、 （ｂ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、 （ｃ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｄ）（ｃ）の測定から液体試料中のコルチゾールの量
を決定する各工程から成る、液体試料中のコルチゾール
を測定するためのアッセイ。 - 【請求項１２】（ａ）液体試料を、（ｉ）抗17−ベータ
−エストラジオール抗体および（ii）請求項４記載の複
合体と共にインキュベートして反応混合物を形成し、 （ｂ）固体担体上に固定された、抗17−ベータ−エスト
ラジオール抗体に結合能のある抗体を含む複合物と共に
前記反応混合物をインキュベートして錯体複合物を形成
し、 （ｃ）前記錯体複合物を上清から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｅ）（ｄ）の測定から液体試料中の17−ベータ−エス
トラジオールの量を決定する各工程から成る、液体試料
中の17−ベータ−エストラジオールを測定するためのア
ッセイ。 - 【請求項１３】（ａ）液体試料を、（ｉ）抗トロンボキ
サンB2抗体および（ii）請求項６記載の複合体と共にイ
ンキュベートして反応混合物を形成し、 （ｂ）固体担体上に固定された、抗トロンボキサンB2抗
体に結合能のある固定化抗体を含む複合物と共に前記反
応混合物をインキュベートして錯体複合物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を上清から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
ステルラベルの量を測定し、 （ｅ）（ｄ）の測定から液体試料中のトロンボキサンB2
の量を決定する各工程から成る、液体試料中のトロンボ
キサンB2を測定するためのアッセイ。
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