JPH02222838A - 試料中の被分析物の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、試料中の被分析物を二段階の酵素反応を用い
て測定する方法に関するものである。

（従来の技術とその課題） 従来、臨床診断や免疫診断の分野においては放射性同位
元素で標識された抗体等を用いたラジオイムノアッセイ
法（ＲＩＡ法）や酵素で標識された抗体等を用いたエン
ザイムイムノアッセイ法（ＥＩＡ法）が知られている。

ＲＩＡ法では、例えば標識として使用される放射性同位
元素の保管、管理等に課題があり、更には放射性同位元
素の安定性に由来して検出精度が変動する等の課題や放
射性同位元素を取扱ったり実際にＲＩＡ法を実施する者
に対し生物学的な影響を与える恐れがある等の課題があ
る。

ＥＩＡ法では、ＲＩＡ法と比較して試薬の保管、管理及
び試薬の人体への影響という観点では課題は少ないが、
例えばその検出下限界に課題がある。即ち、ＥＩＡ法に
おける検出下限界は標識として使用される酵素に左右さ
れるが、例えば比色法で、ペルオキシダーゼを用いた場
合の検出下限界は１０分間の測定で５０ａｍｏ　ｌ、１
００分間の測定で５ａｌｌＯＩであり、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼを用いた場合の検出下限界は１０分間の測定
で１０００〜５０００ａｎｏ　ｌ、１００分間の測定で
１００〜５００ａｎｏｌであり、アルカリ性フォスファ
ターゼを用いた場合の検出下限界は１０分間の測定で２
０００〜１０１００００ａ　ｌ、１００分間の測定で２
００〜１００ａｎｏ！であると報告されている（石川栄
治、河合忠、宮井潔編、酵素免疫測定法第３版、医学書
院、１９８７年）。しかしながら例えば感染症等の診断
においては、より高感度の検出、即ちより検出下限界の
低い検出が要求されることから、ＥＩＡ法においては検
出感度に課題がある。

本発明者らは、酵素を標識として用いる検出方法におい
て、従来のＥＩＡ法に比較してより高感度の検出方法を
提供すべく研究・検討した結果二段階の酵素反応を利用
することで目的を達成できることを見出だし、本発明を
完成させた。

即ち、本発明は、試料中の被分析物を検出する方法であ
って、 ■被分析物に対して親和性を有する物質及び該物質に結
合している第一の酵素からなる第一酵素複合体を試料に
添加する操作、 ■少なくとも、被分析物と結合していない前記第一酵素
複合体を試料から除去する操作、■第一の酵素に対する
基質及び該基質と結合している第二の酵素からなり、第
一の酵素との接触により第二の酵素を含む第一生成物に
変換される第一基質又は第一の酵素との接触により第一
生成物に変換される、第二の酵素と結合していない第一
基質のいずれかを、試料に添加する操作、 ■第一の酵素に対する基質として第二の酵素と結合して
いる第一基質を使用した場合における、少なくとも、第
一生成物に変換されていない第一基質を前記試料から除
去する操作、 ■第一の酵素に対する基質として第二の酵素と結合して
いない第一基質を使用した場合における、第一生成物に
対して親和性を有する物質と該物質に結合している第二
の酵素からなる第二酵素複合体を試料に添加する操作、
及び少なくとも、第一生成物と結合していない第二酵素
複合体を試料から除去する操作、 ■第二の酵素との反応により検出可能な第二生成物に変
換される第二基質を試料に添加する操作■第二生成物を
検出する操作、 の各操作からなる方法である。

本発明の好ましき態様として、例えば式、Ｘ１−Ｙｌ−
Ｚ（ただしＸｌは第二の酵素であり、Ｙｌはハブテン又
は抗原であり、ＺはＹｌとＹｌを認識する抗体との抗原
抗体反応を妨害する修飾基である。）を第一基質として
用いる場合がある。

また、式Ｙ２−Ｙｌ−Ｚ　（ただしＹ２はハプテン、抗
原又は抗体であり、Ｙｌ及びＺは前記に同じである。）
を第一基質として使用し、更に式、Ｙ３−Ｘ２（ただし
、Ｙ３は前記Ｙ２に対して親和性を有する抗原又は抗体
であり、Ｘ２は第二の酵素である。）を使用する場合も
ある。

更に、本発明は試料中の被分析物を検出するための測定
試薬を提供するものであり、該試薬は■被測定物に対し
て親和性を有する物質及び該物質と結合している第一の
酵素からなる第一酵素複合体からなる成分、 ■固相に固定化された、第一酵素複合体中の被測定物に
対して親和性を有する物質と被測定物の反応を妨害しな
い様な、被測定物に対して親和性を有する物質、からな
る成分、 ■固相に固定化された、第一の酵素により製造される生
成物に対して親和性を有する抗体、からなる成分、 ■上記■〜■の成分を保持する容器、 からなる試薬である。

（課題を解決するための手段） 本発明では、例えば体液（血清、血漿等の血液成分や尿
等）等が試料として用いられるが、試料はこれらの例示
に限定されるものではなく、被測定物を含有する可能性
のあるものであれば良い。

例えば、被測定物を含有する可能性のある、生活排水や
工業排水、更には地下水等も試料と成り得る０本発明の
検出方法に従えば、核酸、蛋白質、ペプチド、ホルモ又
は薬剤等を検出することが可能である。従って、本発明
で被測定物とはこれらの物質を意味する。

まず、前記試料に、被測定物に対して親和性を有する物
質及び該物質と結合した第一の酵素からなる第一酵素複
合体を添加する。被測定物に対して親和性を有する物質
は、通常、核酸、抗体、抗原、リガンド又は阻害剤に分
類される物質である。被測定物の一例を記載すれば、例
えばＴ３　（ｔｒ　ｉ　１ｏｄｏｔｔ＋ｙｒｏｎ　１ｎ
ｅ）、Ｔ４　（ｔｙｒｏｘ　１ｎｅ）、１Ｎ　（Ｉｕｔ
ｅｎ　１ｚｉｎ（］　ｈｏｒｍｏｎｅ）、ＦＳＨ（ｆｏ
ｌｔｉｃｌｅ　５ｔｉｎｕｌａｔｉｒ＋ｇｈｏｒＩＩｌ
ｏｎｅ）、ＴＳＨ（ｔｈｙｒｏｉｄ　ｓｔｉｍｕｌａｔ
ｉｎｇｈｏｒｌｏｎｅ）、　ＴＢＧ（ｔｈｙｒｏｘｉｎ
ｅｂ　ｉｎｄ　ｉｎｇｇ　１ｏｂｕ　Ｉ　１ｎｅ）、　
ＣＴ　（ｃａ　ｌｃ　ｉ　ｔｏｎ　ｉｎ）、　ＰＲＬ　
（ｐｒｏ　ｔａｃｔｉｎ）、　ＨＣＧＡ（ｈｕｎａｎ　
ｃｈｏｒｉｏｎｉｃｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）、　Ｉ
ｎ５ｕｌ　１ｎ１３．Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｃｏｒｔｉ
ｓｏｌ、＾Ｉｄｏｓｔｅｒｏｎｏ、ＡＣＴＩＩ（ａｄｒ
ｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃｈｏ　１ｌｏｎ）、
　ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ、　ＣＥ＾（Ｃａｒ　１ｎ
ｏｅ＋ｎｂｒｙｏｎ　１ｃａｎｔ　ｉｇｅｎ）、　ＣＡ
１９−９．八ＦＰ　（ａｌ　ｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔ
ｅｉｎ）、ＢＦＰ（ｂａｓｉｃｆｅｔＯｐｒＯｔ１３ｉ
ｎ）、Ｆｅｒｒｉｔｉｎ、　　β２−Ｈ＋ｃｒｏｇｌｏ
ｂｕｌｔｎ、ＴＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ　　ｐｏｌｙｐｅｐ
ｔｉｄｅａｎｔｉｇｅｎ）、　ｒ−８ｅｒｘｉｎａｐｒ
ａｔｅｉｎ、ＰＡＰ（ｐｒｏｓｔａｔｉｃａｃｉｄ　ｐ
ｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、＾ＩＯ３ｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ
（ｃｙｔｏｎｅｇａ　Ｉｏｖ　１ｒｕｓ）、　ＨＡＶ（
ｈｅｐａｔ　ｉｔ　ｉｓ＾ｖｉｒｕｓ）、ＨＢＶ（ｈｅ
ｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ）、Ｎｏｎ−Ａ−Ｎｏ
ｎ−［３ｖｉｒｕｓ、ＥＶＢ（ ｅｐｓｔｅｉｎ　ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ）、Ｈ３Ｖ（ｈ
ｅｒｐｅｓ　５ｉｌｐｌｅｘｖｉｒｕｓ）、Ｐａｒｖｏ
　ｖｉｒｕｓ、５ｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ。

５ｔｒｅｐｔＯＣＯＣＣ１１３，）４ＹＣＯｂａＣｔ１
３ｒｉｔｌＩＩｌ、ＮｅｉＳＳｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈ
ｏｅａｅ、　Ｓａ　ｌ１ｏｎｅ　ｌ　Ｉａ、　Ｐｓｅｕ
ｄｏｒａｏｎａｓｖ；がある。

上記した様な被分析物を検出することが可能になれば、
例えば種々の感染症やガン等の臨床診断が可能となる。

被測定物に対して親和性を有する物質は、検出されるべ
き被分析物により異なるらのが使用される。例えば、被
分析物が上記した様なホルモン、蛋白質、ペプチドであ
れば、これらを抗原として製造された抗体を使用するこ
とができる。また例えば被分析物が上記した様な微生物
やウィルスである場合は、その膜部分等に１種特異的な
蛋白質が存在するのであれば前記した様に抗体を使用し
ても良いし、例えばその遺伝的な情報を暗号化する特異
的な核酸が存在するのであればそのＤＮＡやＲＮＡに対
して相補的な核酸を使用することも出来る。被測定物が
酵素等の場合には、前記した櫟に抗体を使用しても良い
し、該酵素と特異的に結合することでその活性を阻害す
る、いわゆる阻害剤を使用しても良い。阻害剤の一例と
しては、例えばし−スレオニン脱水素酵素に対するし一
インロイシン、シアリダーゼに対するパノシアリン、β
−ガラクトシダーゼに対するピリジ。

ンドール、ＣＡＮＰに対するＣＡＮＰインヒビター等が
ある。近年注目されつつあるインターロイキン（ＩＬ）
やインターフェロン（ＩＦ）等の生理活性物質において
は、前記した様に抗体を使用しても良いが、これらと特
異的に結合するリガンドを使用しても良い。ＩＬやＩＰ
に対するリガンドとしては、例えばＩＬ２に対するＩＬ
２レセプターや、ＩＬ６に対するＩ’　Ｌ　６レセプタ
ー等が知られている。被測定物が抗体である場合には、
該抗体に対する抗体を使用しても良いし、該抗体が認識
する抗原を使用しても良い。

以上の様に、被測定物に対して親和性を有する物質とし
ては、被測定物に依存して種々の物質が使用されるが、
取得の容易さ等を考慮すれば、抗体を使用することが好
ましい。

被測定物に対して親和性を有する抗体を製造する具体的
方法として、例えばゲーラーとミルシュタインノ方法（
に６１１１ｅｒ、Ｈｉ！５ｔｅｉｎ、ｎａｔｕｒｅ、ｖ
。

２５６．１９７５年）を例示することが出・来る。また
、被測定物に対して親和性を有する抗体はモノクローナ
ル抗体に限定されるものではなく、ポリクローナル抗体
であっても良いが、認識部位の同一性や親和力の同一性
を考慮すると、モノクローナル抗体を使用することが好
ましい、また、ポリクローナル抗体の製造は、通常の方
法に従えば良い。

本発明で使用される第一の酵素は、後に説明する第一基
質を第一生成物に変換できるらのであれば特別の制限な
く使用できる。特に、基質を変換する能力にすぐれた、
いわゆるターン・オーバー数の大きな酵素が好ましい、
ターン・オーバ数の大きな酵素としては、例えばアルカ
リ性フォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、カ
ルボキシルエステラーゼ、リパーゼが例示できるが、こ
れらは−例であって、例えば酵素ハンドブック等を参照
し、適宜選択すれば良い。

前記した被測定物に対して親和性を有する物質と第一の
酵素を結合させることにより、本発明でいう第一酵素複
合体を得ることができる。該第一酵素複合体は、被測定
物に対する反応性と第一基質を第一生成物に変換する反
応性を有するしのである。両者を結合させる方法として
は、公知の方法を使用することができる。例えば被測定
物に対して親和性を有する物質として抗体を選択した場
合について例示すれば、マレイミド法、ピリジルジスル
フィド法、ヒンジ法等により両者を架橋して第一酵素複
合体を得ることが出来る（にａｔＱｈ、に、、Ｈａｎａ
ｇｕｃｈｉ、Ｙ、、Ｆｕｋｕｉ、Ｈ，、Ｉｓｈｉｋａｗ
ａ、Ｅ、。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、ｖｏｌ、７８，２３５−２３７
及び４２３−４２５頁。

１９７５年、同、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、ｖｏｌ、５６
，３７０−３７２頁、　１９７５年、Ｃａｒｌｓｓｏｎ
、　Ｊ、ら、Ｂ　１ｏｃｈｅ、　Ｊ、　、　ｖｏｌ、　
１７３．７２３−７３７頁、１９７８年等参照）。

第一酵素複合体と被測定物との結合は、第一酵素複合体
を試料に添加し、被分析物に対して親和性を有する物質
及び第一の酵素等が失活しない条件下に放置することで
達成出来る。放置時に穏やかに試料を撹拌しても良い。

被測定物が一本鎖の核酸であり、被測定物に対して親和
性を有する物質が該核酸に対して相補的な核酸である場
合にも前記したのと同様の条件での反応により第一酵素
複合体と被測定物を結合させることが出来る。

被測定物が二本鎖の核酸である場合には、第一酵素複合
体の試料への添加に先立って、該二本鎖核酸を一本銀に
変性させるための予備的操作を通常の方法に従って実施
しておけば良い。この様な操作としては、変性剤を使用
する方法や、界面活性剤を使用する方法等が知られてい
る。

第一酵素複合体を試料に添加した後、遊離の該複合体、
即ち（被測定物〜第一酵素複合＃、）を形成していない
第一酵素複合体を除去する０便宜上、本明細書中では「
・・・を試料から除去する」と記載するが、例えば後に
説明する様にゲル濾過を実施し、（被測定物〜第一酵素
複合体）画分を選択することも、遊離の第一酵素複合体
の除去操作と同義である。即ち、この操作は、少なくと
も遊離の第一酵素複合体と被測定物と結合した第一酵素
複合体を分離し、後者をその後の試料として使用するた
めの中間的操作である。

また、この操作は、試料中に遊離の第一酵素複合体が共
存しない様にできる操作であれば良い。

即ち、遊離の第一酵素複合体が除去されていれば、その
他の成分の存在については制限がない。遊離の第一酵素
複合体の除去には、例えば通常の免疫測定で実施される
Ｂ　／　Ｆ　（Ｂｉｎｄｉｎｇ／ｆｒｅｅ）分離法を実
施しても良い。Ｂ／Ｆ分離を行う場合には、例えば、第
一酵素複合体中の、被測定物に対して親和性を有する物
質とは異なる部位で被測定物と結合する物質を予め適当
な固相に固定化し、被測定物を仲介として該固相上に第
一酵素複合体を固定化する等すれば良い。この固相とし
ては、本発明を実施する反応容器の内壁や、反応容器中
に位置させることが可能なビーズ状固相が例示出来る。

また、Ｂ／Ｆ分離については、例えば米国特許箱４．８
１６，４０８号に記載された装置又は方法に従うことが
出来る。上記した様な物質としては、被測定物に対して
親和性を有する物質と同様な物質を使用することが出来
るが、製造の容易さ等の観点から、被測定物が蛋白質で
ある場合には抗体を使用することが好ましい、第一酵素
複合体中の、被測定物に対して親和性を有する物質とは
異なる部位で被測定物と結合する物質の反応容器内壁又
は適当な固相への固定化は、化学的な結合法又は物理的
な吸着法等によれば良い。抗体を固相に吸着する場合に
ついて例示すれば、化学的な結合法として、例えば、特
開昭６２−１９７４２５号に記載された様な固相を用い
、その表面の反応基を利用する方法が例示できる。また
、物理的な吸着法としては、例えば、ポリスチレン等で
固相を形成することで池に特別の操作を必要とせずに抗
体を吸着することが出来る。

遊離の第一酵素複合体の除去は、被測定物に結合したも
のとの分子量の差を利用して、例えばゲルー過、遠心分
離法によっても行うことが出来る。即ち、遊離の第一酵
素複合体と被測定物に結合した第一複合体では、複合体
の分子量が異なるため、例えばゲル濾過ではカラムから
の溶出に要する時間が興なるし、また遠心分離では沈降
係数の異なる両分に分離される。

以上説明した様に、第一酵素複合体と被測定物の接触に
より、第一酵素及び被測定物を含む複合体が形成される
０本発明では、続いて第一基質を試料に添加する操作を
実施する。

第一基質としては、第二の酵素と結合した第一の酵素、
に対する基質（以下第一基質■とする）又は第二の酵素
と結合していない第一の酵素に対する基質（以下第一基
質■とする）が使用される。

本発明で使用される第二の酵素は、後に説明される第二
の基質を検出可能な第二生成物に変換可能な酵素であれ
ば特別の制限はない。より高精度の検出のために、第二
の酵素は大きなターン・オーバー数を有するものが好ま
しい、アルカリ性フォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、デヒドロ
ゲナーゼ、グルコース、グルコースオキシダーゼ又はペ
ルオキシダーゼ等が例示できるが、これらに限定される
ものではなく、例えば酵素ハンドブック等を参照し、適
宜選択すれば良い。

ここに記載した第二の酵素の例示の一部は本発明の第一
の酵素についての例示と同一の酵素であるが、仮に同一
の酵素を本発明の第一及び第二の酵素として使用すると
、いわゆる「自己消化」が生じ、第二の酵素の働きによ
り第一基質が第一生成物に変換される。従って、本発明
では第一の酵素とは異なる酵素を第二酵素として使用す
る。

即ち、本発明は試料中の被測定物の存在を、第一酵素複
合体を使用することで第一の酵素の存在に置換し、置換
された第一の酵素の存在を、該第一の酵素の第一基質へ
の反応により生じる第一生成物の存在に増幅し、増幅さ
れた第一生成物の存在を該生成物中の第二の酵素の第二
基質への反応により第二生成物に増幅し、最終的に第二
生成物を検出する方法を提供するらのである。

例えば前記した第一基質■を使用した場合には、第二の
酵素と結合していない第一生成物が生じる。従って、こ
の場合には、第一生成物に対し素からなる第二酵素複合
体と第一生成物を反応させ、第一生成物に第二の酵素を
導入する。第二酵素複合体は、第一生成物に対して結合
するものであっても、第一生成物と第一基質の両者に結
合するものであっても良い。第一基質と第一生成物は、
第一生成物が第一の酵素により変換されている点で異な
っている。従って、第二酵素複合体中の第一生成物に対
して親和性を有する物質としては、第一生成物中の、第
一の酵素で変換されて生じた部分に対して親和性を有す
る物質を使用すれば良い。

以上の操作の後に、第一基質■を使用した場合には未反
応の基質、即ち第一生成物に変換されていない第一基質
を除去する。第一基質■を使用した場合には、その後添
加された第二酵素複合体のうち第一生成物と結合してい
ない複合体、即ち遊離の第二酵素複合体又は未反応の第
一基質と結合した第二酵素複合体を除去する。ミれらの
除去は、例えば、予め第一生成物に対して親和性を有す
る物質を、例えば反応容器の内壁又は適当なビーズ等の
適当な固相に固定化しておき、前記した様なり／Ｆ分離
又はゲル濾過等により行えば良い。

第一基質■が使用された場合に使用される第二酵素複合
体中の第一生成物に対して親和性を有する物質と、前記
した固定化された第一生成物に対して親和性を有する物
質は、互いに干渉することなく第一生成物と反応可能な
物質である。

ここで、第一基質■を使用した場合には、後に、第一基
質中の第一の酵素により変換されないび（第一生成物〜
第二酵素複合体）という二種類の複合体を形成し、Ｂ／
Ｆ分離の際に、固定化された第一生成物のみに親和性を
有する物質を使用することで遊離の第二酵素複合体及び
第一基質と結合した第二酵素複合体を除去する操作が達
成される。

以上の操作により、試料中に、少なくとも第一生成物及
び第二の酵素が残留した状態を形成する。この状態は、
少なくとも、第一基質■を使用した場合には第一生成物
に変換されていない第一基質■を、また第一基質■を使
用した場合には第一生成物に変換されていない第一基質
■と結合した第二酵素複合体又は遊離の第二複合体が存
在していない状態であれば艮い。

最終的に、第二の酵素により検出可能な第二の生成物に
変換される第二基質が添加される。検出可能な生成物と
は、第二の酵素の酵素反応を受ける前と後でのシグナル
が変化するものを意味する。本発明では、通常の蛍光検
出、比色検出、発光検出等の光学的検出操作により検出
可能な第二生成物に変換され得る第二基質を使用するこ
とが好ましい、第二基質は、本発明において使用される
第二の酵素との関係により適宜決定されるが、例えばＰ
−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　、　
４−ｎ＋ｅｔｙｌ−ｕＩｌｂｅｌ　ｌ　１ｆｅｒｙｌｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅがアルカリ性７オスフアターゼを第二
の酵素として使用した場合には使用出来る。また、２−
ｎｉｔｒｏｐｈｌｙ＋−β−ローａａｌａｃｔｏｓｉｄ
ｅ　、４−１′１ｅｔｈｙｌ−ｕｎｂｅｌｌｉｆｅｒｙ
ｌ−β−Ｄ−Ｑａ　ｌ　ａＣｔｏｓ　ｉ　ｄｅがβ−ガ
ラクトシダーゼを使用した場合に、１．２−ｐｂｅｎｙ
ｌｅｎｅ−ｄｉａｎｉｎｅ　、　３．３’、５．５’−
ｔｅｔｒａ’ｎｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、４−ｈ
ｙｄｒｏｘ’ｙＤｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ又は３−（
，１−ｈｙｄｒｏｘｙｐｔ＋ｅｎｙｌ）−ｐｒｏｐｉｏ
ｎｉｃ　ａｃｉｄがペルオキシダーゼを第二の酵素とし
て使用した場合にそれぞれ使用できる９例えばＲｏｂｅ
ｒｔ　Ｈ，Ｙｏｌｋｅｎ（Ｒｅｖ＋ｅｗｏｆ　Ｉｎｆｅ
ｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ、ｖｏｌ、４．Ｎｏ、１
．Ｊａｎｕａｒｙ−Ｆｅｂｒｕａｒｙ　１９８２）等の
酵素と基質の関係についての記載を参照し、本発明でい
う第二基質を適宜選択すれば良い。

第二生成物の検出は、免疫測定の分野で行われる通常の
方法に従って行えば良い。例えば特開昭６２−０５０６
６２号等に記載された、いわゆるレート・アッセイ法等
を実施しても良い。

以下、本発明の好ましきａｍについて説明するが、これ
らは−例であり、本発明を限定するものではない。

本発明の態様（１）は、第一の酵素により第一生成物に
変換される第一基質として、式（Ｉ） ｘ　ｉ　−ｙ　ｉ　−ｚ で示される物質を使用し、第一の酵素により変換された
第一生成物（Ｘ　１−　、％ｉ）−と未反応の第一基質
を、予め固相に固定化された抗体を利用して分離するこ
とを特徴とするものである。ここで、式中のＸｌは第二
の酵素であり（従って、この物質は先の説明に従えば第
一基質■である）、ＹｌはＢ／Ｆ分離操作で使用される
、抗−（第一生成物）−抗体と免疫反応可能なハプテン
又は抗原であり、ＺはＹｌと抗−（第一生成物）−抗体
の免疫反応を妨害する修飾基である。ＹｌとＺの結合は
第一の酵素により切断される結合であり、ＸｌとＹｌの
結合は共有結合である。

Ｙｌとしては、ドーパミン、コルチゾル、テストステロ
ン等のハブテン又はインスリン、アンジオテンシン、グ
ルカゴン等の抗原を使用することが出来る。Ｚとしては
、ベンゾイル基、フェニルアラニン基、リン酸基、１β
−０−ガラクトシル基、１β−Ｄ−グルクロニル基、グ
リコジル基等を使用することが出来る。

ＹｌとＺの結合は、例えば、エステル結合、グリコシド
結合、エーテル結合又はアミド結合であり、Ｙｌは、Ｙ
ｌと抗−（第一生成物）−抗体の反応を妨害しない位置
でＸｌと共有結合している。本発明で第一の酵素として
ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔ、ｅｒａｓｅ　　を使用した場
合には、Ｙｌにｃｏｒｔｉｓｏｌ、Ｚにｂｅｎｚｏｙ　
ｌ基を有する物、Ｙｌにｃｏｒｔｉｓｏｌ、Ｚにｐｈｅ
ｎｙｌａｌａｎｉｎｅを有する物、Ｙｌにｄｏｐａｒａ
ｉｎｅ、　Ｚにｂｅｎｚｏｙｌ基を有する物、Ｙｌにｄ
ｏｐａｎ＋ｉｎｅ、　Ｚにｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ
を有するた物、Ｙｌにｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、　Ｚ
にｂｅｎｚｏｙ　Ｉ基を有する物、Ｙｌにｔｅｓｔｏｓ
ｔｅｒｏｎｅＳｚにｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅを有す
る物が具体的に例示できる。第一の酵素としてｐｈｏｓ
ｐｈａｔａｓｅを使用した場合には、Ｙｌとしてｃｏｒ
ｔｉｓｏｌ、Ｚとしてｐｈｏｓｐｈｏｒ　１ｃａｃ　ｉ
ｄ遊離基を有する物、ＹｌとしてｄＯｐａｌｌｉｎｅ、
　Ｚとしてｐｈｏｓｐｈｏｒ　１ｃａｃ　ｉｄ遊離基を
有する物、Ｙｌとしてｔｅｓｔ０３ｔｆ３ｒｏｎｅ、　
Ｚとしてｐｈｏｓｐｈｏｒ　１ｃａｃ　ｉｄ遊離基を有
する物が具体的に例示できる。第一の酵素としてβ−Ｄ
−Ｑａ　ＩａＣｔＯ５１（ｊａＳｅを使用した場合には
、ＹｌとしてＣ０ｒｔｉＳＯ１，２として１β−り一！
ＪａｌａＣｔＯ３ＶＩ基を有する物、Ｙｌとしてｄｏｐ
ａｉｉｎｅ、Ｚとして１β−Ｄ−（ｌａ　＋ａｃｔｏｓ
ｙ　＋基を有する物、Ｙｌとしてｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏ
ｎｅ、　ｚとして１β−０−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ基を
有する物が具体的に例示できる。

第一の酵素としてβ−Ｄ−ｇｌｕＣｔＪｒＯｎｉｄａＳ
ｅを使用した場合には、Ｙｌとしてｃｏｒｔｉｓｏｌ、
Ｚとして１β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｙｔ基を有する物
、Ｙｌとしてｄｏｐａｍｉｎｅ、　Ｚと、して１β−Ｄ
−ｇ　ｌ　ｕｃｕ　ｒｏｎｙ　ｌ基を有する物、 Ｙｌとしてｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、　ｚとして１β
−り−ｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌ基を有する物を具体的に例
示することが出来る。第一の酵素としてβ−Ｄ−ｇｌｕ
ｃｏｓｉｃ！ａｓｅを使用した場合には、ＹｌとしてＣ
０ｒｔｉＳＯ１，２として１β−Ｄ−ｇａ　Ｉａｃ　ｔ
ｏｓｙ　Ｉ基を有する物、Ｙｌとしてｄｏｐａｎｉｎｅ
、　Ｚとして１β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ基を有す
る物、Ｙｌとしてｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、　ｚとし
て１β−ロ−ｇａ＋ａｃｔｏｓｙ＋基を有する物を具体
的に例示することが出来る。中でも、Ｘｌがアルカリ性
フォスファターゼであり、Ｙｌがｄｏｐａｒｇｉｎｅで
あり、Ｚが１β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｔ基である物
が好よしい。また、ここでｂｅｎｚｏｙｌ基とは、不飽
和〕ｂｅｎｚｏｙ　Ｉ基に限らず、例えばＰ−１１ｉｅ
ｔｈＯＸ’／ｂｌＺＯ１／１基やＰ−ｎｉｔｒｏｂｅｎ
ｚｏｙｌであっても良い。

以上の様な第一基質を使用する態様（１）においては、
まず、試料に添加された第一酵素複合水が被測定物と複
合体を形成する。遊離の第一酵素複合体は除去され、続
いて、添加された第一基質は、第一の酵素によりＺが切
断された第一生成物に変換される。ここで、予め固相に
固定化された抗−（第一生成物）抗体と第一生成物（Ｘ
ｌ−Ｙｌ）が反応し、第一生成物は固相に間接的に固定
化される。Ｂ／Ｆ分離操作により、第一の酵素と反応し
ていない第一基質は除去される。最終的に、第二基質を
添加し、第二の酵素（Ｘｌ〉により変換された検出可能
な第二生成物を検出すれば良い。この態様〈１）で使用
される抗−（第一生成物）抗体は、即ち抗Ｙ１抗体であ
る。

本発明の態様（２）は、第一の酵素により第一生成物に
変換される第一基質として、式（ｆｆ＞ Ｙ２−Ｙｌ−Ｚ で示される物質を使用し、後に第二の酵素をＹ２に対し
て親和性を有する抗体を使用して結合させ。

第一生成物と未反応の第一基質の分離を予め固相に固定
化された抗体を用いて行うことを特徴とする。ここで、
式中のＹ２はハプテン、抗原又は抗体であり、ＹｌはＢ
／Ｆ分離操作で使用される抗（第一生成物）−抗体と免
疫反応可能はハプテン又は抗原であり、ＺはＹｌと抗−
（第一生成物）−抗体の免疫反応を妨害する修飾基であ
る。ＹｌとＺの結合は第一の酵素により切断される結合
であり、ＸｌとＹｌの結合は共有結合である。

Ｙｌ又は２としては、前記しなＲ様（１）で説明したＹ
ｌ、Ｚと同様の物質を使用することが出来る。また、Ｙ
ｌとＺの結合についても、先に説明した態様（１）での
ＹｌとＺの結合が具体的に例示出来る。この結合は、本
発明で第一の酵素として使用される酵素により決定され
るが、それら゛については前記した通りである。中でも
Ｙ２がアンジオテンシン＜ａｎｑｉｏｔｅｎｓｉｎ　）
　ＩＩであり、Ｙｌがドーパミン（ｄｏｐａ＋ｅｉｎｅ
）であり、Ｚが１−β−Ｄｇａ　＋　ａＣｔｏｓｙ　ｌ
基である第一基質が好ましい。

以上の様な第一基質を使用するＢ様（２）においては、
まず、試料に添加された第一酵素複合体が被測定物と複
合体を形成する。遊離の第一酵素複合体は除去され、続
いて、添加された第一基質は、第一の酵素により２が切
断された第一生成物に変換される４、ここで、予め固相
に固定化された抗−（第一生成物）−抗体と第一生成物
が反応し、第一生成物は固相に間接的に固定化される。

Ｂ／Ｆ分離操作の実施に伴い、第一の酵素と反応してい
ない第一基質が除去される。

態様（２）においては、第二の酵素を有していない第一
基質を使用する。従って、第二の酵素を有する第二酵素
複合体を導入する操作を以上の操作に引続き実施する。

第二酵素複合体は、式（ＩＩＩ） ３−Ｘ２ で示される。式中、Ｘ２は第二の酵素であり、Ｙ３は前
記式（ＩＩ＞で説明したＹ２を特異的に認識する抗体で
ある０例えば、Ｘ２がアルカリ性フォスファターゼであ
り、Ｙ３が抗アンジオテンシン■抗体であるものが例示
出来る。

態様（２）では、式（ＤＩ）を添加することで（第一基
質〜第二酵素複合体）及び（第一生成物〜第二酵素複合
体）が形成されるが、予め固相に固定化された抗−（第
一生成物）−抗体により、（第一生成物〜第二酵素複合
体）のみが間接的に固相上に形成される。その後、Ｂ／
Ｆ分Ｍ操作を行い、態様（１）で説明した様な第二基質
を添加し、第二生成物を検出する操作を行えば良い。

以下に、第一の酵素としてβ−Ｄ− ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅが使用された場合に使用さ
れ得る、Ｘｌがアルカリ性フォスファターゼであり、Ｙ
ｌがドーパミンであり、Ｚが１β−Ｄ−！ＪａｌａＣｔ
Ｏ３’／１基である４−ｏ−１β−（ＪａｌａＣｔＯ３
ＶＩ−ｄＯｐａＩｌｌｎ１３−ａｌｋａｌ＋ｎ。

ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　　＜先の態様（１）の第一基
質）及びＹｌがドーパミンであり、Ｚが１β−り−ｇａ
　１ａｃｔＯ３Ｖ　１基であり、Ｙ２がアンジオテンシ
ン■である４−ｏ−１β−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ−ｄｏ
ｐａＩｌｉｎｅ−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｅ　　ＩＩ　
（３−８）　　（先の態様（２）の第一基質）について
、その合成の一例を説明する。以下の記載は本発明で使
用される態１（１）、態様（２）及びその他における第
一基質の合成の一例であって、本発明はこれらに限定さ
れるものではない。

ドーパミンのＮ−トリフロロアセチル化反応により容易
に合成出来るＮ−トリフロロアセチルドーパミンの４位
のフェノール基をガラクトシル化する。この工程は、ペ
ンタアセチルガラクトース又はテトラアセチルガラクト
シル−１−ブロマイドの１．０〜１．５当量を、縮合触
媒存在下、乾燥有機溶媒中で反応する事により行うこと
が出来る。

縮合触媒としては、臭化第二水銀、シアン化第二水銀等
の第二水銀塩類、トリメチルシリルトリフロロメタンス
ルホネート、トリフロロメタンスルホン酸銀、硝酸銀等
を使用すれば良い。乾燥有機溶媒としては、クロロホル
ム、ジクロロメタン、ジオキサン、ニトロメタン、アセ
トニトリル、ジメチルホルムアミド、デトラしドロフラ
ン、エーテル等を使用すれば良い。特に限定されるもの
ではないが、この工程は、乾燥アセトニトリル中で。

−２０℃〜室温の範囲の反応温度下で触媒としてトリフ
ロロメタンスルホン酸銀を触媒に用いて１．５当量のテ
トラアセチルガラク１〜シル−１−ブロマイドを反応さ
せることが好ましい。得られる生成物は、アセチル基を
除去するためにメタノール中でナトリウムメトキサイド
と処理し、加溶媒分解反応に付すことにより４−ｏ−（
１β−Ｄ−ガラクトシル）−ト　トリフロロアセチルド
ーパミンを得ることが出来る。この化合物に対し、ガラ
クトシル化反応の際に副生ずるガラクトシル基の３位置
換異性対及び、３．４位ジガラクトシル置換体を除去す
るなめにシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施し
、精製を行った後、第二酵素であるアルカリ性フォスフ
ァターゼと結合させるための接合手又はアンジオテンシ
ン■と結合させるための接合手を導入する工程に洪する
。

まず、４−ｏ−（１β−Ｄ−ガラクトシル）−トリフロ
ロアセチルドーパミンをアルゴン気流下アルカリ溶液中
で脱トリフロロアセチル化反応に付す。アルカリ水溶液
としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナ
トリウム、炭酸カリウム、アンモニアの水溶液等を使用
することが出来る。

この工程での反応条件については特に限定されるもので
はないが、例えば２規定の水酸化ナトリウム水溶液を使
用し、室温下で２４時間反応させることでこの反応は達
成出来る。反応滝は希塩酸でｐＨ８，０に調節し、Ｎ−
サクシヌイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ネート＜５ＰＤＰ）のメタノール溶液で処理する事によ
り、４−ｏ　−（１β−Ｄ−ガラクトシル）−Ｎ−［３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル１ドーパミンを
得ることが出来る。

該化合物についての、１位α異性体の含有率はプロトン
ＮＭＲスペクトル解析等で測定することが出来る０本発
明者らがこの化合物を合成した際には、約２０％のαガ
ラクトシル異性体が混在していた。

続いて、得られた４−ｏ−（１β−Ｄ−ガラクトシル）
−Ｎ−［３−（２−ピリジルジチオ）グロピオニル］ド
ーパミンと第二の酵素であるアルカリ性フォスファター
ゼを結合させる。この工程は、アルカリ性フォスファタ
ーゼをＳ−アセチルメルカプト無水コハク酸で処理して
得られるメルカプト化アルカリ性フォスファターゼを、
ｐＨ７，０のリン酸緩衝液中でヒドロキシルアミン存在
下４℃、４−ｏ−（１β−Ｄ−ガラクトシル）−Ｎ−［
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル１ドーパミン
のメタノール溶液と接触させることにより達成される。

一方、４−ｏ−（１β−０−ガラクトシル）−ト［３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオニル１ドーパミンにア
ンジオテンシン■を導入する工程は、先のアルカリ性フ
ォスファターゼを導入する工程においてアルカリ性フォ
スファターゼの代わりにアンジオテンシン■を使用すれ
ば良い。

態様（１）又は態様（２）においては、第一生成物を固
相に間接的に固定化するための物質、即ち第一生成物に
対して親和性を有する物質として抗体を使用するが、こ
の物質は例えばリガンド、抗原、核酸といった物質であ
っても良い。しかし、態様＜１）又は態様（２）の様に
、抗体を使用することにより、第一基質中の、該抗体に
認識される物質（Ｙｌ）として蛋白質、ベグチド又はハ
プテンを使用できるなめ、好ましい。

態様（２）において説明した第二酵素複合体は、抗体と
第二酵素が結合した複合体である。従って、先に記載し
た第一酵素複合体の製造についての例示に従って製造す
ることが出来る。

また、本発明では二段階の酵素反応により試料中の被測
定物の存在を増幅し、これを検出するが、例えば三段階
以上の酵素反応による増幅も可能である。即ち、本発明
でいう第二基質の添加に先だって、第二の酵素により第
三の酵素を有する第二生成物に変換される第二基質を添
加し、第二生成物に変換されていない第二基質を除去し
、続いて第三の酵素により検出可能な第三生成物に変換
される第三基質を添加し、検出のための操作を行えば良
い。

以上説明してきた、二段階の酵素反応を利用した被測定
物の検出は、 ■被測定物に対して親和性を有する物質及び該物質と結
合している第一の酵素からなる第一酵素複合体からなる
成分、■固相に固定化された、第一酵素複合体中の被測
定物に対して親和性を有する物質と被測定物の反応を妨
害しない様な、被測定物に対して親和性を有する物質、
からなる成分、■固相に測定された、第一の酵素により
製造される生成物に対して親和性を有する抗体、からな
る成分、■前記■〜■の成分を保持する容器、からなる
試薬を使用することで容易に実施される。各成分を保持
する容器は、それ自体が■及び／又は■における固相と
しても使用することができる。

また、これまで説明した様に、固相は、容器の内壁を使
用する以外にも、適当な、例えばポリスチレン製のビー
ズ等を使用しても良い。

試薬は、例えば凍結乾燥処理されていてもよく、また、
窒素ガス等を入れて封入されて１１ても良い。

（発明の効果） 以上説明して来た様に、本発明によれば極めて微量な物
質を検出することが可能である。例えばＡＩＤＳ等のウ
ィルス感染症では、感染初期にはウィルスは活動的では
なく、増殖しなへ１から、従来の技術ではそれらの核酸
に特異的な核酸をグローブを使用しても検出出来なかっ
たが、本発明ではこの微量の核酸量を第一の酵素量に置
換し、さらに第一の酵素の酵素触媒活性を利用して第二
の酵素量に増幅し、更に第二の酵素の酵素触媒活性を利
用して第二生成物量に増幅することで検出可能とした１
例えば酵素免疫測定法等の従来の技術では、核酸等の被
分析物量を酵素量に置換し、該酵素の酵素触媒活性を利
用して増幅された基質分解物量に増幅するのみである。

従って、本発明によれば、前記の例示の々口き感染症に
限らず、従来は検出下限界が高かったため検出されてい
なかったものが検出可能となる。

このことは、例えば従来に比較してより早期の疾病の発
見、潜伏期間中の感染症の発見等を可能にするものであ
る。

一方、例えば酵素免疫測定法等の従来の技術では、検出
下限界が高いなめに、その実施には比較的多量の試料（
通常は２〜４ｍ１）を必要としていたが、本発明はその
１／１，０〜１／Ｗｏｏの試料でも被分析物を検出する
ことが可能であるにのことは、例えば被測定物がガン・
マーカーである場合等に、被検者から採取する試料（血
ン夜等）を少な（できることを意味し、結果として注射
器等を使用しないでも、試料を採取できることを意味し
ている。

（実施例） 以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

実施例１；インシュリンの検出 β−Ｄ−ガラクトシダーゼと結合したインシュリンに特
異的な抗体＜ｌＮ５ＵＩ（ＩＮ　　ｒＨＩＴｓ旧」■、
三井製薬工業株式会社製）を第一酵素複合体として使用
した。また、被測定物（インシュリン）と結合していな
い第一酵素複合体を除去するためのＢ／Ｆ分離操作のた
め、第一酵素複合体中のインシュリンに特異的な抗体と
は異なる部位でインシュリンを認識する抗体を固定化し
たポリスチレンボール（ＩＮＳＵＲＩＮ　　ｒＨＩＴｓ
ＵＩ」ＩＩ、三井製ｉ工業株式会社製）を使用した（以
下、抗体結合ボールエという）。

式、ＸＩ−Ｙｌ−Ｚ（本発明の詳細な説明を参照）で示
される第一基質として、Ｘｌがアルカリ性フォスファタ
ーゼであり、Ｙｌがドーパミンであり、Ｚが１β−〇−
ガラクトシル基である化合物（１β−Ｄ−ガラクトース
−ドーパミン−アルカリ性フォスファターゼ）を合成し
な。

Ｎ−トリフロロアセチルドーパミン（ ５１８ｎｇ；２．２ｎ＋ｎｏｌ　）及びトリフロロメタ
ンスルホンサン銀＜　１５６４Ｉｌａ；６．　ｌｎｍｏ
ｌ　）を１５１の無水アセトニトリルに溶解した後、粉
末状の吸水剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＳｉｅＶ１３Ｓ　４Ａ　１／１６．和光純薬株式会社製
）を９４５ｎ＋ｇ添加した。懸濁液を水冷撹拌しながら
、テトラアセチルガラクトシルブロマイド（１３５２１
！（Ｊ、　３．１３１１ ｎｏ！　）を添加した。混合物を１０分間水冷下で反応
させ、更に２°２時間、室温下で撹拌した。反応混合物
を沢過し、？′１液を２１！！！縮し、残渣をジクロロ
メタンに溶解した。この溶液を水洗後、１０％重炭酸ナ
トリウム水溶液で洗浄し、更に水で洗浄し、無水硫酸マ
グネシウムで乾燥して溶媒を留去した。

得られた油状物を３０１１１１の無水メタノールに溶解
して、５規定ナトリウムメトキサイドメタノール溶液を
加え、アルゴン気流中で１８時間、室温上放置した０反
応液はイオン交換樹脂（ＩＲＣ−５０）を加えてｐＨ７
，０に中和した後、濃アンモニア水を加えてｐＨ８，２
に合せてから沢過してＰ液を濃縮した。得られた油状物
をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、１５％
メタノールクロロホルム混合溶媒で溶出した結果、無色
油状物の４−。

−（１β−ガラクトシル）−Ｎ−トリフロロアセチルド
ーパミンが２８７ｒｅｇ得られた。また、この化合物は
、以下に示す赤外線吸収スペクトルを示した。

ν　（ＫＢｒ）：　３３５２．１７！Ｏｃｍ−１３０ｒ
ｉｇ（０，０７３ｕ＋ｏｌ　）の４−ｏ−（１β−ガラ
クトシル）’−Ｎ−トリフロロアセチルドーパミンを２
１１１のメタノールに溶解し、２規定水酸化ナトリウム
（０，５１１１＞を加えてアルゴン気流中、２４時間室
温で放置してトリフロロアセチル基を脱保護した。反応
液は、０．５規定の塩酸でｐ）１８．０に中和した後、
５ＰＤＰ　（２８１（１；０．０９０＋１１ｏｌ　）を
１１のメタノールに溶解した液を添加し、更に１７時間
、室温下で撹拌した６反応液を飽和食塩水で約３倍に希
釈し、２−ブタノール−クロロホルムの１；１混合溶媒
で抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を
留去した。得られた無色残渣をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィーに付し、１５％メタノール−クロロホルム
混合溶媒で溶出し、２３１１１（ｌの４−ｏ−（１β−
０−ガラクトシル）−Ｎ−［３−（２−ピリジルジチオ
）プロピオニル］を無色固体として得た。この化合物は
、以下に示す赤外線吸。

収スペクトルを示した。

ｖ　（Ｋ　Ｂ　ｒ　）　：　３３８０，１６３５，１４
１９ｃ　ｍｉ更にこの化合物は、以下に示すプロトンＮ
ＭＲスペクトルを示した。

δ（ｄ４−ＨｅＯＨ）：　　２．５６（ｔ、２Ｈ，Ｊ−
７，３１１ｚ）２．６７（ｔ、２Ｎ、Ｊ−７，３ｔｌｚ
）３．０１（ｔ、２１．Ｊ−６，８１１Ｚ）３．０３−
４．００（ｎ、８Ｈ） ４．８４１ｊ、０．８０Ｈ，Ｊ−７，８）１ｚ、　１−
）１）５、２４　（ｄ、　０．２０ｔｔ、　Ｊ−２，９
Ｈｚ、　１−ｔｌ）６．６０−８．４０ｆｎ、　７Ｈ） 以上のプロトンＮＭＲ解析の結果、この化合物はガラク
トシル基の１α−異性体を２０％含有する混合物である
ことが判明した。

５　、４５　ｍｇ／＋＋＋ｌのアルカリ性フォスファタ
ーゼ溶゛液５．５＋１１を０　、　１５Ｉｌｏｌ／！の
リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に加え、次いでＳ−アセチ
ルメルカプト無水コハク酸１７４．２１１ｇをｉｌｌの
ジオキサンに溶解した溶液のうち３００μｍを該、水溶
液に添加した後、３０℃で１時間インキュベートし、５
１の０．１ｉｏ１／ｌ　　リン酸１衝液（ｐｌ（７，０
＞に対して一晩透析した。４−ｏ−（１β−０−ガラク
トシル）−Ｎ−（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ニル］１７、ＬＨを０．５１１１のメタノールに溶解し
たものと、ヒドロキシルアミン１４１１ｇを２００μｍ
の０．１　ｌｏｔ／Ｉ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に
溶解したもののうち１８０μｍを透析した溶液に添加し
、４℃で一晩放置した後、限外Ｐ″Ｉｊ１膜（＾旧ＣＯ
Ｎ社製、Ｐ旧Ｏ）を使用して２１１まで濃縮し、０．１
１Ｉｏｔ／Ｉ　リン酸ＭＩＷＩ液（ｐＨ７，０）　、０
．８％塩化ナトリウム、０．０２％塩化カリウム、０．
５％牛血清アルブミン、０，１％アジ化ナトリウム１０
１１を添加した。。

抗−（第一生成物）−抗体、即ち抗ドーパミン抗体とし
ては、市販の抗ドーパミン抗体（ＰＯＬＹＣＬＯＮＡＬ
　ＡＮＴＩＳＥＲＡ　Ａｎｔｉ−ｄｏｐａｉｉｎｅ　０
．０５［１１用、ｉ１ｎ＋ＵｎＯｔｅｃ社製）を使用し
た。

第二基質としては、パラニトロフェニールフォスフェー
ト（以下ｐＮＰＰとする）を使用しな。

被測定物を含む試料としては、市販の標準インシュリン
溶液（ＩＮＳＵＲＩＮ　　ｒ旧ＴＳ旧」■；三井製薬工
業株式会社製）を使用した。

９６大のマイクロタイタープレート（タンク社ｔｌりに
４，５μｇ／１１に調整した抗ラビットイムノグロブリ
ンＧ抗体を１００μｉずつ分注し、４゛Ｃで一晩放置し
た。３００μｍの０．８％塩化ナトリウム、０．０２％
塩化カリウムを含む０．１１１０１／［１１１！、Ｉ　
ンａ［’Ｆｌｒ液（ｐ　Ｈ７，０）テ各人を３Ｄ洗浄し
、前記した抗ドーパミンｖｒ、＃１バイアルにイオン交
換水１０１１を加えて良く振ったものを１００μＩずつ
各人に分注し、−晩装置した。２５０μｍの、０．８％
塩化ナトリウム、０．０２％塩化カリウム、０．５％牛
血清アルブミン、０，１％アジ化ナトリウムを含む０　
、　１１１０１／ｆｆｉ＋リン＃緩衝液（ｐＨ７，０）
を各人に分注し、４°Ｃで一晩放置した。以下、このプ
レートを抗体結合プレートとする。

標準インシュリン溶液をイオン交換水で希釈して、それ
ぞれＯ（イオン交換水）、１０−１．１０−２．１０−
３．１０−４μＵ／ｎ　Ｉのインシュリン溶液を作製し
、試料としな。それぞれの溶液を１００μＩずつ試験管
に加え、先に調整した第一酵素複合体溶液２８０μｍを
１０分間隔でそれぞれの試料に添加した。各試料に対し
、抗体結合ボール■を第一酵素複合体溶液を添加したの
と同じ順序で１個ずつ１０分おきに入れ、該ボールが試
料に完全に浸っていることを確認した後緩やかに撹拌し
、３７°Ｃで２時間インキュベートした。

試験管中の各試料を、アスピレータ−を使用して第一酵
素複合体溶液を添加した順序で１０分おきに吸引しな。

また、吸引後、洗浄液■（９０１１ｇ／ＩＩ　＋の塩化
ナトリウム溶液）を２１１ずつ試ｙＡ管に添加し、緩や
かに撹拌し、吸引した。この操作を２回繰返しな。

各試料に対して、先に調整した１β−Ｄ−ガラクトシル
−アルカリフォスファターゼ溶液（２，５Ｈ／Ｉｌ＋を
１００μｍずつ、第一酵素を添加しな順序で１０分おき
に添加し、４５°Ｃで１時間インキュベートした。

試験管中の試料をマイクロシリンジを使用して１００μ
ｊずつ取得し、先に調整した抗体結合グレートに分注し
た。４℃で一晩インキユベートした後、洗浄液Ｉ　（０
，８％塩化ナトリウム、０．０２％塩化カリウム、０．
０５％ツイーン２０を含むＯ，Ｍｏｌ／［のリン酸ｙ１
衝液）を３００μｍで５回洗浄した。

基質溶液（９，３ｊｇのｐＮＰＰに０．５ｒｉｏｌ／ｌ
の２−アミノ−２−メチル−１−プロパノ−ルー酢酸緩
衝液＜　ｐ　Ｈ１０，０）を添加した溶液）を１００μ
ｌずつ各人に分注し、３７℃で３０分間インキュベート
した後、反応停止液（０，ｌｏｌ／Ｉ　ＢＤＴＡ、０．
１％アジ化ナトリウムを含む０．１４℃ｇｏｌ／ｌ　リ
ン酸緩衝液（ｐＨ９ｊ））を１００μｉずつ分注し、４
０５ｎｎの吸光度を測定した。

この結果を表１に示す。本実施例においては、インシュ
リンを１０−４μｕ／ｎ＋ｌ、即ち７．２×１０−２０
ｎｏｌまで検出可能なことが示された。

比較例１ 一段階の酵素増＠（通常のサンドイツチ法）を用いた、
市販のインシュリン測定キット（２ＮＳＬＪＲＩＮ　　
Ｉ’ＭＩＴＳｔｌｂ　Ｉｆ　、三井製薬株式会社製）に
より、試料中のインシュリンを検出した。

実施例１で使用した標準インシュリン溶液をイイオン交
換水で希釈して０（イイオン交換水）、１０−１．１０
−２．１０−３．１０−４μＬｔ／ｎ１ｌｃ７）　（ン
シュリンを含む試料を作製した。それぞれの試料を１０
０μｍずつ試験管に入れ、実施例と同様に第一酵素複合
体溶液を２８０μｍずっ添加した。続いて、抗体結合ボ
ール■を入れ、３７°Ｃで２時間インキュベートした。

実施例と同様に、アスピレータ−を使用して試験管から
試料を吸引した後、各試験管中の試料に実施例１と同様
の基質溶液０．５ｎ＋ｌを添加し、３７℃で１時間イン
キュベートしな。各試験管に反応停止液２．０１１を加
え、４２０ｎｎの吸光度を測定した。

結果を表２に示す０本比較例のでは、インシュリンを１
００μＵ／１、即ち７゜２　Ｘ　１０−１６まで検出可
能であった。

実施例２；フェリチンの検出 β−Ｄ−ガラクトシダーゼと結合したフェリチンに特異
的な抗体（ＩＲ−１４００ＦＥＲＲＩＴＩＮｒ　ＭＩＴ
Ｓ旧」、三井製薬工業株式会社製）を第一酵素複合体と
して使用した。また、被測定物（フェリチン）と結合し
ていない第一酵素複合体を除去するためのＢ／Ｆ分離操
作のため、第一酵素複合体中の７エリチンに特異的な抗
体とは異なる部位でインシュリンを認識する抗体を固定
化したボリスチＬ／７ボール（ＩＲ−１４００ＦＥＲ旧
ＴＩＮ　ｒ　ＨＩＴＳ旧」、三井製薬工業株式会社製）
を使用しなく以下、抗体結合ボール■という）。

式、Ｙ２−Ｙｌ〜Ｚ（本発明の詳細な説明を参照）で示
される第一基質として、Ｙ２がアンジオテンシン■であ
り、Ｙｌがドーパミンであり、Ｚが１β−Ｏ−ガラクト
シル基である化合物（１β−〇−ガラクトースードーパ
ミンーアンジオテンシン■）を合成した。なお、本実施
例では、アンジオテンシンＨの第３〜８番目の６アミノ
酸からなるペプチドを「アンジオテンシン■」と呼ぶ。

まず、実施例１と同様の操作により、４−ｏ−（１β−
Ｄ−ガラクトシル）−Ｎ−（３−（２−ピリジルジチオ
）１０ピオニル］ドーパミンを得た。

０１５ｒａＱのアンジオテンシン■を１１１のエタノー
ルに溶解し、Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸１７
４．２ｎ＋ｃ＋を１１のジオキサンに溶解したうちの２
０μｍと混合し、室温で１時間インキュベートした後Ｄ
ＥＡＥ−２８＄４により分取しな０分取した溶液２１１
１に、２７．０ｆｆｉｇの４−ｏ−（１β−Ｄ−ガラク
トシル）−Ｎ−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ニル１ドーパミンを１１１１のメタノールに溶解したう
ちの５０μｍと、１４１１ｇのヒドロキシルアミンを２
００μの０．１ｍｏｌ／！　リン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）に溶解したうちの４０μｍを添加し、室温で一晩法治
した後、ＤＥＡＥ−２３旧こより分取した。

抗ドーパミン抗体及び第二基質は実＃１例１と同様のも
のを使用しな。

Ｘ２−Ｙ３で示される第二酵素複合体として、Ｘ２がア
ルカリ性フォスファターゼであり、Ｙ３が抗アンジオテ
ンシン■抗体であるものを調整した。公知の方法に従っ
て調整された抗アンジオテンシン■抗体とアルカリ性フ
ォスファターゼをビリジルジスルヒドを用いた方法によ
り結合し、第二抗体複合体を調整した。

試料であるフェリチン溶液としては、市販の標準フェリ
チン溶液（ＪＲ−１４００ＦＥｌ？ＲＩＴＩＮ　ｒ旧Ｔ
Ｓ旧」：三井製薬工業株式会社製）を使用した。

抗ドーパミン抗体を結合したマイクロタイターグレート
（タンク社製）は、実施例１と同様にして調整した（以
下抗体結合プレートとする）。

標準フェリチン溶液をイオン交換水で希釈し、０（イオ
ン交換水）　、１０−１４．１０−１５．１Ｏ−１（３
，１０−１７，１０−１８，１０−１９ｎ＋ｏ１１５０
μＩのフェリチンを含む試料を作製した。試験管に試料
を５０μｍずつ入れた後、抗体結合ボール■を入れ、更
に第一酵素複合体溶液３００μを１０分の間隔で添加し
た。抗体結合ボール■が完全に浸っていることを確認し
、３７℃で２時間インキュベートした。

第一酵素複合体を添加した順序で１０分おきに試験管な
いの試料を吸引した。吸引は、実施例１と同様にして行
った。抗体結合プレートに、先に合成した１β〜Ｄ−ガ
ラクトシル−ドーパミンアンジオテンシン■溶液を１０
０μｍずつ分注し、実施例１と同様の操作を行った後、
抗水結合ボール■を各人に１個ずついれ、室温で一晩放
置した。

抗体結合プレートを洗浄液■で２回洗浄し、各人に３２
．５μｇ／ｌに調整した抗アンジオテンシン■抗体溶液
を１００μずつ分注し、室温で一晩放置した後、洗浄液
■３００μで２回洗浄した。

実施例１と同様の基質溶液を１００μｉずつ各人に分注
し、３７℃で３０分インキュベートした後、反応停止液
を１００μずつ分注した後、４０５　ｎｌｌの吸光度を
測定した。

結果を表３に示す０本実施例では、フェリチンを１０−
１８１１ｏｔまで検出することができた。

実施例３；β２−ミクログロビンの検出β−Ｄ−ガラク
トシダーゼと結合したβ２−ミクログロビンに特異的な
抗体＜　ＩＲ−１５００β２−ＨＧ「旧ＴＳＵＩＪ　、
三井製薬工業株式会社製）を第一酵素複合体として使用
した。また、被測定物（β２−ミクログロビン）と結合
していない第一酵素複合体を除去するためのＢ／Ｆ分離
操作のなめ、第一酵素複合体中のβ２−ミクログロビン
に特異的な抗体とは異なる部位でβ２−ミクログロビン
を認識する抗体を固定化したポリスチレンボール（ＩＲ
−１５００β２−ＨＧ　ｒ旧ＴＳ旧」、三井製薬工業株
式会社製）を使用した（以下、抗体結合ボール■という
）式、Ｙ２−Ｙｌ−Ｚ（本発明の詳細な説明を参照）で
示される第一基質として、Ｙ２がアンジオテンシン■で
あり、Ｙｌがドーパミンであり、Ｚが１β−Ｄ−ガラク
トシル基である化合物（１β−Ｄ−ガラクトース−ドー
パミン−アンジオテンシン■）を実施例２と同機にして
合成しな。なお、本実施例でも、アンジオテンシン■の
第３〜８番目の６アミノ酸からなるペプチドを「アンジ
オテンシン■」と呼ぶ。

Ｘ２−Ｙ３で示される第二酵素複合体として、Ｘ２がア
ルカリ性フォスファターゼであり、Ｙ３が抗アンジオテ
ンシン■抗体であるものを実施例２と同様にして調整し
た。

整した。

試料であるフェリチン溶液としては、市販の標準フェリ
チン溶液ｃ　ＩＲ−１５００Ｂ　２−Ｈａ　ｒ　ＨＩＴ
Ｓ旧」　：三井製薬工業株式会社製）を使用しな。

抗ドーパミン抗体を結合したマイクロタイタープレート
（ヌンク社製）は、実施例１と同様にして調整した（以
下抗体結合プレートとする）。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料中の被分析物を検出する方法であつて［１］
   被分析物に対して親和性を有する物質及び該物質と結合
   している第一の酵素からなる第一酵素複合体を試料へ添
   加する操作、 ［２］少なくとも、被分析物と結合していない前記第一
   酵素複合体を試料から除去する操作、 ［３］第一の酵素に対する基質及び該基質と結合してい
   る第二の酵素からなり、第一の酵素との接触により第二
   の酵素を含む第一生成物に変換される第一基質又は第一
   の酵素との接触により第一生成物に変換される、第二の
   酵素と結合していない第一基質のいずれかを、試料に添
   加する操作、 ［４］第一の酵素に対する基質として第二の酵素と結合
   している第一基質を使用した場合における、少なくとも
   、第一生成物に変換されていない第一基質を前記試料か
   ら除去する操作、 ［５］第一の酵素に対する基質として第二の酵素と結合
   していない第一基質を使用した場合における第一生成物
   に対して親和性有する物質と該物質に結合している第二
   の酵素からなる第二酵素複合体を試料に添加する操作、
   及び少なくとも、第一生成物と結合していない第二酵素
   複合体を試料から除去する操作、 ［６］第二の酵素との反応により検出可能な第二生成物
   に変換される第二基質を試料に添加する操作［７］第二
   生成物を検出する操作、 の各操作からなる方法。
2. （２）試料中の被測定物を検出するための測定試薬であ
   って、 ［１］被測定物に対して親和性を有する物質及び該物質
   と結合している第一の酵素からなる第一酵素複合体から
   なる成分、 ［２］固相に固定化された、第一酵素複合体中の被測定
   物に対して親和性を有する物質と被測定物の反応を妨害
   しない様な、被測定物に対して親和性を有する物質、か
   らなる成分、 ［３］固相に固定化された、第一の酵素により製造され
   る生成物に対して親和性を有する抗体、からなる成分、 ［４］上記［１」〜［３］の成分を保持する容器、から
   なる試薬。