JPH0535990B2 - - Google Patents

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JPH0535990B2
JPH0535990B2 JP62180216A JP18021687A JPH0535990B2 JP H0535990 B2 JPH0535990 B2 JP H0535990B2 JP 62180216 A JP62180216 A JP 62180216A JP 18021687 A JP18021687 A JP 18021687A JP H0535990 B2 JPH0535990 B2 JP H0535990B2
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JP
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enzyme
group
antibody reagent
reagent
antibody
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Pii Arubarera Jeemusu
Teii Batsukuraa Robaato
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Miles Inc
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Publication of JPH0535990B2 publication Critical patent/JPH0535990B2/ja
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/964—Chemistry: molecular biology and microbiology including enzyme-ligand conjugate production, e.g. reducing rate of nonproductive linkage

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ 本発明は、完全な本来の免疫グロブリン又はそ
のフラグメントのような抗体試薬が、酵素に共有
連結してなる酵素標識抗体試薬に関する。特に、
本発明は、抗体試薬及び酵素部分がそれらの本来
の結合及び触媒特性を、それぞれ実質的に保持す
る該標識試薬を製造するための方法及びカツプリ
ング剤に関する。
酵素標識抗体試薬は、主に、抗体試薬部分が関
係する抗原及びハプテンの検出及び測定において
多種の用途を有し、放射性同位元素標識抗体試薬
の使用に代わる安全で便利な代替物を提供する。
酵素標識抗体試薬の重要な分析的用途は酵素イム
ノアツセイ法である。その方法は、当業界で周知
のように、種々の形式又はプロトルコを取ること
ができる。一般に、抗体性又はハプテン様分析対
象物の存在又は量を測定する試験試料は、１もし
くはそれ以上の工程で、最終的に結合種と遊離種
の間に分配される酵素標識成分を含む試薬と一緒
にされる。結合種及び遊離種のいずれか一方の酵
素活性を測定し、試験試料中の分析対象物の存在
又は量と関連づけることができる。
標識試薬の結合種及び遊離種の物理的分離を必
要とする酵素イムノアツセイは不均一系と称さ
れ、米国特許第3654090号；4016043号；及び米国
再発行特許第31006号に記載されている方法が例
として挙げられる。結合種及び遊離種を物理的に
分離せずに行なわれるものは均一系と称され、米
国特許第3817837号及び4043872号の記載が例とし
て挙げられる。標識抗体試薬を使用する特に有用
な酵素イムノアツセイプロトコルは、免疫学的測
定方法（immunometric technique）及びサンド
イツチ技法として一般に知られているものであ
る。
イムノアツセイ以外にも、酵素標識抗体試薬
は、抗原性又はハプテン性を有する物質を検出す
るどんな分析方法においても使用される。そのよ
うな物質は重要な分析対象物であつてもよく、な
んらかの間接的又は中間的な測定の相互作用によ
つて重要な分析対象物と関連づけられるものであ
つてもよい。例としては、組織学的、細胞学的試
料中の抗原の検出及び視覚化、及び、抗原性及び
ハプテン性標識又は核酸のハイブリツド形成試験
における抗原性ハイブリツドの検出がある。後者
の測定法としては、どちらも本譲渡受人に譲渡さ
れているヨーロツパ特許公報第146039号及び
163220号明細書に記載されている方法が例として
挙げられる。
上記の方法及び酵素標識抗体試薬の使用はすべ
て、所望の酵素及び抗体試薬成分の、必要とされ
る複合体を都合よく、また再現性よく製造する能
力に依存している。さらに、標識試薬の臨界的な
特徴は、複合抗体及び酵素部分のそれぞれの、結
合性及び触媒性である。種々の蛋白質間の結合技
術が文献において公知であり、多くのものが酵素
標識抗体試薬の製造に適用されている。この分野
における最近の研究論文には、Peters及び
RichardsのAnn.Rev.Bioihem.47：523（1977）；
Das及びCoxのAnn.Rev.Biophys.Bioeng.8：165
（1979）；JiのBiochem.Biophys.Acta559：39
（1979）；及びConn.Meth.in Enzymol.103：49
（1983）がある。代表的な同種二官能性の連結試
薬としては、アミン間のカツプリング剤、例えば
ジメチルアジポイミデート、ジメチルマロンイミ
デート及びジメチルスベルイミデートのようなジ
メチルイミデート類；スベリン酸ジスクシンイミ
ジル（DS）及び酒石酸ジスクシンイミジルのよ
うなビス−Ｎ−オキシスクシンイミジルエステル
類；及び１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロ
ベンゼン及び４，4′−ジフルオロ−３，3′−ジニ
トロフエニルスルホンのようなビス−ニトロフル
オロベンゼン類；メルカプトカツプリング剤、例
えば１，２−フエニレンジマレイミド及び１，４
−フエニレンジマレイミドのようなビス−マレイ
ミド試薬；Ｎ，Ｎ−エチレン−ビス−イオドアセ
トアミドのようなビス−イオドアセトアミド類；
及び３，６−ビス−（メルクリメチル）−ジオキサ
ンのようなビス−有機水銀試薬；４，4′−ジイソ
チアシアノ−２，2′−ジスルホン酸及びｐ−フエ
ニレン−ジイソチオシアネート（DTIC）のよう
な高反応性ジイソチオシアネート類及び４，4′−
ジチオ−ビス−フエニルアジドのようなアリール
アジド類が挙げられる。
異種二官能性のカツプリング試薬は、概念上上
記の化学的に適合する反応性基を合わせることに
より製造される。一般例としては、４−フルオロ
−３−ニトロフエニルアジド（FNPA）、Ｎ−ス
クシンイミジル−６−（4′−アジド−2′−ニトロ
フエニルアミノ）ヘキサノエート（SANPAH）、
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル（MBS）及びスクシンイミ
ジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキ
サン−１−カルボン酸エステルが挙げられる。
二官能性の試薬に共通する欠点は、湿気に対す
る感受性（例えばアジポイミデート、Ｎ−オキシ
スクシンイミジル（NOS）エステル及びイソチ
オシアネート試薬）、又は光に対する感受性（フ
エニルアジド類）である。数種の試薬は水溶性に
乏しいが、この欠点は、DS及びMBSのようなＮ
−ヒドロキシスクシンイミジルエステル試薬で
は、Ｎ−３−スルホスクシンイミジルエステル類
縁本の製造により解消されている。また、最も一
般的に用いられる二官能性の試薬のスペーサー腕
（spacer arm）は短かすぎるか又は過度に親油性
であり、それぞれカツプリングの効率及び異型性
に影響を及ぼす。さらに、従来のアミン間のカツ
プリング試薬は、一般に抗体成分が、第一級アミ
ンと反応する試薬により非常に不活性化されやす
いという欠点を有する。
親水性のスペーサー基を介する蛋白質のカツプ
リングは、Lowe及びDeanのAffinity
Chromatography，J.Wiley and sons（New
York 1974）、第５章、200−259頁に記載されて
いる。特定の親水性スペーサー腕は、Porathの
Meth.Enzymol.34：24−27（1974）−「ビス−オキ
シランカツプリング剤」；O′CarraらのMeth.
Enzymol.34：116−118（1974）−「１，３−ジアミ
ノプロパン−２−オール」；及び特開昭58−
176547号（Chem.Abstr.100：48087u）−「ポリエ
チレングリコールジアミン類及びジヒドラジド
類」に記載されている。交差結合剤としての脂肪
族ビス−マレイミド類の使用は、Lundblad及び
NoyesのChemical Reagents for Protein
Modification，第２巻、CRC Press（Boca
Raton，FL 1984）、第５章、129−139頁に記載
されており、特定の試薬の例としては、特開昭58
−183094号（Chem.abst.100：99096d）及び特開
昭58−49821号（Chem.abst.100：135441y）；
CooneyらのBiochem.Pharmocol.24（２）：151−
166（1978）；Heilmann及びHolznerのBBRC
99：1146（1981）；及びサトー（Sato）及びナカ
オ（Nakao）のJ.Biochem.90：1177（1981）に記
載されているものが挙げられる。
ビス−マレイミド類は、β−ガラクトシダーゼ
をはじめとする酵素を抗体試薬へ結合させるため
に使用されてきた［ヨシタケ（Yoshitake）らの
Scand・J.Immunol.10：81（1979）］。しかし、試
用されたものは水性緩衝剤への溶解性に乏しいた
め、合成が再現不可能であることが判明した。ビ
ス−マレイミドポリアルキレングリコール類は、
公知であるが、そのような化合物をカツプリング
剤として酵素標識抗体試薬の製造に使用する試み
は知られていない。しかし、全く関連のない目的
には使用されている［特開昭58−15515号
（Chem.Abst.99：71625n）、特開昭58−136637号
（Chem.Abst.100：104888v）及び特開昭58−
40374号（Chem.Abst.99：124206k）参照］。
［発明の概要］ 有利な酵素標識抗体試薬が、蛋白質のメルカプ
ト基に連結したビス−マレイミドポリアルキレン
グリコール架橋基を介して、それぞれの蛋白質成
分を共有結合的に連結することにより調製される
ことを見い出した。架橋基は、得られた標識試薬
に高い水溶性を与え、抗体及び酵素部分のそれぞ
れの結合性及び触媒性を実質的に保持する。さら
に、標識試薬の合成は、その他のタイプのビス−
マレイミドカツプリング剤を用いる従来の試みよ
りも極めて再現可能性が高い。
［好ましい実施態様の説明］ 本発明の酵素標識抗体試薬は、酵素及び抗体部
分のそれぞれにおけるメルカプト基を連結するビ
ス−マレイミドポリアルキレングリコール架橋基
を特徴とする。ポリアルキレングリコール残基
は、エーテル結合の形態の酸素によつて互いに連
結した、少なくとも２つの、好ましくはそれ以上
のアルキレン基を有する直鎖からなることが理解
されるであろう。アルキレン基は置換されうる
が、好ましくは未置換であり、任意数のメチレン
単位からなるが、好ましくは、少なくとも２つ
の、かつ通常10又はそれ以下の単位、例えばエチ
レン、プロピレン、ヘキシレン等からなる。ポリ
アルキレングリコール残基は、同一の又は長さ及
び／又は置換の異なるアルキレン繰り返し単位か
らなる。１つ又はそれ以上のアルキレン単位の置
換基はいずれも、言うまでもなく、本発明の有利
が性質が実質的に損われないように選択される。
当業者は適切な選択を行なうことが可能であろ
う。代表的には、そのような置換基としては、ヒ
ドロキシル、アルコキシル、又は、二基置換され
たアミノ成分が挙げられる。
好ましい架橋基は次式： （式中、(S)は架橋基がそれぞれ共有結合で連結し
ている、抗体試薬及び酵素のメルカプト基を表わ
し、ｎは２から10の整数であり、ｘは１から1000
の整数である。）で示される。より好ましくは、
ｎは６以下、最も好ましくは２であり、ｘは約50
未満、より一般的には約20未満、最も好ましくは
12未満であり、特に有用な化合物のｘは５であ
る。このタイプの特に好ましい架橋基のｎとｘの
組み合わせは次表から選ばれる： ｎ ｘ ２ ２ ２ ３ ２ ５ ２ ９ ２ 11 ３ ２ ３ ３ 別のタイプの有用な架橋基は次式： （式中、(S)は上記で定義した通りであり、ｍは２
から10の整数であり、ｙは０から10の整数であ
り、ｚは０から1000の整数である。より好ましく
は、ｍとｙは６以下であり、ｚは約50未満、より
一般的には約20未満、最も好ましくは12未満であ
る。）で示される。これらの架橋基において、ポ
リアルキレングリコール鎖は、非対称数の炭素原
子で構成されている。数種の鎖は文献において公
知であり、ポリアミド及びポリウレタン類の製造
に使用される。関連する分岐鎖は適切なグリコー
ル類から、シアノエチル化及び還元（例えば
Chem.Abstr.81：49258b，Chem.Abstr.78：
111934n，及びChem.Abstr.49：4654h）により又
は、トシル化／ガブリエル連続反応により製造さ
れる。非対称的なポリアルキレングリコールのス
ペーサー腕のｍ，ｙ，ｚの組み合わせの例として
は、次表より選ばれたものが挙げられる：ｍ ｙ ｚ 参 照 ３ ０ ０ Chem.Abst.72：101556 ３ １ ２ Chem.Abst.49：3003 ３ ２ ２ Chem.Abst.72：101556 ３ １ ４ Chem.Abst.81：492586 ３ １ ５ Chem.Abst.72：101556 所望の複合を達成するために必要なビス−マレ
イミドポリアルキレングリコールのカツプリング
剤は、従来の合成方法により製造される。好まし
い架橋基(A)からなる標識試薬を製造するためのカ
ツプリング剤は次のように製造される。
α，ω−ジアミノポリアルキレングリコール誘
導体を、上記した化学技術を用いてグリコール類
から製造する。次に、ジアミンを無水マレイン酸
でジアシル化して、対応するＮ，N′−ビス−マ
レアミド酸中間体を得る。これらを単離せずに、
Trommer及びHendrich（Synthesis 1973，484）
により述べられているように、Ｎ−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾールとジシクロヘキシルカルボジイ
ミドを用いて、所望のビス−マレイミド誘導体に
還化させる。
本発明による酵素で標識されうる抗体試薬は、
活性抗体結合部位とカツプリング反応に利用可能
なメルカプト基からなる、いかなる全免疫グロブ
リン又はそのフラグメント、凝集体、誘導体もし
くは変種であつてもよい。全免疫グロブリンの形
態である場合、いかなる公知の種及び亜種、例え
ばIgG、IgM等にも属することができる。それぞ
れの抗原又はハプテンに特異的結合親和力を保持
する該免疫グロブリンのいかなるフラグメント、
例えば、通常、Fab、Fab′及びＦ（ab′）2と称され
るIgGのフラグメントもまた使用することができ
る。さらに、該免疫グロブリン又はフラグメント
の凝集体、ポリマー、誘導体及びその他のいかな
る化学物質又はその他の変種もまた、適当な場合
に使用することができる。
抗体試薬の免疫グロブリン源は、通常の抗血清
及びモノクローナル技法のようなどのような使用
可能な方法によつても得られる。抗血清は、マウ
ス、ウサギ、モルモツト又はヤギのような宿主の
動物を適切な免疫源で免疫化することを包含す
る、十分に確立された技法により得られる。免疫
グロブリンは、リンパ球などを作る抗体の体細胞
のハイブリツド形成により得られるハイブリドー
マの分泌物からも得られ、一般に、そのような免
疫グロブリンはモノクローナル抗体と称される。
抗体試薬が結合する抗原又はハプテンによつて、
本発明が限定されないことは明らかである。
言うまでもなく、抗体試薬は、カツプリング反
応を起こすために少なくとも１つの利用可能なメ
ルカプト基を有する。１又は複数のそのようなメ
ルカプト基は、本来の抗体試薬中に存在しても、
又は合成的に導入されていてもよい。IgGのFab、
Fab′及びＦ（ab′）2フラグメントは、天然免疫グロ
ブリン中のジスルフイド架橋を還元して得られる
利用可能なメルカプト基を有する。メルカプト基
を全抗体のような蛋白質に合成的に導入するため
に、従来の数種の方法が使用できる。全抗体−酸
素複合体の製造方法が、最近イシカワ
（Ishikawa）及び協力者らにより報告されている
［J.Immnoassay ４：209（1983）］。これらの方法
に１つにおいては、無水Ｓ−アセチルメルカプト
コハク酸を用いてチオール基をウサギIgGに導入
する。次に、チオール基を脱保護化し、マレイミ
ド−活性化酵素に結合せしめる。一方、ウサギ
IgGをメルカプトエチルアミンで、ヒンジ部にお
いて還元し、Ｎ−N′−ｏ−フエニレンジマレイ
ミドで処理し、本来のβ−ガラクトシダーゼに結
合せしめる。この手順の逆、即ち還元されたIgG
とマレイミド−活性化β−ガラクトシダーゼとの
カツプリングも用いることができる。
利用可能なメルカプト基を含有するか又は合成
的に導入しうるものであれば、本質的にはいかな
る酵素も本発明による抗体試薬を標識するために
用いることができる。メルカプト基の合成的導入
は上記と同様にして達成される。使用しうる酵素
のほんの数種の例としては、西洋わさび（ホース
ラデイツシユ）ペルオキシダーゼ、アルカリホス
フアターゼ及びグルコースオキシダーゼが挙げら
れる。その安定性、高転換性及び測定の容易性故
に、所望の酵素標識が、β−ガラクトシダーゼで
ある場合、本発明は特に有用である。
適切なビス−マレイミドポリアルキレングリコ
ールカツプリング剤と酵素標識及び抗体試薬との
カツプリングは、任意の順序の工程で、また適切
に選ばれた条件下で進行せしめることができる。
通常、酵素及び抗体試薬の１方がカツプリング剤
との反応により活性化され、未反応物質から単離
された後、活性化された成分が、酵素及び抗体試
薬のもう一方に結合する。カツプリング剤に対し
て適当に過剰量の活性化すべき物質、即ち酵素又
は抗体試薬を用いることにより、分子間架橋物質
の著しい生成が避けられる。
活性化及びカツプリング反応は、通常、温和な
条件下で、例えばほぼ中性のPH及び室温下で、適
度の熟成時間、例えば活性化反応に１時間または
カツプリング反応に24時間までの時間をかけて行
なわれる。条件とインキユベーシヨン時間は所望
により広い範囲で変更することができる。活性化
された中間体及び最終的な酵素標識抗体試薬の分
離は、任意の手段、通常クロマトグラフイーによ
り得ることができる。ビス−マレイミドカツプリ
ング剤は、上記記載の架橋基を生ぜしめるものか
ら選ばれる。好ましいカツプリング剤は次式： （式中、ｎ及びｘは前述した通りである。）で示
される。
得られた酵素標識抗体試薬は、当業界で公知
の、また今後開発される分析及びその他の方法の
いずれにおいても有用であろう。該試薬は上記で
述べたようなイムノアツセイ、及び、分析され
る、又は重要な分析対象物に関連する、特定の抗
原又はハプテンの検出を必要とするその他の方
法、例えば標識プローブ又はハイブリツドの免疫
化学的検出を包含する核酸のハイブリツド形成に
おいて特に有用であろう。有利な水溶性、及び、
高い免疫反応性及び酵素活性故に、本発明の試薬
はこれらの分析方法において特に有用となる。
ここで本発明を以下の実施例により説明する
が、本発明を限定するものではない。
［実施例］ β−Ｄ−ガラクトシダーゼとFab′抗体フラグ
メントの複合体を製造し、核酸のハイブリツド形
成測定法で生成したDNA・RNAハイブリツドの
検出に使用して、尿中のバクテリアの存在を測定
した。
二官能基カツプリング試薬の製造 脱水したテトラヒドロフラン20ml中に、１，17
−ジアミノ−３，６，９，12，15−ペンタオキサ
ヘプタデカン［KernらのMakromol.Chem.180：
2539（1979）］2.80ｇ（10ミリモル）を含有する溶
液を、テトラヒドロフラン20ml中に、無水マレイ
ン酸4.50ｇ（45ミリモル）を含有する攪拌された
溶液に１時間かけて滴下した。反応の過程で沈泥
様の沈殿物が認められた。１時間後、反応混合物
を過し、液を真空下（12mmHg、続いて0.2mm
Hg）50℃で、油状物に濃縮した。ビス−マレア
ミン酸中間体を含有する黄色の粗ペースト6.34ｇ
を得た。次に、この残留物を、ヒドロキシベンゾ
トリアゾールの水和物2.97ｇ（22ミリモル）で処
理し、脱水したジメチルホルムアミド（DMF）
20mlに溶解した。この溶液を真空下で蒸発させ
た、残留物をDMF20mlに２回溶解し、蒸発させ
た。次にその残留物を不活性雰囲気下に置き、
DMF20mlに溶解し、０℃に冷却し、ジシクロヘ
キシカルボジイミド4.54ｇ（22ミリモル）で処理
した。得られた混合物を０℃で１時間、次に雰囲
気温度で一晩攪拌した。得られた暗かつ色の混合
物を過し濃縮して、暗かつ色の粗油状物5.62ｇ
を得た。１％CH3OH−CHCl3溶媒混合物を用
い、300ｇのSiO2−60（230−400メツシユ、米国、
ニユージヤージー州、チエリーヒルのE.M.
Science社製）上で、フラツシユクロマトグラフ
イーによつて試料を精製した。部分的に精製され
た生成物を含有する画分を貯留し、濃縮して、黄
色の油状物2.76ｇを得た。同じ溶媒混合物を用
い、200ｇのSiO2−60上で、再び試料にフラツシ
ユクロマトグラフイーを行ない、１，17−ジマレ
イミド−３，６，９，12，15−ペンタオキサヘプ
タデカンの純生成物を1.62ｇの油状物として得た
（収率37％）。
C20H28N2O9の分析 計算値 ：Ｃ，54.53；Ｈ，6.41；Ｎ，6.36 実測値 ：Ｃ，54.96；Ｈ，6.28；Ｎ，6.48 PMR（60MHz）CDCl3δ：3.63（ｓ，10H）；3.70
（ｓ，14H）；6.70（ｓ，4H） IR（CHCl3）cm-1：2860，1710，1405，1100cm
-1 質量スペクトル（FAB）ｍ／ｅ：441（Ｍ＋１，
51％）． β−Ｄ−ガラクトシダーゼとFab′抗体フラグメ
ントの結合 β−ガラクトシダーゼをFowlerの方法［J.
Biol.Chem.258：14354（1983）］により製造し、
50％硫酸アンモニウム懸濁液として保存した。酵
素懸濁液の一部を取出してこれを遠心分離し、ペ
レツトをNaCl0.15Mを含むPH7.0の0.1Mリン酸ナ
トリウム緩衝液に溶解した。ジチオトレイトール
を2mMの最終濃縮物に加え、25℃で４時間イン
キユベートした後、NaCl0.15MとEDTA1mMを
含むPH7.0の0.1Mリン酸ナトリウム中で、
BioGelP6−DGカラム（米国、カリフオルニア
州、リツチモンドのBio−Rad Laboratories社
製）上で、混合物にクロマトグラフを行なつた。
メルカプトの含有量は、酵素１モルにつき9.1−
10.4モルであつた。次に、還元したβ−ガラクト
シダーゼを、NaCl0.15MとEDTA1mMを含むPH
7.0の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液中で、上記で
述べたように新たに製造した200倍モル過剰の１，
17−ジマレイミド−３，６，９，12，15−ペンタ
オキサヘプタデカンと室温で１時間反応させた。
同様の緩衝液を用いBioGelP6−DG上で、得られ
たマレイミド−β−ガラクトシダーゼにクロマト
グラフイーを行ない、直ちにFab′とのカツプリ
ングに用いた。活性化されたβ−ガラクトシダー
ゼのマレイミド含有量は、酵素誘導体の１部と過
剰のグルタチオンを反応させ、その過剰のグルタ
チオンをEllman試薬［Meth.Enzymol.25：457
（1972）］で測定することにより決定された。マレ
イミド含有量は、酵素１モルにつき6.9−10.5モ
ルであつた。
Fab′抗体フラグメントを次の様にして製造し
た。DNA・RNAハイブリツドに対するマウスの
モノクローナルIgGを、BoguslawskiらのJ.
Immunol.Meth.89：123（1985）に記載されてい
るように製造した。PH4.2の0.1M酢酸ナトリウム
中で、IgGに対し１：33の重量比のペプシンで37
℃で16時間消化することによりＦ（ab′）2を得た
［Lamoyi及びNisonoff、J.Immunol.Meth.56：
235（1983）］。NaCl0.15Mを含むPH6.0の10mM
リン酸ナトリウム緩衝液中で、Sephacryl Ｓ−
200（米国、ニユージヤージー州、ピスキヤタウエ
イのPharmacia社製）カラム上で、消化生成物
にクロマトグラフイーを行なつた。
該Ｆ（ab′）2の一部をジクロロトリアジニルアミ
ノフルオレセイン（DTAF）（米国、モンタナ
州、セントルイスのSigma Chemical Co.製）で
標識して、複合体の製造における抗体トレーサー
として使用した。Ｆ（ab′）2に対し３：１のモル比
のDTAFを用い、PH9.0の0.1M硼酸ナトリウム緩
衝液中で、標識反応を１時間行なつた
［Blakeslee及びBanesのJ.Immunol.Meth.13：
305（1976）］。標識抗体をBioGelP−６−DGカラ
ム上で遊離DTAFから分離した。実験的に引き
出した式から計算したDTAF／（ab′）2のモル比
は2.1であつた［The及びFeltkampの
Immunol.18：865（1970）］。
Ｆ（ab′）2を20：１の割合でDTAF−Ｆ（ab′）2と
混合し、NaCl0.15M、EDTA1mM、ジチオトレ
イトール10mMを含むPH7.0の0.1Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液中でFab′に還元した。還元は室温で
３時間行なつた。NaCl0.15M、EDTA1mMを含
むPH7.0の0.1Mリン酸ナトリウム中、BioGelP6−
DGカラム上でFab′を単離し、直ちに上記記載の
様に製造したマレイミド−β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼへのカツプリングに使用した。Ellman法
［Meth.Enzymol.25：457（1972）］により測定さ
れたFab′のメルカプト含有量は、Fab′1モルにつ
きメルカプト2.5−3.0モルであつた。
マレイミド−β−ガラクトシダーゼを１：５の
モル比でFab′と混合した。マレイミド−β−ガ
ラクトシダーゼの最終濃縮物は1.5μMであり、
Fab′の最終濃縮物は7.5μMであつた。結合反応を
５℃で22時間攪拌しながら行なつた。多少の凝集
物質が生成され、遠心分離により除去された。
NaCl0.15Mを含むPH6.0の10mMリン酸ナトリウ
ム緩衝液中、BioGelA−1.5m（Bio−Rad社製）
カラム上で、上澄み液にクロマトグラフイーを行
なつた。180nmにおける吸収と、492nmの励光と
512nmの発光を用いたDTAF−Fab′の蛍光に関
して、各画分を調べた。酵素活性と蛍光を示した
画分は複合体を含有していた。それらを貯留し、
NaCl0.15M、0.1％NaN3、ウシ血清アルブミン
（BSA）１mg／ml、50％グリセリンを含むPH7.0の
0.1Mリン酸ナトリウム中で−15℃で保存した。
酵素活性と蛍光の検出に基づくと、複合体は酵素
１モルにつき4.1モルのFab′を含有していた。
核酸の製造 リボソームRNA（rRNA）を大腸菌
（Escherichia coli）から製造し、16S及び23S成
分を密度勾配遠心分離により分離した［タカナミ
（Takanami）のMeth.Enzymol.12A：494
（1967）；McConkeyのMeth.Enzymol.12A：670
（1967）］。
サケ精子DNA中のRNA（米国、ニユージヤー
ジー州、ピスキヤタウエイのPharmacia製）の
極微量を0.3MのNaOHに溶解した〜５mgの
DNA／mlの溶液を37℃で16時間インキユベート
することにより分解した。この溶液を30％酢酸で
中和し、DNAを冷却したエタノールで沈殿させ
た。EDTA0.4mMを含むPH7.4の20mMリン酸ナ
トリウムにDNAを溶解した。
標準的な方法［Maniatisら、Molecular
Cloning.A Laboratory Manual.Cold Spring
Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，
NY（1982）］を用いて、23S rRNA遺伝子を含む
制限フラグメントを大腸菌と枯草菌（Bacillus
subtilis）からM13mp18とM13mp19］
NorrananderらのGene 26：101（1983）］へクロ
ーン化することによりDNAプローブを製造した。
制限エンドヌクレアーゼXbaI及びSmaIで消化す
ることにより、pN01301［Jinks−Robertsonらの
Cell33：865（1983）］から大腸菌23S rRNA遺伝
子を含む3.2キロベースのDNAフラグメントを得
た。得られたフラグメントを予めXbaI及びSmaI
で消化されたM13ベクターにクローン化した。制
限エンドヌクレアーゼBamHI及びSmaIで消化す
ることにより、p14B1［StewartらのGene19：153
（1982）］から３分の２の枯草菌23S rRNA遺伝
子を含む1.0キロベースのDNAフラグメントを得
た。得られたフラグメントをM35mp18の同一の
制限部位にクローン化した。
ポリエチレングリコール沈殿によつて、感染し
た培養の上澄み液からバクテリオフアージの粒子
を回収し［ヤマモト（Yamamoto）及びAlberts
のVirology40：734（1960）］、一本鎖ビリオン
DNAをフエノール抽出によつて精製した後、上
記のようなアルカリ処理を行なつた。精製された
DNAをEDTA1mMを含むPH6.5の10mMトリ
ス・HCl中で保存した。
変性ナイロンビーズへのプローブDNAの固定化 MorrisらのBiochem.J.147：593（1975）に記載
されている方法を修正した方法を用いて、第一級
アミン基をナイロンビーズ（米国、イリノイ州、
シカゴのPrecision Plastic Ball社製）上に導入
した。その方法はナイロンポリマーとテトラフル
オロ硼酸トリメチルオキソニウムとの、及びその
後の１，６−ヘキサンジアミンとの反応を包含す
る。変性ビーズは、ポリマー内にアミジン基に結
合した第一級アミンを含有する。
直径4.8mmのナイロンビーズ100個を変性させる
方法は次の通りである。真空下80℃でベークして
ビーズを完全に乾燥させた。それらを無水塩化メ
チレン30mlとともに125mlのフラスコに入れ、テ
トラフルオロ硼酸トリメチルオキソニウムを加え
た。溶媒上に浮遊したビーズを激しく攪拌した。
その攪拌はまた、溶媒に部分的にしか溶解しない
テトラフルオロ硼酸トリメチルオキソニウムの溶
解も容易にした。30分後、ビーズと溶媒をガラス
製漏斗に注ぎ、そこでビーズが捕捉され、溶解し
なかつたテトラフルオロ硼酸トリメチルオキソニ
ウムとともに溶媒を流出させた。ビーズを溶媒で
２度すすぎ、速やかに１，６−ヘキサジアミン
0.36ｇを含む溶媒30ml中に入れた。混合物を４〜
５時間激しく攪拌した。溶媒を上記のように漏斗
で除去し、ビーズを溶媒で一度すすぎ、次に蒸留
水ですすいだ。少なくとも一晩、３度水（各500
ml）を取り換えてビーズを振盪した後、真空下で
乾燥させた（40−50℃）。
アミノアミジンナイロンビーズを丸底フラスコ
に入れ、EDTA1.0ミルモルを含むPH7.4の、最少
量の50リルモルリン酸ナトリウム緩衝液で浸漬せ
しめた。ビーズ１個につき2.0μgのプローブDNA
を加え、混合物を50℃で６〜８時間振盪した。ビ
ーズ１個につき50μgのサケ精子DNAを加え、50
℃での振盪を６〜８時間続けた。
ビーズから液体を除去し、ホルムアミド４部と
10×SSPE6部、0.1％（ｗ／ｖ）ドデシルスルホ
ン酸ナトリウム（SDS）、サケ精子DNA0.1mg／
ml、並びに、ウシアルブミン、ポリビニルピロリ
ドン及びFicoll（米国、ニユージヤージー州、ピ
スキヤタウエイのPharmacia製）各1.0mg／mlか
らなるハイブリツド形成溶液中で55℃で17時間ビ
ーズを振盪した。SSPEは、NaCl0.15Mと
EDTA1mMを含むPH7.8の10mMリン酸ナトリウ
ム緩衝液である。この後、ビーズ１個につき0.5
mlの１×SSPE、0.1％SDSでビーズを２度すすい
だ。
臨床用尿試料の培養 標準の目盛りを定めた接種ループを用いて、５
％ヒツジ血液／MacConkey寒天バイプレート
（biplates）（米国、ニユーヨーク州、グランドア
イランドのGibco Laboratories社製）でトリブ
シンのダイズ寒天上に部分標本を平板培養するこ
とによつて、臨床用尿試料中の生存しうる微生物
の定量を行なつた。平板培地を37℃で18時間から
24時間インキユベートした。
ハイブリツド形成測定法 尿中のバクテリアからのrRNAのハイブリツド
形成のために、尿の部分標本0.5mlを遠心分離し、
ペレツトを、EDTA1mM、１mlにつき200μgの
リソチーム及び１mlにつき25μgのリソスタフイ
ン（lysostaphin）を含むPH8.0の50mMトリス−
HCl緩衝液33μ中に懸濁させた。混合物を37℃
で10分間インキユベートし、次に、ハイブリツド
形成溶液（この溶液の成分は上記の濃度の1.28倍
であつた）117μとアミノアミジンナイロンビ
ーズを固定化されたプローブとともに加えた。精
製されたrRNAを使用した実験では、１×ハイブ
リツド形成容液150μ中でビーズと配合した。
どちらの場合においても、混合物を55℃で、別の
時間が示指されていない限り一晩振盪した。次
に、ビーズを室温で２度、55℃で30分、さらに室
温で１度、１×SSPEと0.1％SDS各0.5mlで洗浄
した。ビーズ上に形成されたハイブリツドを、以
下に述べるイムノアツセイ法のうちの１つにより
測定した。
DNA：RNAハイブリツドに関して測定される
ビーズを、１mlあたり５mgのBSA、
MgCl25.0mM、及びβ−ガラクトシダーゼ−抗
DNA：RNA複合体100ngを含む0.5％（ｖ／ｖ）
Tween20（PBMT）を含むPH7.4の50mMリン酸
ナトリウム緩衝液150μとともに60分間振盪し
た。次に、溶液を除去し、0.5MNaClを含む
PBMT各0.5mlでビーズを３度洗浄した。各ビー
ズを、MgCl25mM及びｏ−ニトロフエニル−β
−Ｄガラクトピラノシド3mMを含むPH7.4の
50mMリン酸ナトリウム緩衝液とともに37℃で30
分間インキユベートすることにより、β−ガラク
トシダーゼの活性を測定した。0.1M Na2Co31.8
mlを加えて酵素反応を停止した。405nmでの吸収
を記録した。
イムノアツセイによりハイブリツド形成の経時
試験を行ない、生成されたDNA：RNAハイブリ
ツドの量を測定した。固定化されたプローブ
DNAを有するビーズを、ハイブリツド形成溶液
中でビーズ１個につき1.0ngの23SrRNAとともに
55℃でインキユベートした。指示された時間にビ
ーズを取り除き洗浄した。DNA：RNAハイブリ
ツド、及び、アルカリホスフアターゼに結合した
抗マウスIgGに対するモノクローナル抗体を用い
て、生成されたDNA：RNAハイブリツドの量を
測定した。その結果、ハイブリツド形成は15〜20
時間で完了したことが示された。
ハイブリツド形成によるバクテリアの検出 種々の濃度の大腸菌細胞の溶解産物を、プロー
ブDNAを含むビーズで、ハイブリツド化すると、
イムノアツセイの応答は溶解産物の添加量ととも
に線状に増加した。rRNA配列は細菌種間で逆に
なるが、グラム陰性バクテリアとグラム陽性バク
テリアに対して同様に感受性を与えるためには、
大腸菌と枯草菌の両方から誘導されたrRNAプロ
ーブを組み合わせて使用しなければならないこと
が判明した。尿路感染に通常認められる種々のバ
クテリアの培養物を平板培養して細胞数を測定
し、ハイブリツド形成の測定において溶解産物の
一部を取りその試験を行なつた。下記の表中の結
果は、該測定が同様の感受性を有する全種を検出
したことを示している。
23S rRNAのハイブリツド形成による種々
のバクテリア検出に関する感受性 吸収バクテリア （405nm） 大腸菌 0.443 プロテウスミラビリス 0.315 緑膿菌 0.466 肺炎杆菌 0.499 モルガネラモルガニイ 0.287 エンテロバクタークロアカエ 0.436 黄色ブドウ球菌 0.497 表皮ブドウ球菌 0.458 腸球菌sp. 0.436 各種の溶解産物を固定化されたDNAプローブ
で、5000細胞当量でハイブリツド化し、β−ガラ
クトシダーゼー抗DNA：RNA複合体を用いてイ
ムノアツセイの応答を測定した。
上に示した結果は、固定化されたDNAプロー
ブによる、試料23SrRNAのハイブリツド形成に
より比較的少数のバクテリアが検出されうるこ
と、したがつて細菌尿検出方法の予備評価を試み
なかつたことを示している。54の臨床用尿をすべ
てハイブリツド形成により、また、感染の表示と
して１mlにつき104のコロニー形成単位を用い
た標準培養方法により調べた。培養と比較する
と、ハイブリツド形成では、偽陰性結果は１例
（1.9％）、偽陽性結果は５例（9.3％）であつた。
以上が本発明の詳細な説明及び実施例である。
明らかに、本発明の精神及び範囲から逸脱しない
限り、多くのその他の修正及び変形を行なうこと
が可能である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 抗体試薬と酵素とが、メルカプト（スルフヒ
    ドリル）基で共有結合したビス−マレイミドポリ
    アルキレングリコール架橋基を介して、共有連結
    した酵素標識抗体試薬であつて、該抗体試薬が
    IgGあるいはそのFab又はFab′フラグメントであ
    り、及び該連結が式 （式中、(S)はそれぞれ、架橋基が共有連結してい
    る抗体試薬及び酵素におけるメルカプト基を表わ
    し、ｎは２から６の整数であり、ｘは２から12の
    整数である） である水溶性酵素標識抗体試薬。 ２ ｎが２である特許請求の範囲第１項記載の標
    識試薬。 ３ ｘが５である特許請求の範囲第２項記載の標
    識試薬。 ４ 酵素がβ−ガラクトシダーゼである特許請求
    の範囲第１項記載の標識試薬。 ５ 架橋基が連結している該メルカプト基が、抗
    体試薬及び酵素本来の基である特許請求の範囲第
    １項記載の標識試薬。 ６ 架橋基が連結している一方の又は両方の該メ
    ルカプト基が、抗体試薬および酵素の一方又は両
    方に合成的に導入された基である特許請求の範囲
    第１項記載の標識試薬。 ７ 抗体試薬と酵素とが、メルカプト基で共有結
    合したビス−マレイミドポリアルキレングリコー
    ル架橋基を介して共有連結した酵素標識抗体試薬
    であつて、該抗体試薬がIgGあるいはそのFab又
    はFab′フラグメントであり、及び該連結が式 （式中、(S)はそれぞれ、架橋基が共有連結してい
    る抗体試薬及び酵素におけるメルカプト基を表わ
    し、ｎは２から６の整数であり、ｘは２から12の
    整数である） である水溶性酵素標識抗体試薬を用いて、イムノ
    アツセイにより抗体試薬に結合しうる抗原又はハ
    プテンを検出する方法。
JP62180216A 1986-07-24 1987-07-21 ポリアルキレングリコール架橋基を有する酵素標識抗体試薬 Granted JPS6345561A (ja)

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