JP3150158B2 - オリゴヌクレオチドプローブ標識用の予備活性化したタンパク - Google Patents
オリゴヌクレオチドプローブ標識用の予備活性化したタンパクInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、安定な予め活性化され
たタンパク誘導体、及びタンパク−ポリヌクレオチド及
びタンパク−タンパク結合体の調製におけるその使用に
関する。かかる結合体は分析及び診断方法において有用
であり、タンパク−ポリヌクレオチド結合体は、例えば
診断方法や遺伝子特性化方法において、交雑プローブと
して殊に有用である。
たタンパク誘導体、及びタンパク−ポリヌクレオチド及
びタンパク−タンパク結合体の調製におけるその使用に
関する。かかる結合体は分析及び診断方法において有用
であり、タンパク−ポリヌクレオチド結合体は、例えば
診断方法や遺伝子特性化方法において、交雑プローブと
して殊に有用である。
【０００２】
【従来の技術】核酸配列の検出は、従来、例えば３２Ｐ
または３５Ｓで予め放射標識された相補的核酸配列の交
雑によりなされた。安全性及び便宜性のために、これら
の標識を、酵素、発蛍光団及び発化学発光団のような非
アイソトープ標識で置き換えようとする努力がなされて
きた。
または３５Ｓで予め放射標識された相補的核酸配列の交
雑によりなされた。安全性及び便宜性のために、これら
の標識を、酵素、発蛍光団及び発化学発光団のような非
アイソトープ標識で置き換えようとする努力がなされて
きた。
【０００３】欧州特許明細書第０２０７７５８Ａ号は、
単一のヌクレオチドのみのような小さな差異でヌクレオ
チド配列同志の間を区別するための交雑プローブとして
有用であるオリゴヌクレオチド−酵素結合体を開示して
いる。かかるアプローチは、最も有用であることが証さ
れてきており、また広く採用されてきている（例えば、
Ｊ．Ｃ．エドマン等Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
１９８８，１６，６２３５及びＪ．Ｊ．オプランディ等
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８８，２６
９２）。それ以降、核酸とタンパク標識またはマーカ
ー部分との間の共有結合を達成するための種々の方法が
提案されている。これを達成するのに殊に好都合な方法
は、チオール官能端部を有する結合部分を有するオリゴ
ヌクレオチドを使用することによるものである。チオー
ル官能基は、チオール官能に対して予め活性化された酵
素と反応させ、これによってタンパクとオリゴヌクレオ
チドとの直接的な共有結合が達成される。このアプロー
チは、Ｐ．リ等のＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１
９８７，１５，５２７５や上述の我々の欧州特許出願に
説明されている。
単一のヌクレオチドのみのような小さな差異でヌクレオ
チド配列同志の間を区別するための交雑プローブとして
有用であるオリゴヌクレオチド−酵素結合体を開示して
いる。かかるアプローチは、最も有用であることが証さ
れてきており、また広く採用されてきている（例えば、
Ｊ．Ｃ．エドマン等Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
１９８８，１６，６２３５及びＪ．Ｊ．オプランディ等
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８８，２６
９２）。それ以降、核酸とタンパク標識またはマーカ
ー部分との間の共有結合を達成するための種々の方法が
提案されている。これを達成するのに殊に好都合な方法
は、チオール官能端部を有する結合部分を有するオリゴ
ヌクレオチドを使用することによるものである。チオー
ル官能基は、チオール官能に対して予め活性化された酵
素と反応させ、これによってタンパクとオリゴヌクレオ
チドとの直接的な共有結合が達成される。このアプロー
チは、Ｐ．リ等のＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１
９８７，１５，５２７５や上述の我々の欧州特許出願に
説明されている。
【０００４】上記の方法は、核酸とタンパクとの共有結
合のための他のすべての方法と同様に、ある種の反応工
程を包含することは了解されよう。このような反応工程
は、再現性のあるベースで合理的な量の結合体を調製す
るためには、関連化学の理解を必要とする。
合のための他のすべての方法と同様に、ある種の反応工
程を包含することは了解されよう。このような反応工程
は、再現性のあるベースで合理的な量の結合体を調製す
るためには、関連化学の理解を必要とする。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、比較的熟練し
ていない使用者によっても実施することができ、そして
できるだけ少ない機器及び特殊技能を必要とするにすぎ
ない結合に関する改善された試薬及び方法に対する要求
がある。
ていない使用者によっても実施することができ、そして
できるだけ少ない機器及び特殊技能を必要とするにすぎ
ない結合に関する改善された試薬及び方法に対する要求
がある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の第１の態様によ
れば、チオール化ポリヌクレオチドのチオール基または
チオール含有タンパクのチオール基へ共有結合カップリ
ングするために予め活性化された安定なタンパク試薬が
提供される。
れば、チオール化ポリヌクレオチドのチオール基または
チオール含有タンパクのチオール基へ共有結合カップリ
ングするために予め活性化された安定なタンパク試薬が
提供される。
【０００７】ここに「安定な」という表現は、本発明の
試薬が許容しうる貯蔵寿命を有すること（例えばキット
に含まれたときに少なくとも１月、好適には少なくとも
３月、６月あるいは９月、そして好ましくは１２月の貯
蔵寿命を示すこと）を意味するものとする。上記の期間
は周囲温度、例えば室温での貯蔵に関するものである
が、もし希望ならば、それより低い温度例えば１０℃以
下（例えば４〜６℃あるいは−１５〜−２５℃）を使用
できる。試薬の所安定性は、例えば加水分解、重合また
はその他の副反応による分解あるいは劣化が試薬の有用
性を損なう程度まで進行しないような程度のものである
ことは、了解されよう。（例えば中間使用のために）共
有結合カップリングのための活性化タンパクをその場で
調製することは、従来上記の問題を回避するのに必要で
あると考えられてきた。
試薬が許容しうる貯蔵寿命を有すること（例えばキット
に含まれたときに少なくとも１月、好適には少なくとも
３月、６月あるいは９月、そして好ましくは１２月の貯
蔵寿命を示すこと）を意味するものとする。上記の期間
は周囲温度、例えば室温での貯蔵に関するものである
が、もし希望ならば、それより低い温度例えば１０℃以
下（例えば４〜６℃あるいは−１５〜−２５℃）を使用
できる。試薬の所安定性は、例えば加水分解、重合また
はその他の副反応による分解あるいは劣化が試薬の有用
性を損なう程度まで進行しないような程度のものである
ことは、了解されよう。（例えば中間使用のために）共
有結合カップリングのための活性化タンパクをその場で
調製することは、従来上記の問題を回避するのに必要で
あると考えられてきた。
【０００８】ここに「予め活性化された」（あるいは予
備活性化）なる表現は、タンパクがチオール化ポリヌク
レオチドのチオール基またはチオール含有タンパクのチ
オール基へ共有結合カップリングするために化学的に変
性されたことを意味するものとする。化学的変性は、架
橋剤、好ましくはタンパク官能性基（例えばタンパクア
ミノ基）と反応しうる基及びチオール基と反応しうる別
の基の両方を有するヘテロ二官能性架橋剤、を用いて都
合よく実施される。後者はハロアセチル、ハロアセトア
ミジル、マレイミド、活性化ジスルフィド、チオール類
（酸化性条件下）及び重金属誘導体（例：水銀誘導体）
から都合よく選択される。チオール基と反応しうる好ま
しい基は、マレイミド基である。そのような基は、好都
合には、例えば１２個まで、１０個まで、８個まで、６
個まであるいは４個までの炭素原子、そして好適には６
個までの炭素原子を含む飽和もしくは不飽和炭化水素骨
格（これは随意に置換されていてよい）により結合され
ている。随意置換基の例としてはヒドロキシル基があ
る。そのような選定置換基が結合（架橋結合）反応を妨
害してはならないことは了解されよう。
備活性化）なる表現は、タンパクがチオール化ポリヌク
レオチドのチオール基またはチオール含有タンパクのチ
オール基へ共有結合カップリングするために化学的に変
性されたことを意味するものとする。化学的変性は、架
橋剤、好ましくはタンパク官能性基（例えばタンパクア
ミノ基）と反応しうる基及びチオール基と反応しうる別
の基の両方を有するヘテロ二官能性架橋剤、を用いて都
合よく実施される。後者はハロアセチル、ハロアセトア
ミジル、マレイミド、活性化ジスルフィド、チオール類
（酸化性条件下）及び重金属誘導体（例：水銀誘導体）
から都合よく選択される。チオール基と反応しうる好ま
しい基は、マレイミド基である。そのような基は、好都
合には、例えば１２個まで、１０個まで、８個まで、６
個まであるいは４個までの炭素原子、そして好適には６
個までの炭素原子を含む飽和もしくは不飽和炭化水素骨
格（これは随意に置換されていてよい）により結合され
ている。随意置換基の例としてはヒドロキシル基があ
る。そのような選定置換基が結合（架橋結合）反応を妨
害してはならないことは了解されよう。
【０００９】そのような架橋剤のいくつかは文献に記載
されている。その例としては、ピアース（Ｐｉｅｒｃ
ｅ）ケミカル社によって刊行された「ピアース・カタロ
グ」に記載されているものがある。好適な例としては下
記のものがある：
されている。その例としては、ピアース（Ｐｉｅｒｃ
ｅ）ケミカル社によって刊行された「ピアース・カタロ
グ」に記載されているものがある。好適な例としては下
記のものがある：
【００１０】 Ｒ1 ＝Ｈ（ＳＭＣＣ） 文献：Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ等，
１９７９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，３
９５−３９９ Ｒ1 ＝ＳＯ3 Ｎａ 文献：Ｈａｓｈｉｄａ等，１９８
４，Ｊ．ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｍ．，６，５６−
６３
１９７９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，３
９５−３９９ Ｒ1 ＝ＳＯ3 Ｎａ 文献：Ｈａｓｈｉｄａ等，１９８
４，Ｊ．ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｍ．，６，５６−
６３
【００１１】 Ｒ2 ＝Ｈ（ＭＢＳ） 文献：Ｋｉｔａｇａｗａ Ｔ及び
Ａｉｋａｗａ Ｔ，１９７６，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
７９，２３３−２３６ Ｒ2 ＝ＳＯ3 Ｎａ 文献：ピアース社のカタログ
Ａｉｋａｗａ Ｔ，１９７６，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
７９，２３３−２３６ Ｒ2 ＝ＳＯ3 Ｎａ 文献：ピアース社のカタログ
【００１２】 Ｒ3 ＝Ｈ 文献：Ｍａｒｔｉｎ Ｆ．Ｊ．及びＰａｐａ
ｈａｄｊｏｐｏｌｏｕｓ Ｄ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ，２５７，２８６−２８８ Ｒ3 ＝ＳＯ3 Ｎａ 文献：Ｂａｎｇｓ Ｊ．Ｄ．等，１
９８６，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０３，２５５−
２６３
ｈａｄｊｏｐｏｌｏｕｓ Ｄ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ，２５７，２８６−２８８ Ｒ3 ＝ＳＯ3 Ｎａ 文献：Ｂａｎｇｓ Ｊ．Ｄ．等，１
９８６，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０３，２５５−
２６３
【００１３】 Ｒ4 ＝Ｈ（ＳＩＡＢ），ＳＯ3 Ｎａ 文献：Ｗｅｌｔｍ
ａｎ Ｊ．Ｋ，１９８３，Ｂｉｏ ＳＯ3 Ｎａ Ｔａｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ，１，１４８−１５２
ａｎ Ｊ．Ｋ，１９８３，Ｂｉｏ ＳＯ3 Ｎａ Ｔａｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ，１，１４８−１５２
【００１４】 （ＳＰＤＰ） 文献：Ｃａｒｌｓｏｎ Ｊ．等，１９７
８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３，７２３−７３７
８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３，７２３−７３７
【００１５】特に好適な架橋剤は、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ
等によりＥｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｓｔｉｒｙ，（１９７９），１０１，３９５
−３９９において記載され、製造された如き、スクシン
イミジル４−（マレイミドメチル）クロロヘキサン−１
−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）架橋剤である。
等によりＥｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｓｔｉｒｙ，（１９７９），１０１，３９５
−３９９において記載され、製造された如き、スクシン
イミジル４−（マレイミドメチル）クロロヘキサン−１
−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）架橋剤である。
【００１６】タンパク試薬は、抗体、酵素または、特異
結合性物質（例えば、アビディン、ストレスタビディン
もしくは抗体）であるのが好適である。タンパク試薬は
酵素であるのが好適である。酵素の例としては、アルカ
リ性ホスファターゼ；ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）のようなペルオキシダーゼ；ベータガラクトシダー
ゼ；キサンチンオキシダーゼ；ホタルまたは細菌ルシフ
ェラーゼ等がある。好ましい酵素は、適切である場合に
は、熱安定性形態にあるのが好ましい。合成タンパクも
包含される。
結合性物質（例えば、アビディン、ストレスタビディン
もしくは抗体）であるのが好適である。タンパク試薬は
酵素であるのが好適である。酵素の例としては、アルカ
リ性ホスファターゼ；ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）のようなペルオキシダーゼ；ベータガラクトシダー
ゼ；キサンチンオキシダーゼ；ホタルまたは細菌ルシフ
ェラーゼ等がある。好ましい酵素は、適切である場合に
は、熱安定性形態にあるのが好ましい。合成タンパクも
包含される。
【００１７】ここに「チオール化ポリヌクレオチド」と
は、１個またはそれ以上のペンダント状チオール基を与
えるように予め誘導されたオリゴヌクレオチドのような
ポリヌクレオチドを意味するものとする。ポリヌクレオ
チドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその他の類似体（アナロ
ーグ）のような任意の核酸であってよく、それは単一ま
たは二本鎖の形態であってよく、そしてそれは天然物で
あっても、合成物であってもよい。殊に、ポリヌクレオ
チドは合成単一鎖オリゴヌクレオチドであってよい。チ
オール基はポリヌクレオチド中へ化学的な経路または酵
素的な経路により導入できる。オリゴヌクレオチドにつ
いては、化学的方法が好適である。チオール基導入のた
めのいくつかの方法が、例えばＰ．リー等，Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１９８７，１５，５２７５及び
我々の欧州特許出願２０７７５８号明細書において公知
である。チオール基は、一般に１つまたはそれ以上の中
間（スペーサー）アームを介してオリゴヌクレオチドに
結合されている。そのような中間アームは、一般に、オ
リゴヌクレオチドに架橋剤を結合するのに用いられた方
法の結果として生じる部分（例えばカルボニルまたはホ
スホリール）を介して通常オリゴヌクレオチドに結合さ
れた２〜６個の炭素原子の直鎖炭化水素からなる。我々
は、
は、１個またはそれ以上のペンダント状チオール基を与
えるように予め誘導されたオリゴヌクレオチドのような
ポリヌクレオチドを意味するものとする。ポリヌクレオ
チドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその他の類似体（アナロ
ーグ）のような任意の核酸であってよく、それは単一ま
たは二本鎖の形態であってよく、そしてそれは天然物で
あっても、合成物であってもよい。殊に、ポリヌクレオ
チドは合成単一鎖オリゴヌクレオチドであってよい。チ
オール基はポリヌクレオチド中へ化学的な経路または酵
素的な経路により導入できる。オリゴヌクレオチドにつ
いては、化学的方法が好適である。チオール基導入のた
めのいくつかの方法が、例えばＰ．リー等，Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１９８７，１５，５２７５及び
我々の欧州特許出願２０７７５８号明細書において公知
である。チオール基は、一般に１つまたはそれ以上の中
間（スペーサー）アームを介してオリゴヌクレオチドに
結合されている。そのような中間アームは、一般に、オ
リゴヌクレオチドに架橋剤を結合するのに用いられた方
法の結果として生じる部分（例えばカルボニルまたはホ
スホリール）を介して通常オリゴヌクレオチドに結合さ
れた２〜６個の炭素原子の直鎖炭化水素からなる。我々
は、
【００１８】 及び のような５′−アミノアルキル誘導オリゴヌクレオチド
を最初に合成し（ここに「ｏｌｉｇｏ」はオリゴヌクレ
オチドを意味する。）、次いでチオール化試薬と反応さ
せることにより、好適かつ有利な架橋剤が構成されるこ
とを発見した。
を最初に合成し（ここに「ｏｌｉｇｏ」はオリゴヌクレ
オチドを意味する。）、次いでチオール化試薬と反応さ
せることにより、好適かつ有利な架橋剤が構成されるこ
とを発見した。
【００１９】チオール化試薬としては、（殊に）２−イ
ミノチオラン及びホモシステインチオラクトンがある。
２−イミノチオラン（典型的には塩酸塩、すなわちトラ
ウト試薬の形で用いられる）： ホモシステインチオラクトン： 〔あるいはそのＮ−アセチル化誘導体〕
ミノチオラン及びホモシステインチオラクトンがある。
２−イミノチオラン（典型的には塩酸塩、すなわちトラ
ウト試薬の形で用いられる）： ホモシステインチオラクトン： 〔あるいはそのＮ−アセチル化誘導体〕
【００２０】上記の反応で下記のようなチオール化オリ
ゴヌクレオチドが得られる。 （ここにｎは例えば６または２であり、そして「ｏｌｉ
ｇｏ」はオリゴヌクレオチドを意味する）。
ゴヌクレオチドが得られる。 （ここにｎは例えば６または２であり、そして「ｏｌｉ
ｇｏ」はオリゴヌクレオチドを意味する）。
【００２１】ここに「チオール含有タンパク」とは、１
個またはそれ以上の元々存在するチオール基；あるい
は、例えば元々存在したジスルファイド基の還元によ
り、または上記の「一段階」試薬のようなチオール化剤
あるいは「二段階」試薬のようなチオール化剤との反応
により、導入されたチオール基；を含む任意のタンパク
質物質を意味するものとする。
個またはそれ以上の元々存在するチオール基；あるい
は、例えば元々存在したジスルファイド基の還元によ
り、または上記の「一段階」試薬のようなチオール化剤
あるいは「二段階」試薬のようなチオール化剤との反応
により、導入されたチオール基；を含む任意のタンパク
質物質を意味するものとする。
【００２２】安定なタンパク試薬は凍結乾燥された形態
で与えられるのが好ましい。我々は予想外にも、マレイ
ミドまたはヨードアセトアミジル官能基のようなチオー
ル反応性部分をもつように変性されたタンパクが凍結乾
燥されうること、そして得られる予備活性化試薬が安定
でありかつ可成りの時間後に核酸結合体の共有結合合成
のために使用できることを発見した。
で与えられるのが好ましい。我々は予想外にも、マレイ
ミドまたはヨードアセトアミジル官能基のようなチオー
ル反応性部分をもつように変性されたタンパクが凍結乾
燥されうること、そして得られる予備活性化試薬が安定
でありかつ可成りの時間後に核酸結合体の共有結合合成
のために使用できることを発見した。
【００２３】従って本発明の別の態様によれば、チオー
ル化ポリヌクレオチドのチオール基またはチオール含有
タンパクのチオール基に共有結合カップリングするため
に予め活性化された安定な凍結乾燥タンパク試薬が提供
される。
ル化ポリヌクレオチドのチオール基またはチオール含有
タンパクのチオール基に共有結合カップリングするため
に予め活性化された安定な凍結乾燥タンパク試薬が提供
される。
【００２４】凍結乾燥は、一般に、関係あるタンパクの
活性、ならびにチオール反応性官能基の反応性を維持し
うる溶液から実施される。そのような溶液は、炭水化
物、殊にマンニトール、ラクトースまたはトレハロース
のような糖類、あるいは重炭酸アンモニウム、もしくは
有機酸あるいは塩基の塩のような揮発性塩、を含んでい
てもよい。我々は、凍結乾燥用溶液においてラクトース
を（特に約１％の濃度で）用いて殊に良好な結果を得て
いる。その溶液は望ましくは６〜８、殊に７．２〜７．
８の範囲、特に約７．４のｐＨ値に緩衝される。ＳＭＣ
Ｃ誘導（変性）アルカリ性ホスファターゼに関して、ラ
クトースは好ましい糖であり、そして好ましい凍結乾燥
緩衝剤は１％のラクトース、５ｍＭのＮａＨ2 ＰＯ4 ／
Ｎａ2 ＨＰＯ4 （ｐＨ７．４）である。求核性緩衝成分
は、これらが、予備活性化タンパク試薬、特にチオール
反応性基に対して反応性である場合には、避けるのが好
ましい。不揮発性塩は許容されることもあるが、それら
は、例えば１０ｍＭ以下のような低濃度であるべきであ
る。チオール反応性官能基が加水分解を受け易い予備活
性化タンパクの場合には、凍結乾燥その誘導体の調製直
後に実施されるべきである。タンパクを安定化すること
が公知であるか判明しているその他の成分も包含されう
る。
活性、ならびにチオール反応性官能基の反応性を維持し
うる溶液から実施される。そのような溶液は、炭水化
物、殊にマンニトール、ラクトースまたはトレハロース
のような糖類、あるいは重炭酸アンモニウム、もしくは
有機酸あるいは塩基の塩のような揮発性塩、を含んでい
てもよい。我々は、凍結乾燥用溶液においてラクトース
を（特に約１％の濃度で）用いて殊に良好な結果を得て
いる。その溶液は望ましくは６〜８、殊に７．２〜７．
８の範囲、特に約７．４のｐＨ値に緩衝される。ＳＭＣ
Ｃ誘導（変性）アルカリ性ホスファターゼに関して、ラ
クトースは好ましい糖であり、そして好ましい凍結乾燥
緩衝剤は１％のラクトース、５ｍＭのＮａＨ2 ＰＯ4 ／
Ｎａ2 ＨＰＯ4 （ｐＨ７．４）である。求核性緩衝成分
は、これらが、予備活性化タンパク試薬、特にチオール
反応性基に対して反応性である場合には、避けるのが好
ましい。不揮発性塩は許容されることもあるが、それら
は、例えば１０ｍＭ以下のような低濃度であるべきであ
る。チオール反応性官能基が加水分解を受け易い予備活
性化タンパクの場合には、凍結乾燥その誘導体の調製直
後に実施されるべきである。タンパクを安定化すること
が公知であるか判明しているその他の成分も包含されう
る。
【００２５】タンパクを化学的に変性するのに使用され
る架橋剤は、低度かつ制御された程度の置換をなすよう
に制御された量で存在するのが好ましい。好ましくは、
置換の程度は、タンパクの１モル当り３モル以下、さら
に好ましくは１〜２モル、例えば１．４／１．６モルで
ある。このように低度かつ制御された程度の置換は、安
定な活性化タンパク試薬を与え、そして１：１結合体が
高含量である結合体混合物を与える。
る架橋剤は、低度かつ制御された程度の置換をなすよう
に制御された量で存在するのが好ましい。好ましくは、
置換の程度は、タンパクの１モル当り３モル以下、さら
に好ましくは１〜２モル、例えば１．４／１．６モルで
ある。このように低度かつ制御された程度の置換は、安
定な活性化タンパク試薬を与え、そして１：１結合体が
高含量である結合体混合物を与える。
【００２６】置換の程度は、架橋剤の濃度の実験的最適
化手段によって最も良好に制御されるが、温度、ｐＨ及
び反応時間のようなその他の因子によっても制御されう
る。置換の程度の測定のための適当な検定法は当業者で
あれば容易に案出できる。例えば、変性処理済タンパク
の試料を過剰の既知濃度チオール化合物と反応させ、そ
の反応後に残留するチオール化合物の量を測定する検定
（分析）法を考案することができよう。
化手段によって最も良好に制御されるが、温度、ｐＨ及
び反応時間のようなその他の因子によっても制御されう
る。置換の程度の測定のための適当な検定法は当業者で
あれば容易に案出できる。例えば、変性処理済タンパク
の試料を過剰の既知濃度チオール化合物と反応させ、そ
の反応後に残留するチオール化合物の量を測定する検定
（分析）法を考案することができよう。
【００２７】本発明の好ましい安定なタンパク試薬は、
ＳＭＣＣ（前述）架橋剤によって誘導（変性）されたア
ルカリ性ホスファターゼからなる。このものは、好まし
くは１％のラクトース及び５ｍＭのＮａＨ2 ＰＯ4 ／Ｎ
ａ2 ＨＰＯ4 を含む溶液（ｐＨ７．４）から凍結乾燥さ
れたものである。
ＳＭＣＣ（前述）架橋剤によって誘導（変性）されたア
ルカリ性ホスファターゼからなる。このものは、好まし
くは１％のラクトース及び５ｍＭのＮａＨ2 ＰＯ4 ／Ｎ
ａ2 ＨＰＯ4 を含む溶液（ｐＨ７．４）から凍結乾燥さ
れたものである。
【００２８】ポリヌクレオチドの長さは、当該ポリヌク
レオチド信号発生結合体が使用されるべき目的によって
左右され決定される。これが交雑プローブとして使用さ
れる場合、好適なオリゴヌクレオチドの長さは、１〜５
０個のように５０個以下、２０〜４０個のように４０個
以下、そして１０〜２０個のように２０個以下のヌクレ
オチド単位である。核酸はＤＮＡもしくはＲＮＡあるい
はそれらの同族体ないし類似体であるのが好適であり、
例えばＤＮＡは一本鎖または二本鎖の形で存在していて
よい。好適には、交雑のために意図されている核酸配列
の少なくとも一部分は一本鎖の形であろう。好ましく
は、核酸はすべて一本（単一）鎖の形で存在する。好適
には、ポリヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ配列は、合
成反応により調製して、チオール含有基を結合可能にす
る。そのような合成のための方法及び装置は、例えば
Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編 ＩＲＬプレス社（１９８４年オッ
クスフォード）の「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐ
ｒｏａｃｈ」及びその他の上記引用文献に記載されてい
るような公知方法を用いている分子生物学者や通常の熟
練度の化学者にとっては明らかであろう。
レオチド信号発生結合体が使用されるべき目的によって
左右され決定される。これが交雑プローブとして使用さ
れる場合、好適なオリゴヌクレオチドの長さは、１〜５
０個のように５０個以下、２０〜４０個のように４０個
以下、そして１０〜２０個のように２０個以下のヌクレ
オチド単位である。核酸はＤＮＡもしくはＲＮＡあるい
はそれらの同族体ないし類似体であるのが好適であり、
例えばＤＮＡは一本鎖または二本鎖の形で存在していて
よい。好適には、交雑のために意図されている核酸配列
の少なくとも一部分は一本鎖の形であろう。好ましく
は、核酸はすべて一本（単一）鎖の形で存在する。好適
には、ポリヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ配列は、合
成反応により調製して、チオール含有基を結合可能にす
る。そのような合成のための方法及び装置は、例えば
Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編 ＩＲＬプレス社（１９８４年オッ
クスフォード）の「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐ
ｒｏａｃｈ」及びその他の上記引用文献に記載されてい
るような公知方法を用いている分子生物学者や通常の熟
練度の化学者にとっては明らかであろう。
【００２９】安定タンパク試薬をタンパク−タンパク結
合体の調製に用いる場合、殊に有用な別のタンパクは、
好適には免疫学的検定、殊に酵素免疫学的検定、ウエス
ターン法、組織化学及びその他の免疫化学技法におい
て、使用するための抗体またはその断片である。
合体の調製に用いる場合、殊に有用な別のタンパクは、
好適には免疫学的検定、殊に酵素免疫学的検定、ウエス
ターン法、組織化学及びその他の免疫化学技法におい
て、使用するための抗体またはその断片である。
【００３０】本発明のさらに別の態様によれば、結合体
を調製するために安定予備活性タンパク試薬を使用でき
るようにするキットが提供される。そのようなキット
は、安定予備活性化タンパク試薬と使用指針（説明書）
そして場合により長期保存のための乾燥剤からなろう。
を調製するために安定予備活性タンパク試薬を使用でき
るようにするキットが提供される。そのようなキット
は、安定予備活性化タンパク試薬と使用指針（説明書）
そして場合により長期保存のための乾燥剤からなろう。
【００３１】好適にはキットは、下記の要素（成分）一
つまたはそれ以上をも含むことがある： １．ある量の固体チオール化剤、例えば２−イミノチオ
ラン、 ２．チオール化剤の生成物から過剰のチオール化剤を除
去するための予備充填されたカラム（好ましくは、この
ものは例えばＰｈａｍａｃｉａ社製、Ｓｅｐｈａｄｅｘ
TM Ｇ２５Ｍを含むゲル濾過カラムであるべきであ
る。）、 ３．２のカラムを平衡化及び／または機能させるための
緩衝剤、 ４．チオール化剤を再構成するための緩衝剤、 ５．結合体の精製のためのさらに別のカラム（好適に
は、このものは、例えばＢｉｐｒａｄ社製Ｂｉｏｇｅｌ
TM Ｐ１００を含む予備充填されたゲル濾過カラムであ
る。） ６．５のカラムを平衡化及び／または機能させるための
緩衝剤、 ７．これらのカラムを装着するための架台、 ８．生成物及び中間体を捕集するためのビン、 ９．結合後に過剰のチオール反応性基を鎮静化するため
の試薬、 １０．長期貯蔵のために結合体を安定化させる添加剤、 １１．操作を実施するための指針ないし説明書。
つまたはそれ以上をも含むことがある： １．ある量の固体チオール化剤、例えば２−イミノチオ
ラン、 ２．チオール化剤の生成物から過剰のチオール化剤を除
去するための予備充填されたカラム（好ましくは、この
ものは例えばＰｈａｍａｃｉａ社製、Ｓｅｐｈａｄｅｘ
TM Ｇ２５Ｍを含むゲル濾過カラムであるべきであ
る。）、 ３．２のカラムを平衡化及び／または機能させるための
緩衝剤、 ４．チオール化剤を再構成するための緩衝剤、 ５．結合体の精製のためのさらに別のカラム（好適に
は、このものは、例えばＢｉｐｒａｄ社製Ｂｉｏｇｅｌ
TM Ｐ１００を含む予備充填されたゲル濾過カラムであ
る。） ６．５のカラムを平衡化及び／または機能させるための
緩衝剤、 ７．これらのカラムを装着するための架台、 ８．生成物及び中間体を捕集するためのビン、 ９．結合後に過剰のチオール反応性基を鎮静化するため
の試薬、 １０．長期貯蔵のために結合体を安定化させる添加剤、 １１．操作を実施するための指針ないし説明書。
【００３２】安定な活性化タンパク試薬は、オリゴヌク
レオチドやその他のタンパク意外のチオール含有または
チオール化成分、例えばその他の核酸種（物質）、オリ
ゴ糖類または多糖類、ペプチド、ハプテン及び薬剤類と
の結合体を形成するように使用できること、ならびに、
本発明の安定な活性化タンパク試薬及びキットは本発明
の試薬に結合される成分によって限定されるものでない
こと、は了解されよう。
レオチドやその他のタンパク意外のチオール含有または
チオール化成分、例えばその他の核酸種（物質）、オリ
ゴ糖類または多糖類、ペプチド、ハプテン及び薬剤類と
の結合体を形成するように使用できること、ならびに、
本発明の安定な活性化タンパク試薬及びキットは本発明
の試薬に結合される成分によって限定されるものでない
こと、は了解されよう。
【００３３】本発明は以下の実施例及び図面により説明
する。略記号 下記の略記号は実施例に適用される。 ＳＭＣＣ：スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート ＳＩＡＢ：Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチ
ル）アミノベンゾエートＴｒｉｓ：トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ分
子生物学品級） ＰＢＳ：０．１３Ｍ ＮａＣｌ，５．４ｍＭ Ｎａ2 Ｈ
ＰＯ4 ，１．６ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 緩衝液 ｐＨ７．３ ＳＳＣ：２０×ＳＳＣは３Ｍ ＮａＣｌ，０．３Ｍクエ
ン酸三ナトリウム ＰＶＰ：ポリビニルピロリドン ＳＤＳ：ナトリウムドデシルサルフェート ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド ＨＲＰ：ワサビペルオキシダーゼ ＴＢＳ：１×ＴＢＳは２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．
１，ＮａＣｌ １５０ｍＭ
する。略記号 下記の略記号は実施例に適用される。 ＳＭＣＣ：スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート ＳＩＡＢ：Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチ
ル）アミノベンゾエートＴｒｉｓ：トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ分
子生物学品級） ＰＢＳ：０．１３Ｍ ＮａＣｌ，５．４ｍＭ Ｎａ2 Ｈ
ＰＯ4 ，１．６ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 緩衝液 ｐＨ７．３ ＳＳＣ：２０×ＳＳＣは３Ｍ ＮａＣｌ，０．３Ｍクエ
ン酸三ナトリウム ＰＶＰ：ポリビニルピロリドン ＳＤＳ：ナトリウムドデシルサルフェート ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド ＨＲＰ：ワサビペルオキシダーゼ ＴＢＳ：１×ＴＢＳは２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．
１，ＮａＣｌ １５０ｍＭ
【００３４】
【実施例１】凍結乾燥マレイミドアルカリ性ホスファターゼの調製 アルカリ性ホスファターゼの溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ，１０ｍｇ／ｍｌ，０．２ｍｌ）に対して、０．１Ｍ
のトリエタノールアミンＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2 、
１ｍＭのＺｎＳＯ4 、ｐＨ７．４（０．６ｍｌ）を加
え、次いで乾燥ＤＭＦ中のＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ製）
（６．７ｍｇ／ｌ）の作りたての溶液１２μｌを加え、
反応混合物を２５℃で３０分間インキュベートした。次
いで生成物をＮＡＰ２５脱塩カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ製）に通して精製した。このカラムはＢＳＡで前処理
し、そして１０ｇ／ｌのＤ−マンニトールを含むリン酸
塩緩衝剤ＰＢＳ中で平衡化させてあった。生成物を１．
６ｍｌ捕集し、その一部を分析のために採取した。タン
パク濃度を２８０ｎｍにおけるＯＤにより検定した（１
ｍｇ／ｍｌの溶液について０．８９の消光定数を使
用）、またマレイミド濃度は下記のように検定した。：
０．１５ｍｌの試料を１ｍＭメルカプトエタノール１０
μｌと３０分間３７℃で反応させ、対照として緩衝液の
み０．１５ｍｌも同様に反応させた。次いで反応混合物
を１．２ｍｌのＰＢＳで稀釈し、分光分析器において４
１２ｎｍで零ポイト合せをし、１ｍＭの５，５′−ジチ
オビス（２−ニトロ安息香酸）２５μｌを添加した。こ
のようにして、１４１５０の消光定数を用いて残留チオ
ール濃度を測定し、試料と対照との間の差異によって、
マレイミド濃度、従って置換度の計算ができた。この値
は、タンパク１モル当り１．４〜１．６モルのマレイミ
ノであることが判明した。このように誘導された酵素を
次いで３ナノモルの部分に分割（少量つづに別けて）、
凍結乾燥した。
ｒ，１０ｍｇ／ｍｌ，０．２ｍｌ）に対して、０．１Ｍ
のトリエタノールアミンＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2 、
１ｍＭのＺｎＳＯ4 、ｐＨ７．４（０．６ｍｌ）を加
え、次いで乾燥ＤＭＦ中のＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ製）
（６．７ｍｇ／ｌ）の作りたての溶液１２μｌを加え、
反応混合物を２５℃で３０分間インキュベートした。次
いで生成物をＮＡＰ２５脱塩カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ製）に通して精製した。このカラムはＢＳＡで前処理
し、そして１０ｇ／ｌのＤ−マンニトールを含むリン酸
塩緩衝剤ＰＢＳ中で平衡化させてあった。生成物を１．
６ｍｌ捕集し、その一部を分析のために採取した。タン
パク濃度を２８０ｎｍにおけるＯＤにより検定した（１
ｍｇ／ｍｌの溶液について０．８９の消光定数を使
用）、またマレイミド濃度は下記のように検定した。：
０．１５ｍｌの試料を１ｍＭメルカプトエタノール１０
μｌと３０分間３７℃で反応させ、対照として緩衝液の
み０．１５ｍｌも同様に反応させた。次いで反応混合物
を１．２ｍｌのＰＢＳで稀釈し、分光分析器において４
１２ｎｍで零ポイト合せをし、１ｍＭの５，５′−ジチ
オビス（２−ニトロ安息香酸）２５μｌを添加した。こ
のようにして、１４１５０の消光定数を用いて残留チオ
ール濃度を測定し、試料と対照との間の差異によって、
マレイミド濃度、従って置換度の計算ができた。この値
は、タンパク１モル当り１．４〜１．６モルのマレイミ
ノであることが判明した。このように誘導された酵素を
次いで３ナノモルの部分に分割（少量つづに別けて）、
凍結乾燥した。
【００３５】
【実施例２】アミノアルキルオリゴヌクレオチドの調製 製造者によって推奨されたプロトコール ＡＬ−ＧＴＧＧＡＴＡＧＧＧＴＧＧＡＴＡＧＧＧＴＧＧ を用いて「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」自
動化ＤＮＡ合成器で公称１．０μモルの規模で以下に示
されるアミノアルキルオリゴヌクレオチドを合成した。
上記のＡｌは下記の結合基を表わす。 この結合基は下記のホスホルアミジトから誘導され、製
造業者によって説明されているように合成中に導入され
る。 脱保護及び蒸発処理の後、試料を１．０ｍｌの水に再溶
解させた。
動化ＤＮＡ合成器で公称１．０μモルの規模で以下に示
されるアミノアルキルオリゴヌクレオチドを合成した。
上記のＡｌは下記の結合基を表わす。 この結合基は下記のホスホルアミジトから誘導され、製
造業者によって説明されているように合成中に導入され
る。 脱保護及び蒸発処理の後、試料を１．０ｍｌの水に再溶
解させた。
【００３６】
【実施例３】オリゴヌクレオチドアルカリ性ホスファラーゼ結合体の
調製 実施例１は本発明の可能なキットの一つ主要な成分を説
明するものである。本実施例は、その成分を所望の結合
体の製造するのに使用することを説明するものである。
その他の成分も必要とされ、それらのうちのいくつかま
たはすべてはキットの部分として提供されうる。０．０
１ｍｌの上記アミノアルキルオリゴヌクレオチドを水で
０．２ｍｌに稀釈した。２−イミノチオラン（５ｍｇ）
を含むびんに、１．０ｍｌの０．２Ｍ重炭酸ナトリウム
緩衝液ｐＨ９．２を加え、この溶液の０．３ｍｌをただ
ちにオリゴヌクレオチド溶液に添加した。この混合物を
３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳで平
衡化されたＮＡＰ２５脱塩カラムに装入した。試料がカ
ラムに吸着された後に、２．２ｍｌの（カラム機能化
用）ランニング緩衝液を加え、溶離液をすてた。この部
分を適用した後に誘導（変性）酵素（実施例１）を含む
びんを、カラムの下に置き、そして１．６ｍｌの緩衝液
をカラムに適用してチオール化オリゴヌクレオチドを溶
離させた。溶離試料を穏かに振とうして酵素を溶解し、
反応を４℃で１６時間進行させた。次いで試料を２分割
した。
調製 実施例１は本発明の可能なキットの一つ主要な成分を説
明するものである。本実施例は、その成分を所望の結合
体の製造するのに使用することを説明するものである。
その他の成分も必要とされ、それらのうちのいくつかま
たはすべてはキットの部分として提供されうる。０．０
１ｍｌの上記アミノアルキルオリゴヌクレオチドを水で
０．２ｍｌに稀釈した。２−イミノチオラン（５ｍｇ）
を含むびんに、１．０ｍｌの０．２Ｍ重炭酸ナトリウム
緩衝液ｐＨ９．２を加え、この溶液の０．３ｍｌをただ
ちにオリゴヌクレオチド溶液に添加した。この混合物を
３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳで平
衡化されたＮＡＰ２５脱塩カラムに装入した。試料がカ
ラムに吸着された後に、２．２ｍｌの（カラム機能化
用）ランニング緩衝液を加え、溶離液をすてた。この部
分を適用した後に誘導（変性）酵素（実施例１）を含む
びんを、カラムの下に置き、そして１．６ｍｌの緩衝液
をカラムに適用してチオール化オリゴヌクレオチドを溶
離させた。溶離試料を穏かに振とうして酵素を溶解し、
反応を４℃で１６時間進行させた。次いで試料を２分割
した。
【００３７】半分の方をマイクロ濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ
TM製）を用いて約０．３ｍｌまで濃縮し、そして、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．５で平衡化され機能化さ
れた「ＢｉｏｇｅｌTM Ｐ−１００Ｆ」（Ｂｉｏｒａｄ
製）のカラム（約３５ｍｌ）に、０．１４ｍｌ／分の流
量で適用した。溶離されたピークはＵＶ吸収（２６０ｎ
ｍ）により検出し（図１ａ参照）、そして第１のピーク
をなす画分（結合体を含む）のＵＶスペクトルを測定し
た。この第１のピーク内の画分をプールした。試料を３
０倍モル過剰のメルカプトエタノールで周囲温度におい
て１５分間処理した。この結合体の長期貯蔵のために、
ＮａＮ3 及びＢＳＡ（分子生物学用品級）をそれぞれ
０．２％及び０．１％添加した。前記２分割した試料の
他の半分は精製しなかったが、上記のようにメルカプト
エタノールで処理し、またＢＳＡ及びＮａＮ3 を添加し
た。
TM製）を用いて約０．３ｍｌまで濃縮し、そして、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．５で平衡化され機能化さ
れた「ＢｉｏｇｅｌTM Ｐ−１００Ｆ」（Ｂｉｏｒａｄ
製）のカラム（約３５ｍｌ）に、０．１４ｍｌ／分の流
量で適用した。溶離されたピークはＵＶ吸収（２６０ｎ
ｍ）により検出し（図１ａ参照）、そして第１のピーク
をなす画分（結合体を含む）のＵＶスペクトルを測定し
た。この第１のピーク内の画分をプールした。試料を３
０倍モル過剰のメルカプトエタノールで周囲温度におい
て１５分間処理した。この結合体の長期貯蔵のために、
ＮａＮ3 及びＢＳＡ（分子生物学用品級）をそれぞれ
０．２％及び０．１％添加した。前記２分割した試料の
他の半分は精製しなかったが、上記のようにメルカプト
エタノールで処理し、またＢＳＡ及びＮａＮ3 を添加し
た。
【００３８】
【実施例４】凍結乾燥マレイミドアルカリ性ホスファターゼ調剤の安
定性 乾燥剤と共に４℃で３月間貯蔵されていた凍結乾燥マレ
イミドアルカリ性ホスファターゼの試料を前記のように
（ただし約７９ｍｌ容のカラムを使用）結合体としそし
て精製した。図１ｂは得られた溶離分布を示す。ＯＤ２
６０／２８０（ｎｍ）比は＞１．０であった。この比の
値とその溶離分布の形状とは、貯蔵されていた材料がそ
の能力を結合体に対して維持したことを証明した。予め
活性化された酵素の安定性は、試料を４℃で８月間また
３７℃で８月間それぞれ貯蔵することにより確認され
た。これらの両貯蔵試料は、結合されて試験スロットブ
ロット検定で使用されたときになおも良い結果を与え
た。我々は４℃で３月間貯蔵されたものと比較して、こ
れら８月間貯蔵（４℃または３７℃）後の試験検定にお
ける顕著な性能差異は認められなかった。
定性 乾燥剤と共に４℃で３月間貯蔵されていた凍結乾燥マレ
イミドアルカリ性ホスファターゼの試料を前記のように
（ただし約７９ｍｌ容のカラムを使用）結合体としそし
て精製した。図１ｂは得られた溶離分布を示す。ＯＤ２
６０／２８０（ｎｍ）比は＞１．０であった。この比の
値とその溶離分布の形状とは、貯蔵されていた材料がそ
の能力を結合体に対して維持したことを証明した。予め
活性化された酵素の安定性は、試料を４℃で８月間また
３７℃で８月間それぞれ貯蔵することにより確認され
た。これらの両貯蔵試料は、結合されて試験スロットブ
ロット検定で使用されたときになおも良い結果を与え
た。我々は４℃で３月間貯蔵されたものと比較して、こ
れら８月間貯蔵（４℃または３７℃）後の試験検定にお
ける顕著な性能差異は認められなかった。
【００３９】
【実施例５】サザン法における結合体の使用 Ｈｉｎｆｌで処理したヒトＤＮＡのナイロンフィルター
サザン法ブロットをＡ．Ｊ．Ｊｅｆｆｒｅｙ等によって
Ｎａｔｕｒｅ，１９８５，３１４，６７に記載されてい
るようにして調製した。次いでフィルターをＳＳＣで予
め湿潤し、次いでロール圧搾し、プラスチック箱に入れ
た。これらの容器を、軌道インキュベータ内で５×ＳＳ
Ｃ、１％ＳＤＳ、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｆｉｃｏｌ
TM ４００（ＰｈａｒｍａｃｉａTM）、０．１％ＰＶＰ
４４００（ＢＤＨ）中５０℃で２時間インキュベート
した。次いで結合体を１．０ｎＭの濃度で容器に入れ、
５０℃で２０分間回転下にインキュベートした。フィル
ターを次いで１×ＳＳＣ中の０．５％のＳＤＳを入れた
箱に移し、インキュベータ中で５０℃において５分間洗
浄した。この洗浄工程を２回繰返し、次いで０．２５×
ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでさらに２回洗浄した。次いで
フィルターを１×ＳＳＣのみで最終洗浄した。この最後
の洗浄は室温で実施した。次いでフィルターに、かがつ
発光性アルカリ性ホスファターゼ基質である「Ｌｕｍｉ
−ｐｈｏｓTM」（Ｌｕｍｉｇｅｎ社製）を噴霧し、カセ
ット内の透明フィルムの間に置き、１．７時間にわたり
「Ａｇｆａ ＣｕｒｉｘTM」フィルムに露出した。
サザン法ブロットをＡ．Ｊ．Ｊｅｆｆｒｅｙ等によって
Ｎａｔｕｒｅ，１９８５，３１４，６７に記載されてい
るようにして調製した。次いでフィルターをＳＳＣで予
め湿潤し、次いでロール圧搾し、プラスチック箱に入れ
た。これらの容器を、軌道インキュベータ内で５×ＳＳ
Ｃ、１％ＳＤＳ、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｆｉｃｏｌ
TM ４００（ＰｈａｒｍａｃｉａTM）、０．１％ＰＶＰ
４４００（ＢＤＨ）中５０℃で２時間インキュベート
した。次いで結合体を１．０ｎＭの濃度で容器に入れ、
５０℃で２０分間回転下にインキュベートした。フィル
ターを次いで１×ＳＳＣ中の０．５％のＳＤＳを入れた
箱に移し、インキュベータ中で５０℃において５分間洗
浄した。この洗浄工程を２回繰返し、次いで０．２５×
ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでさらに２回洗浄した。次いで
フィルターを１×ＳＳＣのみで最終洗浄した。この最後
の洗浄は室温で実施した。次いでフィルターに、かがつ
発光性アルカリ性ホスファターゼ基質である「Ｌｕｍｉ
−ｐｈｏｓTM」（Ｌｕｍｉｇｅｎ社製）を噴霧し、カセ
ット内の透明フィルムの間に置き、１．７時間にわたり
「Ａｇｆａ ＣｕｒｉｘTM」フィルムに露出した。
【００４０】
【実施例６】 ＳＩＡＢ誘導（変性）凍結乾燥アルカリ性ホスファター
ゼの調製 アルカリ性ホスファターゼの溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ製；１０ｍｇ／ｍｌ，０．１ｍｌ）に対して、０．１
ＭのトリエタノールアミンＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣ
ｌ2 、１ｍＭのＺｎＳＯ4 、ｐＨ７．４（０．３ｍｌ）
を加え、次いで乾燥ＤＭＦ中のＳＩＡＢ（Ｐｉｅｒｃｅ
製）の新鮮溶液（８．３ｍｇ／ｍｌ濃度）７μｌを加え
た。次いで、この反応混合物を２５℃で３０分間インキ
ュベートし、生成物を「ＮＡＰ２５」脱塩カラムに通し
て精製した。このカラムは１％ラクトース、５ｍＭ Ｎ
ａ2 ＳＯ4 （ｐＨ７．４）で前処理（プライム）し、Ｐ
ＢＳ中で平衡化させてあった。生成物１．６ｍｌを捕集
し、これを二つの等量試料（０．８ｍｌ）；約３ｎモル
の変性酵素含有）に分割した。これらの試料を−７０℃
で凍結し、次いで一晩凍結乾燥させた。この凍結乾燥
後、試料を含むびんに栓をして４℃で１週間貯蔵した
後、以下の実施例７のようにして結合体を作った。
ゼの調製 アルカリ性ホスファターゼの溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ製；１０ｍｇ／ｍｌ，０．１ｍｌ）に対して、０．１
ＭのトリエタノールアミンＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣ
ｌ2 、１ｍＭのＺｎＳＯ4 、ｐＨ７．４（０．３ｍｌ）
を加え、次いで乾燥ＤＭＦ中のＳＩＡＢ（Ｐｉｅｒｃｅ
製）の新鮮溶液（８．３ｍｇ／ｍｌ濃度）７μｌを加え
た。次いで、この反応混合物を２５℃で３０分間インキ
ュベートし、生成物を「ＮＡＰ２５」脱塩カラムに通し
て精製した。このカラムは１％ラクトース、５ｍＭ Ｎ
ａ2 ＳＯ4 （ｐＨ７．４）で前処理（プライム）し、Ｐ
ＢＳ中で平衡化させてあった。生成物１．６ｍｌを捕集
し、これを二つの等量試料（０．８ｍｌ）；約３ｎモル
の変性酵素含有）に分割した。これらの試料を−７０℃
で凍結し、次いで一晩凍結乾燥させた。この凍結乾燥
後、試料を含むびんに栓をして４℃で１週間貯蔵した
後、以下の実施例７のようにして結合体を作った。
【００４１】
【実施例７】イミノチオランによる５′アミノ誘導（変
性）オリゴヌクレオチドのチオール化及びそれに引き続
く、ＳＩＡＢ誘導（変性）凍結乾燥アルカリ性ホスファ
ターゼとの結合 アミノ変性オリゴヌクレオチドの水性溶液（名目０．２
μモル合成の１０分の１）を、凍結乾燥２−イミノチオ
ラン（０．６ｍｇ）及び反応用緩衝剤１Ｍ重炭酸ナトリ
ウム（緩衝液ｐＨ９．２）の２０μｌを含むびんに加え
た。びんの内容物を、すべての２−イミノチオラン試薬
が溶解されるように混合し、次いで３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。次いで生成物を「ＮＡＰ５」脱塩カ
ラムに通して精製した（ＰＢＳ中で平衡化）。そして生
成物を０．６ｍｌ捕集した。これを、実施例６で調製し
たＳＩＡＢ変性凍結乾燥アルカリ性ホスファターゼのび
んに加えた。少しの間混合の後、結合反応を４℃で一晩
進行させた。次いで反応混合物を、５０ｍＭのＴｒｉｓ
緩衝剤ｐＨ７．５、０．１％ＢＳＡ及び０．２％ナトリ
ウムアジド中で平衡化され機能化された「Ｂｉｏｇｅｌ
TMＰ−１００Ｃ」（Ｂｉｏｒａｄ製）のカラム（約１０
ｍｌ）に適用した。精製された結合体を１．１ｍｌの量
で回収し、そして以下の実施例１０でスロットブロット
をプローブするのに用いた。
性）オリゴヌクレオチドのチオール化及びそれに引き続
く、ＳＩＡＢ誘導（変性）凍結乾燥アルカリ性ホスファ
ターゼとの結合 アミノ変性オリゴヌクレオチドの水性溶液（名目０．２
μモル合成の１０分の１）を、凍結乾燥２−イミノチオ
ラン（０．６ｍｇ）及び反応用緩衝剤１Ｍ重炭酸ナトリ
ウム（緩衝液ｐＨ９．２）の２０μｌを含むびんに加え
た。びんの内容物を、すべての２−イミノチオラン試薬
が溶解されるように混合し、次いで３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。次いで生成物を「ＮＡＰ５」脱塩カ
ラムに通して精製した（ＰＢＳ中で平衡化）。そして生
成物を０．６ｍｌ捕集した。これを、実施例６で調製し
たＳＩＡＢ変性凍結乾燥アルカリ性ホスファターゼのび
んに加えた。少しの間混合の後、結合反応を４℃で一晩
進行させた。次いで反応混合物を、５０ｍＭのＴｒｉｓ
緩衝剤ｐＨ７．５、０．１％ＢＳＡ及び０．２％ナトリ
ウムアジド中で平衡化され機能化された「Ｂｉｏｇｅｌ
TMＰ−１００Ｃ」（Ｂｉｏｒａｄ製）のカラム（約１０
ｍｌ）に適用した。精製された結合体を１．１ｍｌの量
で回収し、そして以下の実施例１０でスロットブロット
をプローブするのに用いた。
【００４２】
【実施例８】マレイミド変性凍結乾燥ワサビペルオキシダーゼの調製 ４．１ｍｇのＨＲＰ）Ｂｉｏｚｙｍｅ）の試料を秤量
し、０．１ＭのトリエタノールアミンＨＣｌ、１ｍＭの
ＭｇＣｌ2 、１ｍＭのＺｎＳＯ4 、ｐＨ７．４（０．８
ｍｌ）中に溶解させた。これに対して、乾燥ＤＭＦ中の
ＳＭＣＣ（１５ｍｇ／ｍｌ）の新鮮溶液１００μｌを加
え、この反応混合物を２５℃で４０分間インキュベート
した。次いで生成物を、ＢＳＡでプライム処理され５ｍ
Ｍリン酸塩、１％ラクトース緩衝液（ｐＨ７．４）で平
衡化された「ＮＡＰ２５」脱塩カラムに通して精製し
た。生成物を１．６ｍｌの量で捕集し、試料を分析のた
めに採取した。変性℃はタンパク１モル当り１．８０モ
ルのマレイミドであった。残部の試料を２．３２ｍｌに
稀釈し、２００μｌの画分に分散した（びん１個当り６
ｎモル）。これらを−７０℃に凍結し、１晩凍結乾燥さ
せた。凍結乾燥の後に、各びんに蓋をして、３７℃で１
月間貯蔵してから実施例９のようにして結合体を調製し
た。
し、０．１ＭのトリエタノールアミンＨＣｌ、１ｍＭの
ＭｇＣｌ2 、１ｍＭのＺｎＳＯ4 、ｐＨ７．４（０．８
ｍｌ）中に溶解させた。これに対して、乾燥ＤＭＦ中の
ＳＭＣＣ（１５ｍｇ／ｍｌ）の新鮮溶液１００μｌを加
え、この反応混合物を２５℃で４０分間インキュベート
した。次いで生成物を、ＢＳＡでプライム処理され５ｍ
Ｍリン酸塩、１％ラクトース緩衝液（ｐＨ７．４）で平
衡化された「ＮＡＰ２５」脱塩カラムに通して精製し
た。生成物を１．６ｍｌの量で捕集し、試料を分析のた
めに採取した。変性℃はタンパク１モル当り１．８０モ
ルのマレイミドであった。残部の試料を２．３２ｍｌに
稀釈し、２００μｌの画分に分散した（びん１個当り６
ｎモル）。これらを−７０℃に凍結し、１晩凍結乾燥さ
せた。凍結乾燥の後に、各びんに蓋をして、３７℃で１
月間貯蔵してから実施例９のようにして結合体を調製し
た。
【００４３】
【実施例９】ロバ抗ヒツジ抗体と凍結乾燥マレイミドＨＲＰとの結合 硫酸アンモニア沈澱で部分的に精製されたロバ抗ヒツジ
１ｇＧ抗体（スコテッシュ・アンチボディ・プロダクシ
ョン・ユニット）の０．８ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）を、ミ
クロ試験管中の２６μｌの２−イミノチオランＰＢＳ中
２ｍｇ／ｍｌ）、１００μｌの１．０Ｍ炭酸ナトリウム
緩衝剤ｐＨ９．０及び７４μｌのＰＢＳに加えた。この
ミクロ試験管を３７℃で３０分間インキュベートし、そ
して下記の操作により「ＮＡＰ −２５」カラムで脱塩
処理することにより未反応のイミノチオランを除去し
た。カラムは１００μｌのＰＢＳ １％ＢＳＡの添加に
より予めブロックしておいた。その処理剤は次に１５ｍ
ｌのＰＢＳで完全に洗浄除去された。ミクロ試験管の内
容物をカラムに入れ、溶離液を流出させこれを廃棄し
た。次いでカラムに１．６ｍｌのＰＢＳを加え、溶離液
を、予め３７℃で１月間貯蔵してあった凍結乾燥マレイ
ミドＨＲＰの６ｎモルを含むびんに捕集した。このびん
を４℃で１６時間インキュベートした。結合体はかくし
てすぐに使用できる状態にあった。
１ｇＧ抗体（スコテッシュ・アンチボディ・プロダクシ
ョン・ユニット）の０．８ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）を、ミ
クロ試験管中の２６μｌの２−イミノチオランＰＢＳ中
２ｍｇ／ｍｌ）、１００μｌの１．０Ｍ炭酸ナトリウム
緩衝剤ｐＨ９．０及び７４μｌのＰＢＳに加えた。この
ミクロ試験管を３７℃で３０分間インキュベートし、そ
して下記の操作により「ＮＡＰ −２５」カラムで脱塩
処理することにより未反応のイミノチオランを除去し
た。カラムは１００μｌのＰＢＳ １％ＢＳＡの添加に
より予めブロックしておいた。その処理剤は次に１５ｍ
ｌのＰＢＳで完全に洗浄除去された。ミクロ試験管の内
容物をカラムに入れ、溶離液を流出させこれを廃棄し
た。次いでカラムに１．６ｍｌのＰＢＳを加え、溶離液
を、予め３７℃で１月間貯蔵してあった凍結乾燥マレイ
ミドＨＲＰの６ｎモルを含むびんに捕集した。このびん
を４℃で１６時間インキュベートした。結合体はかくし
てすぐに使用できる状態にあった。
【００４４】
【実施例１０】ＭＳ１スロットブロット（ＤＮＡ）の調
製 「Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ」膜に接合されたＭＳ１ＤＮＡでス
ロットブロットを作った。ＭＳ１を稀釈して下記の濃度
（ｐｇ／μｌ）とした。３０，１５，６，３，０．６，
０．２デナチュレーション（変性）緩衝液を次のように
して作った。１４．８ｍｌの水に、１．７ｍｌの１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、３ｍｌの２Ｍ ＮａＯ
Ｈ、及び１０ｍｌの２０×ＳＳＣを加えた。５μｌのＤ
ＮＡ溶液を２９５μｌの変性緩衝液に加え（試料）、こ
れを沸とう水浴中で１０分間インキュベートし、氷浴に
移し、１００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．
５で中和した。「Ｈｙｂｏｎｄ−ＮTM」ナイロン膜（１
×ＳＳＣ中に予備浸漬）を用いてスロットブロットを作
り、これらのスロットをまず４０ｍｌの１×ＳＳＣで洗
浄し、変性試料（０．４ｍｌ）を適用し、そしてスロッ
トをさらに０．４ｍｌの１×ＳＳＣで洗浄した。膜を濾
紙上で２０分間風乾させ、「サランラップ」で包み、４
分間ＵＶ照射し、次いで完全に風乾させた。
製 「Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ」膜に接合されたＭＳ１ＤＮＡでス
ロットブロットを作った。ＭＳ１を稀釈して下記の濃度
（ｐｇ／μｌ）とした。３０，１５，６，３，０．６，
０．２デナチュレーション（変性）緩衝液を次のように
して作った。１４．８ｍｌの水に、１．７ｍｌの１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、３ｍｌの２Ｍ ＮａＯ
Ｈ、及び１０ｍｌの２０×ＳＳＣを加えた。５μｌのＤ
ＮＡ溶液を２９５μｌの変性緩衝液に加え（試料）、こ
れを沸とう水浴中で１０分間インキュベートし、氷浴に
移し、１００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．
５で中和した。「Ｈｙｂｏｎｄ−ＮTM」ナイロン膜（１
×ＳＳＣ中に予備浸漬）を用いてスロットブロットを作
り、これらのスロットをまず４０ｍｌの１×ＳＳＣで洗
浄し、変性試料（０．４ｍｌ）を適用し、そしてスロッ
トをさらに０．４ｍｌの１×ＳＳＣで洗浄した。膜を濾
紙上で２０分間風乾させ、「サランラップ」で包み、４
分間ＵＶ照射し、次いで完全に風乾させた。
【００４５】
【実施例１１】ヒツジ１ｇＧドットブロットの調製 親和性精製ヒツジ抗体（０．９ｍｇ／ｍｌの濃度）をＰ
ＢＳリン酸塩ｐＨ７．５中で１／１８に稀釈して、５０
ｎｇ／μｌの濃度とした。ＰＢＳ中での一連の稀釈を行
なって、１０，５，１，０．５，０．１，０．０５，
０．０１ｎｇ／μｌの種々の濃度とした。これら各溶液
の１μｌの部分を「Ｈｙｂｏｎｄ ＣTMｅｘｔｒａ」
（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）の細長片上へスポットし、これ
を３０分間乾燥させた。下記のフォーマットを用いた。
ＢＳリン酸塩ｐＨ７．５中で１／１８に稀釈して、５０
ｎｇ／μｌの濃度とした。ＰＢＳ中での一連の稀釈を行
なって、１０，５，１，０．５，０．１，０．０５，
０．０１ｎｇ／μｌの種々の濃度とした。これら各溶液
の１μｌの部分を「Ｈｙｂｏｎｄ ＣTMｅｘｔｒａ」
（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）の細長片上へスポットし、これ
を３０分間乾燥させた。下記のフォーマットを用いた。
【表１】
【００４６】
【実施例１２】スロットブロットへの結合体の交雑 スロットブロットをサンドウィッチ箱に入れ、振とう水
浴内で５０℃において２時間交雑溶液中でインキュベー
トした。その交雑溶液に代えて、新鮮交雑溶液を入れ、
そして５０μｌのＤＮＡプローブ（実施例７）を添加し
た。フィルターをその溶液中におき、振とう水浴内で５
０℃において２０分間インキュベートした。交雑後、フ
ィルターを洗浄溶液（１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）中
５０℃で５分間（２回）、次いで洗浄溶液（０．２５×
ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）中５０℃で５分間（３回）、
そして最後に１×ＳＳＣ中室温で５分間（１回）洗浄し
た。次いでフィルターをプラスチック皿の上に置き、
「Ｌｕｍｉ−ｐｈｏｓ」を噴霧し、次いでフィルムカセ
ット中のアセテートシートの間に密封した。Ｘ線フィル
ム片（富士）をそのアセテートサンドイッチ構造体の上
に置き、そしてフィルムカセットを３７℃で１時間イン
キュベートした。次いでフィルムを現像し、信号発現を
測定した（図３参照）。
浴内で５０℃において２時間交雑溶液中でインキュベー
トした。その交雑溶液に代えて、新鮮交雑溶液を入れ、
そして５０μｌのＤＮＡプローブ（実施例７）を添加し
た。フィルターをその溶液中におき、振とう水浴内で５
０℃において２０分間インキュベートした。交雑後、フ
ィルターを洗浄溶液（１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）中
５０℃で５分間（２回）、次いで洗浄溶液（０．２５×
ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）中５０℃で５分間（３回）、
そして最後に１×ＳＳＣ中室温で５分間（１回）洗浄し
た。次いでフィルターをプラスチック皿の上に置き、
「Ｌｕｍｉ−ｐｈｏｓ」を噴霧し、次いでフィルムカセ
ット中のアセテートシートの間に密封した。Ｘ線フィル
ム片（富士）をそのアセテートサンドイッチ構造体の上
に置き、そしてフィルムカセットを３７℃で１時間イン
キュベートした。次いでフィルムを現像し、信号発現を
測定した（図３参照）。
【００４７】
【実施例１３】ロバ抗ヒツジＨＲＰ結合体を用いてのヒツジＩｇＧの検
出 ヒツジＩｇＧドットブロットをブロッキング緩衝液
（０．５％カゼイン、１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０）中で室温において予めブロック処理した。ブロッ
トを実施例１２で調製したロバ抗ヒツジＨＲＰ検出体の
１／５００稀釈物を含むブロッキング溶液に移した。ブ
ロットをこの溶液中で室温において２時間インキュベー
トした。次いでブロットを１×ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗ
ｗｅｅｎ２０中室温で１５分間（２回）そして１×ＴＢ
Ｓ中室温で５分間（１回）洗浄した。このブロットを基
質緩衝液（１．５μｌ３０％過酸化水素、４ｍｇ３，
３′−ジアミノベンジジンテトラハイドロクロライドを
５ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓに加えたものｐＨ７．５）
中で１０分間インキュベートし、水で洗浄し、乾燥させ
た。結果を図４に示す。
出 ヒツジＩｇＧドットブロットをブロッキング緩衝液
（０．５％カゼイン、１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０）中で室温において予めブロック処理した。ブロッ
トを実施例１２で調製したロバ抗ヒツジＨＲＰ検出体の
１／５００稀釈物を含むブロッキング溶液に移した。ブ
ロットをこの溶液中で室温において２時間インキュベー
トした。次いでブロットを１×ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗ
ｗｅｅｎ２０中室温で１５分間（２回）そして１×ＴＢ
Ｓ中室温で５分間（１回）洗浄した。このブロットを基
質緩衝液（１．５μｌ３０％過酸化水素、４ｍｇ３，
３′−ジアミノベンジジンテトラハイドロクロライドを
５ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓに加えたものｐＨ７．５）
中で１０分間インキュベートし、水で洗浄し、乾燥させ
た。結果を図４に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例３に記載の結合体（ａ）及び実施例４に
記載の結合体（ｂ）の精製についての「ＢｉｏｇｅｌTM
Ｐ−１００Ｆ」溶離分布図である。
記載の結合体（ｂ）の精製についての「ＢｉｏｇｅｌTM
Ｐ−１００Ｆ」溶離分布図である。
【図２】実施例３の精製結合体（ａ）及び未精製結合体
（ｂ）でプローブしたＨｉｎｆｌヒトＤＮＡ断片のサザ
ン法ブロットである。３つの列は、左から右へ、３，２
及び１μｇのＤＮＡ負荷を含む。
（ｂ）でプローブしたＨｉｎｆｌヒトＤＮＡ断片のサザ
ン法ブロットである。３つの列は、左から右へ、３，２
及び１μｇのＤＮＡ負荷を含む。
【図３】スロットブロット上のＭＳＩ ＤＮＡ試料を、
実施例３で調製のオリゴヌクレオチド結合体ＭＳＩミニ
サテライトプローブでプローブすることにより得られた
バンドを示す。カラム１，２，３，４，５及び６のそれ
ぞれにおけるターゲットＤＮＡ負荷は１５０，７５，３
０，１５，３及び１．５ｐｇであった。
実施例３で調製のオリゴヌクレオチド結合体ＭＳＩミニ
サテライトプローブでプローブすることにより得られた
バンドを示す。カラム１，２，３，４，５及び６のそれ
ぞれにおけるターゲットＤＮＡ負荷は１５０，７５，３
０，１５，３及び１．５ｐｇであった。
【図４】実施例Ｄ出調製したロバ抗ヒツジ抗体結合体を
実施例Ｆで調製したヒツジＩｇＧドットブロットと共に
インキュベートすることにより得られたデータを示す。
ターゲットＩｇＧ負荷は図示のように５０，１０，５，
０，１，０．５，０．１，０．０５，０．０１及び０ｎ
ｇであった。
実施例Ｆで調製したヒツジＩｇＧドットブロットと共に
インキュベートすることにより得られたデータを示す。
ターゲットＩｇＧ負荷は図示のように５０，１０，５，
０，１，０．５，０．１，０．０５，０．０１及び０ｎ
ｇであった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C07K 1/10 G01N 33/53 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (11)
- 【請求項１】 チオール化ポリヌクレオチドのチオール
基またはチオール含有タンパクのチオール基へ共有結合
カップリングするために予め活性化された安定なタンパ
ク試薬であって、６〜８のｐＨ値を有しかつ１０ｍＭ以
下の不揮発性塩の濃度を有する緩衝処理溶液から凍結乾
燥される前記タンパク試薬。 - 【請求項２】 タンパクを、タンパク官能基と反応しう
る第１の反応性基及びチオール基と反応しうる第２の反
応性基を有するヘテロ二官能性架橋剤の第１の反応性基
に対して反応させることにより予め活性化された請求項
１の試薬。 - 【請求項３】 第１の反応性基がタンパクアミノ基に対
して反応性である請求項２の試薬。 - 【請求項４】 第１の反応性基がスクシンイミド基であ
る請求項３の試薬。 - 【請求項５】 第２の反応性基がマレイミド、アロアセ
チルもしくはハロアセトアミジル、または活性化ジスル
フィド、チオール基、あるいは重金属誘導体である請求
項１〜４のいずれかの試薬。 - 【請求項６】 タンパク試薬のタンパクが抗体、酸素ま
たは特異結合性物質である請求項１〜５のいずれかの試
薬。 - 【請求項７】 タンパクがアルカリ性ホスファターゼま
たはワサビペルオシターゼである請求項６の試薬。 - 【請求項８】 タンパク試薬が炭水化物、殊にラクトー
スの溶液から凍結乾燥される請求項７の試薬。 - 【請求項９】 チオール化ポリヌクレオチドのチオール
基またはチオール含有タンパクのチオール基へ共有結合
カップリングするために予め活性化された安定なタンパ
ク試薬と、使用のための説明書と、からなる調製結合体
の指南キットであって、該タンパク質が６〜８のｐＨ値
を有しかつ１０ｍＭ以下の不揮発性塩の濃度を有する緩
衝処理溶液から凍結乾燥される前記キット。 - 【請求項１０】１．ある量の固体チオール化剤、例えば
２−イミノチオラン、 ２．チオール化済生成物から過剰のチオール化剤を除去
するための予備充填カラム、 ３．２のカラムを平衡化及び／または作用させるための
緩衝剤、 ４．チオール化剤を再構成するための緩衝剤、 ５．結合体の精製のためのさらに別のカラム、 ６．５のカラムを平衡化及び／または作用させるための
緩衝剤、 ７．カラムを装着するための架台、 ８．生成物及び中間体を捕集するためのバイアル、 ９．結合後に過剰のチオール反応性基を鎮静化するため
の試薬、 １０．長期保存のために結合体を安定化するための添加
剤、 １１．操作を実施するための説明書、 のうちの一つまたはそれ以上をも含む請求項９のキッ
ト。 - 【請求項１１】 チオール化ポリヌクレオチドのチオー
ル基またはチオール含有タンパクのチオール基へ共有結
合カップリングするために予め活性化された安定なタン
パク試薬を、それぞれチオール化ポリヌクレオチドまた
はチオール含有タンパクのチオール基と、反応させるこ
とからなる結合体の製法であって、該タンパク質が６〜
８のｐＨ値を有しかつ１０ｍＭ以下の不揮発性塩の濃度
を有する緩衝処理溶液から凍結乾燥される前記製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB898927365A GB8927365D0 (en) | 1989-12-04 | 1989-12-04 | Reagent |
| GB8927365-0 | 1989-12-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0584100A JPH0584100A (ja) | 1993-04-06 |
| JP3150158B2 true JP3150158B2 (ja) | 2001-03-26 |
Family
ID=10667384
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP40037990A Expired - Fee Related JP3150158B2 (ja) | 1989-12-04 | 1990-12-04 | オリゴヌクレオチドプローブ標識用の予備活性化したタンパク |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5441867A (ja) |
| EP (1) | EP0431882B1 (ja) |
| JP (1) | JP3150158B2 (ja) |
| AT (1) | ATE163449T1 (ja) |
| DE (1) | DE69032062T2 (ja) |
| DK (1) | DK0431882T3 (ja) |
| GB (1) | GB8927365D0 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012210407A (ja) * | 2011-03-23 | 2012-11-01 | Tokyo Metropolitan Industrial Technology Research Institute | 冷却基材、冷却シート及びネッククーラー |
| JP2014012086A (ja) * | 2012-07-04 | 2014-01-23 | Tokyo Metropolitan Industrial Technology Research Institute | 冷却シート |
Families Citing this family (10)
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