JPS5983056A - ジゴキシゲニン免疫原複合体に対する抗体およびそれらを用いるジゴキシン測定免疫試験法 - Google Patents
ジゴキシゲニン免疫原複合体に対する抗体およびそれらを用いるジゴキシン測定免疫試験法Info
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- JPS5983056A JPS5983056A JP58174442A JP17444283A JPS5983056A JP S5983056 A JPS5983056 A JP S5983056A JP 58174442 A JP58174442 A JP 58174442A JP 17444283 A JP17444283 A JP 17444283A JP S5983056 A JPS5983056 A JP S5983056A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ジコギシゲニン誘導体、特に、従来の免疫原
性担体材に結合したカルボキシ−およびアミノ−官能基
化誘導体からなる免疫原複合体に関し、かつ、かかる免
疫原複合体に対して産ノ1された抗−ジコキシン抗体に
関する。かかる抗体は、生物学的液体中のジゴキシンA
11l ’+if川の免疫試験においてイ1用である。
性担体材に結合したカルボキシ−およびアミノ−官能基
化誘導体からなる免疫原複合体に関し、かつ、かかる免
疫原複合体に対して産ノ1された抗−ジコキシン抗体に
関する。かかる抗体は、生物学的液体中のジゴキシンA
11l ’+if川の免疫試験においてイ1用である。
本発明はまた、特に好ましい免疫試験手法において有用
な標識化ジ」ギシケニン複合体に関する。
な標識化ジ」ギシケニン複合体に関する。
薬剤治療を受ている患者の血流中のジゴキシン7161
Kを監視することが、医学的に価値のあること1オ既に
認められているところである。免疫試験は、例えば、血
清またはプラズマのような血液試料中のジゴキシンを測
定するために用いられる現41品もバ通の方法であり、
試験試料中の薬剤に対する抗−ジゴキシン抗体の特異的
結合に基づいている。
Kを監視することが、医学的に価値のあること1オ既に
認められているところである。免疫試験は、例えば、血
清またはプラズマのような血液試料中のジゴキシンを測
定するために用いられる現41品もバ通の方法であり、
試験試料中の薬剤に対する抗−ジゴキシン抗体の特異的
結合に基づいている。
ジゴキシンは、アグリコン、ジゴキシン抗体およびC−
3(<iでアグリコンと連結した3個のグリコシ1:性
ジギトキソース残基からなる強心性グリコシドである。
3(<iでアグリコンと連結した3個のグリコシ1:性
ジギトキソース残基からなる強心性グリコシドである。
グリコシドはハプテンであり、すなわち、例えば、異種
動物からのアルブミンのような蛋白質等の免疫原性担体
材との複合体の形で、宿主動物に注入されなければ、抗
体産生を刺激することはできない。抗−ジゴキシン抗体
を産生するための従来の免疫原複合体は、末端グリコシ
ド残)^の修iI(物を介して担体に化学的に結合した
グリコシドからなる。末端残基は過ヨウ素酸で酸化され
、開環し、担体中の遊離アミノ基と容易に結合しうるジ
アルデヒド誘導体を生成する[パトラ−およびシx 7
(Butler and Chenl、Proc、N
atl。
動物からのアルブミンのような蛋白質等の免疫原性担体
材との複合体の形で、宿主動物に注入されなければ、抗
体産生を刺激することはできない。抗−ジゴキシン抗体
を産生するための従来の免疫原複合体は、末端グリコシ
ド残)^の修iI(物を介して担体に化学的に結合した
グリコシドからなる。末端残基は過ヨウ素酸で酸化され
、開環し、担体中の遊離アミノ基と容易に結合しうるジ
アルデヒド誘導体を生成する[パトラ−およびシx 7
(Butler and Chenl、Proc、N
atl。
Acad、Sci、アメリカ合衆国57aニア1頁(1
987)。
987)。
ならびにスミス等(Smith et al)、Bio
che+a 9巻:331頁(+970)]。結果とし
て得られるものはジコキシンー担体複合体である。
che+a 9巻:331頁(+970)]。結果とし
て得られるものはジコキシンー担体複合体である。
関連する強心性グリコシド、すなわち、ジギトキシンに
対する抗体は、担体と0〜3位で結合するアグリコンの
複合体から産生されている。アグリコン3−0−サクシ
ノイルージギトキシゲニンは、従来手法により蛋白質担
体に結合されている[オリバー等(Oliver et
all、 J、Cl1n、Invegt、 47巻:
l035頁(+988)]。
対する抗体は、担体と0〜3位で結合するアグリコンの
複合体から産生されている。アグリコン3−0−サクシ
ノイルージギトキシゲニンは、従来手法により蛋白質担
体に結合されている[オリバー等(Oliver et
all、 J、Cl1n、Invegt、 47巻:
l035頁(+988)]。
3−置換ジゴキシン抗体およびジキトキシゲニン誘導体
が提案されており、免疫試験の実施において、抗〜ジゴ
キシン抗体および抗−ジギトキシン抗体と連係して用い
るための標識化複合体を製造する目的のために用いられ
ている。この従来技術の代表的なものは、米国特許第3
,981,982号および第4,0ff4,227号な
らびに種々の非放射性標識化複合体と関連する米国特許
tftJ4,039,385号、第4,213.119
3号および第4,273,888号である。
が提案されており、免疫試験の実施において、抗〜ジゴ
キシン抗体および抗−ジギトキシン抗体と連係して用い
るための標識化複合体を製造する目的のために用いられ
ている。この従来技術の代表的なものは、米国特許第3
,981,982号および第4,0ff4,227号な
らびに種々の非放射性標識化複合体と関連する米国特許
tftJ4,039,385号、第4,213.119
3号および第4,273,888号である。
米国特許第4,217,280号および第4,219,
549号には、種々の3−アミノ−3−デオキシジゴキ
シゲニン誘導体の合成および強心剤療法におけるそれら
の使用について述べられている。3−ジゴキシン抗体の
#Ajf4については、タムおよびガブラー(Tan+
and Gublerl 、l1elv、Cbim、
Acta 42 @ :239頁(+1159)な
らびにシミズおよびミツハシ、 Tetrahedro
n 24’/(3:4207頁(+988)より知られ
る。ブヂックおよびケー−−ッヒ(Boutique
aid Koenig) 、Bull、 Cbes。
549号には、種々の3−アミノ−3−デオキシジゴキ
シゲニン誘導体の合成および強心剤療法におけるそれら
の使用について述べられている。3−ジゴキシン抗体の
#Ajf4については、タムおよびガブラー(Tan+
and Gublerl 、l1elv、Cbim、
Acta 42 @ :239頁(+1159)な
らびにシミズおよびミツハシ、 Tetrahedro
n 24’/(3:4207頁(+988)より知られ
る。ブヂックおよびケー−−ッヒ(Boutique
aid Koenig) 、Bull、 Cbes。
5−qc、Fr、 +973(2)、第2部、75o頁
には、ステロイドケトン類の還元的アミン化が述べられ
ている。アルデヒド類およびケトン類の還元的アミノ化
における水素化シアノ硼素ナトリウムの使用については
、ボルナ等(Borch et al)、J、Amer
、Chem、Soc、93巻: 2987頁(1971
)に記載されている。3−アミツカJl/デ/!Jドa
li、ハン4j −等(Ilanger et at)
。
には、ステロイドケトン類の還元的アミン化が述べられ
ている。アルデヒド類およびケトン類の還元的アミノ化
における水素化シアノ硼素ナトリウムの使用については
、ボルナ等(Borch et al)、J、Amer
、Chem、Soc、93巻: 2987頁(1971
)に記載されている。3−アミツカJl/デ/!Jドa
li、ハン4j −等(Ilanger et at)
。
11elv、Chim、Acta 513(8)@ :
271]2 頁(IE173)ニよ’J 製造された。
271]2 頁(IE173)ニよ’J 製造された。
本発明は、従来の免疫原性担体材に結合した3−[N−
(カルボキシアルキル)]−]アミノー3−デオキシジ
ゴキシゲニまたは3−[N−(アミノアルキル月−アミ
ノー3−デオキシジゴキシゲニン誘導体からなるジゴキ
シゲニン免疫原複合体を提供する。提供される免疫原は
一般式: (式中、Carrierは担体材、Rは結合または連結
基、見およびmの一方はlで他方は0.nは2からlO
までの整数、およびPは平均して1がら約50までであ
る。)の免疫原である。連結基Rが結合の場合は、ジゴ
キシゲニン誘導体は、例えば、誘導体の7ミノ基または
カルボキシル基および但体上のそれぞれカルボキシル基
またはアミン基とのアミド連結により、直接、担体材に
結合し、力)かる場合にはJlq体材仕材通常、蛋白質
またはボ1ノペプチドである。架橋基Rが、単純な結合
以外の場合、広汎な従来構造、例えば、ジゴキシゲニン
部分のアミン末端基またはカルボキシル末端基を、通常
、アミン基またはカルボキシル基である、111体」−
の適pJな基に連結する二官能性結合剤の残基からなっ
てもよい。
(カルボキシアルキル)]−]アミノー3−デオキシジ
ゴキシゲニまたは3−[N−(アミノアルキル月−アミ
ノー3−デオキシジゴキシゲニン誘導体からなるジゴキ
シゲニン免疫原複合体を提供する。提供される免疫原は
一般式: (式中、Carrierは担体材、Rは結合または連結
基、見およびmの一方はlで他方は0.nは2からlO
までの整数、およびPは平均して1がら約50までであ
る。)の免疫原である。連結基Rが結合の場合は、ジゴ
キシゲニン誘導体は、例えば、誘導体の7ミノ基または
カルボキシル基および但体上のそれぞれカルボキシル基
またはアミン基とのアミド連結により、直接、担体材に
結合し、力)かる場合にはJlq体材仕材通常、蛋白質
またはボ1ノペプチドである。架橋基Rが、単純な結合
以外の場合、広汎な従来構造、例えば、ジゴキシゲニン
部分のアミン末端基またはカルボキシル末端基を、通常
、アミン基またはカルボキシル基である、111体」−
の適pJな基に連結する二官能性結合剤の残基からなっ
てもよい。
従来の抗血清またはモノクローナル手法により、かかる
複合体に対して産生された抗−ジョ゛キシン抗体もまた
提供される。かかる抗体は、ジゴキシン測定用の、免疫
試験法ならびに試験キットおよび試験具のような試薬に
おいて有用である。
複合体に対して産生された抗−ジョ゛キシン抗体もまた
提供される。かかる抗体は、ジゴキシン測定用の、免疫
試験法ならびに試験キットおよび試験具のような試薬に
おいて有用である。
特に好ましい均−系、非放射性免疫試験手法番こおいて
有用な標識化複合体も、かかる標識化複合体および免疫
原複合体の合成に用いられる新規なジゴキシゲニン誘導
体と同様に提供される。
有用な標識化複合体も、かかる標識化複合体および免疫
原複合体の合成に用いられる新規なジゴキシゲニン誘導
体と同様に提供される。
ト官能基化−アミ/−3−デオキシジゴキシゲニン誘導
体は、式: (式中、Zはアミノまたはカルボキシルであり、nは2
から10までの整数である。)のカルボキシアルキル誘
導体またはアミノアルキル誘導体である。かかる誘導体
は、水素化シアノ硼素ナトリウムの存在下で、適切なα
、ω−アルカンジアミンまたはω−アミノアルカン酸を
用いて3−ジョキシゲノンを還元的にアミノ化すること
により製造される。
体は、式: (式中、Zはアミノまたはカルボキシルであり、nは2
から10までの整数である。)のカルボキシアルキル誘
導体またはアミノアルキル誘導体である。かかる誘導体
は、水素化シアノ硼素ナトリウムの存在下で、適切なα
、ω−アルカンジアミンまたはω−アミノアルカン酸を
用いて3−ジョキシゲノンを還元的にアミノ化すること
により製造される。
好ましい実施態様においては、官能基化ジゴキシゲニン
誘導体は、アミド結合またはペプチド結合の形成により
、担体材中の相当するアミノ基またはカルボキシル基に
、直接、結合する。結果として得られる好ましい免疫原
複合体は、式:(式中、Carrierおよびnは先に
定義したとうりであり、Yは、通常、免疫原性蛋白質ま
たは免疫原性ポリペプチドである担体材上のカルボキシ
ル基またはアミノ基を、ジゴキシゲニン部分に連結−4
−るアミド基であり、Pは、平均して、lから411体
トの利用しうるアミド結合部位(例えば、結合条件の下
C1場合次第で、利用しうるカルボキシルノ、(または
アミン基)の数までであり、通常、約50未溝である。
誘導体は、アミド結合またはペプチド結合の形成により
、担体材中の相当するアミノ基またはカルボキシル基に
、直接、結合する。結果として得られる好ましい免疫原
複合体は、式:(式中、Carrierおよびnは先に
定義したとうりであり、Yは、通常、免疫原性蛋白質ま
たは免疫原性ポリペプチドである担体材上のカルボキシ
ル基またはアミノ基を、ジゴキシゲニン部分に連結−4
−るアミド基であり、Pは、平均して、lから411体
トの利用しうるアミド結合部位(例えば、結合条件の下
C1場合次第で、利用しうるカルボキシルノ、(または
アミン基)の数までであり、通常、約50未溝である。
)を有する。
カルボキシル基−含イ目月体にジゴキシゲニン誘4体を
直接に1合さゼるために利用しうるペプチド縮合反応は
周知であり、制限なしに、カルボジイミド反応[エール
ネ等(Aherne et al) Br1t、J。
直接に1合さゼるために利用しうるペプチド縮合反応は
周知であり、制限なしに、カルボジイミド反応[エール
ネ等(Aherne et al) Br1t、J。
Cl1n、 Pharm、3 巻:5+(頁(1971
3)および5cience+4401344頁(197
4) ]、混合無水物反応[エルラン刀−等(Erla
nger et all、Methods inIII
lmunolo y and IIl1munoche
mistryウィリアムズおよびチェイス編アカデミツ
ク・プレスied 。
3)および5cience+4401344頁(197
4) ]、混合無水物反応[エルラン刀−等(Erla
nger et all、Methods inIII
lmunolo y and IIl1munoche
mistryウィリアムズおよびチェイス編アカデミツ
ク・プレスied 。
Williams and Chase、Academ
ic Press) にューヨーク +967)14
9頁]、ならびに酸アジドおよび活性エステル反応(コ
ツプル(Kopple)、江■」μand Am1no
Ac1ds 、タブリュー・エイ・ベンジアミン舎イ
ンコーボレーテッF(W、^、BenjaminInc
、l (=j、−ヨーク 196ft)] を包含す
る。
ic Press) にューヨーク +967)14
9頁]、ならびに酸アジドおよび活性エステル反応(コ
ツプル(Kopple)、江■」μand Am1no
Ac1ds 、タブリュー・エイ・ベンジアミン舎イ
ンコーボレーテッF(W、^、BenjaminInc
、l (=j、−ヨーク 196ft)] を包含す
る。
CI in、chem、22巻 ニア26頁(1978
)も参照されたり)。
)も参照されたり)。
また、ジコキシゲニン誘導体は、その一端で、誘導体の
アミノ基またはカルボキシル基との結合を形成し、その
他端で、担体1−に存在する適切な官能基との結合を形
成する従来の連結試薬を使用して結合させることができ
る。例え1え、アミン11店4体をアミン巨大分子に結
合させるために、ヒスイミテーI・9F+、ビスイソシ
アネート類、およびグ共lタールアJレデヒF’ (I
mmunocbem、6巻:53頁(+9H)] をは
しめとする二官能t1結合試薬は周知でIi)る。他の
イI用な結合反応は、例えば、−に連のコy 7”ルの
論文;ロウエおよびディーン (Loveand De
anl 、 Affinit Chromato r
a h ジゴン會ワイリー・アンドeサンズ(Joh
n Wiley and!1ions) にューヨー
ク 1974)’ 、ミーンズおよび フ、 イ −ニ
ー (Means and Feeneyl、
Ghemicaltlodification o
f Proteins、ホルデンーデー(11olde
n−Dayl (サンフランシス:I 1971);
ならびにクレイザー等tGlazer et all、
Chemical Modification ol
Proteins 、 エルセピア(Elsevier
lにューヨーク +975)等の文献に十分に検δ・1
されている。
アミノ基またはカルボキシル基との結合を形成し、その
他端で、担体1−に存在する適切な官能基との結合を形
成する従来の連結試薬を使用して結合させることができ
る。例え1え、アミン11店4体をアミン巨大分子に結
合させるために、ヒスイミテーI・9F+、ビスイソシ
アネート類、およびグ共lタールアJレデヒF’ (I
mmunocbem、6巻:53頁(+9H)] をは
しめとする二官能t1結合試薬は周知でIi)る。他の
イI用な結合反応は、例えば、−に連のコy 7”ルの
論文;ロウエおよびディーン (Loveand De
anl 、 Affinit Chromato r
a h ジゴン會ワイリー・アンドeサンズ(Joh
n Wiley and!1ions) にューヨー
ク 1974)’ 、ミーンズおよび フ、 イ −ニ
ー (Means and Feeneyl、
Ghemicaltlodification o
f Proteins、ホルデンーデー(11olde
n−Dayl (サンフランシス:I 1971);
ならびにクレイザー等tGlazer et all、
Chemical Modification ol
Proteins 、 エルセピア(Elsevier
lにューヨーク +975)等の文献に十分に検δ・1
されている。
1式の111pはJlj体に結合しているジゴキシゲニ
ン部分の数、すなわち、免疫原のエピト−プ密度(Ep
itopic density)を表わし、通常の状f
n;では、・11均して、■から約50までであり、さ
らに普通には、■から約20となるであろう。免疫原の
合成および抗体応答の、容易さおよび再現性を考慮すれ
ば、最適のエピト−プ密度は、約2ないし約15゜さら
に通常には、4ないしIOになる。
ン部分の数、すなわち、免疫原のエピト−プ密度(Ep
itopic density)を表わし、通常の状f
n;では、・11均して、■から約50までであり、さ
らに普通には、■から約20となるであろう。免疫原の
合成および抗体応答の、容易さおよび再現性を考慮すれ
ば、最適のエピト−プ密度は、約2ないし約15゜さら
に通常には、4ないしIOになる。
免疫原性担体材は、ジコキシケニン誘導体に結合させる
ために利用しうる官能基をイ1する、従来公知のものの
いずれからも選択することができる。十分な大きさおよ
び免疫原性を有する、炭水化物類、多糖類、リボ多糖類
、核酸類等のような他の4A料もまた同様に用いること
かできるが、はとんどの場合、11.1体は蛋白質また
はポリペプチドであろう。大部分、免疫原性蛋白質類お
よび免疫原性ポリペプチド類は、4,000および10
,000,000の間の、好ましくは、15,000よ
り大きい、さらに通常には、50,000より大きい分
子量を右するであろう。通常、−・つの動物種から取り
出された蛋白質類は、他種の血液流に導入された際、免
疫原性を示すであろう。特に、有用な蛋白質類は、アル
ブミン類、グロブリン類、酵素類、ヘモシアニン類、グ
ロブリン類、有為の非蛋白質f’l成分を有する蛋白J
IJ、類、例えば°、グリコ蛋白質類等である。
ために利用しうる官能基をイ1する、従来公知のものの
いずれからも選択することができる。十分な大きさおよ
び免疫原性を有する、炭水化物類、多糖類、リボ多糖類
、核酸類等のような他の4A料もまた同様に用いること
かできるが、はとんどの場合、11.1体は蛋白質また
はポリペプチドであろう。大部分、免疫原性蛋白質類お
よび免疫原性ポリペプチド類は、4,000および10
,000,000の間の、好ましくは、15,000よ
り大きい、さらに通常には、50,000より大きい分
子量を右するであろう。通常、−・つの動物種から取り
出された蛋白質類は、他種の血液流に導入された際、免
疫原性を示すであろう。特に、有用な蛋白質類は、アル
ブミン類、グロブリン類、酵素類、ヘモシアニン類、グ
ロブリン類、有為の非蛋白質f’l成分を有する蛋白J
IJ、類、例えば°、グリコ蛋白質類等である。
分子Ip カ、30.00QtiJ:び2(to、00
0 (7)間テアルアルブミン類およびクロプリン類は
、特に、好ましい。さらに、従来の免疫原性担体材およ
び/\ジブテン類、それらに結合させるための手法に関
する(シー市水Qliについては、次のものを参照して
もよい:パーカー(Parkerl、Radioimm
unoagsa ofBiolo 1cally A
ctive Comounds 、プレンティス−ホー
ル(イングルウッド曹クリブス、ニュー・シャーシー、
アメリカ合衆国、197e(Prentice−Hal
l(Englewood Cl1ffs、New Je
rsey USA、IE17fl)l;パトラ−(Bu
tler)J、Immunol、Me’th、 7巻:
1−24頁(!1174) 、ワインリプおよびシュロ
フ(Weinryband 5hroffl Dr
u Metab、Rev、lOlj3 : 2
71−2[13頁(+975) 、ブo −1−7およ
びストロング(Broughtonand Stron
gl 、 Cl1n、 Che+s、 22巻ニア2B
−732頁(1976) ; ならびに、プレイフェ
ア等 (PlayfaireL at)、 Br、Me
d、Bull、 30巻:24−31頁(+974)。
0 (7)間テアルアルブミン類およびクロプリン類は
、特に、好ましい。さらに、従来の免疫原性担体材およ
び/\ジブテン類、それらに結合させるための手法に関
する(シー市水Qliについては、次のものを参照して
もよい:パーカー(Parkerl、Radioimm
unoagsa ofBiolo 1cally A
ctive Comounds 、プレンティス−ホー
ル(イングルウッド曹クリブス、ニュー・シャーシー、
アメリカ合衆国、197e(Prentice−Hal
l(Englewood Cl1ffs、New Je
rsey USA、IE17fl)l;パトラ−(Bu
tler)J、Immunol、Me’th、 7巻:
1−24頁(!1174) 、ワインリプおよびシュロ
フ(Weinryband 5hroffl Dr
u Metab、Rev、lOlj3 : 2
71−2[13頁(+975) 、ブo −1−7およ
びストロング(Broughtonand Stron
gl 、 Cl1n、 Che+s、 22巻ニア2B
−732頁(1976) ; ならびに、プレイフェ
ア等 (PlayfaireL at)、 Br、Me
d、Bull、 30巻:24−31頁(+974)。
木免15゛ト原複合体を用いての特異的抗体の産生は、
いかなる従来手法に従ってもよい。抗体生成を誘導する
ノ^本的な態様を記載した数多くのテキストが人手可能
であり、例えばパーカー(Parker)Radioi
nmunoassa of Biologicall
y^ctivedプレンチスーホール(イングルウッド
ークリフス、ニュー−シャーシー、アメリカ合衆国19
78)(Prentice−Hall (Engle、
wood Cl1ffs。
いかなる従来手法に従ってもよい。抗体生成を誘導する
ノ^本的な態様を記載した数多くのテキストが人手可能
であり、例えばパーカー(Parker)Radioi
nmunoassa of Biologicall
y^ctivedプレンチスーホール(イングルウッド
ークリフス、ニュー−シャーシー、アメリカ合衆国19
78)(Prentice−Hall (Engle、
wood Cl1ffs。
New Jersey、USA、1978)l を参照
してもよい。通常の場合、ラビット、ヤギ、マウス、モ
ルモット、またはウマのような宿主動物に、1またはそ
れ以にの種々の部位に、通常、アジュへンi・との混合
物として、免疫原複合体を注射する。さらに、注射を、
同一部位にまたは異なる部位に、定期的間隔でまたは不
定期的間隔で施こし、その後、受容しうる適宜量が達成
されたと測定されるまで、抗体適宜量を評価するために
採血される。宿主動物から採血して、適νJ最の特異的
抗1r11清をfIする。必要ならば、抗血清が実際の
試験の遂行に用いるのにa !uJだと考えられ・るま
で、−Il特yA的抗体のような望ましくない物質を除
去するために、精製rV+“を行っ・Cもよい。
してもよい。通常の場合、ラビット、ヤギ、マウス、モ
ルモット、またはウマのような宿主動物に、1またはそ
れ以にの種々の部位に、通常、アジュへンi・との混合
物として、免疫原複合体を注射する。さらに、注射を、
同一部位にまたは異なる部位に、定期的間隔でまたは不
定期的間隔で施こし、その後、受容しうる適宜量が達成
されたと測定されるまで、抗体適宜量を評価するために
採血される。宿主動物から採血して、適νJ最の特異的
抗1r11清をfIする。必要ならば、抗血清が実際の
試験の遂行に用いるのにa !uJだと考えられ・るま
で、−Il特yA的抗体のような望ましくない物質を除
去するために、精製rV+“を行っ・Cもよい。
抗体は、体細胞融合反応法、(Somatic cel
lhvbridization techniques
)によってもa+られ、かかる抗体は5通常、モノク
ローナル抗体と呼はれる。かかるモノクローナル抗体手
法についての概説は、L m hocyte It b
ridomas 、メルヂャース’r”=編、スフ゛リ
ン刀−−フェルラーグ(ed 。
lhvbridization techniques
)によってもa+られ、かかる抗体は5通常、モノク
ローナル抗体と呼はれる。かかるモノクローナル抗体手
法についての概説は、L m hocyte It b
ridomas 、メルヂャース’r”=編、スフ゛リ
ン刀−−フェルラーグ(ed 。
Melchers et al、Springer−V
erlagl にューヨーク1978) ; Nat
ure 2se春: 485頁(+977)、および5
i−c iμヨ208巻;882頁(19110)に見
出される。
erlagl にューヨーク1978) ; Nat
ure 2se春: 485頁(+977)、および5
i−c iμヨ208巻;882頁(19110)に見
出される。
本発明の免疫原から産生される抗体は、凝集反1べ\、
法、放用件免疫試験、不均一系酵素免疫試験(3に国特
許第3.fi54,090号参照)平均−系イ1を光免
役試験(米国特許第4,201.7H号; t54,1
33.[139すt; 、1: ヒff13,992.
E131 号参照) オ、J: ヒ均−系(公卿操作を
含まない)免疫試験をはじめとする、ジゴキシン測>i
−川の免疫試験法、および相当する試薬に用いることが
できる。節後のものは、特に、々rましく、蛍光減光ま
たは増加(米国特許第4、l[io、0113号参照)
、蛍光偏光(J 、Exp、Med、+2271102
9頁(IH5)参照)、酵素基質−標識化免疫試験(米
国特許第4,279,992号および英国特許明細舎弟
1,552,807号参照)、補欠分子族−標識化免疫
試験(米国特許第4.238.565号参照)、例えば
阻害物標識(米国特許第4,134,9?2号およU第
4.273,868号参照)を用いる酵素活性調整物−
標識化免疫試験、酵素−標識化免疫試験(米国時δ1第
3,817,837吋参照)、エネルキー移動免疫試験
(米国特許第3.99fl、345号参jip、)、化
学的−励起t+’光免疫試験(米国特許第4,238,
195号参照)および二重抗体立体障害免疫試験(米国
特許第3.935,074号および第3,9H,943
号参!!9)のような手法を包含する。
法、放用件免疫試験、不均一系酵素免疫試験(3に国特
許第3.fi54,090号参照)平均−系イ1を光免
役試験(米国特許第4,201.7H号; t54,1
33.[139すt; 、1: ヒff13,992.
E131 号参照) オ、J: ヒ均−系(公卿操作を
含まない)免疫試験をはじめとする、ジゴキシン測>i
−川の免疫試験法、および相当する試薬に用いることが
できる。節後のものは、特に、々rましく、蛍光減光ま
たは増加(米国特許第4、l[io、0113号参照)
、蛍光偏光(J 、Exp、Med、+2271102
9頁(IH5)参照)、酵素基質−標識化免疫試験(米
国特許第4,279,992号および英国特許明細舎弟
1,552,807号参照)、補欠分子族−標識化免疫
試験(米国特許第4.238.565号参照)、例えば
阻害物標識(米国特許第4,134,9?2号およU第
4.273,868号参照)を用いる酵素活性調整物−
標識化免疫試験、酵素−標識化免疫試験(米国時δ1第
3,817,837吋参照)、エネルキー移動免疫試験
(米国特許第3.99fl、345号参jip、)、化
学的−励起t+’光免疫試験(米国特許第4,238,
195号参照)および二重抗体立体障害免疫試験(米国
特許第3.935,074号および第3,9H,943
号参!!9)のような手法を包含する。
さらに、本発明の誘導体は、1.記の種々の免疫試験を
遂行するのに必要とされる標識化複合体を製造するのに
用いることができる。標準方法により、適切な?A誘導
体、放射性標識化することもできまたは蛍光性部分を用
いて標識化することもできる。同様に、例えば、酵素基
質、補欠分子族、酵素活性調整物または酵素(蛋白質で
あり、かつ、1−述の免疫原性担体に同様にR1合され
うるちの)のような好ましい均一系手法のための適切な
標識部分を、誘導体と結合させて、標識化複合体を11
成することができる。
遂行するのに必要とされる標識化複合体を製造するのに
用いることができる。標準方法により、適切な?A誘導
体、放射性標識化することもできまたは蛍光性部分を用
いて標識化することもできる。同様に、例えば、酵素基
質、補欠分子族、酵素活性調整物または酵素(蛋白質で
あり、かつ、1−述の免疫原性担体に同様にR1合され
うるちの)のような好ましい均一系手法のための適切な
標識部分を、誘導体と結合させて、標識化複合体を11
成することができる。
〃rましい標識化複合体の一形式は、一般式:(式中、
βGO(GO)−は 1 であり、nは先に定義したとうりである。)を右する、
β−ガラクトシル−ウンベリフェロン(βGυ)で標識
されたものである。好ましくは、かかる複合体は、適す
ノな3−[N−(アミノアルキル)]−]アミノー3−
デオキシジゴキシゲニン誘?qとβGU−カルボン酢(
米国特許第4,228,978 吟)との従来のペプチ
ド縮合により製造される。βGU−標識化複合体は、基
質−標識化蛍光性免疫試験における標識化試薬としてイ
i用である(SLFI^ 米国持前第4’、279,9
92号参照)。
βGO(GO)−は 1 であり、nは先に定義したとうりである。)を右する、
β−ガラクトシル−ウンベリフェロン(βGυ)で標識
されたものである。好ましくは、かかる複合体は、適す
ノな3−[N−(アミノアルキル)]−]アミノー3−
デオキシジゴキシゲニン誘?qとβGU−カルボン酢(
米国特許第4,228,978 吟)との従来のペプチ
ド縮合により製造される。βGU−標識化複合体は、基
質−標識化蛍光性免疫試験における標識化試薬としてイ
i用である(SLFI^ 米国持前第4’、279,9
92号参照)。
別の形式の標識化複合体は、一般式:
11+i bose −(1’bos 、l−一几i1
x>flavin(式中、Ribose−(Phos)
2− Riboflavinは、FAI)中のりポフラ
ビンーピロホスフェート−リボース残基を表わし、rは
2から10までの整勿であり、nは先に定義したとうり
である。)を右する。フラヒンアテニンジヌクレオチド
(FAD)で標識化さ1tたものである。かかる複合体
は、適切なN1(−ω−アミノアルキル−FAD銹導体
(米国時W 第4.255.5Eie号)と適切なN−
(カルボキシアルキル)−アミノ−3−デオキシジゴキ
シゲニン誘4 体とのペプチドlit合により製造され
る。FAD−標識化複合体は、アポ酵素再活性化免疫試
験系における標識化試薬として有用である(APIS
米国特許第4.238.565時参照)。
x>flavin(式中、Ribose−(Phos)
2− Riboflavinは、FAI)中のりポフラ
ビンーピロホスフェート−リボース残基を表わし、rは
2から10までの整勿であり、nは先に定義したとうり
である。)を右する。フラヒンアテニンジヌクレオチド
(FAD)で標識化さ1tたものである。かかる複合体
は、適切なN1(−ω−アミノアルキル−FAD銹導体
(米国時W 第4.255.5Eie号)と適切なN−
(カルボキシアルキル)−アミノ−3−デオキシジゴキ
シゲニン誘4 体とのペプチドlit合により製造され
る。FAD−標識化複合体は、アポ酵素再活性化免疫試
験系における標識化試薬として有用である(APIS
米国特許第4.238.565時参照)。
本発明の試薬は、本発明により包含される所望のンゴキ
シン免疫試験法を行うのに必要とされる1べての必須の
化学的な要素からなる。試薬または系は、試薬間での両
立ができる範囲で組成物もL < l1ljii!合物
として箱詰め状の市販品の形で;試11t・!1.の形
で;または、試験キy)すなわち必要な試薬を保管する
lまたはそれ以−1−の容器の箱詰め組合セとして提供
される。試薬には、所9の結合反応系に適切な試薬、例
えば、本発明の抗体および標識化複合体が含まれる。勿
論、この試薬は、唇種1液、希釈剤、標準液等のような
当業者に公知の、かつ、商業−1−およびユーザーの立
場からψましい他の物質を含有することもできる。特に
好ましいものは、(a)本発明の抗−ジゴキシン抗体お
よび(b)抗体と結合する際変化する検出可能な性質を
有する標識化ジゴキシゲニン複合体からなる本発明の均
一系競争結合免疫試験用の試験キットである。また、試
薬組成物およびそれを包含せしめた、固体状JLJ体材
仕材なる試験具が好ましい。
シン免疫試験法を行うのに必要とされる1べての必須の
化学的な要素からなる。試薬または系は、試薬間での両
立ができる範囲で組成物もL < l1ljii!合物
として箱詰め状の市販品の形で;試11t・!1.の形
で;または、試験キy)すなわち必要な試薬を保管する
lまたはそれ以−1−の容器の箱詰め組合セとして提供
される。試薬には、所9の結合反応系に適切な試薬、例
えば、本発明の抗体および標識化複合体が含まれる。勿
論、この試薬は、唇種1液、希釈剤、標準液等のような
当業者に公知の、かつ、商業−1−およびユーザーの立
場からψましい他の物質を含有することもできる。特に
好ましいものは、(a)本発明の抗−ジゴキシン抗体お
よび(b)抗体と結合する際変化する検出可能な性質を
有する標識化ジゴキシゲニン複合体からなる本発明の均
一系競争結合免疫試験用の試験キットである。また、試
薬組成物およびそれを包含せしめた、固体状JLJ体材
仕材なる試験具が好ましい。
種々の形のかかる試験具は、ヨーロンパ特許出願第51
,213号として公開されている、1880年10J]
301(出願の米国特許出願第202,378号に記載
されている。好ましい試験キ7)および試験具に用いら
れる特異的標識は、上述のように、用いられる手法に依
るであろう。
,213号として公開されている、1880年10J]
301(出願の米国特許出願第202,378号に記載
されている。好ましい試験キ7)および試験具に用いら
れる特異的標識は、上述のように、用いられる手法に依
るであろう。
ここに、本発明を説明するが、ハ′の実施例により限定
されるものではない。
されるものではない。
1庭1J
ジコキシゲニン誘導体の製造
3−N−(6−アミノヘキシル アミノ−3−デオキシ
ジゴキシゲニン 3−シゴキシゲノン [タムおよびカプラー(Tata
and Gublerl 、1lelv、chim、A
cta 42巻=238頁(1959)ならひにシミズ
およびミツハシTetrahedron 24if:4
207頁(19f(8) Ifグラム(g)(2,58
mmol)、1、[1−ヘキサンジアミン3.21g
(27,6Hmol)、およびメタノール(C)130
)1)50・ミリリットル(ml)の混合物を氷酢酸で
pH13に調節し、水素化シアノ硼素ナトリウ1.12
5ミリグラム(mg)(1,99mrol)で処理した
。−晩+1’l!拌後、混合物をシリカゲル(S 10
2 ) 5 gにP面吸着させS + 02−80 [
イー・メルク(E、Merkl、西ドイツ]を用いてク
ロマトグラフィーにかけ、先ス2:l: I りt:+
0 ホAy ムCCHCl 、)−CH30)1−1
4%水酸化アンモニウム(N II 4011 ) 3
リツi・ル(L)で、ついC12:I:1cIlc、u
−co 011−211%NH4O+1混合物3L
テ溶出3 した。/ll動物2種類の3αおよびβ−異性体の1つ
の部分分離を行なった。この生成物を含む両分をひとま
とめにし、濃縮し、インプロパノ−ルー1・l(エーテ
ル−ヘキサン)より無定形白色粉末どしで沈澱させた。
ジゴキシゲニン 3−シゴキシゲノン [タムおよびカプラー(Tata
and Gublerl 、1lelv、chim、A
cta 42巻=238頁(1959)ならひにシミズ
およびミツハシTetrahedron 24if:4
207頁(19f(8) Ifグラム(g)(2,58
mmol)、1、[1−ヘキサンジアミン3.21g
(27,6Hmol)、およびメタノール(C)130
)1)50・ミリリットル(ml)の混合物を氷酢酸で
pH13に調節し、水素化シアノ硼素ナトリウ1.12
5ミリグラム(mg)(1,99mrol)で処理した
。−晩+1’l!拌後、混合物をシリカゲル(S 10
2 ) 5 gにP面吸着させS + 02−80 [
イー・メルク(E、Merkl、西ドイツ]を用いてク
ロマトグラフィーにかけ、先ス2:l: I りt:+
0 ホAy ムCCHCl 、)−CH30)1−1
4%水酸化アンモニウム(N II 4011 ) 3
リツi・ル(L)で、ついC12:I:1cIlc、u
−co 011−211%NH4O+1混合物3L
テ溶出3 した。/ll動物2種類の3αおよびβ−異性体の1つ
の部分分離を行なった。この生成物を含む両分をひとま
とめにし、濃縮し、インプロパノ−ルー1・l(エーテ
ル−ヘキサン)より無定形白色粉末どしで沈澱させた。
収f?!338 m g (27駕)。
分析:C29H28N2041/2H20として、削算
値 C,69,9!l;H,+0.08;N、5.8
3実験値 C,f(9,ft8.)I、 9.Eil
、N、5.71’HNMR(90mllz 、DMSO
−de) ’δQ、81((s、3H);0.85
(s、311); 1.29(m、28tl):2
.35 (m、3tl); 7.+1 (m、
7H);4.09 (m、1旧; 4.87 (s、
2l−1);5.81 (s、LH)。
値 C,69,9!l;H,+0.08;N、5.8
3実験値 C,f(9,ft8.)I、 9.Eil
、N、5.71’HNMR(90mllz 、DMSO
−de) ’δQ、81((s、3H);0.85
(s、311); 1.29(m、28tl):2
.35 (m、3tl); 7.+1 (m、
7H);4.09 (m、1旧; 4.87 (s、
2l−1);5.81 (s、LH)。
IR(KCL) : 2B40,2870.17
40.1625.1395゜1025cm’ CII 30 It 30 m I中の3−ジコ上シゲ
ノ7300mg (0,77mmol)および6−アミ
ノカプロン酸5Hmg(3,88mmol)のけん濁液
に、水素化シアノ硼素すトリウi、253mgを添加し
た。混合物を一晩室温でIW任した。反応混合物の反応
を水0.5m lで停止にし、減圧−トで蒸発させた。
40.1625.1395゜1025cm’ CII 30 It 30 m I中の3−ジコ上シゲ
ノ7300mg (0,77mmol)および6−アミ
ノカプロン酸5Hmg(3,88mmol)のけん濁液
に、水素化シアノ硼素すトリウi、253mgを添加し
た。混合物を一晩室温でIW任した。反応混合物の反応
を水0.5m lで停止にし、減圧−トで蒸発させた。
残香をI Om I CI! 3011に採取しS +
021 g 、1−に予備吸着させ、S i O2の
3.5tl8cmのカラl・を用いてクロマトグラフィ
ーにかけ、1.:L:I:の0110文、 −CIf
30 H−濃N If 40 H混合物を用いて溶出し
た。所望の生成物を含有する両分をひとまとめにし、蒸
発させて、無色ガラス状物質5Hmgを?1また。試料
を水2mlに溶解し、セファデックス(5ephade
x” l Ltl−20[ファルマシアφピスカタウェ
イ・ニューシャーシー・アメリカ合衆国(Pharma
cia、Piscataway、NJ、USAIIの2
.5!90CI11のカラトを用いてクロマトグラフィ
ーにかけ、水で溶出した。C−3異性体の混合物として
の生成物を含有する両分をひとまとめにし、ついで蒸発
させた。生成物をCIf 30 H/エーテルー石油エ
ーテルより白色粉末として得た。収量279mg(72
%)。mp 1?2=180℃。
021 g 、1−に予備吸着させ、S i O2の
3.5tl8cmのカラl・を用いてクロマトグラフィ
ーにかけ、1.:L:I:の0110文、 −CIf
30 H−濃N If 40 H混合物を用いて溶出し
た。所望の生成物を含有する両分をひとまとめにし、蒸
発させて、無色ガラス状物質5Hmgを?1また。試料
を水2mlに溶解し、セファデックス(5ephade
x” l Ltl−20[ファルマシアφピスカタウェ
イ・ニューシャーシー・アメリカ合衆国(Pharma
cia、Piscataway、NJ、USAIIの2
.5!90CI11のカラトを用いてクロマトグラフィ
ーにかけ、水で溶出した。C−3異性体の混合物として
の生成物を含有する両分をひとまとめにし、ついで蒸発
させた。生成物をCIf 30 H/エーテルー石油エ
ーテルより白色粉末として得た。収量279mg(72
%)。mp 1?2=180℃。
分析:C2゜H45NO61/2+1として、1:1q
値:C,e8.ol;H,9,04;N、2.73実験
イdi :C,88,+4;14,9.28;N、2.
47110(MR(90m1lz、DH8O−d6):
δ0.65 (s、3H);0.85(s、311
); 1.38 (m、31H);2.5 (m、2)
1); 2.97 (m、10);3.23 (m、2
B); 4.02 (H,、O);4.87 (s
、211); 5.82 (s、IH)IR(M
CI) : 2940.28F10.1780.1
745,1f125゜1570.1455.1400c
m’ 夫」自排ヱ 抗−ジゴキシン抗体の製造 3−N−(5−カルボキシペンデル)アミノ−3−デオ
キシジゴキシゲニン 13 ミリグラムを、トリーn−
−jfルアミン フル1を含有する乾燥ジメチルポルム
アミド 0.3mlに溶解し、この71g合物を水浴中
で冷却した。クロロギ酸エチル10マイクロリツ)・ル
(kl)を添加し、15分間反応さぜた。この反応混合
物を、 1.ON*酸化ナトリウム(NaOH) 12
5μ、1を含有する水Sml中に溶解した仔ウシ血清ア
ルブミン 125mgの攪拌溶液に摘ドした。24時間
後、反応物を、 0.1Mリン酸ナトリウL1緩衝液(
p+47.o)テ平衡化した5ephadex” G−
25(相)〔ファルマシア(Pharmaciallの
2.5X 55cmカラムを用いてクロマトグラフィー
にかけ、両分10.5mlを採集した。画分13の28
0ナノメーI・ル(nm)での吸光1((を記録した。
値:C,e8.ol;H,9,04;N、2.73実験
イdi :C,88,+4;14,9.28;N、2.
47110(MR(90m1lz、DH8O−d6):
δ0.65 (s、3H);0.85(s、311
); 1.38 (m、31H);2.5 (m、2)
1); 2.97 (m、10);3.23 (m、2
B); 4.02 (H,、O);4.87 (s
、211); 5.82 (s、IH)IR(M
CI) : 2940.28F10.1780.1
745,1f125゜1570.1455.1400c
m’ 夫」自排ヱ 抗−ジゴキシン抗体の製造 3−N−(5−カルボキシペンデル)アミノ−3−デオ
キシジゴキシゲニン 13 ミリグラムを、トリーn−
−jfルアミン フル1を含有する乾燥ジメチルポルム
アミド 0.3mlに溶解し、この71g合物を水浴中
で冷却した。クロロギ酸エチル10マイクロリツ)・ル
(kl)を添加し、15分間反応さぜた。この反応混合
物を、 1.ON*酸化ナトリウム(NaOH) 12
5μ、1を含有する水Sml中に溶解した仔ウシ血清ア
ルブミン 125mgの攪拌溶液に摘ドした。24時間
後、反応物を、 0.1Mリン酸ナトリウL1緩衝液(
p+47.o)テ平衡化した5ephadex” G−
25(相)〔ファルマシア(Pharmaciallの
2.5X 55cmカラムを用いてクロマトグラフィー
にかけ、両分10.5mlを採集した。画分13の28
0ナノメーI・ル(nm)での吸光1((を記録した。
また、この両分の200g+を連破ieQ、8ml と
混合し、 340から450n、mまでの吸光スペクト
ルを記録した。このスペクトルから得た380nmでの
吸光度を用いて、ジゴキシゲニン誘導体の38Or+n
+でのミリモル吸光係数を 3.2と見做して、仔つシ
面清アルブミンと結合したジゴキシゲニン誘導体のMを
11111 した。ハプテン:蛋白質のモル比は8,6
であった。
混合し、 340から450n、mまでの吸光スペクト
ルを記録した。このスペクトルから得た380nmでの
吸光度を用いて、ジゴキシゲニン誘導体の38Or+n
+でのミリモル吸光係数を 3.2と見做して、仔つシ
面清アルブミンと結合したジゴキシゲニン誘導体のMを
11111 した。ハプテン:蛋白質のモル比は8,6
であった。
クロマトグラフィーからの画分12ないし15をひとま
とめにし、免疫化に用いた。このひとまとめにしたもの
を 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH70)で希
釈し、0.4mg/mlの蛋白質濃度を得た。この免疫
原lミリリットルをフロイント完全アジュパンl−1m
1と合わせ、ラビットに皮下tI射を施した。ブースタ
ー免疫化を4週間間隔で行ない、これらの免疫原をフロ
インド不完全アジュバントと合わせた。ブースターの一
週間後に、試験採血を行なった。最初の免疫化後5ケ月
後には、適切な滴定141の抗血清を畳た。
とめにし、免疫化に用いた。このひとまとめにしたもの
を 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH70)で希
釈し、0.4mg/mlの蛋白質濃度を得た。この免疫
原lミリリットルをフロイント完全アジュパンl−1m
1と合わせ、ラビットに皮下tI射を施した。ブースタ
ー免疫化を4週間間隔で行ない、これらの免疫原をフロ
インド不完全アジュバントと合わせた。ブースターの一
週間後に、試験採血を行なった。最初の免疫化後5ケ月
後には、適切な滴定141の抗血清を畳た。
γ胤狙」
標識化ジゴキシゲニン複合体の製造
シゲニン
ジメチルホルムアミド5ml中の7−β−カラクI・シ
ルクマリン−3−カルボン酸(米国特a1第4.228
,978号) 243mg(0,f(emIIlol)
およびN−ヒト゛ロキシサクシンイミF 84mg(0
,73mmol)に、ジシクロへキシルカルボジイミド
143mg(O139a+mol)をアルゴン気体下、
0°Cで添加した。混合物を4時間に亘って0℃から室
温まで温めた。この混合物に3−N−(6−アミンヘキ
シル)アミノ−3−デオキシジゴキシゲニン322mg
(0,flθmmo l )を1后加し、得られた溶液
を一晩攪拌した。粗反応混合物をシリツク・ニー・アー
ル(登録商標5ilicARo)CG−7[マリンクロ
ット・セント・ルイスφミズーリΦアメリカ合衆国(M
allinckrodt、 St、Louis、Mis
souri USAIIIg、l−に吸着させ、かつ、
エタノールで充填された5ilicAR” CC−7(
1’) 2.5X 80cmカラムに施した。カラムを
、エタノール2Lより 4=1エタノール−11’VI
トリエチル炭酸水素アンモニウム(pH7,5)i合
物21、まで徐々に変化する直線勾配溶液を用いて溶出
した。生成物を含有する両分をひとまとめにし、ノ入発
させ、ついで生成物をメタノール−1°1工−テル/石
油エーテルより沈殿させた。
ルクマリン−3−カルボン酸(米国特a1第4.228
,978号) 243mg(0,f(emIIlol)
およびN−ヒト゛ロキシサクシンイミF 84mg(0
,73mmol)に、ジシクロへキシルカルボジイミド
143mg(O139a+mol)をアルゴン気体下、
0°Cで添加した。混合物を4時間に亘って0℃から室
温まで温めた。この混合物に3−N−(6−アミンヘキ
シル)アミノ−3−デオキシジゴキシゲニン322mg
(0,flθmmo l )を1后加し、得られた溶液
を一晩攪拌した。粗反応混合物をシリツク・ニー・アー
ル(登録商標5ilicARo)CG−7[マリンクロ
ット・セント・ルイスφミズーリΦアメリカ合衆国(M
allinckrodt、 St、Louis、Mis
souri USAIIIg、l−に吸着させ、かつ、
エタノールで充填された5ilicAR” CC−7(
1’) 2.5X 80cmカラムに施した。カラムを
、エタノール2Lより 4=1エタノール−11’VI
トリエチル炭酸水素アンモニウム(pH7,5)i合
物21、まで徐々に変化する直線勾配溶液を用いて溶出
した。生成物を含有する両分をひとまとめにし、ノ入発
させ、ついで生成物をメタノール−1°1工−テル/石
油エーテルより沈殿させた。
IIM IHt l 24mg。試料を、エタノール
で充填されたセフyデリクス(登録商標 5ephad
exθ)L[(−201フアルマシア(PharIll
acia)]の2.5X 60cmカラムに施し、エタ
ノールを用いて溶出した。溶媒を蒸発させ、メタノール
−1:1エーテル/ヘキサンより沈殿させて、生成物を
得た。収172mg(13%) 。
で充填されたセフyデリクス(登録商標 5ephad
exθ)L[(−201フアルマシア(PharIll
acia)]の2.5X 60cmカラムに施し、エタ
ノールを用いて溶出した。溶媒を蒸発させ、メタノール
−1:1エーテル/ヘキサンより沈殿させて、生成物を
得た。収172mg(13%) 。
mp152°C(分解)。
分析” 45He2N2013 ・4■20として、、
1算値: C,59,5; H,?、8; N、 3.
1実験値: C,59,7; H,7,o; N、 3
.8’)I NHR(90mHz、DMSO−d8):
δQ、t15(s、3)1);0.86(s、311
); 1.35(m、2611);2.3(m、211
); 3.55(m、1311);4.08(IIl、
211); 4.f19(m、311);4.87(s
、2H); 5.04(d、J=7Hz、IH);5.
82(s、IH); e、41(m、IM);7.15
(s、IH); 7.21(d、J=8Hz、IH);
7.93(d、J=8)1z、l1l);8.83(b
t、J=6tlz、!tl);8.82(s、IH)。
1算値: C,59,5; H,?、8; N、 3.
1実験値: C,59,7; H,7,o; N、 3
.8’)I NHR(90mHz、DMSO−d8):
δQ、t15(s、3)1);0.86(s、311
); 1.35(m、2611);2.3(m、211
); 3.55(m、1311);4.08(IIl、
211); 4.f19(m、311);4.87(s
、2H); 5.04(d、J=7Hz、IH);5.
82(s、IH); e、41(m、IM);7.15
(s、IH); 7.21(d、J=8Hz、IH);
7.93(d、J=8)1z、l1l);8.83(b
t、J=6tlz、!tl);8.82(s、IH)。
IR(KCI): 1735. 1710. 184
5. Ifl15. 1545゜1220.1075
cm−’ 。
5. Ifl15. 1545゜1220.1075
cm−’ 。
ジゴキシゲニン−FAD
乾燥ジメチルホルムアミド9.5ml中の3−N−(5
−カルボキシペンチル)アミノ−3−テスオキシジコキ
シゲニン25.2B(50JLmol)およびN−ヒド
ロキシサクシンイミドe、3n+g(5e川mmol)
に、乾燥ジメチルスルホキシドO,eml’中に溶解し
たジシクロへキシルカルボジイミド 10.8mg(5
2g mol)溶液を、アルゴン気体ド、0°Cで添加
した。反応物を、0°Cで30分ついで室温で30分子
f+!拌した。水 1mlに溶解したN8−(!!−ア
ミノヘキシル)−フラヒンアデニンジヌクレオチド(米
国特許第4,255.5H吟)10メLmol溶液を、
1−記溶液に添加し、−ンシ)で、混合物を室温で一晩
撹拌した。次に、灰石混合物を水で450m1 まで希
釈し、DEAE−セルロース(炭酸水素111型)の
1.5X30センチメートル(cm)カラムに施した。
−カルボキシペンチル)アミノ−3−テスオキシジコキ
シゲニン25.2B(50JLmol)およびN−ヒド
ロキシサクシンイミドe、3n+g(5e川mmol)
に、乾燥ジメチルスルホキシドO,eml’中に溶解し
たジシクロへキシルカルボジイミド 10.8mg(5
2g mol)溶液を、アルゴン気体ド、0°Cで添加
した。反応物を、0°Cで30分ついで室温で30分子
f+!拌した。水 1mlに溶解したN8−(!!−ア
ミノヘキシル)−フラヒンアデニンジヌクレオチド(米
国特許第4,255.5H吟)10メLmol溶液を、
1−記溶液に添加し、−ンシ)で、混合物を室温で一晩
撹拌した。次に、灰石混合物を水で450m1 まで希
釈し、DEAE−セルロース(炭酸水素111型)の
1.5X30センチメートル(cm)カラムに施した。
カラムを、2.8+nl/分の流速で、If201.5
1.よ!JO,1Mトリエチル炭酸水素アンモニウム(
pH7,5)1.5Lまで徐々に変化する直線勾配溶液
を用いで溶出した。!7n+l/分の両分を採取した。
1.よ!JO,1Mトリエチル炭酸水素アンモニウム(
pH7,5)1.5Lまで徐々に変化する直線勾配溶液
を用いで溶出した。!7n+l/分の両分を採取した。
生成物を含有する両分16〜32をひとまとめにし、濃
縮し、ついでp117.0、容Ji25mlに調整した
。450nm番ζお(Jる吸光度測定(o、e8o)よ
り、11,3としてのFADのミリモル吸光係数を基と
して、収量は1.903 gmol(収率18%)と算
出された。
縮し、ついでp117.0、容Ji25mlに調整した
。450nm番ζお(Jる吸光度測定(o、e8o)よ
り、11,3としてのFADのミリモル吸光係数を基と
して、収量は1.903 gmol(収率18%)と算
出された。
実UしイLA
ジコヤシゲニン−FADの特性
シボキシゲニンカルポン酸誘導体のNOSエステルおよ
びアミンへキシル−FADの反応混合物試才1(10ル
1)を、イソ酪酸−1120−1−リエチルアミン(7
0・29・1)を用いて、薄層クロマトグラフィーにか
けた。Rf=0.2のスポットをプレートより削り取り
、0.1 Mリン酸塩緩衝液(pH7,0)1.0ml
中にけん尚させた。」−澄の・部0.35m1を、0、
IM リン酸緩衝液(pH7,0)2.1mM 3
.5−ジクロル−2−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナ
トリウム 1.1%(wハ) 仔ウシ血清アルブミン21gg/m
l ペルオキシダーゼ 0、105M グルコース よりなるグルコースオキシダーゼ試験試薬 100ル1
と混合した。2マイクロモル(g M)FAD結合部位
; 10%(v/v)グリセロール;4マイクロモル(
gM)4−アミノアンチピリン、0.1モル(M) リ
ン酸塩(pH7,0)よりなるアポグルコースオキシダ
ーゼ試薬を調製した。ジゴキシンに対する抗血清(アi
・ランティック嗜アンティボディズ、スケアポロウ、メ
イン・アメリカ合衆国(AtlanticAntibo
dies、Scarborough、)laine t
ls^))を0.1Mリン酸LUX (pH7,’O)
で10倍に希釈して用いた。0.1Mリン酸塩(pH7
,0)に溶解したジゴキシン(130gl’l)溶液を
同一!a衝液を用いて希釈した。
びアミンへキシル−FADの反応混合物試才1(10ル
1)を、イソ酪酸−1120−1−リエチルアミン(7
0・29・1)を用いて、薄層クロマトグラフィーにか
けた。Rf=0.2のスポットをプレートより削り取り
、0.1 Mリン酸塩緩衝液(pH7,0)1.0ml
中にけん尚させた。」−澄の・部0.35m1を、0、
IM リン酸緩衝液(pH7,0)2.1mM 3
.5−ジクロル−2−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナ
トリウム 1.1%(wハ) 仔ウシ血清アルブミン21gg/m
l ペルオキシダーゼ 0、105M グルコース よりなるグルコースオキシダーゼ試験試薬 100ル1
と混合した。2マイクロモル(g M)FAD結合部位
; 10%(v/v)グリセロール;4マイクロモル(
gM)4−アミノアンチピリン、0.1モル(M) リ
ン酸塩(pH7,0)よりなるアポグルコースオキシダ
ーゼ試薬を調製した。ジゴキシンに対する抗血清(アi
・ランティック嗜アンティボディズ、スケアポロウ、メ
イン・アメリカ合衆国(AtlanticAntibo
dies、Scarborough、)laine t
ls^))を0.1Mリン酸LUX (pH7,’O)
で10倍に希釈して用いた。0.1Mリン酸塩(pH7
,0)に溶解したジゴキシン(130gl’l)溶液を
同一!a衝液を用いて希釈した。
アポ酵素試薬および希釈ジゴキシン抗血rk100マイ
クロリッi・ル(g l)を、使い捨て9f能なキュベ
ントの−・隅に置いて試験を行なったe緩衝液または希
釈ジゴキシン濃度 (10gl>を反対の一隅に置いた
うグルコースオキシダーゼ試験試薬1.90m1を添加
して反応を開始した。試験物を25°Cで10分間温4
し、 52Qr+I11での吸光度を記録した。ジゴキ
シンの最終濃度はe5nMであった。
クロリッi・ル(g l)を、使い捨て9f能なキュベ
ントの−・隅に置いて試験を行なったe緩衝液または希
釈ジゴキシン濃度 (10gl>を反対の一隅に置いた
うグルコースオキシダーゼ試験試薬1.90m1を添加
して反応を開始した。試験物を25°Cで10分間温4
し、 52Qr+I11での吸光度を記録した。ジゴキ
シンの最終濃度はe5nMであった。
fflA520nm(10分後戸
−797740
54G3 71+11
10 391 50520
354 37830
344 339t2回の実験値を、標識が
ない場合の空活性爪(Ill A 520□=+o5)
に対して補正したものの平均害−梅Jff 3−ト(5−カルボキシペンチル)アミノ−3−デスオ
キシショキシゲニンに対する抗血清の滴定標識化複合体
としてβ−GO−ジゴキシゲニン複合体を用いる基質−
標識化蛍光免疫試験(SLFI^;米国特許第4,27
8,992号参照)法で滴定を行なった。50nll八
イシン緩衝液(pH8,3)3ミリリンドルを6個のキ
ュベントに旧り取り、下記に掲げた容量の抗血清を適切
なキュベントに添加した。次に、 340++mでの吸
光度が0.01のβ−GU−ジゴキシゲニン 100g
1を淫加した。最後に、イー−コリiE、colilよ
り得られたβ−カラクトシダーセ 100pLlを添加
し、ついで反応物を室温で20分間放置した。(171
11位の酵素活性は25°Cで、50nNパイシン緩衝
液(pit 8.3)中で、1分間当り0−ニトロフェ
ニル−β−ガラクトシターゼ IpLmol を加水分
解する。)この温4期間の最後に、励起として4QOn
m光を、発光として 450nm光を用いてイ1f光を
記録し。
354 37830
344 339t2回の実験値を、標識が
ない場合の空活性爪(Ill A 520□=+o5)
に対して補正したものの平均害−梅Jff 3−ト(5−カルボキシペンチル)アミノ−3−デスオ
キシショキシゲニンに対する抗血清の滴定標識化複合体
としてβ−GO−ジゴキシゲニン複合体を用いる基質−
標識化蛍光免疫試験(SLFI^;米国特許第4,27
8,992号参照)法で滴定を行なった。50nll八
イシン緩衝液(pH8,3)3ミリリンドルを6個のキ
ュベントに旧り取り、下記に掲げた容量の抗血清を適切
なキュベントに添加した。次に、 340++mでの吸
光度が0.01のβ−GU−ジゴキシゲニン 100g
1を淫加した。最後に、イー−コリiE、colilよ
り得られたβ−カラクトシダーセ 100pLlを添加
し、ついで反応物を室温で20分間放置した。(171
11位の酵素活性は25°Cで、50nNパイシン緩衝
液(pit 8.3)中で、1分間当り0−ニトロフェ
ニル−β−ガラクトシターゼ IpLmol を加水分
解する。)この温4期間の最後に、励起として4QOn
m光を、発光として 450nm光を用いてイ1f光を
記録し。
た。
0 941
802
665
3210
3520 32抗而
枯濃度が増加するにつれ蛍光が減少した。
802
665
3210
3520 32抗而
枯濃度が増加するにつれ蛍光が減少した。
すなわち、抗体がβ−GU−ジゴキシゲニン複合体に4
1、合していることを示している。
1、合していることを示している。
凋凰皇」
ジゴキシン免疫試験
50mM0mMバイシンP:液(pit fl、3)3
.0ml を含有するヤーユヘ71に、種々のMの2ル
hジゴキシンを棒加し、F記に掲げた最終濃度のジゴキ
シンを得た。パイシンに溶解したβ−カラクトシダーゼ
(0,6中f隻“l/ml) 100マイクロリットル
を各キュベン1に添加し、反応物を室温で20分間放置
した。この期間終了時にilt光を記録した。次の結果
がfIIられた。
.0ml を含有するヤーユヘ71に、種々のMの2ル
hジゴキシンを棒加し、F記に掲げた最終濃度のジゴキ
シンを得た。パイシンに溶解したβ−カラクトシダーゼ
(0,6中f隻“l/ml) 100マイクロリットル
を各キュベン1に添加し、反応物を室温で20分間放置
した。この期間終了時にilt光を記録した。次の結果
がfIIられた。
39
7.8 44
552
865
+52 85
ジゴキシン濃度が増加するにつれ、蛍光が増加し、ジゴ
キシンおよびβ−GU−ジゴキシゲニン複合体が、抗体
結合部位に対して拮抗していることを示している。
キシンおよびβ−GU−ジゴキシゲニン複合体が、抗体
結合部位に対して拮抗していることを示している。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ■1式: (式中、Carrierは免疫原性担体材、Rは結合ま
たは連結基、見およびmの一方はlで他方は0、nは2
かも10までの整数、およびPは平均して1から約50
までである。)で示されることを特徴とするジゴキシゲ
ニン免疫原複合体。 2、Rが、結合または水素を除くlないし20個の原子
からなる原子鎖である特許請求の範囲881項記載の複
合体。 3、Rが、ジゴギシゲニン部分のアミン末端基またはカ
ルボキシル末端基を、担体村上のアミノ基またはカルボ
キシル基に連結する二官能性結合試薬の残基である特許
請求の範囲第1項記載の複合体。 4、該担体材が、免疫原性蛋白質または免疫性ポリペプ
チドである特許請求の範囲第1項ないし第3項のいずれ
かに記載の複合体。 5、式: (式中、Carrierは免疫原性蛋白質11体材また
は免疫原性ポリペプチド担体材であり、Yは、担仕材J
二のカルボキシル基またはアミン基を、ジゴギシゲニン
部分に連結するアミド基であり、nは2からlOまでの
整数であり、Pは、平均してlから担体材」二の利用し
うるアミド結合部位の数までである。)で示されること
を特徴とするジゴキシゲニン免疫原複合体。 6、pが、平均してlおよび約50の間である特許請求
の範囲wS5項記載の複合体。 7、該担体材が、アルブミンである#詐請求の範囲fj
S5項記載の複合体。 8.7ミド基Y中の窒素原子が、担体材中のアミン基か
らのものであり、アミF基Y中の炭素原rが、式中のア
ルキレン基と結合している特許請求の範囲第6項または
第7項記載の複合体。 9、nが5である特許請求の範囲第8項記載の複合体。 10、式: (式中、Carrierは免疫原性担体材、Rは結合ま
たは連結基、文およびmの一方は1で他方は0、nは2
から10までの整数、およびpは平均してlから約50
までである。)で示されるジゴキシゲニン免疫原複合体
に対して産生されたことを特徴とする抗体。 Il、式: (式中、Carrier It免疫原性蛋白質担体材ま
たは免4ジ原慴ポリペプチド担体材であり、Yは、担体
材1.0カルボキシル八またはアミツノAを、ジ」キシ
ケニン部分に連結するアミド基であり、nは2か610
までの整数であり、pは、平均してlから411体材上
の利用しうるアミド結合部位の数までである。)で示さ
れるジゴキシゲニン免疫原複合体lこ対して産生された
ことを特徴とする抗体。 12、該式中、該アミド基Y中の窒素原子が、該JIj
体材中材中ミン基からのものであり、該アミド基Y中の
)k素原子が、式中のアルキレン基と結合1、ており、
nが5であり、Pが平均してlおよび約50の間である
特許請求の範囲第11項記載の抗体。 13該式中、1tAcarrierがアルブミンであり
、該アミl” J、(Y中の窒素部r−が、アルブミン
中のアミン基からのものであり、該アミド基Y中の炭素
11;j (か、式中のアルキレン基と結合しており、
nか5である!t!r +i’r請求の範囲第1+ z
li記戦の抗体。 14、j(、・ (式中、nが2から10までの整数である。)で示され
ることを特徴とするジゴキシゲニン誘導体。 15、 nが6である特許請求の範囲第14項記載の
誘導体。 16、ジコキシンに対する抗体として、式;(式中、C
arrierは免疫原性4t4体材、Rは結合または連
結基、立およびmの一方はlで他方は0、nは2からl
Oまでの整数、およびpは平均しでlから約50までで
ある。)で示されるジゴキシケニン免疫原複合体に対し
て産生された抗体を用いることを特徴とするジゴキシン
測定用免疫試験法・ !?、ジゴキシンに対する抗体として、式:(式中、C
arrierは免疫原性蛋白g1.担体材または免疫原
性ポリペプチド担体材であり、Yは、担体材」6のカル
ボキシル基またはアミン基を、ジコキシゲニン部分に連
結するアミド基であり、nは2からIOまでの整数であ
り、pは、平均してlから担体材にの利用しうるアミド
結合部位の数までである。)で示されるジゴキシゲニン
免疫原複合体に対して産生された抗体を用いることを特
徴とするジゴキシン測定用免疫試験法。 +8.該式中、該アミド基Y中の窒素原子が、該担体材
中のアミノ基からのものであり、該アミド基Y中の炭素
原子が、式中のアルキレン基と結合I7ており、nが5
であり、pが平均してlおよび約50の間である特許請
求の範囲第17項記載の試験l去 。 19、該式中、該Carrierがアルブミンであり、
該アミド基Y中の窒素原子が、アルブミン中のアミ7基
からのものであり、該アミI−基Y中の炭素原子が、式
中リアルキレン基と結合しており、nが5である特許請
求の範囲第17項記載の試験法。 20、ジゴキシンに対する抗体として、式:(式中、C
arrierは免疫原性担体材、Rは結合または連結基
、見およびmの一方はlで他方は0、nは2から10ま
での整数、およびpは平均してlから約50までである
。)で示されるジゴキシゲニン免疫原複合体に対して産
生された抗体を用いることを特徴とする免疫試験による
ジゴキシン測定用試薬。 21、ジゴキシンに対する抗体として、式:(式中、C
arrierは免疫原性蛋白質担体材または免疫原性ポ
リペプチド担体材であり、Yは、担体村上のカルボキシ
ル基またはアミノ基を、ジゴキシゲニン部分に連結する
アミド基であり、nは2からlOまでの整数であり、p
は、平均してlから担体村上の利用しうるアミド結合部
位の数までである。)で示されるジゴキシゲニン免疫原
複合体に対して産生された抗体を用いることを特徴とす
る免疫試験によるジゴキシン測定用試薬822、該式中
、該アミド&Y巾の窒素原子が、該担体4 中の7ミノ
基からのものであり、該アミド&Y中の炭素原子が、式
中のアルキレン基と結合しており、nが5であり、pが
平均してlおよび約50の間である特許請求の範囲第2
1項記載の試薬。 23、該式中、該carrierがアルブミンであり、
該アミド基Y中の窒素原子が、アルブミン中のアミ7基
からのものであり、該アミド基Y中の炭素1’K rが
、人中のアルキレン基と結合しており、nが5である特
許請求の範囲第21項記載の試薬。 24、(a)式; (式中、Carrierは免疫原性担体材、Rは結合ま
たは連結基、見およびmの一方はlで他方は0、nは2
からlOまでの整数、およびpは平均して1から約50
までである。)で示されるジゴキシゲニン免疫原複合体
に対して産生された抗体および、(b)該抗体と結合す
る際変化する検出可能な性質を有する、標識化ジゴキシ
ン複合体または標識化ジゴキシゲニン複合体からなるこ
とを特徴とする、均一系免疫試験によるジゴキシン測定
用試験キット。 25、(a)式: (式中、Garrierは免疫原性蛋白質担体材または
免疫原性ポリペプチド担体創であり、Yは、担体村上の
カルボキシル基またはアミ7基を、ジコキシゲニン部分
に連結するアミ1:基であり、nは2かう10までの整
数であり、pは、平均して1から担体村上の利用しうる
アミド結合部位の数までである。)で示されるジゴキシ
ゲニン免疫原複合体に対して産生された抗体および、(
b)該抗体と111合する際変化する検出可能な性質を
有する。標識化ジゴキシン複合体または標識化ジゴキシ
ゲニン複合体からなることを特徴とする、均一・系免疫
試験によるジゴキシン4(11定用試験キ・ント626
該式中、該アミド基Y中の窒素用(子が、該111
体旧中のアミノ基からのものであり、該アミ1′基Y中
の炭素原rが1式中のアルキレンノルと結合しており、
nが5であり、pが平均してlおよび約50の間である
特許請求の範囲第25項記載の試験キット。 27、該式111、該Carrierがアルブミンであ
り、該アミドJ、l; Y中の窒素原子が、アルブミン
中のアミツノ、(力臼ろのものであり、該アミトノ^Y
中の炭素II;Crが、人中のアルキレン基と結合して
おり、nか5である特許請求の範囲第25 JJ’i記
戦の試験キ・21 。 21J、(a)式: (式中、Carrierは免疫原性40体材、Rは結合
または連結基、見およびmの一方はlで他方は0、nは
2からIOまでの整数、およびpは平均して1から約5
0までである。)で示されるジゴキシゲニン免疫原複合
体に対して産生された抗体および該抗体と結合する際変
化する検出可能な性質を有する標識化ジゴキシン複合体
または標識化ジゴキシゲニン複合体、ならびに、(b)
該試薬組成物を包含せしめた固体状11体部月からなる
ことを特徴とする、均一系免疫試験によるジゴキシン測
定用試験具。 29、(a)式: (式中、Carrierは免疫原性蛋白質担体材または
免疫原性ポリペプチド担体材であり、Yは、担体材I−
のカルボキシル基またはアミノ基を、ジゴキシゲニン部
分に連結するアミド基であり、nは2から10までの整
数であり、pは、平均してlかも1[1仕材1−の利用
しうるアミド結合部位の数までである。)で示されるジ
ゴキシゲニン免疫原複合体に対して産生された抗体およ
び該抗体と結合するV5変化する検出Ill能な性質を
有する標識化ジゴキシン複合体または標識化ジゴキシゲ
ニン複合体、ならびに、(b)、IA試薬組成物を包含
せしめた固体状担体部材からなることを特徴とする、均
一系免疫試験によるジ」キシン測定用試験具。 30、該式中、該アミド基Y中の窒素原子が、該J旦体
+4 中のアミ7基からのものであり、該アミド7jt
IY中の炭素原子が、式中のアルキレン基と結合してお
り、nが5であり、pが平均してlおよび約50の間で
ある特許請求の範囲ft529項記載の試験具。 31、該式中、該Carrierがアルブミンであり、
該アミド&Y中の窒素原子が、アルブミン中のアミノ基
からのものであり、該アミド基Y中の炭素原子が、式中
のアルキレン基と結合しており、nが5である特許請求
の範囲第28項記載の試験具。 32、式: (式中、βGU−(CO)−は、 1 であり、かつnは2からlOまでの整数である。)で示
されることを特徴とするβ−ガラクトシルーウンへリフ
ェロンージゴキシゲニン複合体。 33、nが6である特許請求の範囲第32項記載の複合
体。 34、式: %式% (式中、Ribose−(Phos)2−Ribofl
avi nは、フラビンアデニンジヌクレオチド中のり
ポフラビンーピロフォスフェイトーリポース残基を表わ
し、rは2から10までの整数であり、nは2からlO
までの整数である。)で示されることを特命とするフラ
ビンアデニンジヌクレオチドージゴキシゲニン複合体。 35、nが5である特許請求の範囲第34項記戦の複合
体。 36、rか6である#+j訂請求の範囲t534項また
は第35項記載の複合体。
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