JPH041743B2

JPH041743B2 -

Info

Publication number: JPH041743B2
Application number: JP20014086A
Authority: JP
Inventors: Yoshinori Kato; Noriaki Endo; Takeshi Hara
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1986-08-28
Filing date: 1986-08-28
Publication date: 1992-01-14
Also published as: JPS6357569A

Description

【発明の詳細な説明】＜産業上の利用分野＞本発明は新規なヒドラジド化合物及びその製造
方法に関する。さらに詳しくは、活性ジスルフイ
ド基をその分子構造中に含有するヒドラジド化合
物及びその製造方法に関する。＜従来の技術と問題点＞従来、高分子又は低分子物質に活性ジスルフイ
ド基やチオール基を導入するためには、Ｎ−サク
シンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オネート【式】〔J. Carlsson，H.Drevin and R.Axen，Biochem.
J.，173，723（1978）．〕，Ｓ−アセチルメルカプト
無水コハク酸【式】〔I.M. Klotz and R.E.Heiney，Arch.Biochem.
Biophys.，96，605（1962）．〕，２−イミノチオラ
ン【式】〔H.J.Schramm and T. Dulffer，Hoppe−Seyler′s Z.physiol.Chem.，
358，137（1977）．〕などの二官能基性架橋剤が使
用されてきた。これらのジスルフイド基またはチオール基の導
入剤は、いずれもアミノ基と反応性の官能基をそ
の分子構造中に含有しており、従つて活性ジスル
フイド基またはチオール基を導入しようとする対
象物質が、その目的に使用できるアミノ基を持つ
ている場合、例えば、ある種の蛋白質の様な場合
には、これらは好適に使用できる。しかし、アミ
ノ基を含有していない物質、例えば、ある種の糖
質，多糖高分子ゲル等の場合や、アミノ基を含有
していても、それに他の物を結合することが適当
でない糖蛋白等に、活性ジスルフイド基やチオー
ル基を導入することは、これらの導入剤では困難
である。＜問題点を解決するための手段＞本発明者らは、従来の導入剤では有効に成しえ
ない、糖質に活性ジスルフイド基を導入するため
の導入剤を鋭意探索した結果、活性ジスルフイド
基とヒドラジド基を同一分子内に含んだ本発明の
２官能基性化合物が、この目的のために極めて有
用であることを見い出し、本発明に至つた。即ち、本発明は、下記式〔１〕Ｘ−SS−Ａ−CONHNH₂ ……〔１〕〔式中、Ｘは２−ピリジル基または４−ピリジ
ル基を表わし、Ａは炭素数１〜６の２価の炭化水
素残基を表わす。〕で表わされるヒドラジド化合物およびその製造方
法である。本発明の化合物を表わす式〔１〕において、Ｘ
は２−ピリジル基又は４−ピリジル基を表わす。
従つて、隣接するジスルフイド基はいわゆる活性
ジスルフイド基であり、ジチオスレイトール，２
−メルカプトエタノール，水素化ホウ素ナトリウ
ム等の還元剤で容易にチオール基に還元すること
ができる。反面、水素化シアノホウ素ナトリウム
による還元には比較的安定である。Ａは炭素数１
〜６の２価の炭化水素残基であり、メチレン（−
CH₂−），ジメチレン（−CH₂CH₂−），トリメチ
レン（−CH₂CH₂CH₂−），テトラメチレン（−
CH₂CH₂CH₂CH₂−），ペンタメチレン
（CH₂CH₂−CH₂CH₂CH₂−），ヘキサメチレン
（−CH₂CH₂CH₂CH₂−CH₂CH₂−），及び分支し
た炭化水素残基を表わすが、そのうちでもジメチ
レンとトリメチレンが特に好ましい。本発明のヒドラジド化合物の製造においては、
それぞれ原料である下記式〔２〕Ｘ−SS−Ａ−CO₂H ……〔２〕〔式中、Ｘ，Ａの定義は式〔１〕に同じ。〕または、下記式〔３〕Ｘ−SS−Ａ−CO−Ｙ ……〔３〕〔式中、Ｘ，Ａの定義は式〔１〕に同じ。Ｙは
隣接するカルボニル基とともに、カルボン酸の反
応性誘導体残基を形成する１価の有機基を表わ
す。〕で表わされるカルボン酸またはその反応性誘導体
に、前者の場合は脱水縮合剤とともに、後者の場
合は脱水縮合剤無しに、ヒドラジンを反応せしめ
て製造する。原料のカルボン酸またはその反応性誘導体は、
公知の方法〔J.Carlsson et al.，Biochem.J.，
173，723（1978）；J.Carlssonら，特開昭53−
130781〕およびそれらに類似の方法により工業的
に容易に供給される。原料のカルボン酸にヒドラ
ジンを反応させる場合に共存させる脱水縮合剤と
は、アミン類とカルボン酸類よりアミドを形成せ
しめる反応の助剤を意味し、例えば、ペプチド合
成反応に使用されるカツプリング試薬〔泉屋信夫
ら著，「ペプチド合成の基礎と実験」九善（1985）
pp114−125参照〕が好ましい。なかでも、Ｎ，
N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド，カルボ
ニルジイミダゾール，ジフエニルホスホリルアジ
ド等は特に好ましい。反応に際しては、好ましく
は、カルボン酸に対してヒドラジン1.0〜10.0倍
モル，脱水縮合剤1.0〜3.0倍モルを溶媒中均一溶
液として反応させる。用いる溶媒は、カルボン
酸，ヒドラジン，脱水縮合剤のすべてを溶解し、
かつそれらと反応しないものが好ましく、例え
ば、ジクロロメタン，ジクロロエタン等のハロゲ
ン化炭化水素類，テトラヒドロフラン，ジオキサ
ン等のエーテル類，酢酸エチル，酢酸ブチル等の
エステル類，アセトニトリル，ジメチルアセトア
ミド，ジメチルホルムアミド，ピリジンなどの極
性溶媒，等を好ましく用いることができる。通
常、反応温度は０℃〜50℃，反応時間は１時間〜
３日である。反応終了後は、目的物であるヒドラ
ジド化合物は取，抽出，結晶化，クロマトグラ
フイー等の通常の精製手段によつて単離精製する
ことができる。本発明のヒドラジド化合物を、式〔３〕で表わ
されるカルボン酸の反応性誘導体にヒドラジンを
作用させて製造する場合、原料である式〔３〕で
表わされるカルボン酸の反応性誘導体とは、具体
的にはハロゲン化物として酸塩化物，酸臭化物，
酸沃化物，活性エステル類として、Ｎ−サクシン
イミジルオキシ誘導体【式】フエノキシ誘導体【式】活性アミドとして、Ｎ−イミダゾリル誘導体
【式】混合酸無水物として、エトキシカルボニルオキシ誘導体
【式】イソブチルオキシカルボニルオキシ誘導体
【式】ピバロイルオキシ誘導体【式】チオエステルとしてフエニルチオ誘導体
【式】低級アルコールのエステルとしてメチルエステルなどがある。反応にお
いては、好ましくはカルボン酸の反応性誘導体
を、溶媒中均一溶液としてヒドラジンを作用させ
る。用いるヒドラジンの量は、好ましくは１〜50
倍モルである。溶媒は、原料の反応性誘導体とヒ
ドラジンをともに溶解し、かつこれらと反応しな
いものが好ましく、例えば、ジクロロメタン，ジ
クロロエタン等のハロゲン化炭化水素類，テトラ
ヒドロフラン，ジメトキシエタン等のエーテル
類，酢酸エチル，酢酸ブチル等のエステル類，ア
セトニトリル，ジメチルホルムアミド，ピリジン
等の極性溶媒を好ましく用いることができる。通
常、反応温度は−20℃〜50℃、反応時間は30分〜
３日である。必要に応じてトリエチルアミン類の
反応助剤を添加してもよい。反応終了後は、目的
物であるヒドラジド化合物は取，抽出，結晶
化，クロマトグラフイー等の通常の精製手段によ
つて単離精製することができる。本発明のヒドラジド化合物の使用例として、糖
質へ活性ジスルフイド基およびスルフイド基を導
入する方法を下記式によつて説明する。先ず糖質
を、過ヨウ素酸またはガラクトースオキシダーゼ
で酸化してアルデヒド基を発生せしめ（アルデヒ
ド化糖質）、これに、本発明のヒドラジドとシア
ノ水素化ホウ素ナトリウムを作用させて、活性ジ
スルフイド基を糖質に導入することができる。さ
らにこれに２−メルカプトエタノールやジチオス
レイトール等の還元剤を作用させれば、活性ジス
ルフイド基をチオール基に変換することができ
る。＜実施例＞実施例１３−（２−ピリジルジチオ）プロパノヒドラジ
ドの合成Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネートの結晶100mgのジメトキシエ
タン（５ml）溶液に、氷冷下にヒドラジンヒドラ
ート32mgのジメトキシエタン（１ml）溶液を加
え、室温下で13時間反応させた。溶媒を減圧留去
し、得られた残渣をエーテル−ｎ−ヘキサン１：
１の混合溶媒より結晶化して、目的物３−（２−
ピリジルジチオ）プロパノヒドラジドの結晶58mg
を得た。収率は79％であつた。物理性状は以下の
通りであつた。 m.p.：92.5−93.5℃ NMR：（CDCl₃中TMSよりのδ値） 2.52（2H，brt，６Hz），3.03（2H，brt，６
Hz），3.77（2H，brs），6.9−8.6（4H，ｍ），
8.31（1H，brs） IR：（KBr）3260（ｓ），1670（ｓ），1645，
1575，1530，1445，1410cm^-1 質量スペクトル（EIMS）：111（M⁺），229
（Base Peak）実施例２公知の方法（特開昭53−130674号参照）に従つ
て得た２−カルボキシエチル２−ピリジルジスル
フイド200mgの酢酸エチル溶液10mlに、氷冷下に
ヒドラジン60mgと、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド287mgを加えて４℃で15時間反応させた。溶
液に酢酸エチル20mlを加え、0.5Mのエン酢水溶
液30mlで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥
し、溶媒を減圧留去した。残渣を実施例１と同様
のシリカゲルクロマトグラフイーにより精製し、
エーテル−ｎ−ヘキサン１：１の混合溶媒より結
晶化して、目的物である３−（２−ピリジルジチ
オ）プロパノヒドラジドの結晶61mgを得た。収率
は29％であつた。物理性状は実施例１で得られた
ものとよく一致した。参考例１モノクローナル抗体への活性ジスルフイド基の
導入抗ヒトメラノーマ・モノクローナル抗体
（IgG2a）96.5を6.1mg溶解した生理食塩水１mlに、
メタ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液217.8mMを50μ
加え、氷上にて１時間、IgG糖鎖の酸化反応を
行なつた。反応液を生理食塩水にて十分透析する
ことにより、残存するメタ過ヨウ素酸ナトリウム
を除いた後、かかる反応産物に0.1Mクエン酸緩
衝液（PH5.5）を0.5ml添加し、その後80μの
DMFに溶解した３−（２−ピリジルジチオ）プロ
パノヒドラジドを1.76mg加え、氷上にて４時間反
応せしめた。その後、最終濃度が40mMになるよ
うにシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、１時
間還元反応を行なつた後、10mMリン酸緩衝液
（PH7.2）−0.14M NaClにて十分透析することによ
り、２−ピリジルジチオ基を含有するIgG5.1mgを
得た。IgG量は280nmの吸光度により決定した。
得られた２−ピリジルジチオ基を有するIgG上の
活性ジスルフイド残基の量は、一部のサンプルに
過剰のジチオスレイトールを作用させ、遊離した
チオピリドンの吸収極大値（343nm）における吸
光度を測定して定量した。一方、該サンプル中の
IgGの量は280nmにおける吸光度を測定して求め
た。IgG1分子に存在する活性ジスルフイド残基
の数はこれらの測定値の比で表わされる。即ち、〔２−ピリジルチオ基〕／〔IgG〕＝0.127／8080／0.71
3／2.1×10⁵＝4.6 であつた。＜発明の効果＞本発明のヒドラジド化合物の工業的応用は多岐
に渡る。選択的に作用する医薬品の製造への応用
例を示すと、腫瘍に選択的に結合する抗腫瘍抗体
に、その糖鎖部位で活性ジスルフイド基を導入
し、その上で、制ガン薬メソトレキセート
（MTX）の、例えば、下記式で表わされるチオ
ール基含有誘導体を反応させれば、腫瘍に選択的に作用する抗腫瘍抗
体−MTX複合体が得られる。又、例えば、微量物質の定量法に酵素免疫測定
法があるが、そこで使用する酵素−抗体複合体の
作製において、本発明のヒドラジド化合物を使用
すれば、酵素又は抗体の糖鎖部位で、これらを架
橋して複合体を作製することができる。又、例えば、活性ジスルフイド基を導入したセ
フアロースゲルが、チオール基含有物質を捕捉す
るための担体として使用されているが、かかる活
性ジスルフイド基を導入した糖質ゲルを調製する
ために、本発明のヒドラジド化合物を使用するこ
とができる。

Claims

【特許請求の範囲】１下記式〔１〕Ｘ−SS−Ａ−CONHNH₂ ……〔１〕〔式中、Ｘは２−ピリジル基または４−ピリジ
ル基を表し、Ａは炭素数１〜６の２価の炭化水素
残基を表す。〕で表されるヒドラジド化合物。２式〔１〕において、Ｘが２−ピリジル基を、
Ａがジメチレン基（−CH₂CH₂−）またはトリメ
チレン基（−CH₂CH₂CH₂−）を表す、特許請求
の範囲第１項記載のヒドラジド化合物。３下記式〔２〕Ｘ−SS−Ａ−CO₂H ……〔２〕〔式中、Ｘは２−ピリジル基または４−ピリジ
ル基を表し、Ａは炭素数１〜６の２価の炭化水素
残基を表す。〕で表されるカルボン酸に、脱水縮合剤の存在下に
ヒドラジンを作用させることを特徴とする、下記
式〔１〕で表されるヒドラジド化合物の製造方
法。Ｘ−SS−Ａ−CONHNH₂ ……〔１〕〔式中、ＸおよびＡは前記定義に同じ。〕４下記式〔３〕Ｘ−SS−Ａ−CO−Ｙ ……〔３〕〔式中、Ｘは２−ピリジル基または４−ピリジ
ル基を表し、Ａは炭素数１〜６の２価の炭化水素
残基を表し、Ｙは隣接するカルボニル基とともに
カルボン酸の反応性誘導体残基を形成する１価の
有機基を表す。〕で表されるカルボン酸の反応性誘導体に、ヒドラ
ジンを作用させることを特徴とする、下記式
〔１〕で表されるヒドラジド化合物の製造方法。Ｘ−SS−Ａ−CONHNH₂ ……〔１〕〔式中、ＸおよびＡは前記定義に同じ。〕