JPH02133469A - 求核性多置換アリールアクリジニウムエステルとその製造方法およびそれを用いたアッセイ - Google Patents

求核性多置換アリールアクリジニウムエステルとその製造方法およびそれを用いたアッセイ

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JPH02133469A
JPH02133469A JP25040289A JP25040289A JPH02133469A JP H02133469 A JPH02133469 A JP H02133469A JP 25040289 A JP25040289 A JP 25040289A JP 25040289 A JP25040289 A JP 25040289A JP H02133469 A JPH02133469 A JP H02133469A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規な求核性多置換アリールアクリジニウムエ
ステルに関する。本発明はまた、新規な求核性多置換ア
リールアクリジニウムエステルから作られる複合体（ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅ）に関する。本発明はさらに、新規な
求核性多置換アリールアクリジニウムエステルおよびそ
の複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）　ヲ用いたアッセイに
関する。
（従来技術） アクリジニウムエステルを臨床検査のケミルミネセント
ラベルに使用することが知られている。
例えば、ヨーロッパ特許出願節８２３０６５５７．８号
は、イムノアッセイのケミルミネセントラベルとしてＮ
−スクシンイミジル部分に結合したアリールアクリジニ
ウムエステルの使用を開示している。米国特許節４．７
４５．１８１号および同時係属の米国特許出願第１３３
．７９２号は、イムノアッセイおよび核酸ハイブリダイ
ゼーションアッセイに有用な多置換アリールアクリジニ
ウムエステルを記載している。
米国特許出願第２２６，８３９号は、臨床検査、特にリ
ポソームを必要とするアッセイに有用な親水性多置換ア
リールアクリジニウムエステルとその複合体（ｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅ）を開示している。
Ｒｌｃｈａｒｄｓｏｎ等（ＣＩＩｎ、　ＣｈｅＩＩｌ、
　３１／１０．１０６４−１６８８ページ、　１９８５
年）およびＭｉｌｌｅｒ等（Ａｎｎ、　Ｃｈ４ｎ。
Ｂｊｏｃｈｅｍ、２５．２７−３４ページ、　１９８８
年）は、血漿プロゲステロンのケミルミネセントイムノ
アッセイにおける（２−アミノエチル）−４−フェニル
・アクリジン−９−カルボキシレートの使用を開示して
いる。
しかしながら、従来技術におけるアクリジニウムエステ
ルは、ある種の分析物との間で複合体（ｃｏｎｊｕｇａ
ｔｅ）を効果的に形成し得ないことがしばしばある。そ
れらの分析物は求核性基を欠いていたり、容易に変化し
ないカルボキシル基を含んでいる。分析物の免疫活性に
対して結果的に生じる有害作用のため、分析物の求核性
基がアクリジニウムエステルを含むく活性基によってア
シル化できない場合もある。
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ等およびＭｉ　ｌ　Ｉｅｒ等のア
クリジンエステルは、同時に起こるエステルの求核性喪
失を伴わずに有用なアクリジニウムエステルに変換する
ことができない。このアクリジニウムエステルは、求核
反応を通してまず目標の分析物と複合（ｃｏｎｊｕｇａ
ｔｅ）　Ｌなければならず、次に、続いてアクリジニウ
ムエステル部分に変換される。アクリジンエステルから
アクリジニウムエステルへの変換の一般的反応条件は非
選択的である。その結果、目標分析物の敏感な基が影響
を受け、得られた複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の免疫
活性が失われたり低下したりする。
（発明の目的） 上記問題に鑑みて、本発明の目的は、新規な求核性多置
換アリールアクリジニウムエステルを提供することであ
る。また、付加的なイオン化できる基を含む新規な求核
性多置換アリールアクリジニウムエステルを提供するこ
とも本発明の目的である。
本発明のもう１つの目的は、新規な求核性多置換アリー
ルアクリジニウムエステルから作られる複合体（ｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅ）を提供することである。
本発明のさらにもう１つの目的は、新規な求核性多置換
アリールアクリジニウムエステルおよびその複合体（ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅ）を用いたアッセイを提供することで
ある。
（発明の構成） 本発明は下記の化学式を有する求核性多置換アリールア
クリジニウムエステルに関する。
Ｉ　　Ｘ− Ｒに こでＲ１は、０−２０のへテロ原子（好ましくは窒素、
酸素、リンまたは硫黄）を含むアルキル。
アルケニル１アルキニル、アリールまたはアラルキルで
あり、 Ｒ２，Ｒ３，Ｒ５およびＲ７は水素、アミノ。
アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル。
−Ｃｏｚ、ハライド、ニトロ、−ＣＮ、−５ｏ３゜は−
ＳＣＮであって、ここでＲは０−２０のへテロ原子を含
むアルキル、アルケニル、アルキニル。
アリールまたはアラルキルであり、 Ｒ４およびＲ８は水素、アルキル、アルケニル。
アルキニル、アラルキルまたはアルコキシルであり、 Ｘはアニオン、好ましくはＣＨ３５ｏ、−＋　　０Ｓ０
２Ｆ−、ハライド、０３０２　ＣＦ３−．０３０２Ｃ４
Ｆ、または ■ Ｒ６はＱ−Ｒ−Ｎｕ、　Ｑ−Ｒ−ＮｕまたはＱ−Ｎｕで
あって、ここでＱは一〇−−３−−Ｎまたは−ＮＨＣ−
であり、Ｒは上記の通りであり、ＮＨ２ ■は−Ｓｏ３．−ｏｓｏ３．−ｐｏ３．−ｏｐＯ３また
は−ＣＯ２であり、Ｎｕは求核基である。
本発明に係る求核性基は電子に富む化学基であり、反応
座として機能する不対電子を有し、もう１つの分子の陽
電荷の座または電子不足の座に引きよせられる。有用な
求核性基の例としては、強力な電子吸引基に隣接したア
ミノ、ヒドロキシル。
メルカプトまたは活性メチレン基などがある。強力な電
子吸引基は強力に電子を引きつける化学基または置換基
であり、従って、その電子吸引基が結合している炭素原
子（またはカルボニウムイオン）の陽電荷を強めるか、
またはその炭素原子（またはカルボニウムイオン）の陰
電荷を打ち消す。強力な電子吸引基の例としては、−Ｎ
Ｏ２、−ＣＮ、−３Ｏ３Ｈ，−Ｎ　（Ｒ）３Ｓ（Ｒ）ｚ
＋および−ＮＨ３（ここでＲは上記の通り）などがある
。
有機金属部分もまた、本発明に係る有用な求核性基であ
る。有機金属部分は、炭素−金属結合を含む有機部分で
ある。この有機金属部分の例としては、グリニヤール試
薬、リチウチ化合物およびフェニルナトリウムなどがあ
る。
Ｒ１は１−２４の炭素原子を有するアルキル、アルケニ
ル、アルキニル、アリールまたはアラルキルであること
か好ましく； ＲＺ　＋　Ｒ３＋　Ｒ５およびＲ７は水素、アミノ。
ＣＯｚ、−ＣＮ、　　ヒドロキシル、１−４の炭素原子
を有するアルコキシル、ニトロ、ハライド。
ＳＯ３，または−ＳＣＮであることが好ましく；Ｒ４お
よびＲＢは１−８の炭素原子を有するアルキル、アルケ
ニル、アルキニルまたはアルコキシルであることが好ま
しく； Ｘはハライドであることが好ましい。
さらに好ましくは、Ｒ１が１−１０の炭素原子を有する
アルキルであり；Ｒ２，Ｒ３，Ｒ６およびＲ７が水素、
ニトロ、　−ＣＮ、ハライド、１−４の炭素原子を有す
るアルコキシル、アミノ　または−３Ｏ３であり；Ｒ４
およびＲ８が１−４の炭素原子を有するアルキルである
。
最も好ましくは、Ｒ，、Ｒ，およびＲ８がメチルであり
；　Ｒ２＋　Ｒ３、Ｒ５およびＲ７が水素であり；Ｘが
臭化物であり；Ｒ６が−ＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ
２または ＣＯＮ　ＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ　ＨＣＯＣＨＮ　Ｈ２ＣＨ２
Ｓ　−（ＣＨｚ　）　３　ＳＯ３Ｈ本発明はまた、アク
リジニウムエステルのＮｕ基に共有結合できる化合物に
共有結合された本発明による上記のアクリジニウムエス
テルを含む複合体に関する。有用な複合体を形成するた
めに、前記化合物は、アクリジニウムエステルのＮｕ基
に結合能のある少くとも１つの官能基を有していなけれ
ばならない。好ましくは、この複合体は、たん白、核酸
、抗原、ハブテンその他などの生物活性を有する化合物
から作られる。
例えばＮｕがＮｕ２の場合、本発明の複合体を形成する
ための適する化合物の例としては、−Ｎｕ２と結合能の
ある下記のような官能基を含むものがある。
（１）葉酸、カルボキシル化ビタミンＢＩ２．　　リボ
ース部分におけるビタミンＢＩ２−ヘミスクシネート。
Ｔ４−メチルエステルおよびＴ３メチルエステルのＮ−
ヘミスクシネート、トロンボキサンＢ２゜カルボキシプ
ロピル−テオフィリン、ペニシリン。
コルチゾール−３−カルボキシメチルオキシム。
エストラジオール−６−カルボキシメチルオキシム、モ
ルヒネ−６−ヘミスクシネートその他などにおけるカル
ボキシレート基； （２）３−ケトジゴキシゲニンなどにおけるケトン２Ｉ
（。
（３）ジゴキシンジアルデヒドおよびブロモウリジンシ
ア！レデヒドなどにおけるアルデヒド′基；（４）ハブ
テンおよびたん白のジントロフルオロベンゼンおよびタ
ロロトリアジン誘導体などにおけるハライド；（５）ハ
ブテンおよびたん白のＮ−ヒドロキシスクシンイミドお
よびイミデート誘導体などにおける活性エステル；（６
）ハブテンおよびたん０誘導体などにおけるイソシアネ
ートおよびチオイソシアネート。
Ｎｕが一３Ｈの場合、適する化合物の例としては、ハブ
テンおよびたん０誘導体などに見られるマレイミド、ジ
チオピリジノ、またはオレフィンなどの、−３Ｈと結合
能のある官能基を含むものである。
Ｎｕが一〇Ｈの場合、本発明の複合体を形成するための
適する化合物の例としては、ハブテンおよびたん０誘導
体などに見られるオキシランのような、　−ＯＨと結合
能のある官能基を含む化合物がある。
Ｎｕがグリニヤール部分または他の有機金属部分の場合
、本発明の複合体を形成するための適する化合物の例と
しては、非プロトン性ハブテンなどに見られるケトンお
よびアルデヒドのような、上記部分と結合能のある官能
基を含む化合物がある。
他の種々の適するＮｕ基も本発明のアクリジニウムエス
テルに用いられることに留意されたい。
所望の用途に最も適するアクリジニウムエステルと複合
体化合物の組合せを選択するのは製造者である。
本明細書に用いられる“活性化（または活性化する）“
なる用語は、ある化合物の官能基を変化させることを意
味し、その変化によって元の官能基から新しい反応性官
能基を生じさせ、その新しい反応性官能基は第２の化合
物の目標とする官能基に結合することができる。例えば
、トロンボキサンＢ２　（下記の構造参照）のカルボキ
シル基（−ＣＯＯＨ）は、公知の手順を用いて活性化し
、できる。この混合無水物基は次に、例えば２′６′　
−ジメチル−４’　−［Ｎ−（２アミノエチル）カルボ
モイル］フェニル　１０−メチルアクリジニウム−９−
カルボキシレートブロマイド（ＤＭＡＥ−ＥＤ）のアミ
ノ基（−Ｎｕ２　）と反応してアミド結合（−ＣＮＨ−
）を形成し、トロンボキサンＢ２−ＤＭＡＥ−ＥＤ複合
体（下記の実施例１１参照）を得ることができる。
追加例として、アルキルシロキサン被覆の常磁性粒子（
Ｐ　Ｍ　Ｐ　）　　（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔ
ｉｃｓ社）の表面における自由アミノ基（ＮＨｚ）を、
ホモニいた誘導化によって活性化できる。グルタルアル
デヒドの１つの反応性アルデヒド基は、自由アミノ基を
有するシッフ塩基の形成によってＰＭＰと共有結合する
。第２の反応性アルデヒド基はたん白と結合することか
できる。
本発明の複合体の調製は、選択されるアクリジニウムエ
ステルおよび複合する化合物によって変わる。例えば、
次の説明は、ある化合物および本発明のアクリジニウム
エステル上のある好ましいＮｕ基から複合体を形成する
ためのある例示的方法についてのものである。
（１）Ｎｕが−ＮＨ２であり、複合する化合物がカルボ
キシル基を含んでいる場合は、そのカルボン酸基をまず
活性化してＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、混
合無水物またはアシルハライドなどの活性エステルとす
る。その活性化化合物を次にアクリジニウムエステルと
反応させて複合体とする。（２１Ｎ　ｕが−ＮＨ２で複
合する化合物がケトン基またはアルデヒド基を含む場合
は、アクリジニウムエステルを直線前記化合物と反応さ
せてシッフ塩基とすることができる。その複合体を次に
ソディウムシアノボロハイドライドなどの）＼イドライ
ド還元剤と反応させて結合を安定させる。
（３）　Ｎ　ｕが−ＮＨ２の場合、アクリジニウムエス
テルは、ハライド、イソシアネートまたはチオシソシア
ネートなどの反応性基を含む複合する化合物と直線反応
させることができる。（４）　Ｎ　ｕが−ＳＨの場合、
アクリジニウムエステルと有効に反応させて複合体を得
るために、複合する化合物はマレイミド、ジチオピリジ
ノ（ｄｉｔｈｌｏｐｙｒｉｄｉｎｏ）またはオレフィン
などのチオ（メルカプト）反応性基を含んでいる必要が
ある。（５）　Ｎ　ｕがＯＨの場合、アクリジニウムエ
ステルと有効に反応させて複合体を得るために、所望の
複合する化合物はオキシラン基を含んでいることが好ま
しい。（６）　Ｎ　ｕがグリニュールまたは他の有機金
属部分である場合、そのような部分を含むアクリジニウ
ムエステルは各使用に際して作りたてのものである必要
があり、次にケトンまたはアルデヒド官能基を含む複合
する化合物と反応させて複合体を得る。
前記説明は例示であり、種々の他の複合体も、公知の手
順による本発明の新規なアクリジニウムエステルから作
り得ることに留意されたい。
本発明の複合体は発光トレーサーとして有用である。こ
れらの複合体は、抗体／抗原免疫反応。
核酸ハイブリダイゼーション反応または配位子／結合た
ん白相互反応などの特定の結合現象を用いた発光検定（
ルミネセントアッセイ）に特に有用である。
本発明の１つの実施態様においては、本発明のアクリジ
ニウムエステルと葉酸塩（ｆｏｌａｔｅ）または葉酸塩
誘導体とを用いて複合体が調製される。使用されるアク
リジニウムエステルは求核性基と親水性基の両方を含ん
でいることが好ましい。この葉酸塩（ｆ’ｏｌａｔｅ）
−アクリジニウムエステル複合体の調製は、アクリジニ
ウムエステルを下記の化学式を有する保護された葉酸塩
（ｆｏｌａｔｅ）中間体（そのカルボキシル基の１つま
たは両方が活性化されている）と共にインキュベートす
ることを含む。
ここでＲ′は、０−２０のへテロ原子（好ましくは窒素
、酸素、リンまたは硫黄）を含む、１−２４の炭素原子
を有する随意に技分かれしたまたは直鎖の飽和または不
飽和アルキルである。Ｒ′はＺ２゜水素　または０−２
０のへテロ原子（好ましくは窒素、酸素、リンまたは硫
黄）を含む、１−２４の炭素原子を有する枝分かれした
または直鎖の飽和または不飽和アルキルである。点線は
随意の２重結合である。
ＺｌおよびＺ２は保護基である。Ｚ２は随意のものであ
る。これらの保護基は、第１アミンおよび第２アミンを
葉酸塩（ｆｏｌａｔｅ）の活性化カルボキシル基と分子
間または分子内で反応させないように保護できる基であ
ればどのような基でもよい。
これらの保護基は、アクリジニウムエステルに、好まし
くは酸性環境のもとて悪影響を与えない条件下で除去可
能でなければならない。有用な保護基にはトリフルオロ
アセチル基またはｔ−ブチルオキシカルボニル基が含ま
れる。
保護された葉酸塩中間体をアクリジニウムエステルと複
合化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）　Ｌ、、た後、葉酸塩
部分は、保護基を除去することによってブロック解除（
ｄｅｂｌｏｃｋ）される。このブロック解除はＨＢｒ　
／酢酸などの酸性媒質を用いて酸性環境下で行うのが好
ましく、上記酸性媒質は、複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
）の一体性をこわすことなく保護基を除去することがで
きる。このようにして形成された複合体は、葉酸塩を測
定するためのアッセイにおけるトレサーとして使用する
ことができる。
本発明のもう１つの実施態様において、本発明のアクリ
ジニウムエステルとビタミンＤ２　（ジアノコバラミン
）とを用いて複合体を形成する。ビタミンＢＬＬは次の
ような構造を有する。
ビタミンＢ、を稀釈酸で処理するとコリン環の１，２お
よび／または３第１プロパンアミド（ｐｒｉｍａｒｙ　
ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）側鎖を脱アミノ化してカルボ
キシル官能を生じる。このカルボキシレート官能は、ビ
タミンＢ２を本発明の求核性アクリジニウムエステルに
複合化（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）するのに使用される。
モノカルボキシルビタミンＢＬＬ（１つのカルボキシレ
ート官能）、ジカルボキシルビタミンＢ１２（２つのカ
ルボキシレート官能）、およびトリカルボキシルビタミ
ンＢ２　（３つのカルボキシレート官能）の比率は酸濃
度と反応時間に依存する。
モノカルボキシルビタミンＢ、は本発明の複合体（ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅ）を調製するのに望ましい生成物である
。Ａ１１ｅｎ等のＪ、　Ｂｌｏｔ、　Ｃｈｅｍ、２４７
．７８９５ページ。
１９７２年に記載される手順のような公知の手順を最大
限に利用することにより、４０９６までのモノカルボキ
シルビタミンＢＩ２を含むモノ−、ジー、およびトリカ
ルボキシルビタミンＢ１２の混合物を得ることができる
（第３および４図り照）。モノカルボキシルビタミンＢ
９をジーおよびトリカルボキシルビタミンＢユから分離
するために、従来の手順では強力なアニオン交換体を使
用している（Ａｌｉｅｎ等のＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、２４７　．７６９５ページ。
１９７２年）。
３つの第１プロパンアミド側鎖のどれが脱アミノ化され
たかによって、潜在的に３つの型のモノカルボキシルビ
タミンＢ１２が存在する。これらモノカルボキシルビタ
ミンＢＩ２の３つの型を分離することが望ましい。逆相
高性能液体クロマトグラフィ　（ＨＰＬＣ）でカルボキ
シル化ビタミンＢ、の混合物を分離することによって、
モノカルボキシルビタミンＢユ型をジーおよびトリカル
ボキシルビタミンＢＩ２型から互いに分離および単離で
きることを予期せず発見した。これにより、従来のよう
な予備的イオン交換分別工程なしに個々のモノカルボキ
シルビタミンＢ、型を高純度で得ることが可能になる。
さらに、ビタミンＢＩ２アッセイに使用するに当り、本
発明の複合体におけるモノ力ルポキシルビタミンＢｉ２
の１つの型は他の２つの型より有効であることを予期せ
ず発見した。
本発明のさらにもう１つの実施態様において、本発明の
アクリジニウムエステルとエストラジオールとを用いて
複合体を形成する。この複合体は１７−ベーターエスト
ラジオールのアッセイなどに使用できる。
１７−ベーターエストラジオールは次のような構造を有
する。
ここでＡはＣＨ２である。１７−ベーターエストラジオ
ールのａ用な誘導体には６−ケドー１７−ベーターエス
トラジオール（Ａ＝−Ｃ−）、および好ましくは６−カ
ルポキンメチルオキンムー１７ベーターエストラジオー
ル 本発明の適するアクリジニウムエステルとの複合（ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、１７−ベーターエストラジオ
ールまたはその誘導体における利用可能な官能基、すな
わちフェノール系３−ＯＨ基、第２　１７−ＯＨ基、あ
るいはＣ−６位置にできたカルボキシメチルオキシム基
またはケト基などのいずれにおいても起こり得る。複合
のための官能基の選択は、所望のイムノアッセイ系との
適合性、調製された複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の安
定性、および調製の容易さなどの要因に依存する。好ま
しくは、６−カルポキシメチルオキシムー１７−ベータ
ーエストラジオールのカルボキシル基を活性化し、次に
この活性化エストラジオール誘導体を本発明の適するア
クリジニウムエステルと反応させることによって複合体
（ｃｏｎｊｕｇａｉｅ）を調製する。得られたｉ夏合体
は、１７−ベーターエストラジオール測定のためのアッ
セイにおけるトレーサーとして使用できる。
本発明のアクリジニウムエステルはコルチゾールとの釘
用な複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成するのにも使
用できる。コルチゾールは次のような構造を有する。
には３−カルボキシメチルオキンムコルチゾールルボキ
シメチルオキシムコルチゾールのカルボキシル基を活性
化し、次にこの活性化コルチゾール誘導体を本発明の適
するアクリジニウムエステルと反応させることによって
複合体を調製する。得られた複合体は、コルチゾールの
アッセイにおけるトレーサーとして使用できる。
有用な複合体は、本発明のアクリジニウムエステルとト
ロンボキサンＢ２および他のプロスタグランジン類似体
（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　ａｎａｌｏｇｓ）との
間でも形成できる。トロンボキサンＢ２は次ような構造
を有している。
ＯＨ 明の適するアクリジニウムエステルとの複合（ｃｏｎｊ
ｕｇａｉｉｏ口）は、コルチゾールまたはその誘導体の
利用可能な官能基、すなわち２ｌ−ＯＨ基、１７−ＯＨ
基、１ｌ−ＯＨ基、２０−ケトＬ３−ケト基。
および３−カルボキシメチルオキシム基などのいずれに
おいても起こり得る。好ましくは、３−カ本発明の適す
るアクリジニウムエステルとの複合（ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｉｏｎ）は、３つのヒドロキシル基またはオレフィン官
能基のいずれかにおいても起こり得る。官能基の選択は
、特定の結合性たん白との相溶性、および目標でないプ
ロスタグランジン類似体との小さい交差反応性などの要
因に依存する。
好ましくは、トロンボキサンＢ２の末端カルボキシル基
を活性化し、次に、得られたトロンボキサンＢ２誘導体
を本発明の適するアクリジニウムエステルと反応させる
ことによって複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を調製する
。得られた複合体はトロンボキサンＢ２のアッセイにお
けるトレーサーとして使用できる。
本発明はまた、本発明の複合体をケミルミネセントトレ
ーサー化合物として用いたア・ソセイに関する。これら
のアッセイは相同性（ｈｏＩＩｌｏｇｅｎｅｏｕｓ）が
あっても良く、または異種起源であっても良い。
これらのアッセイは、例えば測定すべき分析物が一画の
ハブテンまたは分子であるきっ抗阻害ア・ソセイであっ
ても良い。これらのア・ンセイはまた、例えば本発明の
アクリジニウムエステルが抗体またはレセプター分子に
複合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）　したサンドイッチアセ
ライなどの非競合的なものであっても良い。本発明の複
合体を用いたア・ツセイの成分または試薬は、得られた
アクリジニウムエステルラベルが後の検出系において測
定できるならば、全ての所望する方法または順序で互い
に混合できる。従って、本発明の複合体を用いたアッセ
イは、フォワードモード（ｒｏｒｖａｒｄ　ｍｏｄｅ）
、　　リバースモード（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｍｏｄｅ）ま
たは同時モード（例えば米国特許第４，０９８，８７６
号および第４，２４４，９４０号参照）で行うことがで
きる。
ビタミンＢ１２および葉酸塩（ｆｏｌａｔｅ）の検出お
よび測定のためのアッセイは、本発明の複合体を用いて
行うことのできるアッセイの実例である。
このようなアッセイは、本発明のビタミンＢ１２−アク
リジニウムエステル複合体または葉酸塩（ｒｏｌａｔｅ
）−アクリジニウムエステル複合体を使用することがで
きる。ビタミンＢ２および葉酸塩のための放射性同位体
稀釈アッセイの一般的説明が米国特許第４，４５１，５
７１号に示されており、その開示内容は参考のため本明
細書に取り入れられている。
試料中のビタミン８．２または葉酸塩（ｆｏｌａｔｅ）
を検出または測定するためのア・ソセイは、通常、試料
中のビタミンＢユまたは葉酸塩（ｒｏｌａｔｅ）を内生
的結合たん自から遊離させる試料調製工程を必要とする
。ビタミンＢ１２または葉酸塩をそれぞれの結合たん自
から遊離する方法は、試料を加熱または煮沸するか化学
的遊離剤を用いることを含む。
典型的な遊離剤はＮａ　ＯＨなどの強塩基から成る。
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはベーターメルカプ
トエタノールなどのメルカプト化合物も試料調整工程中
に加えられる。このメルカプト化合物は、遊離剤の添加
より前に、より後に、または同時に加えることができる
。
ビタミンＢＬＬのための１つのアッセイにおいて、試料
調整工程に続いて、ビタミンＢＬ２トレーサー化合物を
、試料と固相に固定された精製豚内因子（ＨＩＦ）とに
混合する。試料とトレーサー化合物は、ＨＩＦの結合部
位について競合する。ＨＩＦに結合したトレーサー化合
物の量は試料中のビタミンＢ、の二に反比例する。
葉酸塩のための１つのアッセイにおいて、試料調整工程
に続いて、葉酸塩トレーサー化合物を、試料と固相に固
定されたウシラクトグロブリンまたは葉酸塩結合たん白
（Ｆ　Ｂ　Ｐ）とに混合する。
試料とトレーサー化合物はＦＢＰの結合部位について競
合する。ＦＢＰに結合したトレーサー化合物の量は試料
中の葉酸塩の量に反比例する。
試料調整工程で使用されるメルカプト化合物は、カウン
ティング（固相に結合されたラベルの量の測定）時に固
相内に残っていることがわかった。
固相内の変化する濃度のメルカプト化合物（特にＤＴＴ
）の存在によってアクリジニウムエステルラベルのケミ
ルミネセント反応の光子出力が抑制され、アッセイの精
度が低下したり信号が減しられたりする。カウンティン
グの前に、エチルマレイミドなどのチオール反応性化合
物を含む溶液内で同相をインキュベートすることによっ
てメルカプト化合物の抑制効果が減じられるか排除され
ることが予期せず発見された。溶液中のチオール反応性
化合物の濃度は約０．ＯＬＩＩＩＭから約５０ｍＭであ
ることが好ましく、約０．５＋ｎＭから約１０ｍＭであ
ることがさらに好ましく、約１＋ｎＭであることが最も
好ましい。
（実　施　例） 本発明を以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明する
。
実施例１ ３０ｍ１のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２’　
、６’　−ジメチル−４′−カルボキシフェニル　１０
−メチルシアクリジニウム−９−カルボキシレートフロ
マイト（ＤＭＡＥ、　２００　ｍｇ、　０．４３ｍｍｏ
ｌｅ）（同時係属米国出願第２２６，８３９号参照）溶
液を水浴中で冷却し、トリエチルアミン（０，２５ｒｒ
ｄ！、　１．７２ｍ　ｍｏｌｅ）　、−ｃ−チルクｏｏ
ホルメート（０，０８ｍ、　０．８５ｍ　ｍｏｔｅ）お
よびクロロホルム３０ｄで処理して反応混合物を形成（
−だ。２０分間の撹拌後、この反応混合物を乾燥滴下漏
斗に移り、１０威のＤＭ　Ｆ　／　ＣＨＣ１３（１：　
１　）中のエチレンジアミン溶液に１５分間に亘って滴
下添加して第２の反応混合物を形成した。
次にこの第２の反応混合物を室温で一晩撹拌し、次にア
ンダーバキュオ（ｕｎｄｅｒ　ｖａｃｕｏ）で乾燥する
まで蒸発させた。蒸発により得られた残分を３＝４ｍｌ
のクロロホルム／メタノール／水（６５：２５：４）に
入れ、２つの２０Ｘ２Ｏｃｍ分取薄層クロマトグラフィ
ーＴＬＣプレート（シリカゲル６０．　　Ｆ２５４　。
メルク社）で純化し、同じ溶媒系で展開した。生じた黄
色の主バンド（Ｒｆ　−０，４７）　　（長および短Ｕ
Ｖ光のもとでも検出し得る）をストリッピングし同じ溶
媒系で溶離した。次にこの溶出液を蒸発処理した。この
蒸発による残分を３０ｄの１０９６メタノール／クロロ
ホルムでトリチュレート（ｔｒｉｔｕｒａｔｅｄ）　Ｌ
、Ｗｈａｔｍａｎ　＃　１フイルターペーパーに重力化
で通して濾過した。このようにして？すられた２液を蒸
発処理してＤＭＡＥ−ＥＤ　（１１０ｍｇ、　５０％）
を得た。陽イオンモードにおける高速原子衝撃（Ｆａｓ
ｔ　Ａｔｏｍ　ＢｏｍｂｅｒｄＩＩｌｅｎｔ：ＰＡＢ）
質量分析（Ｏｎｅｉｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｅｒｖ
ｉｃｅｓにより実施）は４２８のＭ＋ピークを示した。
はぼ同じ強さの同位体臭化物ピーク７９．８１が陰イオ
ンモードで検出された。
実施例２ の調製 ２−　（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシイミノ）
−２−フェニルアセトニトリル（ＢＯＣ０Ｎ）（１２１
ｍＦｌ、　　０．４９１１１　ｍｏｌｅ）　　　（八Ｉ
ｄｒｉｃｈ　　ｃｈｃｍ、　　社）を、３ｄの５０％水
性ジオキサン中の５−（３−スルホプロピル）システィ
ン（ＳｕｌｒｏＣｙｓ、　１００　ｍ３゜０．４１ｍ　
ｍｏｌｅ）　　（Ｕ、Ｔ、ＲｕｃｇｇおよびＪ、Ｒｕｄ
ｉｎｇｅｒ、　Ｊ。
Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　！？ｃｓ、８，４４
７．１９７４年の方法により調製）およびトリエチルア
ミン（０，１８ｍ、　］、２２３ｍｆｆ１ｏｌ　ｅ）溶
液に加えて反応混合物を形成した。この反応混合物を５
０〜５５℃で１時間加熱して黄色溶液を得た。次にこの
反応混合物を冷却し、５ｉの水で稀釈し、そして酢酸エ
チル（３Ｘ　１０Ｉｎｆりで洗浄した。得られた水性層
を、メタノールと共に２度共蒸発することによって、ア
ンダーバアキュオ（ｕｎｄｅｒ　ｖａｃｕｏ）で乾燥ま
で蒸発処理した。クロロホルム／メタノール／水（５５
：４０：５）の溶媒系を用いて、蒸発により得られた残
分をＴＬＣ（シリカゲル８０．メタル社）分析したとこ
ろ、５ｕｌｆｏＣｙｓが完全にＢ　ＯＣ−３ｕｌｒｏＣ
ｙｓに変換されていることがわかった。
実施例３ ＡＥ）の調製 １１０雇のＤ　Ｍ　Ｆ　／　ＣＨＣｆｌ　３　　（１：
　１　）中のＢＯＣ−３ｕｌｆｏＣｙｓ　（３，４２ｍ
　ｒＢｏｌｅ）　　（実施例２）およびＤＭＡ　Ｅ　−
Ｅ　Ｄ　（４００ｍｇ、　０．７９ｍ　ＬＩｌｏｌｅ）
　　（実施例１）溶液をジシクロへキシルカルボジイミ
ド（３２５Ｉｎ９．１．５７ｍ　ｍｏｌｅ）で処理し、
室温で３時間撹拌し、蒸発乾燥した。蒸発による残分を
約１５ｍ１のクロロホルム／メタノール／水（８５：２
５：４）に入れ、８つの分取ＴＬＣプレート（シリカゲ
ル６０、メタル社）で純化し、同じ溶媒系で展開した。
約０．５５Ｒ「で生じた主黄色バンドをストリッピング
し、同じ溶媒系で溶離した。溶出液をアンダーブアキュ
オ（ｕｎｄｅｒ　ｖａｃｕｏ）で乾燥まで蒸発処理し、
Ｂ　ＯＣ−３ｕｌｆｏＣｙｓ　−Ｅ　Ｄ　−ＤＭＡ　Ｅ
　　（６３０ｍｇ。
９０％）を得た。
実施例４ 下添加して粘着性沈澱物と上清を形成した。上清を沈澱
物から除去した。次に沈澱物を約１０戒のメタノールに
溶かし、得られた溶液を約３０ｍ１の新鮮な無水エチル
エーテルに滴下添加して、黄色沈澱物と上清を形成した
。この黄色沈澱物と上滑を中程度空隙フリットを通して
濾過し、得られた黄色固体残分を無水エチルエーテルで
洗浄し、そして空気乾燥して５ｕｌｒｏＣｙｓ　−Ｅ　
Ｄ　−Ｄ　Ｍ　Ａ　Ｅ　（４３８ｍｇ。
９３．７％）を得た。
陽イオンモードにおけるＦＡＢ質量分析（Ｏｎｃｉｄａ
　Ｒｃｓｅｒｃｈ　５ｅｒｖ４ｃｅｓおよびＩｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅ　ｏｆ’Ｃｈｃ１１ｉｃａｌ　　Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ、Ｎｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎ　　Ｕｎｉｖｅｒｓｊ
ｔｙｆこより実施）は６５３のＭ＋ピークを示した。
実施例５ ４ｄの３６％のＨＢｒ　／酢酸中のＢ　ＯＣ−３ｕｌｒ
ｏＣｙｓ　−Ｅ　Ｄ　−Ｄ　Ｍ　Ａ　Ｅ　（６３０ｍｇ
、　０．７１５ｍ　ｍｏｌｅ）溶液を室温で５時間維持
して反応混合物を形成した。この反応混合物を約３０ｍ
の無水エチルエーテルに滴ビタミンＢ１２（１，０９，
０，７３８＋ｎ　ｍｏｌｅ）　（ＳｉｇｍａＣｈｅＩＩ
ｌｉｃａｌ）を８０ｄの０．５Ｎ　　ＨＣ、ｆ！に加え
て反応混合物を形成し、室温で６５時間撹拌した。反応
混合物をＢｌｏ　−Ｒａｄ　ＡＧ　１−Ｘ８　（酢酸型
）の４×１５印カラム（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）　、　　１００−２００メツシユに装
填し、Ａ１１ｅｎ、Ｒ，Ｈ，およびＭａｊ　ｅｒｕｓ　
、　Ｐ　。
Ｗ、のＪ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ、２４７．
７６９５−７７０１　（１９７２年）に記載されるよう
にパックして溶離した。赤色溶出ｉ１１の最初の３００
　ｄを集め、真空下で乾燥まて蒸発して、モノ−、ジー
およびトリカルボキシル化ビタミンＢ１２の混合物約１
ｇを得た。
Ｂ、モノカルボキシル化ビタミンＢＬｌ混合物の調製 Ａで調製したカルボキシル化ビタミンＢ２の混合物をＱ
　Ａ　Ｅ　−５ｃｐｈａｄｃｘ　　Ａ　−２５り０７ト
グラフイーで分別して、Ａ１１ｃｎ等により記載された
（Ｊ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４７，７６９５．１９７
２年）ようなモノカルボキシル化ビタミンＢＩ２の混合
物を得た。
Ｃ，カルボキシル化ビタミンＢ１２の分離用分取ＰＬＣ 水２ｄ中のＡにより与えられたモノ−、ジーおよびトリ
カルボキシル化ビタミンＢ１２？ｆ１合物５Ｃ）ｍ’ｊ
を、ｌ５ＣＯ−Ｆｏｘｙフラクションコレクター、ＩＳ
　Ｃ０−２１５０ピークセパレーター（ＩＳＣＯ社）お
よび３００Ａ空隙サイズの１５％ｍ球状粒子であるＣ１
８接着シリカ（Ｃ１８−ｂｏｎｄｅｄ　５ｉｌｉｃａ）
を装填した３０ｍｍ　Ｘ　２５ｃｍ　Ｙ　Ｍ　ＣＡ　Ｐ
　３６３−１５ステンレススチールカラム（ＹＭ（Ｊｌ
）を備えたＷａｔｅｒｓ　Ｄｅｌｔａ−Ｐｒｅｐ　３Ｑ
ＯＯＨＰ　Ｌ　Ｃシステム（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃ
ｉａｔｅｓ社）に注入した。
溶媒Ｂとしてアセトニトリルを用い、溶媒Ａとして０．
０５〜１の酢酸トリエチルアンモニウム、　ＰＨ４，５
を用いた各実験について、カルボキシル化ビタミンＢ、
を下記のようにしてカラムから溶離した。
■、実験１−不テップーグラディエント（ｓｔｅｐ−ｇ
ｒａｄｌｅｎｔ）溶離 溶媒Ｂ８％／溶媒Ａ９２％で２０分間 次に溶媒ＢＩＯ％／溶媒Ａ９０％で１０分間次に溶媒８
１５９６／溶媒Ａ８５％で５０分間２、実験２−アイソ
クラティック（ｊｓｏｃｒａｔｉｃ）溶離溶媒Ｂ１５９
６／溶媒Ａ８５％を使用 ３、実験３−ステップ−グラデイエンド溶離溶媒８１０
％／溶媒Ａ９０！’６でＩＯ分間溶媒８１５％／溶媒Ａ
８５％で１０分間４．実験４−アイソシラティック（ｉ
ｓｏｃｌａｔｌｃ）溶離溶媒Ｂｉｎ％／溶媒Ａ９０％ カラムの流量は各実験について２０〃ｌｉ！／分とし、
溶出物質は２８０ｎｍの波長で検出した。
第１図は、実験１で得られたカルボキシル化ビタミンＢ
２混合物の分離を示すグラフである。５７のピークが見
られるが、ピーク５の溶出前に予めプログラムした記録
時間が終了してしまったため、ピーク５については記録
されていない。ピーク５は、集った両分の特徴的な赤色
によって決定された。次に、そのピーク５を、グラフ中
のもし記録されていれば位置したであろう所に点線を加
えた。
第２〜４図は、それぞれ実験２〜４で得られたカルボキ
シル化ビタミンＢ、混合物の分なを示すグラフである。
これらの結果は、適切に選択された溶媒系および分取Ｈ
ＰＬＣカラムを用いてカルボキシル化ビタミンＢＩ２混
合物の分離分布が調整できることを示している。例えば
、カルボキシル化ビタミンＢユの同じ混合物（下記り参
照）における分析ＨＰＬＣの分布を示す第２図および第
５Ａ図に見られるように、第５Ａ図のピーク３　（１３
，８４分の保持時間）は分取カラムを用いてピーク３お
よび４（第２図）に分かれた。
Ｄ、カルボキシル化ビタミンＢ１２誘導体の分析ＨＰＬ
Ｃ分布 水２０　ｕｆ）中のＡ、ＢおよびＣの実験２で調製した
カルボキシル化ビタミンＢユ混合物５〜２０　ｕ９各々
をＢｅｃｋｍａｎ　３４４　ＨＰ　Ｌ　Ｃシステム（Ｂ
ｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）に注入した。
このＨＰＬＣシステムは、１２０Ａ空隙サイズの不規則
形状ｕＢｏｎｄａ１）ａｋ　Ｃ１８１０ｕｉ粒子を装填
した３、９　ｍｍＸ３０ｃｍステンレススチールカラム
（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ社）を備えたも
のであった。混合物は各々、１０％のアセトニトリルと
９０％の０　、０５　Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、
ｐＨ４，５を用いてカラムからアイソクラティックに溶
離した。溶離の流量は１．５に７／分とし、溶出物質を
２８０ｎｍの波長で検出した。
第５Ａ図は、Ａから得られたカルボキシル化ビタミンＢ
Ｌ２の分離の分布を示している。ピーク１は未反応ビタ
ミンＢ、ｚを示し、そしてピーク２（１１，９７分の保
持時間）およびピーク３　（１３，８４分の保持時間）
は混合物中に存在する３つの不完全分離モノカルボキシ
ル化ビタミンＢ１２型を示している。第５Ａ図のピーク
５はおそらくジカルボキシル化ビタミンＢ９型を示して
いると考えられる。
第５Ｂ〜５Ｆ図は、Ｃの実験２で得られた分離ピーク１
−５（第２図）の分析ＨＰＬＣ分布である。第５Ｄ図お
よび：１Ｓ５Ｅ図は、第５Ａ図のピーク３および第２図
のピーク３４を形成する２つの異ったモノカルボキシル
化ビタミンＢ１２型の近接した保持時間（各々１３．５
４分および１４．３３分）を示している。
第６図はＢから得られた３つのモノカルボキシル化ビタ
ミンＢユ型混合物の分析ＨＰＬＣ分布を示している。第
６図のピーク１および２は第５Ａ図のピーク２および３
とほぼ同じ保持時間を有していた。
実施例６ 製 実施例５で調製および単離した３つのモノカルボキシル
ビタミンＢ９型（今後、それぞれ１１．５１１１分、　
１３．５４分および１４．３３分の保持時間を有するモ
ノカルボキシルビタミンＢ１２型Ｉ、　ＩＩおよび■と
称する）および実施例１で調製したＤＭＡＥ−ＥＤを用
いて、下記のトレーサーを調製するために３つの別々な
しかし類似した複合反応（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ　ｒ
ｅａｃＨｏｎ　）を実行した。
１．１１１　ｍ＆のＤＭＦ中のモノカルボキシルビタミ
ンＢ、型Ｉ　（ＩＯｍｇ、　７．４ｕ　ｍｏｌｅ　）を
水浴中で冷却し、トリエチルアミン（１ｏｏｕＪ！のＤ
ＭＦ中１０．５　ｕＪｌ！　。
７４ｕ　ｍｏｌｅ）およびエチルクロロホルメート（１
００ｕ１のＤ　Ｍ　Ｆ中２．８ｕｆ　、　３０ｕ　ｍｏ
ｌｅ）で処理して反応混合物を形成した。３０分間の撹
拌後、反応混合物を乾燥するまで蒸発し、余分なエチル
クロロホルメートを除去して残分を得た。ＤＭＦ２ｄ！
中のＤＭＡ　Ｅ　−Ｅ’Ｄ　（３，４〜９．６．７ｕ　
ｍｏｌｅ　）およびトリエチルアミン（５，２＋Ｊ　、
　３７ｕ　ｌ１ｌｏｌｅ）を前記残分に加えて第２の反
応混合物を形成した。この第２の反応混合物を室温で一
晩撹拌し、アンダーブアキュオ（ｕｎｄｅｒ　ｖａｃｕ
ｏ）で乾燥するまで蒸発した。このようにして得られた
生の生成物（ｃｒｕｄｅｐｒｏｄｔ＋ｃｔｓ）を１つの
分析シリカゲル２０　Ｘ　２０ｃｍ　Ｔ　ＬＣプレート
（シリカゲル６０．メルク社）で純化して、クロロホル
ム／メタノール／水（５５：　４０　：　５）で展開し
た。
Ｒｒ　０．４７−０．５７の間に生じた２つの赤色バン
ド（今後上部および下部バンドと称する）各々を別々に
ストリッピングし、同じ溶媒まで溶離した。
各溶出液を乾燥するまで蒸発し、Ｂ、−ＥＤ−ＤＭＡＥ
トレーサーを得た。モノカルボキシルビタミンＢＩ２型
■および■について上記と同し手順をくり返した。その
結果、３つのモノカルボキシルビタミンＢＩ２型から合
計６つのＢ１２−ＥＤ−ＤＭＡＥ複合体（ｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅｓ）　（１〜６と称する）が単離された。複合体
１および２は型１から調製され、３および４は型■から
調製され、そして５および６は型■から調製された。各
複合体を０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共に
リン酸緩衝生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中で稀釈し、下記
の手順を用いて同時にトレーサー活性（第７図）につい
てスクリーニングした。
１％ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）０．２％アジ化ナト
リウムおよび０．４　！７／ｆメルチオレートを含む１
２０＋ｎＭ　　Ｐ　Ｂ　Ｓ中における）中の一連のビタ
ミンＢＩ２標準液を１　、３５　ＭのＤ　Ｔ　Ｔ　＋／
２０容量を加えることによって処理し、処理標桑液を得
た。各処理標準液の１００ｕ、ｆ）を１２Ｘ７５ｍ１１
プラスチックチューブに加えた。各チューブに１ｏｏｕ
Ｊ！の０．５　ＮＮａＯＨと０．５ｄのＩ　Ｆ−ＰＭＰ
　（１００ｕｇ）　　（懸濁液が３　ｕ９のＩＦ／ｙＰ
ＭＰを含み、加熱窓カニ程をハふき、そしテＩ　Ｆ　−
Ｐ　ｒ、ｉ　Ｐを、０．１Ｉ３Ｎｉ）硼酸、１０ＩＩＭ
のリン酸塩、０．１２７　ＭのＮａＣ，ｌ）および０．
１％のアジ化ナトリウム、ｐＨ７，０に再懸濁させるこ
とを除いて後述の実施例１２Ａのように調製した）を加
えた。試験されるＢ１２−ＥＤ−ＤＭＡＥ複合体の１２
−２９Ｘ　１０６相対光単位（ｒｅｌａｔｊｕｃｌｊｇ
ｈｔｕｎｉｔｓ　：ＲＬＵ）　　（ＩＲＬＵ−１光子カ
ウント）を含むＰＢＳ／Ｂ５Ａ１００ｕＪ！を各チュー
ブに加え、そのチューブを室温で１時間インキュベート
した。各チューブの固を目を上清から磁気分離してその
上清をデカントした。各チューブの固Ｆ目を１１ｎ！！
の水で１回洗浄した。次に固相をｌ００ｕｉｌｌの水に
再懸濁させ、下記実施例１２Ｂのようにカウントした。
表１は得られた結果を示している。表１中、Ｔは加えた
各複合体の合計ＲＬＵを示し、Ｂｏは、ビタミンＢＬ２
の不存在下における各複合体について最終再懸濁液中の
固相に伴う合計ＲＬＵを示し、Ｂｏ／Ｔは、各複合体に
ついて、固相に汁って加えられた合計ＲＬＵの割合を示
している。
表　　　１ 複合体　　　Ｔ　　　　　　ＢＯＢＯ／　Ｔ　９’６１
　１８Ｘ１０６　３．８Ｘ１．０４０．２＋２　２９Ｘ
１０６５Ｘ１０’　　０．１７３　１７．５Ｘ１０６７
．７Ｘ１０’　０．４４４　１５．２Ｘ１０６　Ｇ、６
Ｘ１０４０．４４５　２０、［ｆｘｌ、０’　２６．１
ｘ１０’　１．．２７６　１２Ｘ１０６２０Ｘｔｏ’　
　１．６７第７図は、各複合体について、ビタミンＢユ
の濃度に対するＢ／Ｂｏをプロットしたものである。
ここで、Ｂは試料中のあるビタミンＢ１２濃度について
、最終懸濁液の固１０に伴う合計ＲＬＵを示し、Ｂｏは
上記の通りである。最良の効果（最高のＢｏ／Ｔ値）を
発揮する複合体はモノカルボキシルビタミンＢユ型■か
ら生じる下部バンド（複合体＃６）に由来した。
１１００ｕのＢ１０．ＥＤ−ＤＭＡＥ複合体＃６を、０
．０５Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、　ｐｌ（４，５
（溶媒Ａ）とアセトニトリル（溶媒Ｂ）の混合物で４０
％Ｂ／６０％Ａから５０％Ｂ１５０％八へ直線勾配（ｌ
ｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）で１０分間に亘って溶
離すべ〈実施例５Ｄのように分析ＨＰＬＣシステムで分
離した。溶出液の流量はＬｄ／分とし、溶出物質を２６
０ｒ＋ｍの波長で検出した。クロマトグラムは２つのピ
ーク（５，６６分と７．８６分の保持時間）を示した。
単離し、別々に評価した場合、これら２つのピークは、
組合わせても単独でも同様なア・ノセイ効果を与えた。
実施例７ Ｎ−トリフルオロアセチル−葉酸（ＴＦＡ−Ｆ。
１）の工１製 葉酸（１，０９，２，２７ｍ　ｍｏｌｅ）と無水トリフ
ルオロ酢酸（２威、６．４ｍ　ｍｏｌｅ）を室温で１時
間撹拌し、次にアンダーブアキュオ（ｕｎｄｅｒ　ｖａ
ｃｕｏ）で蒸発させた。蒸発による残分を最少量のメタ
ノールでトノチュレート（ｔｒＨｕｒａｔｅ）　Ｌ、、
上ｌＮを濾過によって除去した。得られた湿ったケーク
を乾燥するまで蒸発処理し、クロロホルム／メタノール
／水（５５：４０：５）を用いてＴＬＣプレート（シリ
カゲル６０．メルク社）でクロマトグラフ分離してＲｆ
　Ｏ，３５のＴＦＡ−Ｆｏｌ’；ｒ得ｔ＝。
実施例８ 葉酸塩−’３ｕＨｏＣｙｓ−ＥＤ−ＤＭＡＥ複合体の調
製３．７５ｄのＤＭＦ中のＴＦＡ−Ｆｏｅ！　＜２１ｍ
３．０．０５ｍ　ｍｏｌｅ）　　（実施例７）溶液を、
１．８　ｄのクロロホルムで稀釈し、水浴中で冷却し、
トリエチルアミン（０，ＯＢ５　ｍｌ、　０．４５ｍ　
ｍｏｌｅ）およびエチルクｏロホルメート（０，０３ｍ
１．０．３１１ｍｏｌｅ）で処理して反応混合物を形成
した。３０分間の撹拌後、前記反応混合物をアンダーブ
アキュオ（ｕｎｄｅｒ　ｖａｃｕｏ）で乾燥するまで蒸
発させた。蒸発により得られた残分に４．５　ｄのＤＭ
Ｆ／りｏロホルム（２：　１）、ＳｕｌｆｏＣｙｓ−Ｅ
Ｄ−ＤＭＡＥ　（３１＃１ｇ、０．０４＋ｎ　ｎ＋ｏｌ
ｅ）およびトリエチルアミン（０，０３５ｄ、０．２４
［１１ｍｏｌｅ）を加えて第２の反応混合物を形成した
。この第２の反応混合物を室温で一晩撹拌し、蒸発させ
て第２の残分を形成した。
この第２の残分を１ｆｌＸ２０ｃｍシリカゲル分取ＴＬ
Ｃプレート（シリカゲル６０．メルク社）で純化した。
この第２の残分は、クロロホルム／メタノール／水（５
５：４０：５）で展開された。
約Ｒｆ０．６４で生じた黄色バンドをストリッピングし
同じ溶媒系で溶離した。溶出液を蒸発処理して生のＴＦ
Ａ−Ｆ　ｏＪ！　−３ｕｌｆｏＣｙｓ−ＥＤ−ＤＭＡＥ
　（１１，＋７１ｇ）を得た。この生成物のＴＬＣ分析
により２つの主要なｔＪＶ陽性スポット（Ｒｒｏ、６お
よび０．５）が示された。ＲＩ’０．５のスポットは後
のブロック解除（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）条件に影響さ
れず、従って望ましくない異物と考えられる。
前記のようにして青られた生のＴＦＡ−Ｆｏｌ−３ｕｌ
ｆｏＣｙｓ　−Ｅ　Ｄ　−Ｄ　ＭＡ　Ｅを室温において
２００＋Ｊの３６％ＨＢｒ　／酢酸で一晩処理し、第３
の反応混合物を形成した。この第３の反応混合物を杓１
０ｍの無水エチルエーテルで処理して沈澱を形成した。
１時間放置後、上清をピペットで沈澱から注意深く除去
した。この沈澱を次に約０．５ｍｌのクロロホルム／メ
タノール／水（Ｇ５：２５：４）に溶解し、１つの２０
Ｘ２０ｃｍシリカゲル分析ＴＬＣプレート（シリカゲル
６０．メルク社）で純化した。このＴＬＣプレートはク
ロロホルム／メタノール／水（５５：　４０　：　５）
で展開された。Ｒｆ’　０．３８で生じた黄色バンドを
ストリッピングし同じ展開溶媒系で溶離した。溶出液を
蒸発処理し、葉酸塩５ｕｌｆｏＣｙｓ　−Ｅ　Ｄ　−Ｄ
　Ｍ　Ａ　Ｅ複合体を得た。
実施例９ コルチゾール−３−ＣＭＯ−ＥＤ−ＤＭＡＥ複合体の調
製 ０．２　ｄのＤＭＦ中の３−カルボキシメチルオキシム
−コルチゾール（コルチゾール−３−ＣＭｏ。
１０ｍｇ、　０．０２２ｍ　１ｉｏｌｅ）　［ステラロ
イズ（Ｓｔｅｒａｌｏｌｄｓ）社］溶液を０．８　ｄの
クロロホルムで稀釈し、水浴中で冷却し、０，２ｄのク
ロロホルム中のジシクロへキシルカルボジイミド（Ｄ　
ＣＣ，５，５ｍ’ｊ。
０．０２６ｆｉｍ　ｌｌ１ｏｌｅ）で処理して反応混合
物を形成した。
１０分間の撹拌後、その反応混合物を０，４ｍｌのＤへ
１Ｆ中のＤＭＡ　Ｅ　−Ｅ　Ｄ　（５，５ｍ’ｊ、０．
ＯＬ＋ｎ　ｍｏｌｅ）溶液で処理して第２の反応混合物
を形成した。この第２の反応混合物を室温において一晩
撹拌し、アンダーブアキュオ（ｕｎｄｅｒ　ｖａｃｕｏ
）で蒸発処理した。
蒸発による残分を１ＯＸ２０（７）シリカゲル分取ＴＬ
Ｃプレート（メルク社）で純化した。この残分は１０％
メタノール／クロロホルムで展開された。ＲｆＯ１２８
で生じた黄色バンドをストリッピングし２０％メタノー
ル／クロロホルムで溶離した。溶出液を蒸発処理してコ
ルチゾール−３−ＣＭＯ−ＥＤ−Ｄ　ＭＡ　Ｅ　（３，
５１℃ｇ、４２％）を得た。陽イオンモードにおけるＦ
ＡＭ質量分析（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＣｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓで行われた）では８４５のＭ＋
ピークを示した。
実施例１０ エストラジオール−６−ＣＭＯ−ＥＤ−ＤＭＡＥ複合体
の調製 ２ｉのＤ　Ｍ　Ｆ　／　ＣＨＣＪ！　３　　（１：　１
　）中の６−カルポキシメチルオキシムー１７−ベータ
ーエストラジオール（エストラジオール−６−ＣＭＯ）
（２３，１ｍ！Ｆ、　０．０６２ｍ　ｍｏｌｅ）　（ス
テラロイズ社）溶液を水浴中で冷却し、Ｄ　Ｄ　Ｃ（１
５，４ｍＬ　Ｏ，０７４ｍｍｏｌｅ　）で処理して反応
混合物を形成した。１０分間の撹拌後、反応混合物をＤ
ＭＡＥ−ＥＤ　（３０，１ｍ３．０．０５９ａ＋　ｍｏ
ｌｅ）で処理して第２の反応混合物を得た。この第２の
反応混合物を室温で一晩撹拌し、アンダーブアキュオ（
ｕｎｄｅｒ　ｖａｃｕｏ）で蒸発させた。
蒸発による残分を１つの２ＯＸ２０ｃｍシリカゲル分取
ＴＬＣプレートで純化した。残分は５％メタノール／ク
ロロホルムで展開された。Ｒｆ’０．１７で生じた黄色
バンドをストリッピングし２０％メタノール／クロロホ
ルムで溶離した。溶出液を蒸発処理してエストラジオー
ル−６−ＣＭＯ−ＥＤ−ＤＭＡＥ　（１１，９ｍｙ、２
６％）を得た。陽イオンモードにおけるＦＡＢ質量分析
において７８９のＭ＋ピークが示された。
実施例１１ ０．４ｄのＤＭＦ／ＣＨ（，２３（１：　１）中のトロ
ンボキサンＢ２（Ｔｘ　Ｂ２）　　（２，５ｍｇ、　０
．００６７１１ＩＩＩｌｏｌｅ）（バイオモル社）溶液
を水浴で冷却し、トリエチルアミン（６ｕ１．０．０４
ｍ　ｍｏｌｅ）およびエチルクロロホルメート（２ｕｊ
！、０．０２ｍ　ｍｏｌｅ）で処理して反応混合物を形
成した。３０分間の撹拌後、この反応混合物を乾燥する
まで蒸発させた。
蒸発による残分を０．４　ｄのＤ　Ｍ　Ｆ　／　ＣＨＣ
ｆ！　３（１：　１）に溶解し、トリエチルアミン（６
ｕＣ［１，０４＋ｎ　ｍｏｌｅ）およびＤ　ＭＡ　Ｅ　
−Ｅ　Ｄ　（４，５ｍｇ。
０．００９ｍ　ｌｌ１ｏｌｅ）で処理して第２の反応混
合物を形成した。この第２の反応混合物を室温で撹拌し
、アンダーブアキュオ（ｕｎｄｅｒ　ｖａｃｕｏ）で蒸
発させて第２の残分を形成した。この第２の残分を約０
．５　ｄのクロロホルム／メタノール／水（６５：２５
：４）に入れ、２ＯＸ２０ｃｍシリカゲル分析ＴＬＣプ
レート（メルク社）で純化した。この残分は１５％のメ
タノール／クロロホルムで展開された。
Ｒｒｏ、４９で生じた主たる黄色バンドをストリッピン
グし１５％のメタノール／クロロホルムで溶離した。溶
出液を蒸発処理してＴＸＢ２−ＥＤ−ＤＭＡＥを得た。
実施例１２ Ｐ　Ｍ　Ｐ　（＾ｄｖａｎｃｅｄ　ＭａｇｎｅｓｉＣｓ
社から得られたもの）を米国特許節４，４５４，０８３
号に記載されるようにグルタルアルデヒドで活性化した
。
５ｉの食塩水中の精製ブタ内因子（ｔｊｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙｏｆＣｏｌｏｒａｄｏ　）ｌｅｄｌｃａｌ　Ｃｅｎ
ｔｅｒのＤｒ、Ｒ，Ｈ，Ａｌ　ｆｅｎより購入）（７５
ｕ７）を２５ｄのｌＯ＋ｎＭリン酸ナトリウム、　ｐＨ
７，４中のヒト血清アルブミン（ＨＳ　Ａ）（４００ｍ
９．　Ｉｍｍｕｎｏｓａａｒｃｈ社）の溶液に加えてた
ん白泥合物を得た。
このたん白泥合物を６０ｄの１０　ｍＭリン酸ナナトリ
ウム中活性化ＰＭＰ　（５！ＩＦ）懸濁液に加え、室温
で一晩シエイクしてＩＦ−ＰＭＰを得た。
次にこのＩＦ−ＰＭＰを洗浄し、余分な活性化群をグリ
シンでおさえた。
このＩ　Ｆ−ＰＭＰを、０．１％のアジ化ナトリウム、
０．１％のＢＳＡおよびｏ、ｏｏｉ％のＢｇＧと共１：
２００　ＩＲ１！ノ３ｏ　ｍＭ　　Ｐ　Ｂ　Ｓ中に再懸
濁させ、５０℃で１６時間処理し、１．０ｍＭリン酸ナ
トリウムで３回洗浄し、グリシン緩衝液（０，３２５グ
リシン、ｏ、１％アジ化ナトリウム、および０．１％Ｂ
ＳＡ、ｐＨ７．８　）　１３回洗浄し、グリシン緩衝液
（２５ｍｇ／ｄ）に再懸濁させ、そして必要な時まで４
℃で保存した。
Ｂ、同時アッセイ（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ａｓｓ
ａｙ）６％ＨＳＡ（０，２％アジ化ナトリウムおよび０
．４　’ｊ／ｉのメルチオレートを伴う１２０ｍＭＰＢ
Ｓ中の）中の既知の量で増えるビタミンＢ１２を有する
一連の標準液を１２Ｘ７５ｍｍプラスチックチューブに
加えた（　１００ｕｊ！　／チューブ）　。０．１　Ｉ
ｎ！！の遊離剤（ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ａｇｅｕｔ）　
　（０，５Ｍ　　Ｎａ　ＯＨ，５０ｕｇ／ｍ！！のＫＣ
Ｎ、０．３ｕ９／ｍのコピナミド。
０．０６４　Ｍジチオスレイトール）を前記チューブに
加え、それを室温で１５分間インキュベートした。
Ａで調製したＩＦ−ＰＭＰをグリシン緩衝液（８０ｕ９
／ｍ）中で１　：　３１２に稀釈した。０．５ｍｌの稀
釈Ｉ　Ｆ−ＰＭＰ　（４０ｕ’ｊ／チューブ）と、実施
例６で調製したＱ、Ｌ　ｍｌのＢ、−ＥＤ−ＤＭＡＥ複
合体＃６を０，１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリ
ウムと共にＰＢＳ中で稀釈したもの（４Ｘ１０６ＲＬＵ
／チユーブ）とを前記チューブに加え、それを室温で６
０分間インキュベートした。
前記チューブを、チューブ内の常磁性粒子の磁気分離に
有用な磁気ラック（Ｃｉｂａ　ＣｏｒｎｉｎｇＤＩａｇ
ｎＯ９ｔｉＣ８社）内に置いた。磁界が粒子を上清から
分離し、次にその上清をデカントした。粒子をｌｄの水
中で１回洗浄し、ポルテックスしくｖｏｒｔｅｘｅｄ）
、洗浄物から磁気分離してデカントした。次にその粒子
を０，１ｄの１１１Ｍエチルマレイミド中に再懸濁させ
た。
次に前記チューブをルミノメータ−（ＭＡＧＩＣＲＬＩ
ＴＥアナライザー、　Ｃ１ｂａ　ＣｏｒｎｉｎｇＤｉａ
ｇｎｏｓｔ　ｊｃｓ社）内に置いた。０．１　Ｎ　　Ｈ
ＮＯ３中の０．５％過酸化水素溶液０．３厩を各チュー
ブに加え、ＡＲＱＵＡＤ界面活性剤（Ａｒｍａｃｋ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌＳ社）を含む０．２５Ｎ　　Ｎａ　ＯＨ
０，３ｄを加えることによって発光を開始させた。Ｏ標
準液のＲＬＵ値に対して標準化（ｎｏｒｍａｌ　１ｚｅ
ｄ）された各チューブの７１１１１定されたＲＬＵ値を
、第８図に示されるように、それぞれのビタミンＢ１２
濃度に対してプロットした。
Ｃ，スプリットインキュベーションアッセイ５％ＨＳＡ
（０，２％アジ化ナトリウム、２ｍ’ｊ／」のアンホテ
リシンおよび２４ｍ！７／ｆ！のゲンタマイシンを伴う
ＰＢＳ中の）中の既知の量で増えるビタミンＤ２を有す
る一連のビタミンＢ２標準液をチューブに加え（１００
ｕ１／チユーブ）　　コピナミドを除いたＢの’ｔｌ”
Ｍ剤と共にインキュベートした。
緩衝液に加えられた０、０６ｕｇ／ｍのコピナミドを伴
うＢの稀釈ＩＰ　−ＰＭＰ　（４０ｕｇ／チューブ）０
．５　ｄを各チューブに加え、そのチューブを室温で４
５分間インキュベートした。０．１％のアジ化ナトリウ
ムおよび０．１％のＢＳＡを含むｌ０ＩｏＮｉＰＢＳ、
ＰＨ７，４で稀釈された実施例６のＢ１２−ＥＤＤＭＡ
Ｅ複合体＃６　（８Ｘ１０６ＲＬＵ）　０．１　ｉｆ！
を各チューブに加え、そのチューブを室温で３０分間イ
ンキュベートした。チューブ内の粒子を磁気分離し、洗
浄し、再懸濁させ、そしてＢで述べたようにカウントし
た。各チューブに関するＯ標準液のＲＬＵ値に対して標
準化された測定ＲＬＵ値を、第９図に示すように、それ
ぞれのビタミンＢ戊濃度に対してプロットした。
実施例１３ 葉酸塩（ｆ’ｏｌａｔｅ）アッセイ Ａ、試薬 保存剤として２４ｍｇ／！Ｑのゲンタマイシン、４％の
ＩＳＡ、２％のアジ化ナトリウムおよび２ｍｇ／」のア
ンホテリシンを含む１２０＋ｎＭ　　Ｐ　Ｂ　Ｓ、　ｐ
Ｈ７，４中に溶解したＰＧＡ（プテロイルグルタミン酸
）　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社）を葉酸塩アッ
セイの標準液に使用した。葉酸塩濃度は０．０．２５．
０．５１．０　、２．５　、　５．１０．１５．２０お
よび３０ｎｇＰＧＡ／ｄとした。
遊離剤（Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　Ａｇｅｎｔ）には８４　
ｍＭジチオスレイトールを含む０．５　Ｎ　　Ｎａ　Ｏ
Ｈを用いた。
実施例８で得られた葉酸塩−３ｕｌ　ｆｏｃｙｓ　−Ｅ
　Ｄ　−Ｄ　Ｍ　Ａ　Ｅ複合体（１１，８ＸＩＯ”　Ｒ
ＬＵ）をまず２２ｍ２の１０％ＤＭＦ／水に溶解した。
次にその溶液を、０．１％のＢＳＡと０．１％のアジ化
ナトリウムを含む３２５ｍＭグリシンで１　：　１１２
５０に稀釈して第２の溶液を形成した。この第２の溶液
を０．２％ｍのセルロースアセテートフィルター（Ｓｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄＳｃｈｕｅｌ　Ｉ社）で−過
してトレーサー溶液とした。
各試験につき５００ｕ１のトレーサー溶液を加えた。
アッセイ中のバインダーには葉酸塩結合たん白（ＦＢＰ
）（ウシの乳ラクトグロブリン。
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｏ１ｏｒａｄｏ　Ｍｅ
ｄｉｃａｌ　ＣｅｎｔｅｒのＤｒ、Ｒ，Ｈ，ＡＩ　ｆｅ
ｎより購入）を用いた。ＦＢＰ−ＰＭＰおよびウシ　ガ
ンマ　グロブリン（Ｂｇ　Ｇ）　−ＰＭＰを、米国特許
第４，４５４．０８８号に記載された方法によッテ調製
した。ＦＢＰ−ＰＭＰ　（０，９１Ｊｇ／ＩＲ１）を、
０．１％のＢＳＡおよび０．１％のアジ化ナトリウムを
含む１０１ＢＭ　　Ｐ　Ｂ　Ｓ、　ｐＨ７，４中で１：
６０ニ稀釈した。コれを０．４　ｍ’Ｊ／ｒｎｌｌのＢ
ｇＧ−ＰＭＰと共にバルク化し、固相バインダーを形成
した。
この固相バインダー１００ｕＪを各試験につき加え、そ
の結果、各試験につき１．６ｕ９のＦ　Ｂ　Ｐ　−Ｐ　
Ｍ　Ｐおよび４０　ｕ９のＢｇＧ−ＰＭＰの添加となっ
た。
最終的に、全アッセイ容ｆｆ１８００ｕｊｉにつき、１
００ｕｊ！の試料すなわち標準液、１００ｕｊ！の遊離
剤、５００ｕＪ！のトレーサー溶液、および１．　ＯＯ
ｕ　１の固相バインダーを含んでいた。
Ｂ、アッセイ手順 標準液または試料（１００ｕＪ）を１２Ｘ７５龍ポリス
チレンチユーブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社）に加えた。各チ
ューブにＡに記載の遊離剤１００ｕＪ！を加えた。前記
チューブをポルテックスしくｖｏｒｔｅｘｅｄ）、室温
で１５分間インキュベートした。Ａのトレーサー溶液（
５００ｕＪ！　）を各チューブに加え、次にＡの固相バ
インダー（１００ｕＪりを加えた。チューブを再びポル
テックスしくｖｏｒｔｅｘｅｄ）、室温で１時間インキ
ュベートした。次にチューブを３分間磁気分離機にかけ
、デカントし、そしてプロットした（ｂｌｏｔｔｅｄ）
。１ｍの脱イオン水を各チューブに加え、余分な非結合
トレーサーを洗い流した。チューブ内の固相を３分間磁
気分離し、上清をデカントし、そしてチューブを３分間
ドレン（ｄｒａｉｎ）　Ｌ、。
た。得られたチューブ内のベレットに１００ｕＪ！のＩ
Ｉｌ！Ｍエチルマレイミドを加えた。次にチューブをル
ミノメータ−内に置き、実施例１２Ｂで述べたようにし
てカウントした。各標準液のＲＬＵ値を０標準液のＲＬ
Ｕ値に対して標章化し、それぞれの葉酸塩濃度に対して
プロットして第１０図のようなディスプレイスメント曲
線を得た。
実施例１４ コルチゾール　アッセイ Ａ、試薬の調製 実施例９のコルチゾール−ＥＤ−ＤＭＡＥｌｉ合体をメ
タノールに溶解し、原液として一２０℃で保持した。最
終コルチゾール−ＥＤ−ＤＭＡＥ複合体を、１０　ｍＭ
リン酸ナトリウム、　ｐＨ７，４、０，１％のウシ血清
アルブミン、　０．４　ｍｇ／ｄの８−アニリノ−１−
ナフタレンスルホネート、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ　
−１００および０．０５％のアジ化ナトリウムを含む緩
衝液中で稀釈し、トレーサー溶液とした。
ウサギ抗コルチゾール抗血清をＢｉｏｃｌ　１ｎｉｃａ
ｌＧｒｏｕｐから購入した。０．１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液、　ｐＨ７，４のかわりに０．０１Ｍ酢酸ナトリ
ウム緩衝液、ｐＨ５，５を使用すること以外は米国特許
第４．５５４，０８８号の記載に従って前記抗体をＰＭ
Ｐ（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社）に固定
した。最終ＰＭＰ湿性ケークを、０．０１Ｍリン酸ナト
リウム、０．１９６のウシ血清アルブミン、４ｒｌ／ｍ
の１１−デオキシコルチゾールおよび０．ｌ１ｇ／ｄ８
−アニリノ−１−ナフタレンスルホネートを含む緩衝液
、　ＰＨ７，４で稀釈してＰＭＰ懸濁液（ＬＯｍｇ／ｒ
ｄ）を得た。
Ｂ、アッセイ手順 ０から７５０ｎｇ／戒のｉ９度を有するコルチゾール標
準液の各２５ｄを１２Ｘ７５＋ｎ＋ｍポリスチレン試験
チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社）に加えたものを２つず
つ作った。全活性１０６ＲＬＵを有するＡのトレーサー
溶液１００ｕＪを前記チューブに加え、次にＡの稀釈Ｐ
ＭＰ懸濁液５００ｕＪ！を加えた。ポルテックス（ｖｏ
ｒｔｅｘ）　Ｌ、た後、チューブを室温で１時間インキ
ュベートした。チューブ内のＰＭＰを上清がら磁気分離
した。各チューブの上清をデカントし、各チューブ内（
７１ＰＭＰを０．８７％）食塩水５００Ｊ＋　テ１回洗
浄し、次に１００ｕ、９の水に再懸濁させた。次に前記
チューブをルミノメータ−内に置き、実施例１２Ｂのよ
うにカウントした。第１１図の標準曲線は、標準液に加
えられたコルチゾールにょるＰＭＰに結合しているトレ
ーサーのディスプレイスメントを示している。ディスプ
レイスメントは、標準液中のコルチゾールの濃度に反比
例している。
実施例１５ エストラジオール　アッセイ Ａ、試薬調製 実施例１０のエストラジオール−ＥＤ−ＤＭＡＥ複合体
をメタノールに溶解し、原液として一２０℃で保持した
。この原液を、０．１％のウシ血清アルブミン、Ｏ，１
５Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１および０．０５％のアジ化ナトリウ
ムを含む０　、０１　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液。
ｐＨ７、４で稀釈してトレーサー溶液を作った。
ＢＳＡ−エストラジオール複合体で免疫処理し、その後
ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉ　ｌ５ｔｅｉｎによりＮａｔｕ
ｒｅ　２５Ｂ巻。
４９５−４９７ページ（１９７５年）に記載された手順
によってスプレィサイト（ｓｐｌｅ口ｏｃｙｔｅｓ）を
ｓｐｚｌｏ−Ａｇ１４ミエローマ細胞と融合させること
によって、マウス（Ａ／　Ｊ　）内にモノクローナル抗
エストラジオール抗体を作った。抗エストラジオール抗
体を分泌する雑種細胞を下記の手順で検出した：上記細
胞からの上清を、１＃１ｇ／ｄのウシ血清アルブミンを
含むリン酸緩衝生理食塩水中で１：５に稀釈した。各稀
釈上清１００ｕＪ！とトレーサーとしてのアクリジニウ
ムエステル標識化エストラジオール−ニワトリガンマグ
ロブリン１００ｕＪ２とを試験チューブに加え、室温で
１時間インキュベートした。常磁性粒子に結合されたヤ
ギ抗マウスＩｇＧ（ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　
Ｉ　ｇ　Ｇ）を各チューブに加え、室温でさらに１０分
間インキュベートした。前記粒子を磁気分離し、その粒
子に結合したトレーサーをルミノメータ−で読み取った
。試験で陽性とでた細胞（すなわちバックグラウンドに
亘って光子がカウントされた細胞）を０．１細胞／ウエ
ル（ｗｅｌｌ）で培養（ｐｌａｔｅ）　Ｌ、、成長後頁
試験した。試験で陽性とでた、前記再成長から得られた
細胞をプリスタン注入マウス（ｐｒｉｓｔａｎｅ−ｐｒ
ｉｍｅｄｍｌｃｃ）（ＣＡＦｒ　）に腹腔的注入した。
これらのマウスからの腹水を３〜５週間後に採集した。
抗エストラジオール抗体をさらに精製することなく直接
使用した。
ヤギ抗マウスＩｇＧ抗血清（ｇｏａｔ　ａｎｔｔ−ＩＩ
ｌｏｕｓｅＩ　　ｇ　Ｇ　　ａｎｔｌｓｅｒｕｍ）（Ｊ
ａｃｋｓｏｎ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　　の　Ｉｇ
Ｇ画分を米国特許箱４，４５４．０１１８号に記載され
た方法により常磁性粒子に固定することにより、ヤギ抗
−マウスＩｇＧＰＭＰ粒子を調製した。最終Ｐ〜ＩＰ湿
性ケークを、１ｍ！７／ｍｌのウシ血清アルブミンを含
むリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ／Ｂ　ＳＡ）で稀
釈して最終濃度１０７１１９／ｄのＰ　Ｍ　Ｐ懸濁液を
作った。
Ｂ、アッセイ手順 濃度範囲０−２０００１）ｇ／ｄの一連のエストラジオ
ール標ｌ＄液各５０ｕ１を１２Ｘ７５ｍｍのポリスチレ
ン試験チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社）に加え、次に全
活性３１１５．０００　ＲＬ　Ｕを有するＡのトレーサ
ー溶液１００ｕ１を加えた。
Ａの腹水１００ｕＪ！をＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液中で１：
２００００に稀釈し、各チューブに加えた。それらのチ
ューブを全てポルテックスしくｖｏｒｔｅｘｅｄ）、室
温で１時間インキュベートした。ＡのＰＭＰ懸濁液をＰ
ＢＳ／ＢＳＡ中で稀釈し、最終濃度８０ｕｇ／−とした
。５００ｕ象の稀釈ＰＭＰ懸濁液を各試験チューブに加
えた。それらのチューブをポルテックスし、室温で３０
分間インキュベートした。次に、チューブ内のＰ　ＭＰ
を磁気分離した。各チューブ内のＰ　ｈｉ　Ｐを、０．
０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５００ｕ１の食
塩水で１回洗浄し、磁気分離し、上清をデカントした。
次に前記ＰＭＰを１００ｕＪ２の水に再懸濁させた。次
にチューブをルミノメータ−中に置き、実施例１２Ｂの
ようにカウントした。第１２図のディスプレイスメント
曲線は、光子のカウント数が標準液中のエストラジオー
ル濃度に反比例することを示している。
実施例１Ｇ トロンボキサンＢｚ　　（ＴＸ　Ｂ２　）アッセイＡ、
試薬調製 実施例１１のＴＸ　Ｂ２−ＥＤ−ＤＭＡＥ複合体をメタ
ノール中で稀釈し、原液として一８０°Ｃで保持した。
コノ原液を、０．１％（１）　Ｂ　Ｓ　Ａ　、　０．１
５ＭＮａＣＪ！および０．０５％のアジ化すトリウムを
含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，４で
稀釈し、トレーサー溶液を作った。Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ社からウサギ抗ＴＸ　Ｂ２抗血清を購入
した。この抗血清を、Ｑ、１５Ｍ塩化ナトリウム、ＩＪ
Ｉ！Ｊ／ｄのウシ血清アルブミンおよび０．０５％のア
ジ化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７，４で稀釈した。
ヤギ抗つサギＩｇＧ抗血清（ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｒａ
ｂｂｉｔＩ　ｇ　Ｇ　ａｎｔｌｓｅｒｕｒＡ）（Ｊａｃ
ｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のＩｇＧ画分を米国
特許節４，４５４，０８８号に記載の方法によって常磁
性粒子（Ｐ　Ｍ　Ｐ　）に固定することにより、ヤギ抗
ウサギＩｇＱＰＭＰを調製した。最終Ｐ〜ＩＰ湿性ケー
クをＰ　Ｂ　Ｓ／Ｂ　Ｓ　Ａ緩衝液で稀釈しく１０１１
９／ｄ）　、ＰＭＰ懸濁液とした。
Ｂ、アッセイ手順 ＰＢＳ／ＢＳＡ中の一連のＴＸ　Ｂ２　ｐ’＄液（０３
０ｎｇ／ｉ）各１００ｕＪ！をポリスチレン試験チュー
ブ（１２Ｘ　７５ｍｌ１．５ａｒｓｔｅｄｔ社）に加え
た。全活性３５０．０００　ＲＬ　Ｕを有するＡのトレ
ーサー溶液１００ｕ千を各チューブに加えた。１００ｕ
ｆのウサギ抗ＴＸＢ２抗血清（ＡにおいてＰＢＳ／ＢＳ
Ａ中で１／４００００に稀釈したもの）を全てのチュー
ブにピペット添加した。全てのチューブをポルテックス
しくｖｏｒｔｅｘｅｄ）、室温で１時間インキュベート
した。
Ａの稀釈Ｐ　ＭＰ懸濁液５００ｕＪ！を全てのチューブ
に加え、室温で４５分間インキュベートした。チューブ
内のＰＭＰを上清から磁気分離した。この上清をデカン
トし、そしてＰＭＰを５００ｕＪ！の水で１回洗浄して
１ｏＯｕｊ！の水に再懸濁させた。次に、チューブをル
ミノメータ−中に置き、実施例１２Ｂのようにカウント
した。第１３図のディスプレイスメント曲線は、光子の
カウント数が標準液中のＴｘＢｚ濃度に反比例すること
を示している。
【図面の簡単な説明】
第１〜４図は、それぞれ実施例５の実験１〜４で得られ
たカルボキシル化ビタミンＢＩ２混合物の分離を示すグ
ラフ、 第５Ａ図は実施例５のＡで得られたカルボキシル化ビタ
ミンＢ２の分離を示すグラフ、第５Ｂ〜５Ｆ図は実施例
５のＣの実験２で得られたカルボキシル化ビタミンＢＩ
２の分離ピーク１〜５（第２図）の分析ＨＰＬＣ分布を
示すグラフ、第６図は実施例５０Ｂにより得られた３つ
のモノカルボキシル化ビタミンＢ１２型混合物の分析Ｈ
ＰＬＣ分布を示すグラフ、 第７図は各複合体についてビタミンＢａ濃度に対するＢ
／ＢＯを示すグラフ、 第８図はビタミンＢ１２の同時アッセイにおけるビタミ
ンＢ、濃度に対するＲＬＵ値を示すグラフ、第９図はビ
タミンＢユのスプリットインキュベーションアッセイに
おけるビタミンＢ１２濃度に対するＲＬＵ値を示すグラ
フ、 第１０図は葉酸塩アッセイにおける葉酸塩濃度に対する
ＲＬＵ値を示すグラフ、 第１１図はフルチゾールアッセイにおけるＰＭＰに結合
したトレーサーのディスプレイスメントを示す標準曲線
のグラフ、 第１２図はエストラジオールアッセイにおけるＰＭＰに
結合したトレーサーのディスプレイスメントを示す標準
曲線のグラフ、 第１３図はトロンボキサンＢ２アッセイにおけるＰ　Ｍ
　Ｐに結合したトレーサーのディスプレイスメントを示
す標準曲線のグラフである。 ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ。 ＦＩＧ。 Ａ ＦＩＧ Ｂ ＦＩＧ。 Ｅ ＦＩＧ。 Ｆ ０．５Ｃ ＦＩＧ、５Ｄ ○ ＦＩＧ、６ Ｂ／Ｂ。ｃφ／、） ？ １樟ｌオ当り／ｌき−ぎカフ−トイＪ−（卑仇　ζ・・
°ン １啼シ点りの免各カウ／トζＬ （ｊｌ　ｒｆ−：　ｔｒＦ＋））

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）下記の化学式を有するアクリジニウムエステルであ
    って、 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでＲ＿１は０−２０のヘテロ原子を含むアルキル，
    アルケニル，アルキニル，アリールまたはアラルキル基
    であり、 Ｒ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿５およびＲ＿７は水素，アミノ，
    アミド，アシル，アルコキシル，ヒドロキシル，−ＣＯ
    ＿２，ハライド，ニトロ，−ＣＮ，−ＳＯ＿３，▲数式
    、化学式、表等があります▼（多数）また は−ＳＣＮであって、ここでＲは０−２０のヘテロ原子
    を含むアルキル，アルケニル．アルキニル，アリールま
    たはアラルキルであり、 Ｒ＿４およびＲ＿６は水素，アルキル，アルケニル，ア
    ルキニル，アラルキルまたはアルコキシルであり、 Ｘはアニオンであり、そして Ｒ＿６は▲数式、化学式、表等があります▼（多数）ま
    たは▲数式、化学式、表等があります▼ であって、ここでＱは▲数式、化学式、表等があります
    ▼（多数） ，ジ アゾまたは▲数式、化学式、表等があります▼であり、
    Ｒは上記の通りであり、Ｉは−ＳＯ＿３，−ＯＳＯ＿３
    ，−ＰＯ＿３，−ＯＰＯ＿３，または−ＣＯ＿２であり
    、 Ｎｕは求核基であるアクリジニウムエステル。 ２）Ｒ＿１が、窒素，酸素，リンおよび硫黄から成る群
    より選択された０−２０のヘテロ原子を含む、１−２４
    の炭素原子を有するアルキル，アルケニル，アルキニル
    またはアリールであり、 Ｒ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿５およびＲ＿７が水素，アミノ，
    −ＣＯ＿２，−ＣＮ，ヒドロキシル，Ｃ＿１−Ｃ＿４ア
    ルコキシル，ニトロ，ハライド，−ＳＯ＿３または−Ｓ
    ＣＮであり、 Ｒ＿４およびＲ＿８が１−８の炭素原子を有するアルキ
    ル，アルケニル，アルキニルまたはアルコキシルであり
    、 Ｘがハライド，ＣＨ＿３ＳＯ＿４＾−，ＯＳＯ＿２Ｆ＾
    −，ＯＳＯ＿２ＣＦ＿３，ＯＳＯ＿２Ｃ＿４Ｆ＿３＾−
    または▲数式、化学式、表等があります▼であり、 Ｒが、窒素，酸素，リンおよび硫黄から成る群より選択
    された０−２０のヘテロ原子を含む、１−２４の炭素原
    子を有するアルキル，アルケニル，アルキニル，アリー
    ルまたはアラルキルであり、そして Ｎｕがアミノ，ヒドロキシル，メルカプト、活性メチレ
    ンまたは有機金属部分であることを特徴とする請求項１
    記載のアクリジニウムエステル。 ３）Ｒ＿１が１−１０の炭素原子を有するアルキルであ
    り、 Ｒ＿２，Ｒ＿３，Ｒ＿５およびＲ＿７が水素，Ｃ＿１−
    Ｃ＿４アルコキシル，−ＣＮ，−ＳＯ＿３，ニトロまた
    はアミノであり、 Ｒ＿４およびＲ＿８が１−４の炭素原子を有するアルキ
    ルであり、そして Ｘがハライドであることを特徴とする請求項２記載のア
    クリジニウムエステル。 ４）Ｒ＿１，Ｒ＿４およびＲ＿８がメチルであり、Ｒ＿
    ２，Ｒ＿３，Ｒ＿５およびＲ＿７が水素であり、Ｘがブ
    ロマイドであり、そして Ｒ＿６が−ＣＯＮＨ−ＣＨ＿２ＣＨ＿２−ＮＨ＿２また
    は ▲数式、化学式、表等があります▼ であることを特徴とする請求項３記載のアクリジニウム
    エステル。 ５）生物活性を有する分子と共有結合した請求項１記載
    のアクリジニウムエステルを含む発光複合体。 ６）生物活性を有する分子と共有結合した請求項２記載
    のアクリジニウムエステルを含む発光複合体。 ７）生物活性を有する分子と共有結合した請求項３記載
    のアクリジニウムエステルを含む発光複合体。 ８）生物活性を有する分子と共有結合した請求項４記載
    のアクリジニウムエステルを含む発光複合体。 ９）前記生物活性を有する分子がたん白，抗原，ハプテ
    ン，核酸，または核酸を含む分子であることを特徴とす
    る請求項５記載の発光複合体。 １０）生物活性を有する前記分子がビタミンＢ＿１＿２
    またはビタミンＢ＿１＿２の誘導体であることを特徴と
    する請求項９記載の発光複合体。 １１）生物活性を有する前記分子が葉酸塩または葉酸塩
    の誘導体であることを特徴とする請求項９記載の発光複
    合体。 １２）（ａ）アミノ反応性化合物と共に葉酸塩または葉
    酸塩の誘導体をインキュベートしてアシルまたはアルキ
    ルオキシカルボニル基を葉酸塩または葉酸塩の誘導体の
    Ｃ−２アミノ基と結合させ、それによって保護された葉
    酸塩中間体を形成し、 （ｂ）（ａ）の保護された葉酸塩中間体の少なくとも１
    つのカルボキシル基を活性化し、 （ｃ）（ｂ）の活性化された保護葉酸塩中間体を請求項
    １記載のアクリジニウムエステルと共にインキュベート
    してアクリジニウムエステル−保護葉酸塩中間体複合体
    を形成し、 （ｄ）Ｃ−２アミノ基からアミノ保護基を取り除くのに
    十分な時間、酸性媒質中で前記アクリジニウムエステル
    −保護葉酸塩中間体複合体をインキュベートし、それに
    よってアクリジニウムエステル−葉酸塩複合体を形成す
    る各工程から成る、葉酸塩または葉酸塩の誘導体とアク
    リジニウムエステルとの複合体の製造方法。 １３）（ａ）ビタミンＢ＿１＿２またはビタミンＢ＿１
    ＿２の誘導体のコリン環の第１プロパンアミド側鎖を脱
    アミノ化するのに十分な時間、酸性媒質中で、ビタミン
    Ｂ＿１＿２またはビタミンＢ＿１＿２の誘導体をインキ
    ュベートして、カルボキシル化ビタミンＢ＿１＿２の混
    合物を与え、 （ｂ）そのカルボキシル化ビタミンＢ＿１＿２の混合物
    をＨＰＬＣにかけて、トリカルボキシルビタミンＢ＿１
    ＿２型，ジカルボキシルビタミンＢ＿１＿２型および３
    つのモノカルボキシルビタミンＢ＿１２型を分離し、 （ｃ）モノカルボキシルビタミンＢ＿１＿２型の１つを
    単離し、 （ｄ）（ｃ）のモノカルボキシルビタミンＢ＿１＿２の
    カルボキシル基を活性化し、 （ｅ）（ｄ）の活性化モノカルボキシルビタミンＢ＿１
    ＿２を請求項１記載のアクリジニウムエステルと共にイ
    ンキュベートしてアクリジニウムエステル−ビタミンＢ
    ＿１＿２複合体を得る各工程から成る、ビタミンＢ＿１
    ＿２またはビタミンＢ＿１＿２の誘導体とアクリジニウ
    ムエステルとの複合体の製造方法。 １４）前記生物活性を有する分子が１７−ベータ−エス
    トラジオールまたは１７−ベータ−エストラジオールの
    誘導体であることを特徴とする請求項９記載の発光複合
    体。 １５）前記生物活性を有する分子がコルチゾールまたは
    コルチゾールの誘導体であることを特徴とする請求項９
    記載の発光複合体。 １６）前記生物活性を有する分子がトロンボキサンＢ＿
    ２またはプロスタグランジン類似体であることを特徴と
    する請求項９記載の発光複合体。 １７）（ａ）１７−ベータ−エストラジオールまたは１
    ７−ベータ−エストラジオールの誘導体についている官
    能基を活性化して活性化エストラジオール中間体を与え
    、 （ｂ）その活性化エストラジオール中間体を請求項１記
    載のアクリジニウムエステルと共にインキュベートして
    アクリジニウムエステル−１７−ベータ−エストラジオ
    ール複合体を得る工程から成る、１７−ベータ−エスト
    ラジオールまたは１７−ベータ−エストラジオールの誘
    導体とアクリジニウムエステルとの複合体の製造方法。 １８）（ａ）コルチゾールまたはコルチゾールの誘導体
    についている官能基を活性化して活性化コルチゾール中
    間体を与え、 （ｂ）その活性化コルチゾール中間体を請求項１記載の
    アクリジニウムエステルと共にインキュベートしてアク
    リジニウムエステル−コルチゾール複合体を得る工程か
    ら成る、コルチゾールまたはコルチゾールの誘導体とア
    クリジニウムエステルとの複合体の製造方法。 １９）（ａ）トロンボキサンＢ＿２またはプロスタグラ
    ンジン類似体の末端カルボキシル基を活性化してトロン
    ボキサンＢ＿２またはプロスタグランジン類似体の活性
    化中間体を与え、 （ｂ）前記活性化中間体を請求項１記載のアクリジニウ
    ムエステルと共にインキュベートしてアクリジニウムエ
    ステル−トロンボキサンＢ＿２複合体またはアクリジニ
    ウムエステル−プロスタグランジン類似体複合体を得る
    工程から成る、トロンボキサンＢ＿２またはプロスタグ
    ランジン類似体とアクリジニウムエステルとの複合体の
    製造方法。 ２０）（ａ）試料中のビタミンＢ＿１＿２を内生的ビタ
    ミンＢ＿１＿２結合たん白から遊離させる条件下で液体
    試料をインキュベートして遊離された液体試料を与え、
    （ｂ）前記遊離された液体試料を、（１）固体担体上に
    固定されたビタミンＢ＿１＿２結合たん白を含む複合物
    および（ｉｉ）請求項１３記載の複合体と共にインキュ
    ベートして錯体複合物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、（ｄ
    ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエステ
    ルラベルの量を測定し、 （ｅ）（ｄ）の測定から液体試料中のビタミンＢ＿１＿
    ２の量を決定する各工程から成る、液体試料中のビタミ
    ンＢ＿１＿２を測定するためのアッセイ。 ２１）（ａ）液体試料を、（ｉ）塩基および（ｉｉ）メ
    ルカプト化合物と共にインキュベートして遊離された液
    体試料を与え、 （ｂ）前記遊離された液体試料を、（ｉ）固体担体上に
    固定されたビタミンＢ＿１＿２結合たん白を含む複合物
    および（ｉｉ）請求項１３記載の複合体と共にインキュ
    ベートして錯体複合物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、（ｄ
    ）前記錯体複合物をチオール反応性化合物と共にインキ
    ュベートし、 （ｅ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
    ステルラベルの量を測定し、 （ｆ）（ｅ）の測定から液体試料中のビタミンＢ＿１＿
    ２の量を決定する各工程から成る、液体試料中のビタミ
    ンＢ＿１＿２を測定するためのアッセイ。 ２２）前記メルカプト化合物がジチオスレイトールであ
    ることを特徴とする請求項２１記載のアッセイ。 ２３）前記塩基が水酸化ナトリウムであることを特徴と
    する請求項２２記載のアッセイ。 ２４）前記チオール反応性化合物がエチルマレイミドで
    あることを特徴とする請求項２１記載のアッセイ。 ２５）（ａ）液体試料中の葉酸塩を液体試料中の内生的
    葉酸塩結合たん白から遊離させる条件下で前記液体試料
    をインキュベートして遊離された液体試料を与え、 （ｂ）前記遊離された液体試料を、（ｉ）固体担体上に
    固定された葉酸塩結合たん白を含む複合物および（ｉｉ
    ）請求項１２記載の複合体と共にインキュベートして錯
    体複合物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、（ｄ
    ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエステ
    ルラベルの量を測定し、 （ｅ）（ｄ）の測定から液体試料中の葉酸塩の量を決定
    する各工程から成る、液体試料中の葉酸塩を測定するた
    めのアッセイ。 ２６）（ａ）液体試料を、（ｉ）塩基および（ｉｉ）メ
    ルカプト化合物と共にインキュベートして遊離された液
    体試料を与え、 （ｂ）前記遊離された液体試料を、（ｉ）固体担体上に
    固定された葉酸塩結合たん白を含む複合物および（ｉｉ
    ）請求項１２記載の複合体と共にインキュベートして錯
    体複合物を形成し、 （ｃ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、（ｄ
    ）前記錯体複合物をチオール反応性化合物と共にインキ
    ュベートし、 （ｅ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
    ステルラベルの量を測定し、 （ｆ）（ｅ）の測定から液体試料中の葉酸塩の量を決定
    する各工程から成る、液体試料中の葉酸塩を測定するた
    めのアッセイ。 ２７）前記メルカプト化合物がジチオスレイトールであ
    ることを特徴とする請求項２６記載のアッセイ。 ２８）前記塩基が水酸化ナトリウムであることを特徴と
    する請求項２７記載のアッセイ。 ２９）前記チオール反応性化合物がエチルマレイミドで
    あることを特徴とする請求項２６記載のアッセイ。 ３０）（ａ）液体試料を、（ｉ）固体担体上に固定され
    た抗コルチゾール抗体を含む複合物および（ｉｉ）請求
    項１８記載の複合体と共にインキュベートして錯体複合
    物を形成し、 （ｂ）前記錯体複合物を非結合複合体から分離し、（ｃ
    ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエステ
    ルラベルの量を測定し、 （ｄ）（ｃ）の測定から液体試料中のコルチゾールの量
    を決定する各工程から成る、液体試料中のコルチゾール
    を測定するためのアッセイ。 ３１）（ａ）液体試料を、（ｉ）抗１７−ベータ−エス
    トラジオール抗体および（ｉｉ）請求項１７記載の複合
    体と共にインキュベートして反応混合物を形成し、（ｂ
    ）抗１７−ベータ−エストラジオール抗体に結合能のあ
    る、固体担体上に固定された抗体を含む複合物と共に前
    記反応混合物をインキュベートして錯体複合物を形成し
    、 （ｃ）前記錯体複合物を上清から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
    ステルラベルの量を測定し、 （ｅ）（ｄ）の測定から液体試料中の１７−ベータ−エ
    ストラジオールの量を決定する各工程から成る、液体試
    料中の１７−ベータ−エストラジオールを測定するため
    のアッセイ。 ３２）（ａ）液体試料を、（ｉ）抗トロンボキサンＢ＿
    ２抗体および（ｉｉ）請求項１９記載の複合体と共にイ
    ンキュベートして反応混合物を形成し、 （ｂ）抗トロンボキサンＢ＿２抗体に結合能のある、固
    体担体上に固定された固定化抗体を含む複合物と共に前
    記反応混合物をインキュベートして錯体複合物を形成し
    、 （ｃ）前記錯体複合物を上清から分離し、 （ｄ）前記錯体複合物に結合しているアクリジニウムエ
    ステルラベルの量を測定し、 （ｅ）（ｄ）の測定から液体試料中のトロンボキサンＢ
    ＿２の量を決定する各工程から成る、液体試料中のトロ
    ンボキサンＢ＿２を測定するためのアッセイ。
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