JP2010019854A

JP2010019854A - 親水性修飾剤を有するアクリジニウムエステル標識

Info

Publication number: JP2010019854A
Application number: JP2009239298A
Authority: JP
Inventors: Anand Natrajan; アナンド、ナトラジアン; David Sharpe; デイヴィド、シャープ; Qingping Jiang; クインピン、ジァン
Original assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany; Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany; Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 2001-07-03
Filing date: 2009-10-16
Publication date: 2010-01-28
Anticipated expiration: 2022-06-26
Also published as: US6664043B2; EP1273917A3; JP4467869B2; AU4573602A; US20030045716A1; CA2387466A1; EP1273917B1; EP1273917A2; JP2003050204A; AU782559B2; JP4913195B2; ES2486815T3

Abstract

【課題】親水性修飾剤を有する検出可能な化学発光アクリジニウムエステル標識、そのような標識を含む組成物、錯体、および／またはコンジュゲート、ならびにそのような標識を使用する標的分析物の生物分析アッセイの実施方法を提供すること。
【解決手段】フォレート、テオフィリン、およびトブラマイシンのアッセイ（そのような標識を非イオン性ポリエチレングリコール、ポリイオン性スペルミンジスルホナート、およびポリイオン性スペルミンジカルボキシラートなどの親水性修飾剤と共に用いる）が詳述されている。
【選択図】なし

Description

本発明は、生物分析の応用分野で有用であり、一般に、親水性修飾剤を有する検出可能な化学発光アクリジニウムエステル標識、そのような標識を含む組成物、錯体、および／またはコンジュゲート、ならびにそのような標識を使用する標的分析物の生物分析アッセイを行うための方法に関する。

アクリジニウムエステルは、イムノアッセイおよび核酸アッセイの分野で広範に使用されてきた非常に有用な化学発光標識である。以下の各特許文書は、（ａ）それぞれの全体が参照により本明細書に合体され、かつ（ｂ）アクリジニウムエステル化合物の生物分析への応用例の様々な態様に関する。ＥＰ０２６３６５７、ＵＳ４７４５１８１、ＥＰ０３５３９７１、ＥＰ０３６１８１７、ＵＳ４９１８１９２、ＵＳ５１１０９３２、ＵＳ５２２７４８９、ＵＳ５２４１０７０、ＥＰ０６１７２８８、ＷＯ９４２１８２３、ＵＳ５３９５７５２、ＥＰ０６６１２７０、ＵＳ５４４９５５６、ＷＯ９５２７７０２、ＵＳ５５３８９０１、ＵＳ５５９５８７５、ＥＰ０７５４１７８、ＵＳ５６５６４２６、ＵＳ５６５６５００、ＵＳ５６６３０７４、ＵＳ５７０２８８７、ＷＯ９８５４５７４、ＵＳ５８７９８９４、ＷＯ９９１１８１３、ＷＯ０００９４８７、ＥＰ０９８２２９８、ＥＰ０９８８５５１、ＷＯ００３１５４３、ＥＰ１００９８５２、ＵＳ６０８０５９１、ＥＰ１０４９９３３、ＵＳ６１６５８００、ＷＯ０１０９３７２、およびＥＰ１１０４４０５。

親水性修飾剤を欠く、いくつかの特定の検出可能な化学発光アクリジニウムエステル標識が、当該技術分野で既知であり、例えば、２’，６’−ジメチル−４’−［Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル］フェニル−１０−メチル−９−アクリジンカルボキシラートおよび２’，６’−ジメチル−４’−［Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル］フェニル−１０−スルホプロピル−９−アクリジンカルボキシラート（各標識を、以下それぞれ「ＤＭＡＥ−ＮＨＳ」および「ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ」と呼ぶ）であり、それらはＢａｙｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＢｕｓｉｎｅｓｓＧｒｏｕｐＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、５１１ＢｅｎｅｄｉｃｔＡｖｅｎｕｅ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮｅｗＹｏｒｋ１０５９１−５０９７からイムノアッセイ機器システム用に市販されている。読者の便宜のため、これらの化合物の各構造を下記に示す。

上述のとおり、本発明は、広く親水性修飾剤を有する検出可能な化学発光アクリジニウムエステル標識を対象とする。本発明の標識のいくつかの好ましい実施形態において、本発明者等は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥに２種類の構造要素を組み込み、これらの修飾がイムノアッセイにおいて向上した性能を示すユニークなハプテントレーサーの調製を可能にすることを見出した。３種類の異なる臨床的に関連する分析物、すなわち、ビタミンである葉酸塩、喘息薬であるテオフィリン、およびアミノグリコシド抗生物質であるトブラマイシンを用いて、本発明者等の発見の普遍性を明らかにする。

本発明の標識を深く考察する前に、アッセイフォーマットの簡単な概観を下記に示す。競合イムノアッセイは、共通して、（ａ）問題の分析物を蛍光または化学発光標識したコンジュゲートが、アッセイ中でトレーサーとして使用されているフォーマットを用い、（ｂ）固体支持体を利用している。そのような競合アッセイの典型的な構成は、３種の要素、すなわち、トレーサー、問題の分析物を含むサンプル、および結合した分析物と結合していない分析物の分離方法からなる。（ただし、均一イムノアッセイでは分離は行われないことに注意されたい。）例えば、常磁性粒子などの固体支持体上への葉酸結合タンパク質の固定化（以下、「ＰＭＰ」と呼ぶ）は、遊離した分析物と結合した分析物（この場合の分析物は、葉酸である）のそのような分離（磁気）を実施するための手段を提供する。トレーサーがアッセイに含まれるとき、固定化タンパク質に結合するためにサンプルからの分析物と競合する。アッセイ中の分析物のレベルが上昇すると、結果として固定化タンパク質に結合するトレーサーが減少する。

以下に詳述するとおり、（また後でさらに例示するように）ハプテントレーサーの分離に特に有用な２種のスペーサー、（ａ）非イオン性ポリエチレングリコール、ならびに（ｂ）ポリイオン性スペルミンジスルホナートおよびポリイオン性スペルミンジカルボキシラートが開発された。

ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」と呼ぶ）は、よく知られたポリマーである。それは、生体適合性であり、水性溶媒および有機溶媒のどちらにも可溶性であり、無毒性であり、非免疫原性である。従来技術では、低分子量の薬から大きなタンパク質まで、さらにはリポソームなどの大きな集塊にいたるまでの様々な分子の修飾剤として広範に使用されている。薬剤のＰＥＧコンジュゲートは、向上した可溶性を示し、血流中でより長く生存する。タンパク質とペプチドのＰＥＧ修飾は、溶解性を向上させ、タンパク質分解に対する抵抗性を与え、免疫原性を低下させる。オリゴヌクレオチドのＰＥＧ修飾は、溶解性を高め、ヌクレアーゼ安定性を与える。脂質のＰＥＧ修飾により、立体的に安定で、向上した血液循環時間を示すＰＥＧグラフトされたリポソームの調製が可能となる。ＰＥＧの使用に関する従来技術の優れた考案が、Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５、６、ｐｐ．１５０〜１６５に記載されており、その全体を参照により本明細書中に合体する。ＰＥＧを使用して蛍光染料の性質を修飾することも従来技術に記載されている。ＰＥＧ修飾された蛍光ポルフィリンおよびフタロシアニン染料は、水溶液中で凝集挙動の減少、ならびにＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）などのヒト血清の成分への非特異的結合の低減を示すことが証明された。これらのコンジュゲートはまた、長い蛍光減衰時間を示す（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３４２４およびＰＣＴ／ＵＳ９１／０３４２６）。そのようなコンジュゲートの蛍光イムノアッセイへの応用例、ｉｎｖｉｖｏイメージング、およびｉｎｖｉｖｏ腫瘍療法が、同じ著者によって提案されている。

ＰＥＧの上記の使用にもかかわらず、ポリエチレングリコールによるアクリジニウムエステルの修飾はこれまで記載されていない。同様に、イオン性官能基を導入するための足場としてポリアミンであるスペルミンを用いて考案されたポリイオン性スペーサーも報告されていない。本発明者等は、これらの後者の分子もアクリジニウムエステルの修飾に非常に有用であることを見出した。これらの修飾アクリジニウムエステルの合成および応用例は、次のとおりである。

上述したとおり、ビタミンである葉酸は、臨床的に重要な分析物であり、一般にイムノアッセイ技術を用いて測定される。密接に関連した化合物として、プテロイン酸は、葉酸の単純化された構造変異体であり、これは葉酸に通常見られるグルタミン酸部分を欠いている。本発明者等は、プテロイン酸の２種の異なるＮＳＰ−ＤＭＡＥコンジュゲートを調製した。一方は、疎水性脂肪族（ヘキサメチレン）スペーサーを含み、他方は、親水性ヘキサエチレングリコールスペーサーを含む（図１および図２参照）。最初のトレーサーの合成は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳを１，６−ヘキサンジアミンと反応させることによって実施された（以下、「ＨＤ」と呼ぶ）。次いで、得られたアクリジニウムエステル誘導体（以下、「ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ」と呼ぶ）をＮ¹⁰−トリフルオロアセチルプテロイン酸と縮合させ、次いでコンジュゲートからトリフルオロアセチル保護基を除去した。ＰＥＧスペーサーをもつ類似のトレーサーを調製するために、短いジアミノヘキサエチレングリコールを市販のヘキサエチレングリコールから合成した。ヘキサエチレングリコール中の２個のヒドロキシル基を、メタンスルホン酸エステルに変換し、これを続いてアジドで置き換えた。ジアジドヘキサエチレングリコールを還元するとジアミノヘキサエチレングリコールが得られ、次いで、これをＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳと縮合させた。得られたアクリジニウムエステル誘導体（以下、「ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ」と呼ぶ）を上記で議論したとおりプテロイン酸と結合させた。

次に、この２種の異なるＮＳＰ−ＤＭＡＥ−プテロアート（ｐｔｅｒｏａｔｅ）コンジュゲートをフォレート（ｆｏｌａｔｅ）イムノアッセイで評価した（実施例５、表１〜３、および図３）。このアッセイフォーマットにおいて、フォレート結合タンパク質は、ＰＭＰ上に固定化され、２種のトレーサーは、分析物である葉酸と競合する。用量応答曲線を図３に示す。アッセイデータを得るために使用した方法および種々のアッセイパラメータの定義は、実施例５で説明する。表１〜３は、アッセイの精度、アッセイの確度、およびアッセイの感度を要約したものである。アクリジニウムエステル部分とプテロアート部分との間にヘキサエチレングリコールスペーサーを導入すると、トレーサーの結合は２倍を超える。それにより、Ｂ／Ｔと定義された結合したトレーサーの画分は、ＰＥＧスペーサーをもつトレーサーの場合、０．５３％から１．１５％に増加する（表３）。明らかに、ポリエチレングリコールスペーサーは、ＰＥＧ含有トレーサーの結合に対する任意の立体干渉を緩和する。次に、本発明者等は、これもまたヘキサエチレングリコールスペーサーを含むＮＳＰ−ＤＭＡＥ−フォレートコンジュゲートを合成した（図４）。葉酸中のα−カルボキシラートがフォレート結合タンパク質によく結合するためには遊離したままでなければならないことは、従来技術で知られているので（Ｗａｎｇ，Ｓ．等、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．１９９６、７、ｐｐ．５６〜６２）、本発明者等は、まず特異的ガンマリンクフォレートトレーサーを合成した。具体的には、これは、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグルタミン酸α−ｔｅｒｔ−ブチルエステルとＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧを縮合させることによって実施した（図４）。得られたコンジュゲートから保護基を除去し、Ｎ¹⁰−トリフルオロアセチルプテロイン酸とカップリングさせ、その後トリフルオロアセチル基を除去することにより、短いポリエチレングリコールスペーサーを導入したガンマリンクフォレート−ＮＳＰ−ＤＭＡＥトレーサーを得た。フォレートイムノアッセイでこのトレーサーを評価すると、プテロアートトレーサーと比較して予想していたよりも良好な結合（Ｂ／Ｔ１．８８％）が確かに示された。本発明者等はまた、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグルタミン酸γ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルから出発し、上記の反応と同じシーケンスに従って特異的アルファリンクフォレートトレーサーを調製した（図５）。得られたアルファリンクフォレートトレーサーをフォレートイムノアッセイで評価すると、遊離のα−カルボキシル基が欠如しているために結合は減少していた。様々なトレーサー間にはアッセイの精度またはアッセイの確度に差異が認められないので、ＨＥＧ含有トレーサーは、より低い非特異的結合を示した（表３）。したがって、親水性修飾剤をもたないＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロアートは、最も高い非特異的結合を有する。親水性スペーサーをもつ類似のＨＥＧ含有トレーサーは、非特異的結合が２倍以上低かった。２種のフォレートトレーサーは、親水性ＨＥＧスペーサーを有するために、より低い非特異的結合も有する。ＨＥＧ含有トレーサーの非特異的結合がより少ない結合の増加はまた、フォレートアッセイの動的範囲を拡大し、アッセイの感度を向上させた（表３）。

アミノグリコシド抗生物質であるトブラマイシンのイムノアッセイで、本発明者等は、２種のトブラマイシン−ＮＳＰ−ＤＭＡＥトレーサーのアッセイ性能を比較した。そのうちの一方は（親水性）ヘキサエチレングリコールスペーサーを含み、他方は含まない。トブラマイシンの抗体を生成する手順と、トブラマイシンを他の小分子で部位特異的に修飾する手順は、以前に記載されている（Ｓｉｎｇｈ，Ｐ．等、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．、１９８４、６２、ｐｐ．２４７１〜２４７７）。トブラマイシンでは、６’−アミンが最も反応性である（図６）。したがって、アミノグリコシドを１当量のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳで処理すると、１：１トブラマイシン−ＮＳＰ−ＤＭＡＥトレーサーを与える。第２のトレーサーは、グルタル酸無水物と縮合させることによりＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧをグルタル酸誘導体に変換することによって調製された。次いで、得られた付加物（以下、「ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−グルタラート」と呼ぶ）中のカルボン酸をＮＨＳエステルに変換し、トブラマイシン１当量とカップリングさせるとトレーサーが得られた。

トブラマイシンのイムノアッセイで２種のトレーサーを検査すると、その２種のトレーサーのＰＭＰ上のトブラマイシン抗体への全体的な結合は同様であるが、親水性ＰＥＧ含有トレーサーの非特異的結合は通常のトレーサーよりも２．５倍超低いことが明らかになった（実施例８の表４〜６、図７）。非特異的結合の増加は、多くの場合疎水性と結びつき、それはトブラマイシンなどの高度に水溶性の分析物であっても顕著なので、トレーサー中にポリエチレングリコール修飾剤を導入することは非常に有益である。２種のトレーサーに対するアッセイの精度とアッセイの確度は同様であるが、トブラマイシンアッセイの感度はＨＥＧ含有トレーサーについてかなり良好であった（１．７倍低い、表６）。

喘息薬分析物テオフィリンの場合、炭素６個のスペーサーとヘキサエチレングリコールスペーサーを含む２種のＮＳＰ−ＤＭＡＥテオフィリントレーサー（図８および図９）に加え、本発明者等は、ポリイオン性スペーサーを含む２種の新規なトレーサーを調製した。最初の２種のトレーサーは、８−カルボキシプロピルテオフィリンのＮＨＳエステルをＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤまたはＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧのいずれかと縮合させて簡単に調製した。ポリイオン性スペーサーをポリアミンであるスペルミンから誘導し、最初にその２種の第１級アミンをフタルイミド基に変換して調製した。得られた化合物、ビス（フタルイミド）スペルミンをニートな１，３−プロパンスルトン中で加熱することにより２個の第２級アミンでアルキル化し、または無水コハク酸でアシル化した（図８）。ヒドラジンでフタルイミド保護基を除去すると、スペルミンジスルホナート（以下、「ＳＰＤＳ」と呼ぶ）およびスペルミンジカルボキシラート（以下、「ＳＰＤＣ」と呼ぶ）が得られた。これらの新しいスペーサーをＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳとカップリングさせ、得られたＮＳＰ−ＤＭＡＥ誘導体を８−カルボキシテオフィリンとカップリングさせた（図９）。次いで、４種のテオフィリントレーサーをすべてテオフィリンイムノアッセイで評価した（実施例１３、表７〜９、図１０）。親水性ＰＥＧスペーサーを含むテオフィリントレーサーは、非親水性の炭素６個のスペーサーをもつトレーサーと比べて、低い（２倍）非特異的結合を示した。ＳＰＤＳスペーサーとＳＰＤＣスペーサーを含むトレーサーは、さらにより低い非特異的結合を有する（それぞれ疎水性ＨＤスペーサーより３．７倍および３．１倍低い）。結合している間、４種のトレーサーのアッセイの精度、およびアッセイの確度は同様であったが、ポリカルボキシラートスペーサーＳＰＤＣを含むトレーサーは、アッセイの感度を３倍以上高めた。どちらのスペーサーもより低い非特異的結合を示したが、その他の親水性スペーサーは、この特異的アッセイでそのような向上は示さなかった。

上記の一連の結果は、アクリジニウムエステル−ハプテンコンジュゲート中の親水性スペーサーの有用性を明らかに示す。すべてのアッセイで有益なスペーサーはないが、選択により、アッセイ性能に関してトレーサーに最大の利益を与える親水性スペーサーは容易に識別される。本発明者等は、この点に関して有用な２つのタイプ（非イオン性およびポリイオン性）のスペーサーを開示した。本発明により提供された方法から、当業者は、異なる分析物と異なる標識を用いる様々なトレーサーの調製に同方法を応用できることも明らかである。したがって、本発明は、下記の一般構造のトレーサーを開示している。
Ａ−Ｂ−Ｃ
式中、Ａは、プテロイン酸、葉酸、ステロイドなど問題の分析物、テオフィリン、フェニトイン、ジゴキシンなどの治療薬、トブラマイシン、フェノバルビタールなどのアミノグリコシドであり、
Ｂは、（ａ）分子量１５０〜５０００のポリエチレングリコール、または（ｂ）スペルミンまたは任意のポリアミン（必ずしもすべてではないが、内部のアミンが、スルトン、無水物などの親水性分子で修飾されている）から誘導されたポリイオン性スペーサーであり、
Ｃは、化学発光または蛍光標識である。

親水性修飾剤の好ましいアクリジニウムエステルコンジュゲートは、下記式の化合物を含む。

式中、
Ｒ₁は、２４個までの炭素ならびに窒素、酸素、リン、および硫黄からなる群から選択された２０個までのヘテロ原子を有する、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、スルホエチル、スルホプロピル、スルホブチル、またはアラルキルであり、
Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₅、Ｒ₇は、水素、アミノ、ヒドロキシル、ハライド、ニトロ、−ＣＮ、−ＳＯ₃Ｈ、−ＳＣＮ、−ＯＲ、ＮＨＣＯＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、または−ＣＯＮＨＲであり、Ｒは、２４個までの炭素ならびに窒素、酸素、リン、および硫黄からなる群から選択された２０個までのヘテロ原子を有するアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキルであり、
Ｒ₄およびＲ₈は、８個までの炭素を有し、側鎖基が２個を超える炭素をもつ分枝は有しないアルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、またはアルコキシルであり、
Ｒ₆は、置換Ｒ₆＝Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｒ₁₀を表し、式中、Ｒは、場合により、２４個までの炭素ならびに窒素、酸素、リン、および硫黄からなる群から選択された２０個までのヘテロ原子を有するアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキルであり、Ｌは、エーテル、チオエーテル、アミド、エステル、またはカルバマート結合であり、
Ｓは、分子量３００〜５０００のポリエチレングリコールであり、または以下の構造であり、

あるいは、Ｒ₆は、エステル結合にメタ位であるフェノキシ環の位置で結合することができ（この場合、Ｒ₅またはＲ₇は、エステル結合にパラ位に結合している）、
Ｒ₁₀は、求電子基、脱離基、または求核基である。

プテロアートトレーサーとフォレートトレーサーの好ましい実施形態は、以下の構造で示される。

式中、Ｍは、Ｒ₆が場合により、２４個までの炭素、ならびに窒素、酸素、リン、および硫黄からなる群から選択された２０個までのヘテロ原子を有するアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキルであることを除いて、上記で定義したとおりのアクリジニウムまたはベンズアクリジニウムエステル誘導体であり、
Ｌは、アミド、エーテル、チオエーテル、エステル、またはカルバマート結合であり、
Ｓは、上記で定義したとおりのスペーサーある。

トブラマイシントレーサーおよびテオフィリントレーサーの好ましい実施形態は、以下の構造で示す。

式中、Ｓ、Ｌ、およびＭは、上記で定義したとおりである。

ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロアートの合成を示す図である。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−プテロアートの合成を示す図である。ＤＭＡＥ−プテロアートコンジュゲートの用量応答曲線を示す図である。ヘキサエチレングリコールスペーサーを有するＮＳＰ−ＤＭＡＥ−フォレートコンジュゲートの合成を示す図である。アルファリンクフォレートトレーサーの合成を示す図である。トブラマイシン−ＮＳＰ−ＤＭＡＥトレーサーの合成を示す図である。トブラマイシンコンジュゲートの用量応答曲線を示す図である。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−テオフィリントレーサーの合成を示す図である。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ誘導体をカルボキシテオフィリンとカップリングさせてトレーサーを形成することを示す図である。テオフィリンコンジュゲートの用量応答曲線を示す図である。

以下の非限定的、典型的実施例は、例示のためのものにすぎず、本発明が受ける権利のある特許保護の範囲を制限する意味はなく、その保護は、頭記の特許請求の範囲によってのみ限定される。

実施例１
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤの合成を下記のとおり実施した（図１）。ＤＭＦ（１ｍＬ）と０．１ＭカルボナートｐＨ９（１ｍＬ）中の１，６−ジアミノヘキサン（４９ｍｇ、０．４２ミリモル）をＤＭＦ（１ｍＬ）中のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ（２５ｍｇ、０．０４２ミリモル）で処理した。反応物を室温で１６時間攪拌し、次いでＣ１８カラム（２０×２５０ｍｍ）を使用し、それぞれ０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むＭｅＣＮ／水の１０％から６０％の勾配（４０分）を用いる調製用ＨＰＬＣで直接精製し、生成物を約２１分で溶離した。生成物を含むＨＰＬＣ画分を減圧下で濃縮し、次いで、凍結乾燥させて黄色の固形物を得た。収量２５ｍｇ（定量的）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ５９１測定値（５９１．７３計算値）。

次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロアートの合成を下記のとおり実施した（図１）。次に、ＤＭＦ（４００μＬ）中のＮ¹⁰−トリフルオロアセチルプテロイン酸（２．５ｍｇ、６．１３マイクロモル）をクロロギ酸エチル（３μＬ、５当量）およびジイソプロピルエチルアミン（５．４μＬ、５当量）で処理した。反応物を室温で１時間攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残留物をＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ（１．４ｍｇ、２．３７マイクロモル）とジイソプロピルエチルアミン（２μＬ、１１．３マイクロモル）で処理した。得られた反応物を室温で４時間攪拌し、次いで濃縮した。残留物をメタノールに溶解し、濾過した。Ｃ１８カラム（７．８ｍｍ×２５ｃｍ）を使用し、それぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の０％から６０％の勾配（４０分）を用いるＨＰＬＣで精製した。Ｒｔ（生成物）＝約２７分。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。収量０．６ｍｇ（２６％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ９８３．４７測定値（９８２．０１計算値）。

上記の材料を０．１Ｍピペリジン（５００μＬ）中、室温で４時間攪拌し、次いで、生成物を上記のとおりＨＰＬＣで直接精製した。Ｒｔ（生成物）＝約２６分。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて黄色の固形物を得た。収量約０．２ｍｇ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ８８９．４８測定値（８８６計算値）。

実施例２
ヘキサエチレングリコールジメタンスルホナートの合成を下記のとおり実施した。ヘキサエチレングリコール（１ｇ、３．５４ミリモル）のクロロホルム（１０ｍＬ）溶液を氷浴中の窒素下で冷却し、塩化メタンスルホニル（６０３μＬ、２．２当量）とジイソプロピルエチルアミン（１．５６ｍＬ、２．５当量）で処理した。反応物を室温まで加温し、窒素下で攪拌した。２時間後、追加の塩化メタンスルホニル（２７４μＬ、１．０当量）とジイソプロピルエチルアミン（７４９μＬ、１．２当量）を加えた。室温でさらに２時間後、反応物をクロロホルムで希釈し、得られた溶液を水性塩化アンモニウム、次いでブラインで２回洗浄した。次いで、クロロホルム溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。淡黄色の油状物が得られた。収量１．３８ｇ（８９％）。ＴＬＣ（１０％メタノール、９０％クロロホルム）Ｒｆ（生成物）＝０．６４、Ｒｆ（出発材料）＝０．４２。

次に、ジアジドヘキサエチレングリコールの合成を下記のとおり実施した。ヘキサエチレングリコールジメタンスルホナート（０．５ｇ、１．１４ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液をアジ化ナトリウム（０．３１ｇ、４．７６ミリモル）で処理した。反応物を油浴中１１０℃、窒素雰囲気下で８時間加熱した。次いで、反応物を室温に冷却し、さらに１６時間攪拌した。次いで、ＤＭＦを減圧下で除去し、残留物をクロロホルムとブラインの間で分配した。クロロホルム層を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して油状物を得た。収量０．４４２ｇ（定量的）、ＴＬＣ（５％メタノール、９５％クロロホルム）Ｒｆ（生成物）＝０．５９、Ｒｆ（出発材料）＝０．３５。

次に、ジアミノヘキサエチレングリコール（以下、「ジアミノＨＥＧ」と呼ぶ）の合成を下記のとおり実施した（図２）。次に、ジアジドヘキサエチレングリコール（０．４４ｇ、１．３２ミリモル）の酢酸エチル（１５ｍＬ）溶液を、活性炭素（９５ｍｇ）に担持させた１０％Ｐｄで処理し、黒色の反応混合物を室温で水素化した。室温で１６時間後、反応物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して油状物を得た。収量０．２６ｇ（７０％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ２８０測定値２８０計算値、ＴＬＣ（４５％メタノール、５０％クロロホルム、５％水酸化アンモニウム）Ｒｆ＝０．２９。

次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧの合成を下記のとおり実施した（図２）。次に、１：１のＤＭＦと０．１ＭカルボナートｐＨ９（２ｍＬ）中のジアミノＨＥＧ（３３ｍｇ、０．１２ミリモル）の溶液をＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ（１０ｍｇ、１７マイクロモル）で処理した。反応物を室温で１６時間攪拌した。生成物をＣ１８カラム（２０ｍｍ×３００ｃｍ）を使用し、それぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の０％から６０％の勾配（４０分）を用いる調製用ＨＰＬＣで直接精製した。Ｒｔ（生成物）＝約２１分。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。収量１０．６ｍｇ（８３％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ７５７．３９測定値（７５５．８９計算値）。

次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−プテロアートの合成を下記のとおり実施した（図２のステップ（ＩＩＩ）参照）。次に、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＮ¹⁰−トリフルオロアセチルプテロイン酸（５．４ｍｇ、１３．２マイクロモル）をＮＨＳ（７．６ｍｇ、５当量）とＤＣＣ（１３．６ｍｇ、５当量）で処理した。反応物を室温の窒素雰囲気下で攪拌した。２時間後、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＰＥＧ（３．５ｍｇ、４．６マイクロモル）のＤＭＦ（４００μＬ）溶液とジイソプロピルエチルアミン（２μＬ、１１．３マイクロモル）で反応物を処理した。得られた溶液を室温の窒素雰囲気下で１６時間攪拌した。次いで、反応混合物を上記で記載のとおりＣ１８カラム（７．８ｍｍ×３００ｃｍ）の調製用ＨＰＬＣで直接精製した。Ｒｔ（生成物）＝約２４分。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１１４８．７１．９２測定値（１１４６．１７計算値）。

次に、上記のコンジュゲートを０．１Ｍピペリジン４００μＬ中、室温で１時間攪拌した。次いで、反応物を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。ＨＰＬＣＲｔ＝約２１分、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１０５１．９２測定値、（１０５０．１６計算値）。

実施例３
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−γ−フォレートコンジュゲートの合成を下記のとおり実施した。Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸α−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２５ｍｇ、０．０８２ミリモル）をＭｅＣＮ（２ｍＬ）中に溶解し、ＮＨＳ（１４．２ｍｇ、１．５当量）とＤＣＣ（２５．５ｍｇ、１．５当量）で処理した。反応物を室温で１．５時間攪拌した。この溶液（０．５４ｍＬ）をジイソプロピルエチルアミン（５μＬ、１．５当量）を含むＤＭＦ（５００μＬ）中のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＰＥＧ（１４ｍｇ、１８．５４マイクロモル）の溶液に加えた。２〜３時間後、追加のジイソプロピルエチルアミン（２．５μＬ）を上記からの追加の活性エステル溶液５４０μＬと一緒に加えた。得られた反応物を室温で１６時間攪拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、残留物をＭｅＣＮ２ｍＬに溶解した。これをガラスウールで濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。粗生成物を酢酸中の３０％ＨＢｒ１ｍＬ中で２時間攪拌することによりデブロックした。エーテル（１０ｍＬ）の添加により生成物を沈殿させた。エーテルを傾瀉し、残留物を上記と同じ溶媒系を用いてＨＰＬＣにより直接精製した。Ｒｔ（生成物）＝約２０．５分。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物として生成物２．８ｍｇ（２０％）を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ８８８．６７測定値（８８５．０計算値）。

次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−γ−フォレートの合成を下記のとおり実施した。ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＮ¹⁰−トリフルオロアセチルプテロイン酸（５ｍｇ、１２．２５マイクロモル）をクロロギ酸イソブチル（４．７μＬ、３当量）およびジイソプロピルエチルアミン（８μＬ、４当量）で処理した。反応物を室温で１時間攪拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残留物をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、この溶液１７０μＬをジイソプロピルエチルアミン（１μＬ）と一緒にＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＰＥＧ−γ−グルタマート（１．８ｍｇ、２．０３マイクロモル）に加えた。反応物を室温で１６時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮した。残留物をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、上記と同じ条件を用いてＨＰＬＣにより精製した。Ｒｔ（生成物）＝約２５．５分。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１２７６．３４測定値、（１２７５．２８計算値）。

次に、コンジュゲート中のトリフルオロアセチル基を、水とＤＭＦ（２００μＬ）中の０．１Ｍピペリジン（４００μＬ）の混合物中室温で攪拌して除去した。６時間後、生成物を上記と同じ条件を用いてＨＰＬＣにより直接精製した。Ｒｔ（生成物）＝約２２．５分。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて黄色の固形物を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１１８２．９５測定値（１１７９．２７）。

実施例４
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−α−フォレートコンジュゲートの合成を下記のとおり実施した。Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸ｇ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２０ｍｇ、０．０６５ミリモル）をＭｅＣＮ（約２ｍＬ）に溶解し、氷中窒素雰囲気下で冷却した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１１．４ｍｇ、１．５当量）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（２０．３ｍｇ、０．０９８５ミリモル）を加え、反応物を室温に加温し、１時間攪拌した。ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ（１４ｍｇ、０．０１８５ミリモル）をジイソプロピルエチルアミン（７μＬ、約２当量）、次いで上記のＭｅＣＮ溶液１．２ｍＬで処理した。得られた溶液を室温、窒素下で２４時間攪拌した。次いで、反応物を減圧下で濃縮した。残留物を酢酸中の３０％ＨＢｒ２ｍＬで処理した。室温で３時間攪拌した後、エーテルを加えて生成物を沈殿させ、それを濾過により集め、追加のエーテルですすぎ、風乾した。粗生成物（２８ｍｇ）を上記のとおり調製用ＨＰＬＣにかけた。生成物を含むＨＰＬＣ画分（Ｒｔ＝約１８分）を凍結乾燥させた。収量４．７ｍｇ（２９％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ９１０．１４（Ｍ＋Ｎａ⁺）測定値（８８５計算値）。

次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−α−フォレートの合成を下記のとおり実施した。次に、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＮ¹⁰−トリフルオロアセチルプテロイン酸（５ｍｇ、１２．２５マイクロモル）をイソブチルクロロホルマート（４．７μＬ、３当量）とジイソプロピルエチルアミン（８μＬ、４当量）で処理した。反応物を室温で１時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮した。残留物をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、再び蒸発乾固した。このように得られた化合物をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、この溶液の一部（０．２ｍＬ）をＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−α−グルタマート（２ｍｇ、０．００２３ミリモル）と混合した。反応物を室温で１６時間攪拌し、次いで上記のとおり調製用ＨＰＬＣで直接精製した（Ｒｔ＝約２６分）。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１２７７．４７測定値（１２７５．２８計算値）。

次に、ＨＰＬＣ精製された化合物をＤＭＦ（０．１ｍＬ）に溶解し、水（０．２ｍＬ）中の０．１Ｍピペリジンで処理した。反応物を室温で３時間攪拌し、次いで上記のとおりＨＰＬＣで直接精製した（Ｒｔ＝約２２分）。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させてコンジュゲートを得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１１８１．４２測定値（１１７９．２７計算値）。

実施例５
数種の競合アッセイパラメータをコンジュゲート（トレーサー）結合機能の比較評価に関して試験した。具体的には、これらの基準にはアッセイの精度、アッセイの確度、アッセイの感度、分別非特異的結合、結合親和性、および標準曲線の形が含まれる。

次に、特定の分析物濃度から得られたＲＬＵ（相対発光量、後で定義する）の相加平均は、本明細書ではμと表され、３回の実験から計算された。トレーサーを含まないアッセイ試薬も、小さな、ただし時には大きな数のＲＬＵに寄与する。トレーサーを除くすべてのアッセイ試薬を含む対照反応も平行して行って、トレーサーを含まない試薬のバックグラウンド（本明細書中、ｎと表す）を確認した。平均ＲＬＵ、μをトレーサーのみから得られたＲＬＵ（本明細書中Ｂと表す：Ｂ＝μ−ｎ）を表すように補正した。分析物濃度が０．００である場合、補正された相加平均ＲＬＵ値をＢ₀で表した。標準ＲＬＵの分析物濃度と検出されたＲＬＵの間に、非線形の相反関係（ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ，ｉｎｖｅｒｓｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）が存在する。結果として、その対照をなす相関も分析物濃度と結果として生じる％Ｂ／Ｂ₀を関連づけ、

として経験的に表すことができる。
式中、ｘは分析物濃度であり、ｙは％Ｂ／Ｂ₀またはＲＬＵのいずれかとして生成された測定されたシグナルである｛［Ｒｏｄｂａｒｄ，Ｄａｖｉｄ、「ＬｉｇａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓ」（１９８１）、Ｌａｎｇｏｎ，Ｊ．、Ｃｌａｐｐ，Ｊ．（Ｅｄｓ．）、ＭａｓｓｏｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、ｐｐ．４５〜１０１］、［Ｎｉｘ，Ｂａｒｒｙ、「ＴｈｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＨａｎｄｂｏｏｋ」（１９９４）、Ｗｉｌｄ，Ｄａｖｉｄ（Ｅｄ．）、ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、ｐｐ．１１７〜１２３］、［Ｐｅｔｅｒｍａｎ，ＪｅｆｆｒｅｙＨ．、「ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＳｏｌｉｄ−ＰｈａｓｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」、（１９９１）、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．（Ｅｄ．）、ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ＢｏｃａＲａｔｏｎ、ｐｐ．４７〜６５］｝。

４個のパラメータ、すなわち回帰定数ｂ、回帰係数ｍ、無限用量でプロジェクトされた漸近的非特異的結合（ＮＳＢ）（分析物濃度）ｙ∞、および分析物不在下での漸近的ゼロ用量応答ｙ₀をＤＯＳＥＣＡＬＣ．ＥＸＥＲｅｖ．１．７３プログラム（ＢａｙｅｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｒｐ．、Ｗａｌｐｏｌｅ、ＭＡ）の反復の、重みをつけない、４パラメータロジスティック（４ＰＬ）分析機能を用いて直接計算した。

アッセイの精度精度は、変動係数率、％Ｃ．Ｖ．としての標準偏差、σ_(n-1)から求めた。％Ｃ．Ｖ．は、１００×σ_(n-1)／μである。１０％未満の値が望ましい（Ｆｅｌｄｋａｍｐ，ＣａｒｏｌｙｎＳ．、Ｓｍｉｔｈ，ＳｔｕａｒｔＷ．、「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅ」（１９８７）、Ｃｈａｎ，ＤａｎｉｅｌＷ．、Ｐｅｒｌｓｔｅｉｎ，ＭａｒｉｅＴ．（Ｅｄｓ．）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ｐｐ．４９〜９５）。

アッセイの確度４ＰＬモデルに関する誤差率（％Ｓ）として表された確度を％Ｓ＝１００×（Ｂ−ｙ）／ｙとして計算した。＋５〜−５％の間の値が許容できる（Ｆｅｌｄｋａｍｐ，ＣａｒｏｌｙｎＳ．、Ｓｍｉｔｈ，ＳｔｕａｒｔＷ．、「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅ」（１９８７）、Ｃｈａｎ，ＤａｎｉｅｌＷ．、Ｐｅｒｌｓｔｅｉｎ，ＭａｒｉｅＴ．（Ｅｄｓ．）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ｐｐ．４９〜９５）。

アッセイの感度プロジェクトされた検出可能な分析物の最低濃度を、本明細書中では感度と呼び、ゼロ用量応答からの２個の標準偏差で予想される分析物濃度として求めた。

分別非特異的結合競合アッセイの分別非特異的結合（ｆＮＳＢ）を、無限用量ｙ∞でのｙのプロジェクトされた漸近的下限と合計化学発光シグナルインプットＴとの商として計算した。分別ＮＳＢは、コンジュゲートと固相上の結合タンパク質または抗体の間に特に好ましい結合会合を含まない、固相に対するコンジュゲートの結合相互作用の尺度である。高いｆＮＳＢは望ましくなく、いくつかの異なる因子の１つまたは複数から生じる可能性がある。その因子とは、コンジュゲートの過度の疎水性により増強された疎水性相互作用、コンジュゲートの電荷密度または極性により促進されたイオン性または極性相互作用、および／または特異的であるが、望ましくない生物結合相互作用である。ＮＳＢがかなり上昇してもアッセイ精度が影響を受けない場合は、用量応答曲線の外見上の傾きは、Ｂ₀が検出器の線形限界を超えるとより急激に減少する。

コンジュゲート結合親和性コンジュゲート結合機能を比較評価するために競合アッセイ％Ｂ₀／Ｔを行った。得られた商を比較すると、各コンジュゲートが分析物結合タンパク質または抗体に有する相対的結合親和性が示される。

フォレートアッセイ − フォレート結合アッセイでのアクリジニウムエステル−フォレートおよびアクリジニウムエステル−プテロアートコンジュゲート結合機能の評価このアッセイでは、アクリジニウムエステル−フォレートコンジュゲート（上記では、トレーサーと呼んだ）とフォレート含有標準（ＢａｙｅｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｒｐ．、Ｗａｌｐｏｌｅ、ＭＡ）からのフォレートは、常磁性粒子固相に共有結合的に結合した、ウシフォレート結合タンパク質の制限量をめぐって競合する。フォレート標準は、０．００、２．６６、６．５２、１２．８、２４．７、５２．７ｎＭの濃度のフォレートを含有した。フォレート標準１５０μｌ、ＤＴＴ試薬５０μｌ、および放出剤７５μｌを含む反応混合物を２．５分間３７℃でインキュベートした。各反応物に固相２００μｌを加え、２．５分間３７℃でインキュベートした。最後にトレーサー１００μｌ（２８０ｆモル）を加え、２．５分間３７℃でインキュベートした。永久磁石のアレイ上に固相を集め、脱イオン水で洗浄して結合していないトレーサーを除去した。化学発光反応が上述のように開始した。化学発光データはＡＣＳ：１８０によって検出した光子として集め、相対発光量（ＲＬＵ）で表した。

フォレートアッセイの精度アッセイの間、フォレートコンジュゲートのすべてについて精度は十分であり、％Ｃ．Ｖ．は、用量応答曲線の全体にわたり１０％未満であった。コンジュゲート間の総体的な精度に有意な差異はなかった。

フォレートアッセイの確度予想された４ＰＬ値との誤差率（％Ｓ）として示される確度は、４種のフォレートコンジュゲートすべてで許容可能であり、用量応答曲線の全体にわたり±５％以内である。これらのコンジュゲート間の全体的確度に差異はなかった。

フォレートアッセイの感度フォレートアッセイの最高感度は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−γ−フォレートコンジュゲートで得られた。プロジェクトされた検出可能な分析物の最低濃度は、０．００ｎＭフォレート用量応答、Ｂ₀−２σ_(n-1)からの２個の標準偏差での両方のフォレート濃度から決定された。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−γ−フォレートコンジュゲートは、検出可能なフォレートの最低濃度を示し、次は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−α−フォレートコンジュゲートであり、その次はＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−プテロアートコンジュゲートであった。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロアートトレーサーは、比較的低いＢ₀、削減された動的範囲、および高い分別ＮＳＢ（ｆＮＳＢ）の結果として、最低感度のコンジュゲートであった。トレーサー構造の差異は、感度に対する影響度にしたがって、下記のようにランク付けすることができる。トレーサー構造中のプテロアートをフォレートで置き換えると、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−α−フォレートトレーサーの結果とＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−プテロアートトレーサーの結果を比較した場合、アッセイの感度は少なくとも２．７倍上昇した。これは、フォレートアッセイの感度に関するトレーサーと分析物の構造的類似性が相対的に重要であることを反映している。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−アミンをグルタマートγ−カルボキシラートを介してフォレートに結合させることは、α−カルボキシラートを介するコンジュゲーションには好ましい。なぜなら、γ−カルボキシラート結合は、α−カルボキシラート異性体と比較してアッセイの感度を２．２倍に上げるからである。同様に、プテロアートトレーサーの疎水性ＨＤ−スペーサーアームを親水性ＨＥＧ−スペーサーアームに置き換えることにより、フォレートアッセイの感度が１．４倍上昇した。

ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−フォレートまたはプテロアートコンジュゲート分別非特異的結合分別ＮＳＢ（以下、「ｆＮＳＢ」と呼ぶ）は、親水性ＨＥＧ−スペーサーをコンジュゲート構造に導入することにより有意に減少した。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロアートコンジュゲートのｆＮＳＢは、他のプテロアートまたはフォレートベースのコンジュゲートのｆＮＳＢよりも少なくとも２．２倍高かった。疎水性ＨＤスペーサーは、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロアートコンジュゲートと固相の非特異的疎水性相互作用を増強させた。親水性ＨＥＧ−スペーサーのコンジュゲート構造への導入はｆＮＳＢを減少させ、それはＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＥＧ−プテロアート、ＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＥＧ−α−フォレート、およびＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＥＧ−γ−フォレートで明らかである。後者２種のフォレートベースのコンジュゲートのｆＮＳＢのわずかな上昇は、グルタマート部分で導入された疎水性のわずかな上昇を反映している可能性がある。

プテロアートおよびフォレートベースのコンジュゲートのコンジュゲート結合親和性親水性ＨＥＧ−スペーサーとフォレート部分全体の正しい配向は、％Ｂ₀／Ｔを高めるために重要な構造的性質である。ＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＥＧ−γ−フォレートコンジュゲートの％Ｂ₀／Ｔは、ＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロアートコンジュゲートの％Ｂ₀／Ｔよりも３．５倍高く、親水性ＨＥＧ−スペーサーの導入とγ−グルタマートカルボキシルを介する結合のいずれもがより高い結合値に必要なことを示している。ＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロアートとＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＥＧ−プテロアートの結合値の比較は、ＨＥＧ−スペーサーがＨＤ−スペーサーに関して全体で３．５倍の増加の２．２倍を与えたことを示している。結合のさらなる１．６倍の増加は、フォレートに結合したγ−グルタマートカルボキシル導入の結果である。α−グルタマートカルボキシル結合がγ−グルタマートカルボキシル結合と置き換わったとき、１．２倍のさらにわずかな増加が見られた。

フォレート用量応答曲線の形％Ｂ／Ｂ₀対フォレート濃度の用量応答曲線は、ＨＥＧ−スペーサーの親水性の増大が、用量応答曲線の最初の傾きを増加させることによってアッセイの感度を高めるために重要であることを示している。高用量応答も同じ理由により向上している。なぜなら、ＮＳＰＤＭＡＥ−ＨＤ−プテロアートコンジュゲートの高い％Ｂ／Ｂ₀は、他の比較したコンジュゲートより少なくとも１０パーセントポイント高いからである。

実施例６
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−トブラマイシンコンジュゲートの合成を下記のとおり実施した。トブラマイシン（１．４５ｍｇ、３．３マイクロモル）を１：１、ＤＭＦ／０．１ＭカルボナートｐＨ９（１ｍＬ）に溶解し、５分間隔で周期的に加えられるＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳエステル（２ｍｇ、３．３マイクロモル）のＤＭＦ（０．２ｍＬ）溶液で処理した。反応物を室温で２時間、次いで４℃でさらに２４〜３６時間攪拌した。生成物をＣ１８カラム（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）を使用し、ＭｅＣＮ／０．１ＭＴＥＡＡｐＨ５の１０％から６０％の勾配（４０分）を用いる調製用ＨＰＬＣにより、流量２．３ｍＬ／分および２６０ｎｍのＵＶ検出で精製した。コンジュゲートを１７〜１８分で溶離した。コンジュゲートを含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、白色の無定形の固形物を得た。ＥＳＭＳ９４３．７測定値（９４３計算値）。

実施例７
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧグルタラートＮＨＳエステルの合成を下記のとおり実施した。ＤＭＦ（１〜２ｍＬ）中のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ（２０ｍｇ、２３マイクロモル）をグルタル酸無水物（４．２ｍｇ、１．５当量）とジイソプロピルエチルアミン（１２μＬ、３当量）で処理した。反応物を室温で攪拌した。約６時間後、追加のグルタル酸無水物（３．２ｍｇ）を加え、反応を一晩継続した。生成物をＣ１８カラム（２０×２５０ｍｍ）を使用し、それぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の１０％から６０％の勾配（４０分）を用いる調製用ＨＰＬＣにより、流量１６ｍＬ／分および２６０ｎｍのＵＶ検出で精製した。生成物を含むＨＰＬＣ画分（Ｒｔ＝約２０〜２１分）を凍結乾燥して、黄色の固形物を得た。収量７．３ｍｇ（３２％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ８７３．５測定値（８７０計算値）。

ＤＭＦ（１ｍＬ）中のこの化合物（７．３ｍｇ、８．４マイクロモル）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（４．８ｍｇ、５当量）とジシクロヘキシルカルボジイミド（８．７ｍｇ、５当量）で処理した。反応物を室温、窒素下で攪拌した。約１６時間後、反応物をガラスウールで濾過し、生成物を上述のとおりＨＰＬＣで単離した（Ｒｔ＝約２３〜２４分）。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。収量２．３ｍｇ（２８％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ９７０．８２測定値（９６７．１計算値）。

次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−グルタラート−トブラマイシンコンジュゲートの合成を下記のとおり実施した。０．１ＭカルボナートｐＨ８．５（０．３ｍＬ）中のトブラマイシン（１ｍｇ、２．１４マイクロモル）を毎分２５μＬのアリコートで添加されたＤＭＦ（０．１５ｍＬ）中のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−グルタラート−ＮＨＳエステル（０．５ｍｇ、０．５２マイクロモル）で処理した。反応物を室温で１６時間攪拌し、次いで、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−トブラマイシンコンジュゲートで前述したとおりにＨＰＬＣ（Ｒｔ＝約１８分）で直接精製した。収量約０．１ｍｇ。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１３２３．３８測定値（１３２０．４９計算値）。

実施例８
トブラマイシンアッセイ−トブラマイシン結合アッセイにおけるアクリジニウムエステル−トブラマイシンコンジュゲート結合機能の評価このアッセイでは、アクリジニウムエステル−トブラマイシンコンジュゲート（上記では、トレーサーと呼んだ）とトブラマイシン含有標準（ＢａｙｅｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｗａｌｐｏｌｅ、ＭＡ）からのトブラマイシンは、ネズミＩｇＧ、常磁性固相に共有結合的に結合したモノクローナル抗体の制限量をめぐって競合する。トブラマイシン標準は、０．００、１．０７、２．１４、４．２８、８．５６、１７．１、２５．７および３４．２μＭの濃度のトブラマイシンを含有した。トブラマイシン標準５０μｌ、固相４００μｌ、およびトレーサー１００μｌを混合して反応を開始した。反応混合物を７．５分間３７℃でインキュベートした。永久磁石のアレイ上に固相を集め、脱イオン水で洗浄して結合していないトレーサーを除去した。化学発光反応が上述のように開始した。データをＡＣＳ：１８０によって検出した光子として集め、ＲＬＵで表した。非線形の相反関係が、標準に存在するトブラマイシン濃度とＡＣＳ：１８０で検出されたＲＬＵとの間に存在する。得られたデータをフォレートアッセイデータ処理で上述したとおり処理した。

トブラマイシンアッセイの精度アッセイの間、両方のトブラマイシントレーサーについて精度は優れており、％Ｃ．Ｖ．は、標準曲線の全体にわたり十分に１０％未満であった。２つのコンジュゲート間の総体的な精度に差異はなかった。

トブラマイシンアッセイの確度予想された４ＰＬ値との誤差率として示される確度は、両方のトブラマイシントレーサーで許容可能であり、ほとんどの部分が標準曲線の全体にわたり±５％以内である。これらのコンジュゲートの総体的な確度に差異はなかった。

トブラマイシンアッセイの感度トブラマイシンアッセイの最高感度は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−ｇｌｕｔ−トブラマイシンコンジュゲートを用いて得られた。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−ｇｌｕｔ−トブラマイシンコンジュゲートを用いるアッセイ結果からの予想感度は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−トブラマイシンコンジュゲートを用いたものより１．７倍低かった。したがって、本発明者等は、向上したトブラマイシンアッセイの感度を得るためには、親水性ＨＥＧ−ｇｌｕｔ−スペーサーがトブラマイシンコンジュゲート構造に組み込まれなければならないと推断した。感度の向上は、ＨＥＧ−ｇｌｕｔ−スペーサーがコンジュゲートに組み込まれたときの勾配がより急になった結果である。

ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−トブラマイシンコンジュゲートの分別非特異的結合分別ＮＳＢは、親水性ＨＥＧ−ｇｌｕｔ−スペーサーをコンジュゲート構造に導入することにより有意に減少した。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−ｇｌｕｔ−トブラマイシンコンジュゲートの分別ＮＳＢは、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−トブラマイシンコンジュゲートの分別ＮＳＢよりも２．７倍低かった。

トブラマイシンベースのコンジュゲートのコンジュゲート結合親和性親水性ＨＥＧ−ｇｌｕｔ−スペーサーの導入により、トブラマイシンコンジュゲートの％Ｂ₀／Ｔは、８．９パーセントポイント低下した。

トブラマイシン用量応答曲線の形％Ｂ／Ｂ₀対トブラマイシン濃度の用量応答曲線は、ＨＥＧ−ｇｌｕｔ−スペーサーの親水性の増大が、用量応答曲線の最初の傾きを増加させ、それによってアッセイの感度を高めることを示している。

実施例９
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−テオフィリンコンジュゲートの合成を下記のとおり実施した。ＤＭＦ（３ｍＬ）中の８−カルボキシプロピルテオフィリン（１０ｍｇ、０．０３８ミリモル）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２１．６ｍｇ、０．１８８ミリモル）とジシクロヘキシルカルボジイミド（３８．８ｍｇ、０．１８８ミリモル）で処理した。得られた溶液を室温で１６時間攪拌した。Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×３００ｍｍ）を使用し、それぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の１０％から６０％の勾配（４０分）を用いるＨＰＬＣ分析により、流量１ｍＬ／分、２６０ｎｍのＵＶ検出で、約５０％の変換が示された。Ｒｔ（出発材料）＝１０分。Ｒｔ（生成物）＝１４分。この材料は、次のカップリング反応に精製することなく使用された。次に、メタノール（０．２ｍＬ）中のＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ（３．３ｍｇ、０．００５６４ミリモル）をジイソプロピルエチルアミン（２．９５μＬ、０．０１６９ミリモル）と８−カルボキシプロピルテオフィリンＮＨＳエステル（１．５ｍｇ、１当量）の上記ＤＭＦ溶液０．９ｍＬで処理した。反応物を室温で１６時間攪拌し、次いで、Ｃ１８カラム（２０×３００ｍｍ）を使用し、それぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の１０％から６０％の勾配（４０分）を用いるＨＰＬＣにより流量１６ｍＬ／分および２６０ｎｍのＵＶ検出で精製した。Ｒｔ（コンジュゲート）＝約２３分。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。収量４．３ｍｇ（９１％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ８４０．３９測定値（８３９．９７計算値）。

実施例１０
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳ−テオフィリンコンジュゲートの合成を下記のとおり実施した。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ（６．５ｍｇ、０．００８６ミリモル）を、メタノール（０．２ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（３．９３μＬ、３当量）、次いでＤＭＦ（１．２ｍＬ）中のカルボキシテオフィリン（２ｍｇ、１当量）のＮＨＳエステルにより処理した。得られた反応物を室温で１６時間攪拌した。次いで、反応物をガラスウールで濾過し、上述のようにＨＰＬＣで直接精製した（Ｒｔ＝２２分）。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。収量＝３．６ｍｇ（４２％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１００４．３６測定値（１００２．１１計算値）。

実施例１１
ビス（フタルイミド）スペルミンの合成を下記のとおり実施した。クロロホルム（５ｍＬ）中のスペルミン（２７５ｍｇ、０．００１３８モル）をＮ−カルブエトキシフタルイミド（０．６０８ｇ、０．００２７８モル）で処理した。反応物を室温で４０分間攪拌し、そのときまでにＴＬＣ分析（５％水酸化アンモニウム、９５％メタノール）は、完全な変換を示した（Ｒｆ＝０．４２）。次いで、反応混合物を蒸発乾固させ、その粗製材料をそのまま次の反応に用いた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ４６３．８測定値（４６２．５５計算値）。

次に、ビス（フタルイミド）スペルミンジスルホナートの合成を実施した。ビス（フタルイミド）スペルミン（０．４ｇ）を１，３−プロパンスルトン（４ｇ）と密封管中で混合し、混合物を油浴中、１４０℃で１６時間加熱した。次いで、反応混合物を室温に冷却し、残留物を水と酢酸エチルの間に分配した。曇った水性層を分離させ、酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル抽出物を廃棄した。水性層を減圧下で濃縮し、粘着性の固形物を得た。収量０．５３ｇ（８７％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ７０８．６１測定値（７０６．８４計算値）。

次に、スペルミンジスルホナート（ＳＰＤＳ）の合成を下記のとおり実施した。ビス（フタルイミド）スペルミンジスルホナート（０．５３ｇ）をメタノール（１５〜２０ｍＬ）に溶解し、ヒドラジン（０．５ｍＬ）で処理した。得られた溶液を室温で２４時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮した。残留物を２０％水酸化アンモニウムと８０％メタノール約５ｍＬに溶解し、蒸発乾固した。このプロセスを１回繰り返した。最後に、残留物をメタノール（１ｍＬ）、水（１．５ｍＬ）、およびトリエチルアミン（１．５ｍＬ）の混合物に溶解し、溶液を再び蒸発乾固した。この後に得られた粗生成物を、溶離剤として１０％水酸化アンモニウム９０％メタノールを用いるシリカゲルの調製用ＴＬＣにより精製した。化合物をメタノール中の２５〜３０％水酸化アンモニウムを用いてＴＬＣプレートから抽出し、蒸発乾固した。残留物をメタノール（５）、水（５）、およびトリエチルアミン（１）の溶液からもう１回蒸発乾固した。このプロセスを２回繰り返した。最後に、白色の固形物が得られた。収量０．２ｇ（５７％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ４７０．３６（Ｍ＋Ｎａ⁺）測定値（４４６．６３）。

次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳの合成を下記のとおり実施した。スペルミンジスルホナート（２５ｍｇ、０．０５６ミリモル）を２．０ｍＬの水／０．２Ｍ炭酸水素ナトリウムｐＨ８．５（１：４）に溶解し、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ（４．７ｍｇ、１／７当量）、次いでＤＭＦ０．５ｍＬで処理した。反応物を室温で１６時間攪拌した。Ｃ１８カラム（３．９×３００ｍｍ）を使用し、それぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の１０％から６０％の勾配（４０分）を用いるＨＰＬＣ分析により、流量１ｍＬ／分および２６０ｎｍのＵＶ検出でＲｔ＝１４．５分での生成物が示された。これを２５×３００ｍｍのカラムを使用し、同じ勾配を用いる調製用ＨＰＬＣにより単離した。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。収量２．４ｍｇ（３３％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ９２６．９測定値（９２４．１７計算値）。

次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳ−テオフィリンコンジュゲートの合成を下記のとおり実施した。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳ（５．２ｍｇ、０．００５６４ミリモル）をＤＭＦ（０．１６ｍＬ）および０．１ＭホスファートｐＨ８（４０μＬ）の混合物中に溶解し、８−カルボキシプロピルテオフィリンＮＨＳエステル（１．５ｍｇ、１当量）のＤＭＦ（０．９ｍＬ）溶液で処理した。反応物を室温で１６時間攪拌した。コンジュゲートを上記のＣ１８カラムの調製用ＨＰＬＣにより単離した。Ｒｔ（コンジュゲート）＝１５分。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させた。収量５．６ｍｇ（８５％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１１７１．８９測定値（１１７２．４１計算値）。

実施例１２
スペルミンジカルボキシラートの合成を下記のとおり実施した。クロロホルム（１０ｍＬ）中のスペルミン（２９６ｍｇ、０．００１４６モル）をＮ−カルブエトキシフタルイミド（６５８ｍｇ、２．０５当量）で処理した。反応物を室温、窒素下で攪拌した。１．５時間後、ピリジン（３５３μＬ、３当量）およびジイソプロピルエチルアミン（７７４μＬ、３当量）と共に無水コハク酸（０．４４０ｇ、２当量）を加えた。反応物を室温で１６時間攪拌した。ＴＬＣ分析（９０％クロロホルム、９％メタノール、１％酢酸）により主要な生成物へのきれいな変換が示された（Ｒｆ＝０．４３）。次いで、反応混合物をヒドラジン（０．４５ｍＬ、約１０当量）およびメタノール（１０ｍＬ）で処理した。反応物を室温で攪拌した。１〜２時間後、結晶性の沈殿物が反応混合物中に現れた。３〜４時間の全反応時間後、反応物を減圧下で濃縮した。残留物をアセトンに懸濁し、濾過した。沈殿物をアセトンですすぎ、トリエチルアミン（１．５ｍＬ）を含む水（５０ｍＬ）に溶解した。これを減圧下で濃縮し、白色の粉末を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ４０３．７測定値（４０２．４９計算値）。

次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＣの合成を下記のとおり実施した。スペルミンジカルボキシラート（４５ｍｇ、０．１１２ミリモル）を０．１ＭカルボナートｐＨ９（５ＮＮａＯＨで調整）２ｍＬに溶解し、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳエステル（１０．５ｍｇ、０．０１７８ミリモル）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液で処理した。反応物を室温で１６時間攪拌した。生成物をＣ１８カラム（２０×３００ｍｍ）を使用し、それぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の０％から４０％の勾配（４０分）を用いる調製用ＨＰＬＣにより、流量１６ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出、Ｒｔ（生成物）＝１８分で単離した。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させて、黄色の固形物を得た。収量６．７ｍｇ（４３％）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ８７７．５３測定値（８７８．０１計算値）。

次に、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＣ−テオフィリンコンジュゲートの合成を下記のとおり実施した。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＣ（１ｍｇ、０．００１１４ミルモル）をＤＭＦ０．１ｍＬに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（２μＬ、２当量）と共に８−カルボキシプロピルテオフィリン（１ｍｇ、０．００２６２ミリモル）を加えた。反応物を室温で１６時間攪拌し、次いで、Ｃ１８カラム（２０×３００ｍｍ）を使用し、それぞれ０．０５％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ／水の１０％から６０％の勾配（４０分）を用いるＨＰＬＣにより、流量１６ｍＬ／分、２６０ｎｍでのＵＶ検出、Ｒｔ（コンジュゲート）＝１８分で直接精製した。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させた。収量１．９ｍｇ（定量的）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ１１２７．２４測定値（１１２６．２５計算値）。

実施例１３
このアッセイでは、アクリジニウムエステル−テオフィリンコンジュゲート（上記では、トレーサーと呼ばれた）とテオフィリン含有標準（ＢａｙｅｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｗａｌｐｏｌｅ、ＭＡ）からのテオフィリンは、常磁性粒子固相に共有結合的に結合した、制限量のネズミＩｇＧ、モノクローナル抗テオフィリン抗体をめぐって競合する。テオフィリン標準２０μＬを含む反応混合物、固相４５０μＬ、およびトレーサー１００μＬ（５９ｆモル）を３７℃で７．５分間インキュベートした。テオフィリン標準は、０．００、６．９４、１３．９、２７．７、５５．５、１１１、および２２２μＭの濃度のテオフィリンを含有していた。永久磁石のアレイ上に固相を集め、脱イオン水で２回洗浄して結合していないトレーサーを除去した。化学発光反応が上述のように開始した。データをＡＣＳ：１８０によって検出した光子として集め、ＲＬＵで表した。非線形の相反関係が、標準に存在するテオフィリン濃度とＡＣＳ：１８０で検出されたＲＬＵとの間に存在する。得られたデータをフォレートアッセイデータ処理で上述したとおり処理した。

テオフィリンアッセイの精度アッセイの間、テオフィリントレーサーのすべてについて精度は十分であり、％Ｃ．Ｖ．は、標準曲線の全体にわたり１０％未満であった。

テオフィリンアッセイの確度予想された４ＰＬ値との誤差率として示される確度は、テオフィリンコンジュゲートすべてで十分であり、標準曲線全体にわたり十分に±５％以内である。これらのコンジュゲート間の総体的な確度に差異はなかった。

テオフィリンアッセイの感度テオフィリンアッセイの最高感度は、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＣ−テオフィリンコンジュゲートで得られた。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−テオフィリンおよびＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳ−テオフィリンは、検出可能な最小用量を与え、それはＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−テオフィリンの用量よりも大きい。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−テオフィリンとＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳ−テオフィリンの場合に感度が低下しているのは、ゼロ用量で不精度がわずかに高い結果である可能性がある。

ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−テオフィリンコンジュゲート分別非特異的結合分別ＮＳＢは、親水性スペーサーをコンジュゲート構造に導入することにより有意に減少した。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳ−テオフィリンのｆＮＳＢは、総体的に最も低く、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−テオフィリンコンジュゲートのｆＮＳＢよりも３．７倍低かった。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＣ−テオフィリンコンジュゲートとＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−テオフィリンコンジュゲートは、それぞれ３．１倍と２．０倍低いｆＮＳＢを有していた。より高い極性または荷電スペーサーはそれぞれのコンジュゲート上により低いｆＮＳＢを与える。

テオフィリンベースのコンジュゲートのコンジュゲート結合親和性様々なコンジュゲートの％Ｂ₀／Ｔｓに認め得るほどの差異は見られなかった。

テオフィリン用量応答曲線の形％Ｂ／Ｂ₀対テオフィリン濃度の用量応答曲線は、スペーサーの親水性の増大が、用量応答曲線の最初の傾きを増加させ、それにより精度の当量を推定するアッセイの感度を高めることを示している。ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＣ−テオフィリンコンジュゲートは、最初の傾きで最も急な下り勾配を示し、第１ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＳＰＤＳ−テオフィリン；第２ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＥＧ−テオフィリン；第３ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＨＤ−テオフィリンがこの順番でそれに続く。

Claims

（ａ）親水性修飾剤を有するアクリジニウムエステルを含む、検出可能な化学発光アクリジニウムエステル標識。
（ａ）親水性修飾剤が、非イオン性ポリエチレングリコール、ポリイオン性スペルミンジスルホナート、およびポリイオン性スペルミンジカルボキシラートからなる群から選択される修飾剤である、請求項１に記載の標識。
（ａ）修飾剤がアクリジニウムエステルを競合部分と共有結合的に結合させる、請求項２に記載の標識。
（ａ）競合部分が標的分析物、および標的分析物の誘導体または類似体からなる群から選択される、請求項３に記載の標識。
フォレートのアッセイを実施するように適合され、かつ実施することが可能な、検出可能な化学発光アクリジニウム標識。
テオフィリンのアッセイを実施するように適合され、かつ実施することが可能である、検出可能な化学発光アクリジニウム標識。
トブラマイシンのアッセイを実施するように適合され、かつ実施することが可能である、検出可能な化学発光アクリジニウム標識。
（ａ）請求項３に記載の標識、（ｂ）競合部分の結合パートナー、および（ｃ）標識中の競合部分が結合パートナーに結合していることを含む錯体。
（ａ）標的分析物を含むと推測されるサンプルを、請求項４に記載の標識、および標的分析物の対応する結合パートナーにさらし、（ｂ）標識がサンプルからの標的分析物により、対応する結合パートナーとの結合相互作用を形成することを競合的に妨げられ、かつ／または置き換えられる範囲を決定し、（ｃ）上記のステップ（ｂ）での決定をサンプルからの標的分析物の存在または量と対応させることを含むアッセイの実施方法。