CN105378029B - 具有改进的稳定性和快速发光的亲水高量子产率吖啶酯 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有提高的光输出、改进的稳定性、快速发光和降低的非特异性结合的亲水的高量子产率化学发光吖啶鎓化合物。该化学发光吖啶酯在吖啶鎓核的C2和/或C7位置上具有亲水的支链给电子官能团。

Description

具有改进的稳定性和快速发光的亲水高量子产率吖啶酯
1. 对相关申请的交叉引用
本申请要求2013年7月8日提交的美国临时申请序列号No. 61/843,528的优先权，其全文经此引用并入本文。
2. 发明领域
本发明涉及具有提高的光输出、改进的稳定性、快速发光和低非特异性结合的亲水、高量子产率化学发光吖啶鎓化合物。这些化合物因其提高的量子产率和亲水性质而可用于改进检测灵敏度。这些化合物的改进的稳定性有助于延长使用这些化合物的试剂的贮存寿命以及使检测性能随时间的变化最小化。它们的提高的发射动力学尤其在自动化分析仪中的检测中还能实现更快的光测量。
3. 发明背景
化学发光的吖啶酯（AE）是已广泛用于免疫测定和核酸测定的极其有用的标记物。Pringle, M. J. Journal of Clinical Ligand Assay第22卷, 第105-122页(1999)的综述概括了这类化学发光化合物过去和当前的发展。
McCapra, F.等人在Tetrahedron Lett. 第43卷, 第3167-3172页(1964)中和Rahut等人在J. Org. Chem第301卷,第3587-3592页(1965)中公开了可通过碱性过氧化物触发来自吖啶鎓盐的酯的化学发光。自这些开创性研究以来，由于它们作为标记物的效用，对吖啶鎓化合物的兴趣已经增加。Simpson, J.S.A.等人, Nature, 第279卷, 第646-647页(1979)公开了吖啶酯9-羧基苯基-N-甲基吖啶鎓溴化物在免疫测定中的应用。但是，这种吖啶酯相当不稳定，由此限制其商业应用。这种不稳定性来源于酚和吖啶鎓环之间的9-羧基苯基酯连接基的水解。
已经描述了用于提高吖啶鎓化合物的稳定性的不同策略。Law等人, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, 第4卷, 第88-89页(1989)将两个甲基引入吖啶酯部分的侧面以稳定这种连接基。发现所得空间稳定的吖啶酯，DMAE-NHS [10-甲基吖啶-9-甲酸2’,6’-二甲基-4’-(N-琥珀酰亚胺氧基羰基)苯基酯]具有与不含这两个甲基的吖啶酯相同的光输出。前一化合物在结合到免疫球蛋白上时的稳定性极优并且甚至在37℃下在pH 7下一周后也没有表现出化学发光活性的损失。相反，未取代的吖啶酯在经受相同处理时仅保留其活性的10%。美国专利No. 4,918,192和5,110.932描述了DMAE及其应用。
授予Law等人的美国专利No. 5,656,426公开了DMAE的一种亲水形式，被称作NSP-DMAE-NHS酯，其中N-甲基基团已被N-磺丙基（NSP）所替代。下面图解这两种化合物的结构和吖啶鎓环的编号系统。
Figure 157971DEST_PATH_IMAGE001
Natrajan等人在美国专利No. 6,664,043 B2中公开了具有连接到酚上的亲水改性剂的NSP-DMAE衍生物。在上文中图解了一种这样的化合物，NSP-DMAE-HEG-Glutarate-NHS（缩写为HEG-AE）的结构。在这种化合物中，二氨基六(乙二醇)（diamino hexa(ethylene) glycol，二氨基-HEG）部分连接到酚上以提高该吖啶酯的水溶性。戊二酸酯部分附加到HEG的末端并转化成NHS酯以便能标记各种分子。
Kinkel等人, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, 第4卷,第136-139页(1989)和Mattingly, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, 第6卷, 第107-114页(1991)和美国专利No. 5,468,646描述了不同的一类稳定的化学发光吖啶鎓化合物。在这类化合物中，酚酯连接基被磺酰胺部分所替代，这据报道提供水解稳定性而不损害光输出。在吖啶酯中，酚是“离去基”，而在吖啶鎓磺酰胺中，磺酰胺是与碱性过氧化物的化学发光反应过程中的“离去基”。
通常通过碱性过氧化物触发来自吖啶鎓化合物的发光。总光输出——也可被称作化学发光量子产率，是该化学反应导致形成激发态吖啶酮的效率和激发态吖啶酮的荧光量子产率的组合。
最近，Natrajan等人在美国专利No. 7,309,615 B2（其公开内容经此引用并入本文）中描述了在吖啶鎓环的C2和/或C7上含有亲水烷氧基（OR*）的亲水、高量子产率吖啶鎓化合物，其中R*是包含磺丙基部分或乙二醇部分或其组合的基团。来自此类化合物的提高的光输出和它们的亲水性质使它们可用于改进免疫测定的灵敏度。下面图解一种这样的化合物NSP-2,7-(OMHEG)2-DMAE-AC-NHS（缩写为HQYAE）的结构。
Figure 75111DEST_PATH_IMAGE002
4. 发明概述
已经令人惊讶地发现，在吖啶鎓环的C2和/或C7上具有-OG形式的给电子官能团的亲水、高量子产率化学发光吖啶酯提供提高的光输出、改进的稳定性、快速发光和/或在检测中的低非特异性结合，其中G代表支链亲水的取代基。
在本发明的一个方面中，提供了亲水、高量子产率吖啶酯，其具有式(I)的结构：
Figure 59377DEST_PATH_IMAGE003
其中，R1是甲基或磺丙基；G是支链基团，其在每次出现时独立地选自：
Figure 454586DEST_PATH_IMAGE004
或；
Figure 206642DEST_PATH_IMAGE005
其中R2、R3、R4、R5、R6和R7在每次出现时独立地为甲基或基团-(CH2CH2O) n CH3，其中n是1至5的整数；且R12是用于使吖啶鎓化合物缀合到被分析物、被分析物类似物或被分析物的结合分子上的亲电子或亲核基团。
在根据式(I)的一些实施方案中，G在一处或在两处出现时是基团：
Figure 216055DEST_PATH_IMAGE006
其中R2和R3在每次出现时独立地为甲基或基团-(CH2CH2O) n CH3，其中n是1至5的整数；且特别地，G可以在一处或在两处出现时是基团：
Figure 483088DEST_PATH_IMAGE007
；或在另一实施方案中G可以在一处或在两处出现时是基团：
Figure 619671DEST_PATH_IMAGE008
。
在一个相关实施方案中，G在一处或在两处出现时是基团：
Figure 288550DEST_PATH_IMAGE009
。
在根据式(I)的其它实施方案中，G在一处或在两处出现时代表基团：
Figure 468865DEST_PATH_IMAGE010
，
其中R4、R5、R6和R7在每次出现时独立地为甲基或基团-(CH2CH2O) n CH3，其中n是1至5的整数。在根据这一实施方案的一个变体中，R4-R7可代表甲基，以使G在一处或在两处出现时是基团：
Figure 223194DEST_PATH_IMAGE011
。
在根据式(I)的一个实施方案中，G在一处或在两处出现时是基团：
Figure 897889DEST_PATH_IMAGE012
。
在根据式(I)的吖啶酯中，R12可以例如选自：
(1) -OH；
(2) -O-N-琥珀酰亚胺基；
(3) -NH-(CH2)5-C(O)-O-N-琥珀酰亚胺基；
(4) -NH-(CH2)5-COOH；
(5) -NH-(C2H4O) n -C2H4NH-C(O)-(CH2)3-C(O)-O-N-琥珀酰亚胺基，其中n = 1至5；
(6) -NH-(C2H4O) n -C2H4NH-C(O)-(CH2)3-COOH，其中n = 1至5；
(7) -NH-(C2H4O) n -C2H4NH2，其中n = 1至5；和
(8) -NH-R-NHR，其中R独立地为氢、烷基、烯基、炔基或芳烷基；其中R任选包含最多20个杂原子。
在各种示例性实施方案中，R12是-OH，或R12是基团：
-NH-(C2H4O) n -C2H4NH2，其中n = 1至5，
或R12是基团：
-NH-(C2H4O) n -C2H4NH-C(O)-(CH2)3-C(O)-O-R’’，其中n = 1至5；且其中R’’是氢或-N-琥珀酰亚胺基。
一种根据式(I)的吖啶酯具有下列结构：
Figure 608225DEST_PATH_IMAGE013
其中R12是用于使吖啶鎓化合物缀合到被分析物、被分析物类似物或被分析物的结合分子上的亲电子或亲核基团。
另一根据式(I)的吖啶酯具有下列结构：
Figure 975752DEST_PATH_IMAGE014
其中R12是用于使吖啶鎓化合物缀合到被分析物、被分析物类似物或被分析物的结合分子上的亲电子或亲核基团。
又一根据式(I)的吖啶酯具有下列结构：
Figure 217378DEST_PATH_IMAGE015
其中R12是用于使吖啶鎓化合物缀合到被分析物、被分析物类似物或被分析物的结合分子上的亲电子或亲核基团。
另一根据式(I)的吖啶酯具有下列结构：
Figure 679452DEST_PATH_IMAGE016
其中R12是用于使吖啶鎓化合物缀合到被分析物、被分析物类似物或被分析物的结合分子上的亲电子或亲核基团。
再一根据式(I)的吖啶酯具有下列结构：
Figure 260606DEST_PATH_IMAGE017
其中R12是用于使吖啶鎓化合物缀合到被分析物、被分析物类似物或被分析物的结合分子上的亲电子或亲核基团。
在根据式(I)的吖啶酯的一个示例性实施方案中，R12代表-OH。
在本发明的另一方面中，提供了一种用于检测或量化被分析物的测定法，其包括步骤：(a) 提供一种缀合物，其包含：(i) 被分析物的特异性结合分子；和(ii) 根据式(I)的亲水、高量子产率和快速发光的吖啶酯；(b) 提供具有固定在其上的被分析物的第二特异性结合分子的固体载体；(c) 混合所述缀合物、所述固相和怀疑含有所述被分析物的样品以形成结合复合物；(d) 分离捕获在所述固体载体上的结合复合物；(e) 通过添加化学发光触发剂触发来自步骤(d)的结合复合物的化学发光；(f) 用光度计测量发光量；和(g)通过将来自反应混合物的发光量与将发光量与被分析物的已知浓度相关联的标准剂量响应曲线比较，来检测被分析物的存在或计算被分析物的浓度。
在一个相关方面中，提供了一种用于检测或量化被分析物的测定法，其包括步骤：(a) 提供被分析物与根据式(I)的亲水、高量子产率和快速发光的吖啶酯的缀合物；(b) 提供固定有被分析物的特异性结合分子的固体载体；(c) 混合所述缀合物、固体载体和怀疑含有所述被分析物的样品以形成结合复合物；(d) 分离捕获在所述固体载体上的结合复合物；(e) 通过添加化学发光触发剂触发来自步骤(d)的结合复合物的化学发光；(f) 用光度计测量光量；和(g) 通过将反应混合物的发光量与将发光量与被分析物的已知浓度相关联的标准剂量响应曲线比较，来检测被分析物的存在或计算被分析物的浓度。
通过参考以下发明详述和所附权利要求书更清楚地理解本发明的这些和其它方面。
5. 附图简述
图1图解了具有适用于制备蛋白质或其它含亲核官能团的分子的缀合物的亲电子N-羟基琥珀酰亚胺基（NHS）官能团的B-AE的结构。
图2图解了具有可用于使该吖啶鎓化合物与含亲电子官能团的分子缀合的亲核六乙二醇胺（HEG-NH2）官能团的B-AE结构。
图3显示使用图2的B-AE制备的雌二醇缀合物（缩写为B-AE-E2）的结构。
6. 优选实施方案的描述
在吖啶鎓环的C2和/或C7上引入给电子官能团如OR*提高相应的化学发光吖啶鎓化合物的量子产率。当该R*基团为亲水的，如磺丙基或甲氧基聚(乙二醇)时，相应的吖啶鎓化合物不仅表现出提高的光输出，还表现出在免疫测定中降低的非特异性结合。这两种性质共同导致免疫测定的灵敏度提高。
本发明的主要目的是确认导致(a) 与NSP-DMAE和衍生物以及HQYAE相比时更快的发光；(b) 尤其与HQYAE相比时改进的稳定性；(c) 与HQYAE相当的高光输出和(d) 与HQYAE相当的低非特异性结合的吖啶鎓化合物的结构特征。
根据本发明的亲水吖啶鎓化合物，缩写为B-AE（支链-吖啶酯），不仅表现出提高的光输出，还表现出改进的稳定性和更快的发光。稳定性是指吖啶鎓化合物的化学发光活性。稳定性的提高因此表现为化学发光活性的提高的经时保持性。吖啶鎓化合物的提高的稳定性是有用的，因为衍生自此类化合物的试剂较不可能表现出检测性能的经时劣化，此外，可能延长衍生自此类化合物的试剂的贮存寿命，由此造成较少浪费。通常，衍生自吖啶鎓化合物的检测试剂包括蛋白质或小分子的缀合物。该吖啶鎓化合物的第二种性质是更快的发光，这意味着这些化合物与缺乏本发明的吖啶鎓化合物的独特结构特征的吖啶鎓化合物相比在明显更短的时间段内发出它们的总光量。更快的发光能实现检测中的更快测量并具有提高自动化分析仪的吞吐量的潜力。自动化分析仪的吞吐量通常被定义为该分析仪在给定时间段内可进行的试验数。本发明的吖啶鎓化合物的第三和第四种性质是它们的提高的光输出和低非特异性结合，这两者都极有助于改进检测灵敏度。
已经意外地发现，在吖啶鎓环的C2和/或C7上安置衍生自丙三醇的-OG型支链官能团（其中G是支链官能团）明显提高相应吖啶鎓化合物的稳定性并带来更快的发光。同时，这些支链官能团的存在提高相应的吖啶鎓化合物和它们的缀合物的量子产率并降低其非特异性结合。在使用固相如粒子或微量滴定板的测定法中的非特异性结合是缀合物与这些固相的不合意的结合相互作用。这些不合意的结合相互作用通常提高该测定法的背景，造成该测定法中的信号/背景比的净降低并由此降低检测灵敏度。
本发明的吖啶鎓化合物可由通式(I)表示：
Figure 595772DEST_PATH_IMAGE018
其中R1是甲基或磺丙基（-CH2CH2CH2SO3 -）基团；G被定义为
Figure 511645DEST_PATH_IMAGE019
或
Figure 528142DEST_PATH_IMAGE020
其中，R2和R3相同或不同并且是-(CH2CH2O)nMe，其中n = 1-5；R4、R5、R6和R7相同或不同并且是甲基或-(CH2CH2O)nMe，其中n = 1-5；且其中R12是亲电子或亲核基团。
更具体地，本发明的吖啶鎓化合物可由下式表示：
Figure 213070DEST_PATH_IMAGE021
其中R2和R3相同或不同并且是-(CH2CH2O)nMe基团，其中n =1-3；且其中R12选自：
(1) -O-N-琥珀酰亚胺基；
(2) -NH-(CH2)5-C(=O)-O-N-琥珀酰亚胺基；和
(3) -NH-(C2H4O)n-C2H4NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-O-N-琥珀酰亚胺基，其中n = 1至5；和
(4) -NH-(C2H4O)n-C2H4NH2，其中n = 1-5。
本发明的吖啶鎓化合物也可由下式表示：
Figure 984717DEST_PATH_IMAGE022
其中R4、R5、R6和R7 相同或不同并且是甲基或-(CH2CH2O)nMe，其中n =1-3；且其中R12选自：
(1) -O-N-琥珀酰亚胺基（NHS）；
(2) -NH-(CH2)5-C(=O)-O-N-琥珀酰亚胺基；和
(3) -NH-(C2H4O)n-C2H4NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-O-N-琥珀酰亚胺基，其中n = 1至5；和
(4) -NH-(C2H4O)n-C2H4NH2，其中n = 1-5。
使用传统有机化学技术以分立结构（discrete structure）的形式合成上述通用结构的代表性实例。这些化合物的结构与它们的缩略名一起显示在图1和2中。图1图解了具有亲电子N-羟基琥珀酰亚胺基（NHS）官能团的B-AE的结构，而图2图解了具有亲核六乙二醇胺（HEG-NH2）官能团的B-AE结构。前一化合物适用于制备蛋白质或其它含亲核官能团的分子的缀合物。后一化合物也可用于使该吖啶鎓化合物与含亲电子官能团的分子缀合。图3显示使用图2的B-AE制备的雌二醇缀合物（缩写为B-AE-E2）的结构。雌二醇是常通过免疫测定测量的类固醇激素。
图1的B-AE以及NSP-DMAE、NSP-DMAE-HEG-戊二酸酯-NHS（缩写为HEG-AE）和高量子产率吖啶酯NSP-2,7-(OMHEG)2-DMAE-AC-NHS（缩写为HQYAE）用于制备如实施例9中所述的鼠源性单克隆抗-TSH抗体（TSH = 促甲状腺激素）的缀合物。通过添加两种试剂触发各缀合物的发光。第一种试剂包含在100 mM硝酸中的0.5%过氧化氢，而第二种试剂含有在0.25 N氢氧化钠中的表面活性剂。使用配有光电倍增管的光度计作为检测器测量光。各吖啶鎓化合物缀合物的发光量被报道为通过光度计测得的相对光单位（RLU）。对各种缀合物测量总发光量（100% RLU），在更短测量时间下的发光作为这一数值的分数来表示并也以百分比形式表示在表1中。关于这些测量的其它细节可见于实施例部分。
表1. 随测量时间变化的吖啶鎓化合物-抗-TSH抗体缀合物的% RLU。
Figure 873039DEST_PATH_IMAGE023
根据表1，HEG-AE和HQYAE在一秒内仅发射它们的总光量的65%和61%，而所有B-AE缀合物表现出快得多的发光，在一秒内发射≥ 89%的光。B-AE中的独特结构特征因此加速与蛋白质缀合时来自这些化合物的发光。
类似地，将来自图3中所示的B-AE-E2缀合物的发光动力学与来自NSP-DMAE-E2和HQYAE-E2的E2缀合物的发光相比较。后两种化合物包含相同的HEG连接基。这些测量的结果列在表2中。
表2. 随测量时间变化的E2缀合物的% RLU
Figure 755544DEST_PATH_IMAGE024
。
对于雌二醇缀合物，所有B-AE仍表现出相比NSP-DMAE-HEG-E2缀合物更快的发光。
除表现出快速发光外，本发明的吖啶酯也表现出良好的稳定性。“稳定性”是指在将该化合物或缀合物储存在通常在7-8的pH范围内（这在生理pH内）的水溶液中时通过RLU的损失测得的化学发光活性的最小损失。从机理的视角看，酚酯的水解是化学发光的吖啶酯变得非化学发光的主要途径。稳定的缀合物确保吖啶酯试剂的长贮存寿命，也确保检测性能在给定时期内不会极大变动。本发明的各种吖啶酯缀合物的稳定性列在表3和4中。将该缀合物的水溶液在pH 7.7的水性缓冲液中储存在37℃下并使用光度计定期记录RLU。在初始时间点（也称作0天）测得的RLU被赋予100%的值。在其它时间点测得的RLU表示为这一数值的百分比。关于这些测量的其它细节可见于实施例部分。
表3. 以% RLU表示的抗-TSH抗体缀合物的稳定性
Figure 294979DEST_PATH_IMAGE025
。
表4. 以% RLU表示的E2缀合物的稳定性
Figure 175210DEST_PATH_IMAGE026
。
从表3和4中明显看出，B-AE缀合物与HQYAE缀合物相比保持它们的更大比例的化学发光活性并且更稳定。例如，HQYAE的抗-TSH抗体缀合物在37℃下33天后保持其化学发光活性的68%，B-AE缀合物在相同时期内保持它们的化学发光活性的≥ 79%。对雌二醇(E2)缀合物注意到类似趋势，其中B-AE缀合物在37℃下33天后保持其化学发光活性的≥ 75%，而HQYAE缀合物的化学发光活性在相同时期内降至60%。
除表现出快速发光外，本发明的B-AE还表现出与HQYAE相当或更好的提高的光输出。表5概括了各种B-AE在与抗-TSH单克隆抗体缀合时的相对量子产率。在该表中，HEG-AE的量子产率被赋值为1，且所有其它缀合物的量子产率相对于这种化合物的这种缀合物计。
表5. 抗-TSH抗体的AE缀合物的相对量子产率
Figure 613145DEST_PATH_IMAGE027
。
从表5中可以注意到，所有B-AE缀合物表现出相比HEG-AE缀合物更大的光输出（更高的量子产率）并与HQYAE缀合物的光输出相当或更大。
最后，本发明的B-AE也表现出与固相的低非特异性结合（表6）。在使用固相如粒子或微量滴定板的测定法中的如上所述的非特异性结合是缀合物与这些固相的不合意的结合相互作用。这些不合意的结合相互作用通常提高该测定法的背景，造成该测定法中的信号/背景比的净降低并由此降低检测灵敏度。对于表6中所列的抗-TSH抗体的各种吖啶鎓缀合物，在两种不同种类的粒子上测量非特异性结合：顺磁性粒子（PMP）和磁性胶乳粒子（MLP）。这两种粒子在它们的固有组成上不同。PMP主要由具有含胺的硅烷涂层的氧化铁粒子制成。胺用于将蛋白质使用如戊二醛之类的试剂交联到粒子表面上。另一方面，MLP由聚苯乙烯制成。表6中所用的MLP含有允许磁性分离的磁铁矿薄层和用于缀合蛋白质的聚丙烯酸。将这两种类型的粒子与缀合物溶液混合特定的时间段，然后磁性分离粒子，洗涤一次，然后测量与粒子相关的化学发光。（实验细节可见于实施例11）。这种化学发光值与总化学发光输入的比率被称作非特异性结合分数（fractional non-specific binding）（fNSB）。具有低非特异性结合的缀合物具有低fNSB值。在检查表6时，明显看出所有B-AE缀合物在这两种类型的粒子上都具有比HEG-AE低的非特异性结合。还发现B-AE缀合物的fNSB值与之前描述的亲水HQYAE相当。
表6. 抗-TSH抗体-吖啶鎓缀合物与粒子的非特异性结合分数（fNSB）
Figure 226572DEST_PATH_IMAGE028
。
本发明的水解稳定、快速发光、亲水、高量子产率的吖啶鎓化合物可用作用于测定或量化被分析物的测定法中的标记物。通常在此类测定法中测量的被分析物通常是具有一定的临床相关性的物质并可跨越从大分子如蛋白质、核酸、病毒、细菌等到小分子如乙醇、维生素、类固醇、激素、治疗药物等的宽范围。“夹心”免疫测定通常涉及使用两种结合分子如抗体检测大分子（也被称作大分子被分析物）。一种抗体固定或附着到固相，如粒子、珠粒、膜、微量滴定板或任何其它固体表面上。结合分子如抗体附着到固相上的方法是本领域中公知的。例如，可以通过使用交联分子如戊二醛将抗体共价连接到在其表面上含有胺的粒子上。该连接也可以是非共价的并可能涉及使结合分子简单吸附到固相，如聚苯乙烯珠粒和微量滴定板的表面上。第二抗体通常与常被称作标记物的化学发光或荧光分子共价连接。结合分子如抗体和其它结合蛋白的标记也是本领域中公知的并常被称作缀合反应，且标记的抗体常被称作缀合物。通常，标记物上的胺反应性部分与抗体上的胺反应以形成酰胺连接基。抗体和标记物之间的其它连接基，如硫醚、酯、氨基甲酸酯等也是公知的。在该测定法中，这两种抗体结合到大分子被分析物的不同区域上。大分子被分析物可以是例如蛋白质、核酸、寡糖、抗体、抗体片段、细胞、病毒、受体或合成聚合物。该结合分子可以是抗体、抗体片段、核酸、肽、结合蛋白或合成结合聚合物。例如，叶酸结合蛋白（“FBP”）结合被分析物叶酸。Mossbach等人 Biotechnology第14卷, 第163-170页(1995)也已公开了可结合各种被分析物的合成结合分子。
当具有固定的抗体和标记的抗体的固相与含有被分析物的样品混合时，在被分析物和这两种抗体之间形成结合复合物。这种类型的测定法因涉及固相而常被称作多相测定法（heterogenous assay）。然后可以测量与该结合复合物相关的化学发光或荧光信号并可以推断被分析物的存在与否。通常，在信号生成之前将结合复合物与其余结合反应组分如过量的标记抗体分离。例如如果该结合复合物与磁珠结合，可以利用磁体将与磁珠结合的结合复合物与本体溶液分离。通过使用一系列“标准”，即被分析物的已知浓度，可以使用这两种抗体生成“剂量响应”曲线。因此，该剂量响应曲线将一定量的测量信号与被分析物的特定浓度相关联。在夹心测定法中，随着被分析物的浓度提高，信号量也提高。然后可以通过将含有大分子被分析物的未知样品生成的信号与剂量响应曲线比较来计算未知样品中的被分析物浓度。
以类似方式，这两种结合组分也可以是结合或杂交到核酸被分析物的不同区域上的核酸。然后可以以类似方式推导核酸被分析物的浓度。
小分子被分析物，如类固醇、维生素、激素、治疗药物或小肽的另一类免疫测定使用常被称作竞争性测定的测定形式。通常，在竞争性测定中，缀合物由相关被分析物和化学发光或荧光标记物通过共价连接这两种分子制成。小分子被分析物可以原样使用或可以在与标记物缀合之前改变其结构。具有改变的结构的被分析物被称作类似物。通常必须使用被分析物的结构类似物以实现用于将该标记物与被分析物连接的化学。有时使用被分析物的结构类似物减弱或增强其与结合分子如抗体的结合。这样的技术是本领域中公知的。相关被分析物的 抗体或结合蛋白通常直接或通过次级（secondary）结合相互作用，如生物素-抗生物素蛋白系统固定在固相上。
可以在竞争性测定中通过使含有被分析物的样品和被分析物-标记物缀合物竞争有限量的固相固定的结合分子来推导样品中的被分析物浓度。随着样品中的被分析物浓度提高，被固相上的结合分子捕获的被分析物-标记物缀合物的量降低。通过使用一系列“标准”，即被分析物的已知浓度，可以构造剂量响应曲线，其中来自被固相上的结合分子捕获的被分析物-标记物缀合物的信号与被分析物的浓度逆相关。一旦已由此方式设计出剂量响应曲线，则可以通过将获自未知样品的信号与剂量响应曲线中的信号比较来推导未知样品中的相同被分析物的浓度。
对小分子被分析物的另一形式的竞争性测定涉及使用固定有相关被分析物或被分析物类似物的固相或与化学发光或荧光标记物缀合的被分析物特异性抗体或结合蛋白。在这种形式中，通过与固相上的被分析物或被分析物类似物的结合相互作用将抗体-标记物缀合物捕获到固相上。样品中存在的相关被分析物随后“竞争性”结合到抗体-标记物缀合物上并因此抑制或替代抗体-标记物缀合物与固相的相互作用。以这种方式，将由捕获在固相上的抗体-标记物缀合物生成的信号量与样品中被分析物的量相关联。
根据上文，一种用于检测或量化被分析物的测定法根据本发明的一个实施方案包括下列步骤：
(a) 提供一种缀合物，其包含：(i) 被分析物的特异性结合分子；和(ii) 根据本发明的任何本发明的亲水、高量子产率和快速发光的吖啶酯；
(b) 提供具有固定在其上的所述被分析物的第二特异性结合分子的固体载体；
(c) 混合所述缀合物、所述固相和怀疑含有所述被分析物的样品以形成结合复合物；
(d) 分离捕获在所述固体载体上的结合复合物；
(e) 通过添加化学发光触发剂触发来自步骤(d)的结合复合物的化学发光；
(f) 用光度计测量发光量；和
(g) 通过将来自反应混合物的发光量与将发光量与被分析物的已知浓度相关联的标准剂量响应曲线比较，来检测被分析物的存在或计算被分析物的浓度。
在另一实施方案中，提供了一种用于检测或量化被分析物的测定法，其包括步骤：
(a) 提供被分析物与任何本发明的亲水、高量子产率和快速发光的吖啶酯的缀合物；
(b) 提供固定有被分析物的特异性结合分子的固体载体；
(c) 混合所述缀合物、固体载体和怀疑含有所述被分析物的样品以形成结合复合物；
(d) 分离捕获在所述固体载体上的结合复合物；
(e) 通过添加化学发光触发剂触发来自步骤(d)的结合复合物的化学发光；
(f) 用光度计测量光量；和
(g) 通过将反应混合物的发光量与将发光量与被分析物的已知浓度相关联的标准剂量响应曲线比较，来检测被分析物的存在或计算被分析物的浓度。
大分子被分析物可以是蛋白质、核酸、寡糖、抗体、抗体片段、细胞、病毒、合成聚合物等。小分子被分析物可以是类固醇、维生素、激素、治疗药物、小肽等。该测定法中的结合分子可以是抗体、抗体片段、结合蛋白、核酸、肽、受体或合成结合分子。
实施例1
B1-AE-NHS酯, 1i的合成
a) 甲苯磺酸-1,3-双(甲氧基乙氧基)-2-丙酯, 1b。如Cormier和Gregg在Chem. Mater. 1998, 10, 1309-1319中所述合成化合物1a，1,3-双(甲氧基乙氧基)-2-丙醇。1a（2克，9.6毫摩尔）在无水吡啶（10毫升）中的溶液用4-二甲基氨基吡啶（0.234克，1.92毫摩尔），接着用对甲苯磺酰氯（3.67克，19.25毫摩尔）处理。该反应在室温下在氮气气氛下搅拌3天。然后在减压下除去溶剂并使残留物在乙酸乙酯（75毫升）和10% HCl（100毫升）之间分相。乙酸乙酯层用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥并在减压下浓缩。粗产物（4.05克）通过在硅胶上使用1:1乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂的快速色谱法提纯。该产物以浅黄色油的形式回收。产量 = 2.42克（70%）。
b) 化合物1d。 2,7-二羟基吖啶甲酯1c（0.2克，0.48毫摩尔）（美国专利No. 7,309,615）、化合物1b（0.868克，2.39毫摩尔）和碳酸铯（0.39克，1.2毫摩尔）在无水DMF（10毫升）中的混合物在氮气气氛下在100℃下加热4-5小时。然后通过使用Phenomenex, C18 4.6mm × 25 cm柱和10 → 100% B（A = 含0.05% TFA的水，B = 含0.05% TFA的MeCN）在1.0毫升/分钟流速下的30分钟梯度和在260纳米的UV检测的HPLC来分析小部分的反应混合物。观察到在Rt = 25分钟洗脱的产物并且其是主要组分。然后将该反应冷却到室温并在减压下浓缩。使残留物在乙酸乙酯（50毫升）和水（50毫升）之间分相。分离乙酸乙酯层，经无水硫酸镁干燥并在减压下浓缩。粗产物（0.48克）通过在硅胶上使用乙酸乙酯作为洗脱剂的快速色谱法提纯。产量 = 0.134克（34%）；MALDI-TOF MS观察值797.8。
c) 化合物1f。化合物1d（60毫克，75.3微摩尔）、蒸馏1,3-丙磺酸内酯（1克，8.2毫摩尔）和碳酸氢钠（65毫克，0.77毫摩尔）的混合物在氮气气氛下在150℃下加热1小时。提取一部分反应混合物，用甲醇稀释并如(b)部分中所述通过HPLC分析。观察到在Rt = 19分钟洗脱的吖啶酯1e。将该反应冷却到室温并加入20毫升1:1乙酸乙酯/己烷。将该混合物简短声处理以分散胶状固体（gummy solid），然后滗析溶剂。使粗产物在减压下干燥。将这种粗产物悬浮在1 N HCl（10毫升）中并在氮气气氛下回流2小时。粗制反应混合物的HPLC分析显示该反应混合物的完全水解，在Rt = 16分钟洗脱产物。通过使用YMC, C18 30 × 300 mm柱和在20毫升/分钟的溶剂流速下的(b)部分中所述的相同梯度和在260纳米的UV检测的制备HPLC提纯产物。合并含产物的HPLC级分并在减压下浓缩。产量 = 55毫克（81%）；MALDI-TOFMS观察值 904.7。
d) 化合物1g。化合物1f（53毫克，58.2微摩尔）在无水DMF（2毫升）中的溶液用二异丙基乙胺（15.2微升，87.3微摩尔）和TSTU（20毫克，64微摩尔）处理。在室温下搅拌该反应。在30分钟后，如(b)部分中所述的反应混合物的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 18分钟洗脱的NHS酯。将该反应逐滴添加到2,2’-(亚乙二氧基)双(乙胺)（86微升，0.582毫摩尔）在无水DMF（1.0毫升）中的经搅拌溶液中。在30分钟后，如(b)部分中所述的反应混合物的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 13.6分钟洗脱的产物1g。通过如(c)部分中所述的制备HPLC提纯该产物。产量 = 50毫克（83%）；MALDI-TOF MS 1035.6观察值。
e) B1-AE-NHS,化合物1i。化合物1g（47.5毫克，46微摩尔）在无水甲醇（3毫升）中的溶液用二异丙基乙胺（40微升，0.23毫摩尔）和戊二酸酐（26毫克，0.23毫摩尔）处理。在室温下搅拌该反应。在30分钟后，如(b)部分中所述的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 14.8分钟洗脱的戊二酸酯衍生物1h。该反应混合物用无水甲苯（3毫升）稀释并在减压下浓缩。将粗产物溶解在无水DMF（3毫升）中并用二异丙基乙胺（80微升，0.46毫摩尔）和TSTU（138毫克，0.46毫摩尔）处理。在搅拌30分钟后，如(b)部分中所述的HPLC分析显示>80%转化成在Rt= 16分钟洗脱的产物1i。通过如(c)部分中所述的制备HPLC提纯该产物。将含有产物的HPLC级分在-80℃下冻结并冷冻至干。将冻干产物溶解在无水MeCN中并转移到配衡圆底烧瓶中并在减压下浓缩。产量 = 32毫克（56%）；MALDI-TOF MS观察值 1247.1。
下列反应描述了B1-AE-NHS,化合物1i的合成。
Figure 636825DEST_PATH_IMAGE029
实施例2
B2-AE-NHS酯, 2h的合成
a). 1,3-双(3,6-二氧杂庚烷基)丙三醇-2-甲苯磺酸酯, 2b。如Vacus和Simon在Adv. Mater. 1995, 7, 797-800中所述合成化合物1,3-双(3,6-二氧杂庚烷基)丙三醇,2a。将粗制2a（16克，0.054摩尔）溶解在无水吡啶（50毫升）中并用4-二甲基氨基吡啶（1.32克，0.011摩尔），接着用对甲苯磺酰氯（12.4克，0.065摩尔）处理。该反应在氮气气氛下搅拌16小时。 然后在减压下除去溶剂并使残留物在乙酸乙酯（100毫升）和2N HCl（100毫升）之间分相。乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠溶液，接着用盐水洗涤。其然后经硫酸镁干燥并在减压下浓缩。粗产物（14克）通过在硅胶上使用1:4己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂的快速色谱法提纯。产量 = 6.3克，浅黄色油。MALDI-TOF MS观察值 473.4，(M + Na+).
b) 化合物2c。1c（0.2克，0.48毫摩尔）、2b（1.08克，2.4毫摩尔)和碳酸铯（0.39克，0.12毫摩尔）在无水DMF（10毫升）中的混合物在油浴中在氮气气氛下在100℃下加热。在5小时后，将该反应冷却到室温并在减压下浓缩。使残留物在乙酸乙酯（75毫升）和水（75毫升）之间分相。乙酸乙酯层用盐水洗涤并经无水硫酸镁干燥。然后在减压下除去溶剂以提供0.974克粗产物，其通过在硅胶上使用乙酸乙酯中的3%甲醇作为洗脱剂的快速色谱法提纯。产量 = 99.4毫克（21%）；MALDI-TOF MS观察值 974.4。
c) 化合物2e。化合物2c（58毫克，60微摩尔）、蒸馏1,3-丙磺酸内酯（0.75克，6.15毫摩尔）和碳酸氢钠（50毫克，0.59毫摩尔）的混合物在氮气气氛下在150℃下加热。在1小时后，提取小部分，用甲醇稀释并通过使用Phenomenex, C18 4.6 mm × 25 cm柱和10 →100% B（A = 含0.05% TFA的水，B = 含0.05% TFA的MeCN）在1.0毫升/分钟流速下的30分钟梯度和在260纳米的UV检测的HPLC来分析。观察到在Rt = 18.5分钟洗脱的产物（>80%转化率，原材料Rt = 23.5分钟）。将该反应冷却到室温并加入20毫升1:1乙酸乙酯/己烷。在简短声处理以分散胶状产物后，滗析溶剂并将产物2d在真空下干燥。
使粗制吖啶酯2d悬浮在I N HCl（10毫升）中并在氮气气氛下回流2小时。如上所述的HPLC分析显示完全转化成在16分钟洗脱的产物2e。通过使用YMC, C18 30 × 300 mm柱和在20毫升/分钟的溶剂流速下的上述相同梯度和在260纳米的UV检测的制备HPLC提纯产物。合并含产物的HPLC级分并在减压下浓缩。产量 = 42毫克（65%）；MALDI-TOF MS观察值1083.3。
d) 化合物2f。 化合物2e（42毫克，39微摩尔）在无水DMF（2毫升）中的溶液用二异丙基乙胺（10微升，59微摩尔）和TSTU（14毫克，46.5微摩尔）处理。在室温下搅拌该反应。在15分钟后，如(c)部分中所述的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 17.7分钟洗脱的NHS酯。将该反应逐滴添加到2,2’-(亚乙二氧基)双(乙胺)（58微升，0.39毫摩尔）在无水DMF（1.0毫升）中的经搅拌溶液中。在30分钟后，如(b)部分中所述的反应混合物的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 13.6分钟洗脱的产物2f。通过如(c)部分中所述的制备HPLC提纯该产物。产量 = 37毫克（79%）；MALDI-TOF MS观察值 1217.9。
e) B2-AE-NHS, 化合物2h。化合物2f（37毫克，30微摩尔）在无水甲醇（3毫升）中的溶液用二异丙基乙胺（26微升，0.15毫摩尔）和戊二酸酐（17毫克，0.15毫摩尔）处理。在室温下搅拌该反应。在30分钟后，如(c)部分中所述的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 15分钟洗脱的戊二酸酯衍生物2g。该反应混合物用无水甲苯（3毫升）稀释并在减压下浓缩。将粗产物溶解在无水DMF（2毫升）中并用二异丙基乙胺（52微升，0.3毫摩尔）和TSTU（89毫克，0.3毫摩尔）处理。在搅拌30分钟后，如(c)部分中所述的HPLC分析显示>80%转化成在Rt = 16分钟洗脱的产物2h。通过如(c)部分中所述的制备HPLC提纯该产物。将含有产物的HPLC级分在-80℃下冻结并冷冻至干。将冻干产物溶解在无水MeCN中并转移到配衡圆底烧瓶中并在减压下浓缩。产量 = 39毫克（91%）；MALDI-TOF MS 观察值1425.4。
下列反应描述了B2-AE-NHS, 2h的合成。
Figure 750274DEST_PATH_IMAGE030
实施例3
B3-AE-NHS酯3h
a) 1,3-双(3,6, 9-二氧杂癸烷基)丙三醇-2-甲苯磺酸酯, 3b。如Lauter等人在Macromol. Chem. Phys. 1998, 199, 2129-2140中所述合成化合物1,3-双(3,6, 9-二氧杂癸烷基)丙三醇, 3a。将该醇（7克，0.0182摩尔）溶解在无水吡啶（30毫升）中并用4-二甲基氨基吡啶（0.444克，3.6毫摩尔）和对甲苯磺酰氯（3.85克，0.02摩尔）处理。该反应在氮气气氛下搅拌3天。然后在减压下除去溶剂并使残留物在乙酸乙酯（100毫升）和10% HCl（100毫升）之间分相。乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤。其然后经无水硫酸镁干燥并在减压下浓缩。粗产物通过在硅胶上使用5:4.5:0.5的己烷:乙酸乙酯:甲醇的快速色谱法提纯。产量 = 4.47克（45%）；浅黄色油。
b) 化合物3c。1c（0.2克，0.48毫摩尔）、3b（1.3克，2.4毫摩尔）和碳酸铯（0.35克，0.11毫摩尔）在无水DMF（10毫升）中的混合物在油浴中在氮气气氛下在100℃下加热。在6小时后，将该反应冷却到室温并在减压下浓缩。使残留物在乙酸乙酯（75毫升）和水（75毫升）之间分相。乙酸乙酯层用盐水洗涤并经无水硫酸镁干燥。然后在减压下除去溶剂以提供1.3克粗产物，其通过在硅胶上使用乙酸乙酯中的5%甲醇作为洗脱剂的快速色谱法提纯。产量= 134毫克（22%）；MALDI-TOF MS观察值 1148.9。
c) 化合物3e。化合物3c（45毫克，39微摩尔）、蒸馏1,3-丙磺酸内酯（0.5克，4.1毫摩尔）和碳酸氢钠（33毫克，0.39毫摩尔）的混合物在氮气气氛下在150℃下加热。在2小时后，提取小部分，用甲醇稀释并通过使用Phenomenex, C18 4.6 mm × 25 cm柱和10 →100% B（A = 含0.05% TFA的水，B = 含0.05% TFA的MeCN）在1.0毫升/分钟流速下的30分钟梯度和在260纳米的UV检测的HPLC来分析。观察到在Rt = 18.3分钟洗脱的产物（>80%转化率，原材料Rt = 22.5分钟）。将该反应冷却到室温并加入20毫升1:1乙酸乙酯/己烷。在简短声处理以分散胶状产物后，滗析溶剂并将产物3d在真空下干燥。
将粗制吖啶酯3d悬浮在I N HCl（10毫升）中并在氮气气氛下回流2小时。如上所述的HPLC分析显示完全转化成在16.3 分钟洗脱的产物3e。通过使用YMC, C18 30 × 300 mm柱和在20毫升/分钟的溶剂流速下的上述相同梯度和在260纳米的UV检测的制备HPLC来提纯产物。合并含产物的HPLC级分并在减压下浓缩。产量 = 28毫克（57%）；MALDI-TOF MS观察值 1255.9。
d) 化合物3f。化合物3e（28毫克，22.3微摩尔）在无水DMF（2毫升）中的溶液用二异丙基乙胺（6.4微升，33.5微摩尔）和TSTU（8毫克，26.6微摩尔）处理。在室温下搅拌该反应。在30分钟后，如(c)部分中所述的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 17.7分钟洗脱的NHS酯。将该反应逐滴添加到2,2’-(亚乙二氧基)双(乙胺)（32微升，0.22毫摩尔）在无水DMF（1.0毫升）中的经搅拌溶液中。在1小时后，如(c)部分中所述的反应混合物的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 14分钟洗脱的产物3f。通过如(c)部分中所述的制备HPLC提纯该产物。产量 =28毫克（90%）；MALDI-TOF MS观察值 1388.6。
e) B3-AE-NHS, 化合物3h。化合物3f（28毫克，20微摩尔）在无水甲醇（2毫升）中的溶液用二异丙基乙胺（17.6微升，0.1毫摩尔）和戊二酸酐（11.5毫克，0.1毫摩尔）处理。在室温下搅拌该反应。在30分钟后，如(c)部分中所述的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 15.2分钟洗脱的戊二酸酯衍生物3g。该反应混合物用无水甲苯（3毫升）稀释并在减压下浓缩。将粗产物溶解在无水DMF（2毫升）中并用二异丙基乙胺（35微升，0.2毫摩尔）和TSTU（60毫克，0.2毫摩尔）处理。在搅拌30分钟后，如(c)部分中所述的HPLC分析显示>70%转化成在Rt =16.2分钟洗脱的产物3h。通过如(c)部分中所述的制备HPLC提纯该产物。将含有产物的HPLC级分在-80℃下冻结并冷冻至干。将冻干产物溶解在无水MeCN中并转移到配衡圆底烧瓶中并在减压下浓缩。产量 = 17.6毫克（55%）；MALDI-TOF MS观察值 1598。
下列反应描述了B3-AE-NHS, 3h的合成。
Figure 862455DEST_PATH_IMAGE031
实施例4
B4-AE-NHS酯, 4h
a) 化合物4a。将1,3-双(甲氧基乙氧基)-2-丙醇，1a（12克，0.058摩尔）和氢氧化钾（2.43克，0.043摩尔）剧烈搅拌并逐滴加入表氯醇（1.334克，0.0144摩尔）。将该反应在80℃下加热24小时。然后将其冷却到室温并加入水（50毫升）。该溶液用二氯甲烷（3 × 50毫升）萃取。合并的二氯甲烷萃取物经无水硫酸镁干燥并在减压下浓缩。粗产物（10.85克）就这样用于下一反应。
b) 化合物4b。4a（10.5克粗制，0.023摩尔）在无水吡啶（25毫升）中的溶液用4-二甲基氨基吡啶（0.56克，4.6毫摩尔）和对甲苯磺酰氯（0.046摩尔，8.8克）处理。该反应在室温下在氮气气氛下搅拌16小时。 然后在减压下除去溶剂并使残留物在乙酸乙酯（100毫升）和2 N HCl（100毫升）之间分相。乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。其然后经无水硫酸镁干燥并在减压下浓缩。粗产物（16.4克）通过在硅胶上的快速色谱法提纯，使用1:1乙酸乙酯:己烷洗脱甲苯磺酸-1,3-双(甲氧基乙氧基)-2-丙酯，接着使用乙酸乙酯洗脱产物。产量 = 2.82克（32%）；MALDI-TOF MS 648.6 (M + Na+)。
c) 化合物4c。2,7-二羟基吖啶甲酯，1c（0.2克，0.48毫摩尔）、化合物4b（1.5克，2.4毫摩尔）和碳酸铯（0.39克，1.2毫摩尔）在无水DMF（10毫升）中的混合物在氮气气氛下在100℃下加热4-5小时。然后通过使用Phenomenex, C18 4.6 mm × 25 cm柱和10 → 100% B（A = 含0.05% TFA的水，B = 含0.05% TFA的MeCN）在1.0毫升/分钟流速下的30分钟梯度和在260纳米的UV检测的HPLC分析小部分的反应混合物。观察到在Rt = 23.5分钟洗脱的产物并且是主要组分。然后将该反应冷却到室温并在减压下浓缩。使残留物在乙酸乙酯（50毫升）和水（50毫升）之间分相。分离乙酸乙酯层，经无水硫酸镁干燥并在减压下浓缩。粗产物（1.36克）通过在硅胶上使用乙酸乙酯中的5%甲醇作为洗脱剂的快速色谱法提纯。产量 =0.156克（25 %）；MALDI-TOF MS观察值 1325。
d) 化合物4e。化合物4c（60毫克，45.3微摩尔）、蒸馏1,3-丙磺酸内酯（1.0克，8.2毫摩尔）和碳酸氢钠（76毫克，0.9毫摩尔）的混合物在氮气气氛下在150℃下加热。在2小时后，提取小部分，用甲醇稀释并通过使用Phenomenex, C18 4.6 mm × 25 cm柱和10 →100% B（A = 含0.05% TFA的水，B = 含0.05% TFA的MeCN）在1.0毫升/分钟流速下的30分钟梯度和在260纳米的UV检测的HPLC来分析。观察到在Rt = 17.8分钟洗脱的产物（>80%转化率，原材料Rt = 23.5分钟）。将该反应冷却到室温并加入20毫升1:1的乙酸乙酯/己烷。在简短声处理以分散胶状产物后，滗析溶剂并将产物4d在真空下干燥。
使粗制吖啶酯4d悬浮在I N HCl（10毫升）中并在氮气气氛下回流2小时。如上所述的HPLC分析显示完全转化成在17分钟洗脱的产物4e。通过使用YMC, C18 30 × 300 mm柱和在20毫升/分钟的溶剂流速下的上述相同梯度和在260纳米的UV检测的制备HPLC提纯产物。合并含产物的HPLC级分并在减压下浓缩。产量 = 33.5毫克（52%）；MALDI-TOF MS观察值1433.1。
e) 化合物4f。化合物4e（33.5毫克，23.4微摩尔）在无水DMF（2毫升）中的溶液用二异丙基乙胺（6.1微升，35微摩尔）和TSTU（8.5毫克，28.2微摩尔）处理。在室温下搅拌该反应。在30分钟后，如(c)部分中所述的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 18.7分钟洗脱的NHS酯。将该反应逐滴添加到2,2’-(亚乙二氧基)双(乙胺)（35微升，0.24毫摩尔）在无水DMF（1.0毫升）中的经搅拌溶液中。在1小时后，如(c)部分中所述的反应混合物的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 14.5分钟洗脱的产物4f。通过如(d)部分中所述的制备HPLC提纯产物。产量 = 22毫克（59%）；MALDI-TOF MS观察值 1565.8。
f) B4-AE-NHS, 化合物4h。化合物4f（22毫克，14微摩尔）在无水甲醇（2毫升）中的溶液用二异丙基乙胺（12.3微升，70微摩尔）和戊二酸酐（8毫克，70毫摩尔）处理。在室温下搅拌该反应。在30分钟后，如(d)部分中所述的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 15.9分钟洗脱的戊二酸酯衍生物4g。该反应混合物用无水甲苯（3毫升）稀释并在减压下浓缩。
将粗产物溶解在无水DMF（2毫升）中并用二异丙基乙胺（24.6微升，0.14 毫摩尔）和TSTU（42毫克，0.14毫摩尔）处理。在搅拌30分钟后，如(c)部分中所述的HPLC分析显示>70%转化成在Rt = 16.9分钟洗脱的产物4h。通过如(d)部分中所述的制备HPLC提纯产物。将含有产物的HPLC级分在-80℃下冻结并冷冻至干。将冻干产物溶解在无水MeCN中并转移到配衡圆底烧瓶中并在减压下浓缩。产量 = 18.8毫克（75%）；MALDI-TOF MS观察值 1776.5。
下列反应描述了B4-AE-NHS, 4h的合成。
Figure 24446DEST_PATH_IMAGE032
实施例5
B04-AE-NHS, 5i
a) 化合物5b。如Kang等人在Bull. Korean Chem. Soc. 2006, 27, 1364-1370中所述合成1,3-二甲氧基-2-丙醇，5a。粗制1,3-二甲氧基-2-丙醇（10.66克，0.089摩尔）和氢氧化钾（3克，0.00534摩尔）在氮气气氛下在80℃下搅拌直至所有氢氧化钾溶解。然后逐滴加入表氯醇（1.65克，0.00178摩尔）并将该反应在氮气气氛下在100℃下加热24小时。然后将该反应冷却到室温并在乙酸乙酯（75毫升）和饱和氯化铵溶液（75毫升）之间分相。分离乙酸乙酯层，且水层用乙酸乙酯（50毫升）再萃取一次。合并的乙酸乙酯萃取物经无水硫酸镁干燥并在减压下浓缩。回收的浅棕色油（3.7克）就这样用于下一反应。
b) 化合物5c。将化合物5b（3.7克，0.0125摩尔）溶解在无水吡啶（15毫升）中并用4-二甲基吡啶（0.381克，3.1毫摩尔）和对甲苯磺酰氯（4.8克，0.0025摩尔）处理。该反应在室温下在氮气气氛下搅拌3天。然后在减压下除去溶剂并使残留物在乙酸乙酯（75毫升）和1N HCl（50毫升）之间分相。分离乙酸乙酯层并用2%氢氧化钠溶液（50毫升）和饱和氯化铵溶液（50毫升）洗涤。其然后经无水硫酸镁干燥并在减压下浓缩。粗产物（6.6克）通过在硅胶上使用75:24:1的己烷:乙酸乙酯:甲醇作为洗脱剂的快速色谱法提纯。产量 = 1.73克，浅黄色油。
c) 化合物5d。2,7-二羟基吖啶甲酯，1c（0.1克，0.24毫摩尔）、化合物5c（0.54克，1.2毫摩尔）和碳酸铯（0.2克，0.06毫摩尔）在无水DMF（5毫升）中的混合物在氮气气氛下在100℃下加热4-5小时。然后通过使用Phenomenex, C18 4.6 mm × 25 cm柱和10 → 100% B（A = 含0.05% TFA的水，B = 含0.05% TFA的MeCN）在1.0毫升/分钟流速下的30分钟梯度和在260纳米的UV检测的HPLC来分析小部分的反应混合物。观察到在Rt = 26.2分钟洗脱的产物并且其是主要组分。然后将该反应冷却到室温并在减压下浓缩。使残留物在乙酸乙酯（75毫升）和水（50毫升）之间分相。分离乙酸乙酯层，经无水硫酸镁干燥并在减压下浓缩。粗产物（0.45克）通过在硅胶上使用乙酸乙酯中的1%甲醇作为洗脱剂的制备TLC来提纯。产量 =64克（28 %）；MALDI-TOF MS观察值 973.8。
d) 化合物5f。化合物5d（64毫克，65.7微摩尔）、蒸馏1,3-丙磺酸内酯（1.6克，13.1毫摩尔）和碳酸氢钠（110毫克，1.3毫摩尔）的混合物在氮气气氛下在150℃下加热。在2小时后，提取小部分，用甲醇稀释并通过使用Phenomenex, C18 4.6 mm × 25 cm柱和10 →100% B（A = 含0.05% TFA的水，B = 含0.05% TFA的MeCN）在1.0毫升/分钟流速下的30分钟梯度和在260纳米的UV检测的HPLC来分析。观察到在Rt = 20.5分钟洗脱的产物（>60%转化率）。将该反应冷却到室温并加入20毫升的1:1乙酸乙酯/己烷。在简短声处理以分散胶状产物后，滗析溶剂并将产物5e在真空下干燥。
使粗制吖啶酯5e悬浮在I N HCl（10毫升）中并在氮气气氛下回流2小时。如上所述的HPLC分析显示完全转化成在17.5分钟洗脱的产物5f。通过使用YMC, C18 30 × 300 mm柱和在20毫升/分钟的溶剂流速下的上述相同梯度和在260纳米的UV检测的制备HPLC提纯产物。合并含产物的HPLC级分并在减压下浓缩。产量 = 12毫克（17 %）；MALDI-TOF MS观察值1082.4。
e) 化合物5g。化合物5f（12毫克，11.1微摩尔）在无水DMF（1毫升）中的溶液用二异丙基乙胺（4.0微升，22微摩尔）和TSTU（5毫克，16.7微摩尔）处理。在室温下搅拌该反应。在30分钟后，如(c)部分中所述的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 19.5分钟洗脱的NHS酯。将该反应逐滴添加到2,2’-(亚乙二氧基)双(乙胺)（16微升，0.11毫摩尔）在无水DMF（1.0毫升）中的经搅拌溶液中。在1小时后，如(c)部分中所述的反应混合物的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 14.7分钟洗脱的产物5g。通过如(d)部分中所述的制备HPLC提纯产物。产量 =15.4毫克（定量）；MALDI-TOF MS观察值 1212.9。
f) B04-AE-NHS, 化合物5i。化合物5g（15.4毫克，12.7微摩尔）在无水甲醇（2毫升）中的溶液用二异丙基乙胺（11微升，63.5微摩尔）和戊二酸酐（7.2毫克，63.5微摩尔）处理。在室温下搅拌该反应。在30分钟后，如(c)部分中所述的HPLC分析显示完全转化成在Rt= 16.2分钟洗脱的戊二酸酯衍生物5h。该反应混合物用无水甲苯（3毫升）稀释并在减压下浓缩。将粗产物溶解在无水DMF（2毫升）中并用二异丙基乙胺（22微升，0.126毫摩尔）和TSTU（38毫克，0.126毫摩尔）处理。在搅拌15分钟后，如(c)部分中所述的HPLC分析显示>80%转化成在Rt = 17.2分钟洗脱的产物5i。通过如(d)部分中所述的制备HPLC提纯产物。将含有产物的HPLC级分在-80℃下冻结并冷冻至干。将冻干产物溶解在无水MeCN中并转移到配衡圆底烧瓶中并在减压下浓缩。产量 = 12.3毫克（68%）；MALDI-TOF MS观察值1423.8。
下列反应描述了B04-AE-NHS, 化合物5i的合成
Figure 85943DEST_PATH_IMAGE033
实施例6
B1-AE-E2, 6b
a) 化合物6a。化合物1f（26毫克，28.7微摩尔）在无水DMF（2毫升）中的溶液用二异丙基乙胺（7.5微升，43微摩尔）和TSTU（10.4毫克，35微摩尔）处理。在室温下搅拌该反应。在30分钟后，使用Phenomenex, C18 4.6 mm × 25 cm柱和10 → 100% B（A = 含0.05% TFA的水，B = 含0.05% TFA的MeCN）在1.0毫升/分钟流速下的30分钟梯度和在260纳米的UV检测的反应混合物的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 18.2分钟洗脱的NHS酯。将该反应逐滴添加到二氨基六(乙二醇)（美国专利No. 6,664,043）（40毫克，0.142毫摩尔）在无水DMF（2.0毫升）中的经搅拌溶液中。在30分钟后，反应混合物的HPLC分析显示完全转化成在Rt =14.1分钟洗脱的产物6a。通过使用YMC, C18 30 × 300 mm柱和在20毫升/分钟的溶剂流速下的如上所述的相同梯度和在260纳米的UV检测的制备HPLC来提纯产物。合并含产物的HPLC级分并在减压下浓缩。产量 = 26毫克（78%）；MALDI-TOF MS观察值1168.6。
b) B1-AE-E2, 6b。将雌二醇-6-羧基甲基肟（1毫克，2.78微摩尔）在DMF（0.1毫升）中与化合物6a（3.25毫克，2.78微摩尔）合并，并用二异丙基乙胺（1微升，5.56微摩尔），接着用BOP试剂（1.84毫克，4.17微摩尔）（作为在DMF中的溶液（0.184毫升的10毫克/毫升溶液）添加）处理。该反应在室温下搅拌2小时。如(a)部分中所述的HPLC分析显示>80%转化成在Rt= 18.2分钟洗脱的产物。通过使用YMC, C18 20 × 250 mm柱和在16毫升/分钟的溶剂流速下的30分钟10 → 70% B（A = 含0.05% TFA的水，B = 含0.05% TFA的MeCN）梯度和在260纳米的UV检测的制备HPLC提纯产物。合并含产物的HPLC级分，在-80℃下冻结并冷冻至干。产量 = 2.8毫克（67%）；MALDI-TOF MS观察值 1511.2。
下列反应描述了B1-AE-E2, 6b的合成。
Figure 557245DEST_PATH_IMAGE034
实施例7
B2-AE-E2, 7b
a) 化合物7a。化合物2e（30毫克，28微摩尔）在无水DMF（2毫升）中的溶液用二异丙基乙胺（7.2微升，42微摩尔）和TSTU（10毫克，34微摩尔）处理。在室温下搅拌该反应。在30分钟后，使用Phenomenex, C18 4.6 mm × 25 cm柱和10 → 100% B（A = 含0.05% TFA的水，B= 含0.05% TFA的MeCN）在1.0毫升/分钟流速下的30分钟梯度和在260纳米的UV检测的反应混合物的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 17.7分钟洗脱的NHS酯。将该反应逐滴添加到二氨基六(乙二醇)（美国专利No. 6,664,043）（40毫克，0.142毫摩尔）在无水DMF（1.0毫升）中的经搅拌溶液中。在30分钟后，反应混合物的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 14分钟洗脱的产物7a。通过使用YMC, C18 30 × 300 mm柱和在20毫升/分钟的溶剂流速下的如上所述的相同梯度和在260纳米的UV检测的制备HPLC提纯产物。合并含产物的HPLC级分并在减压下浓缩。产量 = 28.3毫克（76%）；MALDI-TOF MS观察值 1345.4。
b) B2-AE-E2, 7b。将雌二醇-6-羧基甲基肟（1毫克，2.78微摩尔）在DMF（0.1毫升）中与化合物7a（3.74毫克，2.78微摩尔）合并，并用二异丙基乙胺（1微升，5.56微摩尔），接着用BOP试剂（1.84毫克，4.17微摩尔）（作为在DMF中的溶液（0.184毫升的10毫克/毫升溶液）添加）处理。该反应在室温下搅拌2小时。如(a)部分中所述的HPLC分析显示>80%转化成在Rt= 18.1分钟洗脱的产物。通过使用YMC, C18 20 × 250 mm柱和在16毫升/分钟的溶剂流速下的30分钟10 → 70% B（A = 含0.05% TFA的水，B = 含0.05% TFA的MeCN）梯度和在260纳米的UV检测的制备HPLC提纯产物。合并含产物的HPLC级分，在-80℃下冻结并冷冻至干。产量 = 4.6毫克（98 %）；MALDI-TOF MS观察值 1688.4。
下列反应描述了B2-AE-E2, 7b的合成。
Figure 907455DEST_PATH_IMAGE035
实施例8
B4-AE-E2, 8b
a) 化合物8a。化合物4e（26毫克，18微摩尔）在无水DMF（2毫升）中的溶液用二异丙基乙胺（4.0微升，27微摩尔）和TSTU（6.6毫克，22微摩尔）处理。在室温下搅拌该反应。在30分钟后，使用Phenomenex, C18 4.6 mm × 25 cm柱和10 → 100% B（A = 含0.05% TFA的水，B = 含0.05% TFA的MeCN）在1.0毫升/分钟流速下的30分钟梯度和在260纳米的UV检测的反应混合物的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 18.7分钟洗脱的NHS酯。将该反应逐滴添加到二氨基六(乙二醇)（美国专利No. 6,664,043）（25毫克，0.089毫摩尔）在无水DMF（2.0毫升）中的经搅拌溶液中。在30分钟后，反应混合物的HPLC分析显示完全转化成在Rt =15.1分钟洗脱的产物8a。通过使用YMC, C18 30 × 300 mm柱和在20毫升/分钟的溶剂流速下的如上所述的相同梯度和在260纳米的UV检测的制备HPLC提纯产物。合并含产物的HPLC级分并在减压下浓缩。产量 = 22.5毫克（73 %）；MALDI-TOF MS 观察值1698.6。
b) B4-AE-E2, 8b。将雌二醇-6-羧基甲基肟（1毫克，2.78微摩尔）在DMF（0.1毫升）中与化合物8a（4.72毫克，2.78微摩尔）合并，并用二异丙基乙胺（1微升，5.56微摩尔），接着用BOP试剂（1.84毫克，4.17微摩尔）（作为在DMF中的溶液（0.184毫升的10毫克/毫升溶液）添加）处理。该反应在室温下搅拌2小时。如(a)部分中所述的HPLC分析显示>80%转化成在Rt= 18.9分钟洗脱的产物。通过使用YMC, C18 20 × 250 mm柱和在16毫升/分钟的溶剂流速下的30分钟的10 → 70% B（A = 含0.05% TFA的水，B = 含0.05% TFA的MeCN）梯度和在260纳米的UV检测的制备HPLC提纯产物。合并含产物的HPLC级分，在-80℃下冻结并冷冻至干。产量 = 4.0毫克（70 %）；MALDI-TOF MS观察值 2040.9。
下列反应描述了B4-AE-E2, 8b的合成。
Figure 935454DEST_PATH_IMAGE036
实施例9
用吖啶酯标记抗-TSH Mab的通用程序。抗体的储备溶液（5毫克/毫升，50微升，0.5毫克，3.4纳摩尔）用0.1 M磷酸盐缓冲液pH 8（150微升）或0.1 M碳酸钠pH 9（150微升）稀释成2.5毫克/毫升溶液。向该溶液中加入20当量的作为DMF溶液的吖啶鎓NHS酯。例如，使用B1-AE-NHS，这需要添加83微克作为8.3微升的10毫克/毫升DMF溶液添加的吖啶酯。
将该标记反应在室温下温和搅拌3-4小时，然后用去离子水（1.8毫升）稀释。然后将这些稀释溶液转移到2毫升CentriconTM过滤器（MW 30,000截留值）中并在4500G下离心以将体积降至~0.2毫升。将这一过程再重复三次。将过滤的缀合物最后稀释到200微升总体积的去离子水中以进行质谱分析和RLU测量。
在Voyager DE MALDI-TOF质谱仪上记录质谱并使用未标记抗体作为基准。将大约2微升的缀合物溶液与2微升芥子酸（sinnapinic acid）基质溶液（HP）混合并点涂在MALDI板上。在完全干燥后，记录质谱。可以由未标记抗体和缀合物的质量值的差值测量AE并入程度。通常，在这些标记条件下，在抗体中并入3-6 AE标记物。
实施例10
稳定性的测量。吖啶酯的稳定性的最大化是用于提高检测精确度的一种参数。就吖啶酯的分子结构与在4℃的标称储存温度和37℃的升高的储存温度下的化学发光稳定性的相关性分析共价连接到抗-TSH抗体上的几种吖啶酯的化学发光稳定性。将各自缀合到不同吖啶酯上的等量的吖啶酯标记的抗TSH（促甲状腺激素）抗体在由0.1 M N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙磺酸钠（HEPES）、0.15 M氯化钠、7.7 mM叠氮化钠、1.0 mM乙二胺四乙酸四钠（EDTA）、12 mM叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（Triton X-100）、76 uM牛血清白蛋白（BSA）、7uM小鼠免疫球蛋白（IgG），pH 7.7构成的Siemens Healthcare Diagnostics TSH3（促甲状腺激素）Lite Reagent缓冲液中稀释到0.2纳摩尔的浓度。将各吖啶酯溶液分配到两组储存容器中。一组储存容器保持在4℃，另一组保持在37℃。从最初稀释的那天开始，在BertholdTechnolgies Autolumat LB953光度计上在相继添加300微升的各Siemens HealthcareDiagnostics Flash Reagent 1（0.1 M硝酸和0.5%过氧化氢）和Siemens HealthcareDiagnostics Flash Reagent 2（0.25 M氢氧化钠和0.05%十六烷基三甲基氯化铵）下在标准条件下测定来自10微升的各吖啶酯-抗体溶液的化学发光。
实施例11
非特异性结合分数的测量。吖啶酯与固相的非特异性结合分数（fNSB）的最小化是用于提高检测精确度的一种参数。就与吖啶酯的分子结构的相关性分析共价连接到抗TSH抗体上的几种吖啶酯的非特异性结合分数。将各自缀合到不同吖啶酯上的等量的吖啶酯标记的抗TSH（促甲状腺激素）抗体在由0.1 M N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙磺酸钠（HEPES）、0.15 M氯化钠、7.7 mM叠氮化钠、1.0 mM乙二胺四乙酸四钠（EDTA）、12 mM叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（Triton X-100）、76 uM牛血清白蛋白（BSA）、7 uM小鼠免疫球蛋白（IgG），pH7.7构成的Siemens Healthcare Diagnostics TSH3（促甲状腺激素）Lite Reagent缓冲液中稀释到2纳摩尔的浓度。接着，100微升含吖啶酯的溶液各用200微升的马血清（SiemensHealthcare Diagnostics Multi-diluent 1）和200微升的两种固相的任一种稀释。第一种固相是含有50微克用抗PTH抗体衍生化的磁性胶乳微粒（MLP）的200微升SiemensHealthcare Diagnostics ACS PTH（甲状旁腺素）固相。第二种固相是含有60微克用抗TSH抗体衍生化的顺磁性微粒（PMP）的200微升Siemens Healthcare Diagnostics ACS TSH3（促甲状腺激素）固相。在培养10分钟以使吖啶酯标记的抗体与固相之间相互作用后磁力收集粒子并用水洗涤两次。在Berthold Technolgies Autolumat LB953光度计上在相继添加300微升的各Siemens Healthcare Diagnostics Flash Reagent 1（0.1 M硝酸和0.5%过氧化氢）和Siemens Healthcare Diagnostics Flash Reagent 2（0.25 M氢氧化钠和0.05%十六烷基三甲基氯化铵）下在标准条件下测量与该粒子缔合的吖啶酯的化学发光。测量化学发光5.0秒。作为粒子结合的化学发光与总化学发光输入的比率计算非特异性结合分数（fNSB）。一般而言，吖啶酯的疏水性提高fNSB并在识别出少量特定信号（specific signal）时不合意，相反，吖啶酯的亲水性降低fNSB并在识别出少量特定信号时合意。
实施例12
化学发光动力学的测量。吖啶酯化学发光速率的加速是可用于提高检测吞吐率的一种参数。就吖啶酯的分子结构与其化学发光速率的相关性分析共价连接到抗-TSH抗体上的几种吖啶酯的化学发光动力学。将各吖啶酯标记抗体在由0.1 M磷酸钠、0.15 M氯化钠、6mM叠氮化钠和1 g/L牛血清白蛋白（BSA）构成的缓冲液中稀释到0.2纳摩尔的浓度。在Berthold Technolgies Autolumat LB953光度计上在相继添加300微升的各SiemensHealthcare Diagnostics Flash Reagent 1（0.1 M硝酸和0.5%过氧化氢）和SiemensHealthcare Diagnostics Flash Reagent 2（0.25 M氢氧化钠和0.05%十六烷基三甲基氯化铵）下在标准条件下以0.1秒为间隔积分10微升的各受试吖啶酯-抗体缀合物的化学发光动力学20秒。就发光的相对速率比较受试吖啶酯的化学发光动力学。
实施例13
量子产率的测量。提高吖啶酯化学发光量子产率是可用于提高检测灵敏度的一种参数。就吖啶酯的分子结构与它们的化学发光光输出量级的相关性测试共价连接到抗TSH抗体上的几种吖啶酯的化学发光量子产率。将各吖啶酯标记抗体在由0.1 M磷酸钠、0.15 M氯化钠、6 mM叠氮化钠和1 g/L牛血清白蛋白（BSA）构成的缓冲液中稀释到0.2纳摩尔的浓度。在Berthold Technolgies Autolumat LB953光度计上在相继添加300微升的各SiemensHealthcare Diagnostics Flash Reagent 1（0.1 M硝酸和0.5%过氧化氢）和SiemensHealthcare Diagnostics Flash Reagent 2（0.25 M氢氧化钠和0.05%十六烷基三甲基氯化铵）下在标准条件下测量10微升的各受试吖啶酯-抗体缀合物的化学发光动力学10秒。作为化学发光与受试吖啶酯的量的比率计算化学发光量子产率。
本说明中引用的所有专利和非专利文献经引用并入本文。
已通过优选实施方案的上文的描述说明本发明，但要理解的是，本领域的技术人员可以作出这些实施方案的修改和变动而不背离如下列权利要求书中阐述的本发明的精神或范围。

Claims (10)

1.具有下列结构的亲水、高量子产率吖啶酯：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中
R1是甲基或磺丙基基团；
G是支链基团，其在每次出现时独立地选自：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中R2和R3在每次出现时独立地为基团-(CH2CH2O) n CH3，其中n是1或2；且
R12选自：
(1) -O-N-琥珀酰亚胺基；
(2) -NH-(CH2)5-C(O)-O-N-琥珀酰亚胺基；
(3) -NH-(CH2)5-COOH；
(4) -NH-(C2H4O) n -C2H4NH-C(O)-(CH2)3-C(O)-O-N-琥珀酰亚胺基，其中n = 1至5；
(5) -NH-(C2H4O) n -C2H4NH-C(O)-(CH2)3-COOH，其中n = 1至5；
(6) -NH-(C2H4O) n -C2H4NH2，其中n = 1至5；和
(7) -NH-R-NHR，其中R独立地为氢、烷基、烯基、炔基或芳烷基；其中R任选包含最多20个杂原子。
2.根据权利要求1的吖啶酯，其中G在一处或在两处出现时是基团：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
3.根据权利要求1的吖啶酯，其中G在一处或在两处出现时是基团：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
4.根据权利要求1的吖啶酯，其中R12是
-NH-(C2H4O) n -C2H4NH2，其中n = 1至5。
5.根据权利要求1的吖啶酯，其中R12是：
-NH-(C2H4O) n -C2H4NH-C(O)-(CH2)3-C(O)-O-R’’，其中n = 1至5；且其中R’’是氢或-N-琥珀酰亚胺基。
6.根据权利要求1的吖啶酯，其具有下列结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
。
7.吖啶酯，其具有下列结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
其中R12是用于使吖啶鎓化合物缀合到被分析物、被分析物类似物或被分析物的结合分子上的亲电子或亲核基团。
8.根据权利要求7的吖啶酯，其中R12是-OH。
9.用于检测或量化被分析物的测定法，其包括以下步骤：
(a) 提供缀合物，其包含：(i) 被分析物的特异性结合分子；和(ii) 根据权利要求1的亲水、高量子产率和快速发光的吖啶酯；
(b) 提供具有固定在其上的所述被分析物的第二特异性结合分子的固体载体；
(c) 混合所述缀合物、所述固相和怀疑含有所述被分析物的样品以形成结合复合物；
(d) 分离捕获在所述固体载体上的结合复合物；
(e) 通过添加化学发光触发剂触发来自步骤(d)的结合复合物的化学发光；
(f) 用光度计测量发光量；和
(g) 通过将反应混合物的发光量与将发光量与被分析物的已知浓度相关联的标准剂量响应曲线比较，来检测被分析物的存在或计算被分析物的浓度。
10.用于检测或量化被分析物的测定法，其包括以下步骤：
(a) 提供被分析物与根据权利要求1的亲水、高量子产率和快速发光的吖啶酯的缀合物；
(b) 提供固定有被分析物的特异性结合分子的固体载体；
(c) 混合所述缀合物、固体载体和怀疑含有所述被分析物的样品以形成结合复合物；
(d) 分离捕获在所述固体载体上的结合复合物；
(e) 通过添加化学发光触发剂触发来自步骤(d)的结合复合物的化学发光；
(f) 用光度计测量光量；和
(g) 通过将反应混合物的发光量与将发光量与被分析物的已知浓度相关联的标准剂量响应曲线比较，来检测被分析物的存在或计算被分析物的浓度。
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