JPH0654314B2 - モノアミンの免疫検定法 - Google Patents
モノアミンの免疫検定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 モノアミンは、限定された意味で、残基の酸化を伴わず
にあるいはそのような酸化と同時に、アミノ酸を脱カル
ボキシル化することによって生成するアミンを意味す
る。この種のアミンは、神経系内に認められ、神経伝達
物質として作用する。かかるアミンとしては例えば以下
の物質が知られている。
にあるいはそのような酸化と同時に、アミノ酸を脱カル
ボキシル化することによって生成するアミンを意味す
る。この種のアミンは、神経系内に認められ、神経伝達
物質として作用する。かかるアミンとしては例えば以下
の物質が知られている。
(1)トリプトファンまたはインドールアミン類の誘導
体：トリプタミン、５−ヒドロキシトリプタミン（セロ
トニン）、５−メトキシトリプタミン； (2)チロシンの誘導体：チラミンおよびカテコールアミ
ン類、例えばアドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパ
ミン； (3)ヒスチジンの誘導体：ヒスタミン； (4)グルタミン酸の誘導体：γ−アミノ酪酸（ＧＡＢ
Ａ） 化学的に、モノアミンは、一般式Ｒ−ＮＨ２（式中、Ｒ
は置換されているまたは置換されていない炭化水素基で
ある）で示され、神経系とは特に関連がない天然のアミ
ノ酸を含む他の多数の化合物を含む。
体：トリプタミン、５−ヒドロキシトリプタミン（セロ
トニン）、５−メトキシトリプタミン； (2)チロシンの誘導体：チラミンおよびカテコールアミ
ン類、例えばアドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパ
ミン； (3)ヒスチジンの誘導体：ヒスタミン； (4)グルタミン酸の誘導体：γ−アミノ酪酸（ＧＡＢ
Ａ） 化学的に、モノアミンは、一般式Ｒ−ＮＨ２（式中、Ｒ
は置換されているまたは置換されていない炭化水素基で
ある）で示され、神経系とは特に関連がない天然のアミ
ノ酸を含む他の多数の化合物を含む。
一般に、モノアミンは、クロマトグラフィの後、ニンヒ
ドリン反応のようなアミン官能基に基づいた呈色反応、
またはダンシル残基とのカップリングによる蛍光反応に
よって分析される。あまり行われないが、例えばヒスタ
ミンを分析するためのオルソフタルアルデヒドとの反
応、またはインドールアミンやカテコールアミンを分析
するためのポーラログラフィ法も使用される。（“Meth
ods in Enzymology vol. XVII、H.TaborおよびC.Tabor編
集、Academic Press、ニューヨーク、１９７１年”およ
びMefford I.N.およびBarchas J.D.、J.Chromatogr.、
第１８１巻、第１８７頁〜第１９３頁、１９８０年参
照）。
ドリン反応のようなアミン官能基に基づいた呈色反応、
またはダンシル残基とのカップリングによる蛍光反応に
よって分析される。あまり行われないが、例えばヒスタ
ミンを分析するためのオルソフタルアルデヒドとの反
応、またはインドールアミンやカテコールアミンを分析
するためのポーラログラフィ法も使用される。（“Meth
ods in Enzymology vol. XVII、H.TaborおよびC.Tabor編
集、Academic Press、ニューヨーク、１９７１年”およ
びMefford I.N.およびBarchas J.D.、J.Chromatogr.、
第１８１巻、第１８７頁〜第１９３頁、１９８０年参
照）。
これらの方法の共通する特徴は、特異性を達成するため
に少なくとも抽出やクロマトグラフィを必要とするとい
うことである。これらの方法は感度（１０ｎｇより小さ
いことはまれである）が原因でその使用が限定される。
特に、必然的に試料の量が制限される生物学的分析の場
合にそうである。
に少なくとも抽出やクロマトグラフィを必要とするとい
うことである。これらの方法は感度（１０ｎｇより小さ
いことはまれである）が原因でその使用が限定される。
特に、必然的に試料の量が制限される生物学的分析の場
合にそうである。
酵素を調製できる実験室では、例えばヒスタミンの場合
に、メチル基転移酵素による残基のメチル化に基づいた
放射線酵素法を利用することもできる(C.Bruce、W.H.Tay
lorおよびA.Westwood、Annals of Clinical Biochemist
ry、第１６巻、第２５９頁〜第２６４頁１９７９年）。
これらの方法は工業面では価値がない。
に、メチル基転移酵素による残基のメチル化に基づいた
放射線酵素法を利用することもできる(C.Bruce、W.H.Tay
lorおよびA.Westwood、Annals of Clinical Biochemist
ry、第１６巻、第２５９頁〜第２６４頁１９７９年）。
これらの方法は工業面では価値がない。
さらに、低分子物質の免疫検定法の一般原理をモノアミ
ンに適用しようとの試みもある。かかる免疫検定法で
は、被検定化合物とその放射性誘導体またはトレーサー
に結合したキャリヤーとを、被検定化合物と上記放射性
誘導体またはトレーサーの両方と結合しうる抗体に競争
的に結合させる。
ンに適用しようとの試みもある。かかる免疫検定法で
は、被検定化合物とその放射性誘導体またはトレーサー
に結合したキャリヤーとを、被検定化合物と上記放射性
誘導体またはトレーサーの両方と結合しうる抗体に競争
的に結合させる。
上記キャリヤーはこの種技術では周知のようにハプテン
（それ自体は非免疫原性）を免疫原性にするためそれと
結合せしめられる巨大分子（一般には蛋白質）である。
かかるキャリアーの定義は、ハーバード・ユニバーシテ
ィ・プレスのザ・スペシフィシティ・オブ・セロロジカ
ル・リアクションズ１９４５年発行、アーティフィシャ
ル・コンジュゲーテッド・アンチゲンス・セロロジカル
・リアクションズ・ウイズ・シンプル・ケミカル・コン
パウンドの第１５６頁〜第２１０頁に記載されている。
（それ自体は非免疫原性）を免疫原性にするためそれと
結合せしめられる巨大分子（一般には蛋白質）である。
かかるキャリアーの定義は、ハーバード・ユニバーシテ
ィ・プレスのザ・スペシフィシティ・オブ・セロロジカ
ル・リアクションズ１９４５年発行、アーティフィシャ
ル・コンジュゲーテッド・アンチゲンス・セロロジカル
・リアクションズ・ウイズ・シンプル・ケミカル・コン
パウンドの第１５６頁〜第２１０頁に記載されている。
ヒスタミンまたは他のモノアミンのような低分子量の分
子は、上記の方法を用いるには不適切である。というの
は、このようなモノアミンは、抗体に対し、充分に強い
相互作用を示さないからである。
子は、上記の方法を用いるには不適切である。というの
は、このようなモノアミンは、抗体に対し、充分に強い
相互作用を示さないからである。
本発明の発明者の一人であるM.A.Delaageは、分子の免
疫反応性を増大するために無水コハク酸でセロトニンを
処理するようにしたセロトニンに対する放射線免疫検定
法を発表した。（J.Physiol.Paris、第７７巻、第３３
９頁〜第３４７頁、１９８１年）。またセロトニンを無
水酢酸で処理する類似の方法も発表した。（Journal of
Neurochemistry、第３９巻、第１２７１頁〜第１２７
７頁、１９８２年）。各場合において、反応生成物を適
切な抗体に結合させるにあたってその放射性誘導体と競
合させる。しかしながら、これらの方法は満足すべきも
のではない。なぜならばコハク酸基や酢酸基の寄与が
（酢酸基の方が寄与が大きい）、結合性増加率として１
０００倍を越えず、分子にその抗体に対する好適な結合
力を与えるには不充分だからである。
疫反応性を増大するために無水コハク酸でセロトニンを
処理するようにしたセロトニンに対する放射線免疫検定
法を発表した。（J.Physiol.Paris、第７７巻、第３３
９頁〜第３４７頁、１９８１年）。またセロトニンを無
水酢酸で処理する類似の方法も発表した。（Journal of
Neurochemistry、第３９巻、第１２７１頁〜第１２７
７頁、１９８２年）。各場合において、反応生成物を適
切な抗体に結合させるにあたってその放射性誘導体と競
合させる。しかしながら、これらの方法は満足すべきも
のではない。なぜならばコハク酸基や酢酸基の寄与が
（酢酸基の方が寄与が大きい）、結合性増加率として１
０００倍を越えず、分子にその抗体に対する好適な結合
力を与えるには不充分だからである。
本発明は、５０００００倍のオーダーの抗体に対するモ
ノアミンの結合性増加率を生じさせるのに充分な程度に
モノアミン分子の大きさを増大させる新規な化学的変換
剤を用いることによって上記の欠点を克服するものであ
る。勿論、この場合抗体はキャリアー（タンパク質）に
結合した変換モノアミン分子に対して作らなければなら
ない。
ノアミンの結合性増加率を生じさせるのに充分な程度に
モノアミン分子の大きさを増大させる新規な化学的変換
剤を用いることによって上記の欠点を克服するものであ
る。勿論、この場合抗体はキャリアー（タンパク質）に
結合した変換モノアミン分子に対して作らなければなら
ない。
これらの条件下では、モノアミンの免疫検定法は、ステ
ロイドおよびペプチドのような高分子量の分子の場合と
同じレベルの感度と特異性を得ることができる。本発明
の方法は、ヒスタミンのような分子量が１５０より小さ
い非常に小さな分子のモノアミンに特に適している。
ロイドおよびペプチドのような高分子量の分子の場合と
同じレベルの感度と特異性を得ることができる。本発明
の方法は、ヒスタミンのような分子量が１５０より小さ
い非常に小さな分子のモノアミンに特に適している。
本発明は、モノアミンの免疫検定法に関し、この方法
は、モノアミンを定量的に化学変換させて高分子量誘導
体とし、次いで、この誘導体を、トレーサーと競合させ
て、前記誘導体及びトレーサーのすべてと結合しうる抗
体と結合させることからなるモノアミンの免疫検定法に
おいて、 (a)前記アミンを高分子量の誘導体に化学変換させるの
に用いる試薬が、下記式（Ｉ）： Ｒ−ＣＯ−Ｒ′ （Ｉ） 〔式中Ｒは基−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ
Ｏ−ＮＨ２を表わし、Ｒ′はＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド、ハロゲン、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ″および−Ｓ−Ｒ″
（但しＲ″は炭化水素基または基−Ｏ−Ｃ６Ｈ５であ
る）から選択される脱離基を表わす〕で表されるアシル
剤（Ｉ）であり； (b)前記トレーサーが、下記式（II）： Ｘ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ１− （II） （式中、Ｒ１はＲにできる限り類似の構造を有し、かつ
放射能標識を付けた基、放射能標識を付けたチロシンま
たは酵素に結合した基であり、Ｘはモノアミン分子の残
基である）で表され； (c)抗体は、前記のモノアミンの高分子量誘導体及び前
記トレーサーと結合することができ、かつ免疫原性抱合
体型の巨大分子キャリヤーに結合した前記高分子量誘導
体に対して作られなければならない； ことを特徴とする免疫検定法である。
は、モノアミンを定量的に化学変換させて高分子量誘導
体とし、次いで、この誘導体を、トレーサーと競合させ
て、前記誘導体及びトレーサーのすべてと結合しうる抗
体と結合させることからなるモノアミンの免疫検定法に
おいて、 (a)前記アミンを高分子量の誘導体に化学変換させるの
に用いる試薬が、下記式（Ｉ）： Ｒ−ＣＯ−Ｒ′ （Ｉ） 〔式中Ｒは基−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ
Ｏ−ＮＨ２を表わし、Ｒ′はＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド、ハロゲン、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ″および−Ｓ−Ｒ″
（但しＲ″は炭化水素基または基−Ｏ−Ｃ６Ｈ５であ
る）から選択される脱離基を表わす〕で表されるアシル
剤（Ｉ）であり； (b)前記トレーサーが、下記式（II）： Ｘ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ１− （II） （式中、Ｒ１はＲにできる限り類似の構造を有し、かつ
放射能標識を付けた基、放射能標識を付けたチロシンま
たは酵素に結合した基であり、Ｘはモノアミン分子の残
基である）で表され； (c)抗体は、前記のモノアミンの高分子量誘導体及び前
記トレーサーと結合することができ、かつ免疫原性抱合
体型の巨大分子キャリヤーに結合した前記高分子量誘導
体に対して作られなければならない； ことを特徴とする免疫検定法である。
本発明の方法を実施するには次の３種の試薬を用いる。
１． モノアミンのアミン官能基と反応して、次式で示
されるようにその官能基を置換アミド官能基に変換する
アシル化剤（Ｉ）： ここでＸは例えば下記のようなモノアミン残基である。
されるようにその官能基を置換アミド官能基に変換する
アシル化剤（Ｉ）： ここでＸは例えば下記のようなモノアミン残基である。
ヒスタミンの場合 である。
ドーパミンの場合 である。
同じことが、他のアミン、例えばセロトニンなどのイン
ドールアミン、カテコールアミン（アドレナリン、ノル
アドレナリン）またはγ−アミノ酪酸、グルタメートの
ようなアミノ酸にも適用される。
ドールアミン、カテコールアミン（アドレナリン、ノル
アドレナリン）またはγ−アミノ酪酸、グルタメートの
ようなアミノ酸にも適用される。
（Ｉ）はアシル化剤であり、式中、 Ｒは基−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｎ
Ｈ２を表し； Ｒ′は脱離基であり、例えば または−Ｃｌ（より一般的にはハロゲン） または−Ｏ−ＣＯ−Ｒ″（Ｒ″＝炭化水素基） または−Ｓ−Ｒ″ または 等である。
Ｈ２を表し； Ｒ′は脱離基であり、例えば または−Ｃｌ（より一般的にはハロゲン） または−Ｏ−ＣＯ−Ｒ″（Ｒ″＝炭化水素基） または−Ｓ−Ｒ″ または 等である。
このアシル化剤の好適例は下記の式で示される化合物で
ある。
ある。
２． 下記一般式を有する放射性トレーサー（II）： Ｘ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ１− （II） （式中、Ｘは前記意味と同じであり、Ｒ１はＲにできる
限り類似の構造を有し、かつこれは放射能標識を付けた
基（例えばＲ１−125Ｉの形をとる）、放射能標識を付
けたチロシンまたは酵素に結合した基であり、この基は
上記アシル化剤によってアミンに結合されている） トレーサーが酵素系であるときは基Ｘ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ
１−は、従来この種の目的のために普通に用いられてい
る酵素のリシン残基に結合されている。他の変形とし
て、トレーサーは蛍光型のものであることができる。
限り類似の構造を有し、かつこれは放射能標識を付けた
基（例えばＲ１−125Ｉの形をとる）、放射能標識を付
けたチロシンまたは酵素に結合した基であり、この基は
上記アシル化剤によってアミンに結合されている） トレーサーが酵素系であるときは基Ｘ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ
１−は、従来この種の目的のために普通に用いられてい
る酵素のリシン残基に結合されている。他の変形とし
て、トレーサーは蛍光型のものであることができる。
放射性トレーサーは例えばモノアミンである被検定分子
と、ヨウ素で放射能標識を付けたチロシンから誘導され
た下記式で示される試薬との反応によって得られたもの
である。
と、ヨウ素で放射能標識を付けたチロシンから誘導され
た下記式で示される試薬との反応によって得られたもの
である。
この場合被検定モノアミンがヒスタミンであればトレー
サーは下記の式 を有する化合物である。
サーは下記の式 を有する化合物である。
３． 変換モノアミン（IV）およびトレーサーと結合で
きるモノクローナルもしくはポリクローナル抗体（II
I）： この抗体は、変換モノアミン（IV）が免疫原性タンパク
質に結合された抱合体（下記ＶもしくはVI）に対して作
られなければならない。
きるモノクローナルもしくはポリクローナル抗体（II
I）： この抗体は、変換モノアミン（IV）が免疫原性タンパク
質に結合された抱合体（下記ＶもしくはVI）に対して作
られなければならない。
（Ｖ） Ｘ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ２−ＣＯ−ＮＨ−アルブミ
ン 式中Ｒ２はＲに対して式：−Ｒ＝−Ｒ２−ＣＯ−ＮＨ２
の関係を有する基である。
ン 式中Ｒ２はＲに対して式：−Ｒ＝−Ｒ２−ＣＯ−ＮＨ２
の関係を有する基である。
（VI） Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−アルブミン 上記３種の試薬、すなわち（Ｉ）アシル化剤である変換
剤、（II）トレーサーおよび（III）抗体が得られたな
らば、検定は下記のようにして実施する。
剤、（II）トレーサーおよび（III）抗体が得られたな
らば、検定は下記のようにして実施する。
１． 被検定試料（数百μｌ）を変換剤および適当な緩
衝液（中性もしくはわずかにアルカリ性）と混合して、
全アミン官能基を定量的に（IV）に変換する。
衝液（中性もしくはわずかにアルカリ性）と混合して、
全アミン官能基を定量的に（IV）に変換する。
２． このように変換した試料をトレーサー（II）およ
び校正量の抗体（III）と接触し反応させる。
び校正量の抗体（III）と接触し反応させる。
３． 反応させた後、生成した抗原−抗体複合体を分離
して抗体に結合した放射能を測定する。トレーサー分子
と競合するＸ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ（IV）分子の数が多けれ
ば多いほど、上記放射能は少なくなる。最初に存在した
モノアミンＸ−ＮＨ２の量を標準曲線と比較することに
よって求める。
して抗体に結合した放射能を測定する。トレーサー分子
と競合するＸ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ（IV）分子の数が多けれ
ば多いほど、上記放射能は少なくなる。最初に存在した
モノアミンＸ−ＮＨ２の量を標準曲線と比較することに
よって求める。
この手順は、非放射性トレーサーを用いる場合でも同じ
である。
である。
特に適切なアシル化剤（Ｉ）は下記式： で表される新規化合物である。この化合物は、次の方法
で製造することができる。最初に、ジメチルホルムアミ
ド中５ミリ当量のトリエチルアミンの存在下、１当量の
無水コハク酸を５ミリ当量のグリシンアミドと反応させ
て、グリシンアミドをスクシニル化することによってス
クシニルグリシンアミドが得られる。このスクシニルグ
リシンアミドをＱＡＥセファデックスＡ25タイプのイオ
ン交換樹脂を用いて過剰のグリシンアミドから中性pH下
で分離し、次いで酸性pH下で溶離させる。カップリング
生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥する。
で製造することができる。最初に、ジメチルホルムアミ
ド中５ミリ当量のトリエチルアミンの存在下、１当量の
無水コハク酸を５ミリ当量のグリシンアミドと反応させ
て、グリシンアミドをスクシニル化することによってス
クシニルグリシンアミドが得られる。このスクシニルグ
リシンアミドをＱＡＥセファデックスＡ25タイプのイオ
ン交換樹脂を用いて過剰のグリシンアミドから中性pH下
で分離し、次いで酸性pH下で溶離させる。カップリング
生成物を含有する画分を集めて凍結乾燥する。
次の工程は無水溶媒（モレキュラーシーブ上で保持され
ている）を必要とする。５ミリ当量のスクシニルグリシ
ンアミドを、５ミリ当量のクロロギ酸エチルによって４
℃にて５分間活性化し、次いで過剰のＮ−ヒドロキシス
クシンイミド（７ミリ当量）とカップリングさせる。こ
のカップリング生成物に、ジオキサンを添加して沈澱さ
せ、エーテルですすぎ、次いで凍結乾燥する。
ている）を必要とする。５ミリ当量のスクシニルグリシ
ンアミドを、５ミリ当量のクロロギ酸エチルによって４
℃にて５分間活性化し、次いで過剰のＮ−ヒドロキシス
クシンイミド（７ミリ当量）とカップリングさせる。こ
のカップリング生成物に、ジオキサンを添加して沈澱さ
せ、エーテルですすぎ、次いで凍結乾燥する。
この生成物（すなわちアシル化剤）はジメチルホルムア
ミドと水に可溶性の白色粉末の形態であり、水中では迅
速に加水分解し、大部分の有機溶媒に不溶性である。そ
の融点は１０８〜１１０℃であり、その分子量は３０
７．７である。
ミドと水に可溶性の白色粉末の形態であり、水中では迅
速に加水分解し、大部分の有機溶媒に不溶性である。そ
の融点は１０８〜１１０℃であり、その分子量は３０
７．７である。
以下に示す実施例は例示することだけを目的として提供
するものであり、本発明を限定するものではない。
するものであり、本発明を限定するものではない。
実施例 ＮＯＨ−スクシンイミド−エステル−スクシニル−グリ
シンアミドで変換したヒスタミン： １． アシル化剤（Ｉ）は先に記載した下記式の化合物
である。
シンアミドで変換したヒスタミン： １． アシル化剤（Ｉ）は先に記載した下記式の化合物
である。
（Ｉ）＝ＮＯＨ−スクシンイミド−エステル−スクシニ
ルグリシンアミド このアシル化剤は、わずかにアルカリ性の媒体中で直接
反応によってヒスタミンを下記式の化合物（IV）に変換
する。
ルグリシンアミド このアシル化剤は、わずかにアルカリ性の媒体中で直接
反応によってヒスタミンを下記式の化合物（IV）に変換
する。
（IV）＝スクシニルグリシンアミドヒスタミン ２． ヒスタミンのアミン官能基にスクシニル基 を結合させ、次いでその生成物スクシニルヒスタミン
を、下記（II）で示されるトレーサーを形成するために
ヨウ素化されているグリシルチロシンにカップリングさ
せて放射能標識を付けたトレーサーを得る。
を、下記（II）で示されるトレーサーを形成するために
ヨウ素化されているグリシルチロシンにカップリングさ
せて放射能標識を付けたトレーサーを得る。
一つの変形としては、スクシニルヒスタミンを、グリシ
ルチロシンの代りに酵素とカップリングさせる方法があ
る。
ルチロシンの代りに酵素とカップリングさせる方法があ
る。
３． 対応する抗体（III）は、以下のようにして作っ
た免疫原性誘導体、即ち、抱合体（Ｖ）を動物に注射す
ることによって得られる。
た免疫原性誘導体、即ち、抱合体（Ｖ）を動物に注射す
ることによって得られる。
免疫原性誘導体（Ｖ）は、ヒスタミンのアミン官能基に
スクシニル連鎖を結合後、生成したスクシニルヒスタミ
ンをグリシルアルブミン（未修飾のタンパク質が好まし
い）に結合させて得られる。
スクシニル連鎖を結合後、生成したスクシニルヒスタミ
ンをグリシルアルブミン（未修飾のタンパク質が好まし
い）に結合させて得られる。
（式中Ａｌｂはアルブミンを示す） モノクローナル抗体は、マウスに免疫原性誘導体（Ｖ）
を注射し、GALFRE G.らが報告している方法（Nature、
１９７７年第２６６巻第５５０頁〜第５５２頁）に従っ
て生成した免疫マウス脾臓細胞とマウスの骨髄腫細胞
（×６３細胞系）を、PEG４０００の存在下で、融合す
ることによって得られる。
を注射し、GALFRE G.らが報告している方法（Nature、
１９７７年第２６６巻第５５０頁〜第５５２頁）に従っ
て生成した免疫マウス脾臓細胞とマウスの骨髄腫細胞
（×６３細胞系）を、PEG４０００の存在下で、融合す
ることによって得られる。
いくつかのモノクロナール抗体を、ヨウ素誘導体（II）
と結合する能力を有するものであるとの理由で選択し
た。クローン６７９ＡＭは、変換されたヒスタミンに対
する結合性と選択性（ヒスタミン類似体に対するより高
い結合性）によって選択した。腹水中に産生した抗体を
プロテインＡセファロース（登録商標）で精製し、次い
でこの抗体をシミュノテクの日本特許出願（特願昭５９
−６９８８６、特開昭６０−６９１００）に記載された
方法に従ってアビジン−ビオチンシステムを使用するこ
とで、試験管に固定した。
と結合する能力を有するものであるとの理由で選択し
た。クローン６７９ＡＭは、変換されたヒスタミンに対
する結合性と選択性（ヒスタミン類似体に対するより高
い結合性）によって選択した。腹水中に産生した抗体を
プロテインＡセファロース（登録商標）で精製し、次い
でこの抗体をシミュノテクの日本特許出願（特願昭５９
−６９８８６、特開昭６０−６９１００）に記載された
方法に従ってアビジン−ビオチンシステムを使用するこ
とで、試験管に固定した。
第１図に、種々のアシル化及び非アシル化ヒスタミン類
似体による放射性トレーサーの置換率曲線を示す。この
図はヒスタミンおよびその代謝類似物によって放射能標
識付けした誘導体の置換率をアシル化前及びアシル化後
について示したものである。
似体による放射性トレーサーの置換率曲線を示す。この
図はヒスタミンおよびその代謝類似物によって放射能標
識付けした誘導体の置換率をアシル化前及びアシル化後
について示したものである。
抗ヒスタミン抗体を既知量で被覆した試験管中で種々の
濃度のヒスタミン、アシル化ヒスタミン、アシル化ヒス
チジン及びアシル化メチル−ヒスタミン５０μｌの存在
下において、トレーサー５０μｌを４℃で一晩インキュ
ベートした。インキュベートの後、試験管中の液体を吸
引除去し、抗体被覆試験管に結合した放射能をガンマカ
ウンターで測定した。
濃度のヒスタミン、アシル化ヒスタミン、アシル化ヒス
チジン及びアシル化メチル−ヒスタミン５０μｌの存在
下において、トレーサー５０μｌを４℃で一晩インキュ
ベートした。インキュベートの後、試験管中の液体を吸
引除去し、抗体被覆試験管に結合した放射能をガンマカ
ウンターで測定した。
結果は、補捉結合されたカウント／分対初期カウント／
分の比率（Ｂ／Ｔ）、即ち全放射能に対する抗体に結合
した放射能の比として表した。Ｂ／Ｔの値をインキュベ
ートしたアミン化合物の濃度の関数としてプロットし第
１図に示した。これらの濃度（１０-11ｍｏｌ／〜１
０-3ｍｏｌ／）は対数目盛（Ｌｏｇ Ｃ：−１１〜−
３）で表した。
分の比率（Ｂ／Ｔ）、即ち全放射能に対する抗体に結合
した放射能の比として表した。Ｂ／Ｔの値をインキュベ
ートしたアミン化合物の濃度の関数としてプロットし第
１図に示した。これらの濃度（１０-11ｍｏｌ／〜１
０-3ｍｏｌ／）は対数目盛（Ｌｏｇ Ｃ：−１１〜−
３）で表した。
従って、第１図は試験管上へ被覆したモノクローナル抗
体の特異性を表している。ヨウ素化したトレーサーを置
換するために低い濃度（１０-11ｍｏｌ／〜１０-8ｍ
ｏｌ／）でもよい化合物、即ちアシル化ヒスタミンの
場合は、ヨウ素化したトレーサーを同程度に置換するた
めにさらに高い濃度を必要とする化合物（例えば、アシ
ル化メチルヒスタミンはヨウ素化したトレーサーを置換
するために１０-6ｍｏｌ／〜１０-3ｍｏｌ／の高い
濃度を要求する）よりよく検知されるのである。
体の特異性を表している。ヨウ素化したトレーサーを置
換するために低い濃度（１０-11ｍｏｌ／〜１０-8ｍ
ｏｌ／）でもよい化合物、即ちアシル化ヒスタミンの
場合は、ヨウ素化したトレーサーを同程度に置換するた
めにさらに高い濃度を必要とする化合物（例えば、アシ
ル化メチルヒスタミンはヨウ素化したトレーサーを置換
するために１０-6ｍｏｌ／〜１０-3ｍｏｌ／の高い
濃度を要求する）よりよく検知されるのである。
モノアミン化合物の相対免疫認識（結合性）を比較する
便利な方法はトレーサーに５０％の置換率を与える各種
アミンの濃度を比較することである。例えば、第１図で
はトレーサーの最大結合比Ｂ／Ｔ（即ち、モノアミンが
ない場合）は０．５である。従って、トレーサーに５０
％の置換率（ＩＣ５０と呼ぶ）を与えるモノアミン化合
物の濃度は０．２５に等しいＢ／Ｔを与える該化合物の
濃度の値を直接読みとることによって得ることができ
る。
便利な方法はトレーサーに５０％の置換率を与える各種
アミンの濃度を比較することである。例えば、第１図で
はトレーサーの最大結合比Ｂ／Ｔ（即ち、モノアミンが
ない場合）は０．５である。従って、トレーサーに５０
％の置換率（ＩＣ５０と呼ぶ）を与えるモノアミン化合
物の濃度は０．２５に等しいＢ／Ｔを与える該化合物の
濃度の値を直接読みとることによって得ることができ
る。
これらの濃度を整理すると以下の表のようになる。
以上の結果から以下のことが強調される。
１）他のアシル化類似体と比較してアシル化ヒスタミン
のモノクロナール抗体による免疫認識（結合性）のすば
らしい特異性が判明した。
のモノクロナール抗体による免疫認識（結合性）のすば
らしい特異性が判明した。
２）本発明のヒスタミン免疫検定法における優れた感度
が判明した。即ち、アシル化ヒスタミンのＩＣ５０は１
０-9ｍｏｌ／に等しく、それはほぼヒスタミンの０．
１ｎｇ／mlに近い。
が判明した。即ち、アシル化ヒスタミンのＩＣ５０は１
０-9ｍｏｌ／に等しく、それはほぼヒスタミンの０．
１ｎｇ／mlに近い。
上記の説明から、当業者は、本発明によりモノアミンの
発生な免疫検定法を有利に利用することができることは
明らかであり、したがって本発明の方法を実施するのに
利用できる直ちに使える試薬が入った検定用キットを作
ることが可能である。
発生な免疫検定法を有利に利用することができることは
明らかであり、したがって本発明の方法を実施するのに
利用できる直ちに使える試薬が入った検定用キットを作
ることが可能である。
第１図はアシル化及び非アシル化ヒスタミン類似体によ
る放射性トレーサーの置換率曲線である。
る放射性トレーサーの置換率曲線である。
Claims (7)
- 【請求項１】モノアミンを定量的に化学変換させて高分
子量誘導体とし、次いで、この誘導体を、トレーサーと
競合させて、前記誘導体及びトレーサーのすべてと結合
しうる抗体と結合させることからなるモノアミンの免疫
検定法において、 (a)前記アミンを高分子量の誘導体に化学変換させるの
に用いる試薬が、下記式（Ｉ）： Ｒ−ＣＯ−Ｒ′ （Ｉ） 〔式中Ｒは基−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ
Ｏ−ＮＨ２を表わし、Ｒ′はＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド、ハロゲン、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ″および−Ｓ−Ｒ″
（但しＲ″は炭化水素基または基−Ｏ−Ｃ６Ｈ５であ
る）から選択される脱離基を表わす〕で表されるアシル
剤（Ｉ）であり； (b)前記トレーサーが、下記式（II）： Ｘ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ１− （II） （式中、Ｒ１はＲにできる限り類似の構造を有し、かつ
これは放射能標識を付けた基、放射能標識を付けたチロ
シンまたは酵素に結合した基であり、Ｘはモノアミン分
子の残基である）で表され； (c)抗体は、前記のモノアミンの高分子量誘導体及び前
記トレーサーと結合することができ、かつ免疫原性抱合
体型の巨大分子キャリヤーに結合した前記高分子量誘導
体に対して作られなければならない； ことを特徴とする免疫検定法。 - 【請求項２】前記免疫原性抱合体が下記構造式： Ｘ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ２−ＣＯ−ＮＨ−タンパク質 （式中、Ｒ２は試薬（Ｉ）のＲに対して式：−Ｒ＝−Ｒ
２−ＣＯ−ＨＮ２の関係を有する基である）を有する特
許請求の範囲第１項記載の免疫検定法。 - 【請求項３】上記試薬（Ｉ）が下記式： を有する化合物である特許請求の範囲第１項または第２
項記載の免疫検定法。 - 【請求項４】放射性トレーサーが、モノアミンである被
検定分子と、ヨウ素で放射能標識を付けたチロシンから
誘導された試薬との反応によって得られ、かつ下記式： を有する特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか一つ
に記載の免疫検定法。 - 【請求項５】モノアミンがアミノ酸からのモノアミン誘
導体である特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか一
つに記載の免疫検定法。 - 【請求項６】モノアミンがヒスタミンである特許請求の
範囲第５項記載の免疫検定法。 - 【請求項７】放射性トレーサーが、下記式： を有する化合物であるヒスタミンの検定のための特許請
求の範囲第４項、第５項および第６項のいずれか一つに
記載の免疫検定法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8405783 | 1984-04-10 | ||
| FR8405783A FR2562671B1 (fr) | 1984-04-10 | 1984-04-10 | Procede pour le dosage immunologique des monoamines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60237062A JPS60237062A (ja) | 1985-11-25 |
| JPH0654314B2 true JPH0654314B2 (ja) | 1994-07-20 |
Family
ID=9303102
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60075228A Expired - Lifetime JPH0654314B2 (ja) | 1984-04-10 | 1985-04-09 | モノアミンの免疫検定法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4818683A (ja) |
| EP (1) | EP0161195B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0654314B2 (ja) |
| AT (1) | ATE44826T1 (ja) |
| CA (1) | CA1256024A (ja) |
| DE (1) | DE3571697D1 (ja) |
| FR (1) | FR2562671B1 (ja) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0352817A3 (en) * | 1988-07-29 | 1990-04-25 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Monoclonal antibody to catecholamine metabolite and quantitative assay for catecholamine metabolite |
| CA2042295A1 (fr) * | 1990-05-15 | 1991-11-16 | Jacques Chauveau | Derives de mediateurs endogenes, leurs sels, procede de preparation, applications, et compositions les renfermant |
| FR2662082B1 (fr) * | 1990-05-15 | 1994-12-23 | Immunotech Sa | Nouveaux derives de mediateurs endogenes, leurs sels, procede de preparation et applications. |
| DE4025726A1 (de) | 1990-08-14 | 1992-02-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Bestimmung von biogenen aminen |
| US5580769A (en) * | 1991-11-01 | 1996-12-03 | The Regents Of The University Of California | CD8+ cell antiviral factor |
| US5565549A (en) * | 1991-11-01 | 1996-10-15 | The Regents Of The University Of California | CD8+ cell antiviral factor |
| US6616846B2 (en) | 2001-08-28 | 2003-09-09 | Mds (Canada) Inc. | Extraction of phosphonates |
| AT502850B1 (de) * | 2005-11-18 | 2007-08-15 | Albert Dr Missbichler | Verfahren zur bestimmung der aktivität von diaminooxidase |
| DE102011055265A1 (de) | 2010-11-17 | 2012-05-24 | Karl-Heinz Kellner | Automatenfähiger Immunoassay für biogene Amine |
| EP3070475B1 (en) | 2015-03-18 | 2020-02-19 | Karl-Heinz Kellner | In vitro diagnostic, prognosis of contrast induced nephropathy |
| EP4103946B1 (en) | 2020-02-10 | 2024-03-13 | Immundiagnostik AG | In-vitro diagnosis of histamine intolerance syndrome |
| WO2022049213A1 (en) | 2020-09-02 | 2022-03-10 | Immundiagnostik Ag | Test kit and method of determining tryptophan in extracts of faecal samples |
| EP4134672A1 (en) | 2021-08-09 | 2023-02-15 | Immundiagnostik AG | Differential diagnosis of histamine intolerance syndrome |
| WO2023017050A1 (en) | 2021-08-10 | 2023-02-16 | Immundiagnostik Ag | Differential diagnosis of histamine intolerance syndrome |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2372066A (en) * | 1940-12-23 | 1945-03-20 | Parke Davis & Co | Biological product and process of obtaining same |
| GB1341375A (en) * | 1969-11-19 | 1973-12-19 | Smith Kline French Lab | Aminoalkylimidazoles and process for their production |
| US3975342A (en) * | 1972-05-15 | 1976-08-17 | Biological Developments, Inc. | Tyrosyl-class antigenic conjugates, their preparation and antibodies raised thereto |
| US3873697A (en) * | 1972-11-11 | 1975-03-25 | Mack Chem Pharm | Histamine antigen |
| FR2318877A1 (fr) * | 1975-07-23 | 1977-02-18 | Delaage Michel | Procede pour l'obtention de derives succinyles des ecdysones |
| GB1570818A (en) * | 1977-03-30 | 1980-07-09 | Hoffmann La Roche | Assay for catecholamines |
| US4342780A (en) * | 1977-07-11 | 1982-08-03 | Merrell-Toraude Et Cie | Method of depleting endogenous monoamines |
| EP0000938B1 (en) * | 1977-08-22 | 1984-10-17 | National Research Development Corporation | Macromolecular covalent conjugates, methods for preparing and pharmaceutical compositions containing them |
| FR2437398A1 (fr) * | 1978-06-20 | 1980-04-25 | Commissariat Energie Atomique | Compose iode utilisable comme traceur en radio-immunologie |
| US4241177A (en) * | 1978-08-28 | 1980-12-23 | Syva Company | Propanolol antigen conjugates and antibodies |
| US4299813A (en) * | 1979-05-17 | 1981-11-10 | Snyder Solomon H | Assay kit and method |
| US4506009A (en) * | 1982-03-30 | 1985-03-19 | University Of California | Heterogeneous immunoassay method |
| US4472301A (en) * | 1982-05-27 | 1984-09-18 | Miles Laboratories, Inc. | Propranolol immunogen and antibodies |
| US4495281A (en) * | 1982-10-21 | 1985-01-22 | Miles Laboratories, Inc. | Tricyclic antidepressant drug immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives |
| CA1302919C (en) * | 1985-07-03 | 1992-06-09 | Robert T. Buckler | Histamine derivatives, immunogen conjugates and antibodies raised thereto |
-
1984
- 1984-04-10 FR FR8405783A patent/FR2562671B1/fr not_active Expired
-
1985
- 1985-04-02 EP EP85430010A patent/EP0161195B1/fr not_active Expired
- 1985-04-02 DE DE8585430010T patent/DE3571697D1/de not_active Expired
- 1985-04-02 AT AT85430010T patent/ATE44826T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-04-04 CA CA000478455A patent/CA1256024A/en not_active Expired
- 1985-04-09 JP JP60075228A patent/JPH0654314B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-08-06 US US07/083,899 patent/US4818683A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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|---|---|
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| JPS60237062A (ja) | 1985-11-25 |
| FR2562671B1 (fr) | 1986-07-25 |
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