CN112649601A - 一种酶标偶联二抗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶标偶联二抗,所述酶标偶联二抗是由经修饰的抗体与经修饰的标记酶二者之间以肟键偶联连接;所述经修饰的抗体为抗体赖氨酸残基的氨基被修饰连接氨基氧基,所述经修饰的标记酶为酶分子的赖氨酸残基的氨基被修饰连接芳基醛。本发明的酶标偶联二抗其结构稳定,大小适中,灵敏度高、特异性好,不会因生物体组织自身存在的生物素的干扰而出现非特异性染色,其结构大小适中,尤其适于对一些细胞核内抗原的检测,具有非常高的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及酶标抗体技术领域,尤其涉及一种酶标偶联二抗及其制备方法。
背景技术
免疫分析是一种基于“抗原-抗体特异性结合”的原理,对生物样品内的蛋白质进行检测继而可定性定量分析的方法,具有灵敏度高和特异性强等优点。酶标二抗在免疫分析中的应用尤为广泛,主要包括免疫组织化学(IHC),酶联免疫吸附(ELISA),蛋白免疫印迹(WB)等。
(1)目前市场上的酶标二抗主要有以下三种:1)抗体—酶直接标记法,即通过小分子试剂直接将单个的二抗和HRP酶进行偶联标记。由于标记酶通常体积较大,而抗体表面积和官能团数量有限,因此,每个抗体只能标记非常有限个数的酶分子,容易造成检测灵敏度不足或者抗体特异性降低等问题。2)利用生物素-亲合素放大法,生物素为有机小分子,体积较小,可以较多的标记于二抗分子上且对抗体的特异性和亲和力影响较小,利用生物素与亲合素之间的高亲和力,可以将标有生物素的二抗与标有亲合素的酶分子结合,形成复合物。此方法可大大提高检测的灵敏度,但由于生物体组织自身普遍存在生物素,因此极易出现非特异性染色,对实验结果造成大的干扰。3)链式高分子—酶—抗体聚合物,此方法利用亲水性的链式高分子(比如葡聚糖,多聚赖氨酸多肽等)的链式结构可以先将酶分子标记在其骨架上,然后再与二抗分子连接。这样可以减少标记酶对抗体特异性和亲和力的影响,提高检测灵敏度。然而该方法也存在一定的缺点,链式高分子—酶—抗体聚合物整体结构较为松散、体积较大,进入细胞核膜时具有一定的阻力,对检测一些细胞核内抗原的灵敏度不够。因此,获得一种稳定性好,特异性强,灵敏度高的酶标二抗具有十分重要的意义。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足,本发明提供一种酶标偶联二抗,其结构稳定,大小适中,灵敏度高、特异性好,不会因生物体组织自身存在的生物素的干扰而出现非特异性染色,其结构大小适中,尤其适于对一些细胞核内抗原的检测,具有非常高的灵敏度。
(二)技术方案
为了达到上述目的,本发明采用的主要技术方案包括:
第一方面,本发明提供一种酶标偶联二抗,是由经修饰的抗体与经修饰的标记酶二者之间以肟键偶联连接;所述经修饰的抗体为抗体赖氨酸残基的氨基被修饰连接氨基氧基,所述经修饰的标记酶为酶分子的赖氨酸残基被修饰使酶分子变为芳基醛。
根据本发明较佳实施例,所述抗体为羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、驴抗羊IgG、马抗羊IgG、鼠抗羊、兔抗羊IgG、马抗羊IgG、马抗兔IgG、马抗鼠IgG中的任一种。
根据本发明较佳实施例,所述标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
第二方面,本发明提供一种酶标偶联二抗的制备方法,其包括:
S1:对抗体进行修饰,使抗体赖氨酸残基的氨基被修饰连接氨基氧基;
S2:对标记酶进行修饰,使酶分子的赖氨酸残基的氨基被修饰连接芳基醛;
S3:在弱酸性水溶液中,经修饰的标记酶所含的芳基醛与经修饰的抗体所含的氨基氧基发生缩合反应形成肟键,得到以稳定的肟键连接的酶标偶联二抗。
根据本发明的较佳实施,S3中,加入苯胺作为催化剂,催化肟键生成。S1和S2中修饰成功与否可通过凝胶层析柱判断,分子量变大表示在抗体或标记酶上引入了相应的基团。
根据本发明的较佳实施,S1中,对抗体采用式(I)结构的化合物进行修饰,其中,n=4-16的整数;S2中,对标记酶采用式(II)结构的化合物进行修饰,其中m=4-16的整数;
根据本发明的较佳实施,S1中,上述结构式中n可以取12,对抗体的修饰方法如下:
(1)将抗体溶解于pH 7-7.5的磷酸盐缓冲液中,得到5-10mg/ml的抗体溶液,将邻苯二甲酰亚胺氧基-十二聚乙二醇-NHS-酯溶解于DMSO,得到5-15mg/ml的修饰溶液;
(2)将抗体溶液与修饰溶液按照抗体与邻苯二甲酰亚胺氧基-十二聚乙二醇-NHS-酯的摩尔比为1:8-12进行混合反应;
(3)反应结束后,将反应体系中的缓冲液用50K超滤管置换为pH5.5-6的磷酸盐缓冲液,得到邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体的溶液;
(4)向邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体的溶液中加入肼(N2H4),溶解混匀,室温孵育过夜,去除修饰位点氨基氧基末端的邻苯二甲酰亚胺基;采用脱盐柱,通过透析或分子排阻色谱法纯化,得到氨基氧基修饰的抗体的溶液。
根据本发明较佳实施例,步骤(3)中,还包括使用脱盐柱,通过透析或分子排阻色谱纯化邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体;透析或色谱法纯化时,采用0.1M醋酸钠、0.15MNaCl,pH5.5-6的结合缓冲液作为透析或色谱溶液。
根据本发明较佳实施例,步骤(4)中,透析或色谱法纯化时,采用0.1M醋酸钠、0.15M NaCl,pH5.5-6的结合缓冲液作为透析或色谱溶液。纯化后,使用离心浓缩器,将氨基氧基修饰的抗体的溶液浓缩至预定体积。
根据本发明的较佳实施,S2中,上述结构式中m可以取12,对标记酶的修饰方法如下:
(1)将标记酶溶解于pH 7-7.5的磷酸盐缓冲液中,得到5-15mg/ml的标记酶溶液,将4-甲酰-苯甲酰胺-十二聚乙二醇-TFP酯溶解于DMSO,得到5-15mg/ml的修饰溶液;
(2)将标记酶溶液与修饰溶液按照抗体与4-甲酰-苯甲酰胺-十二聚乙二醇-TFP酯的摩尔比为1:8-12进行混合反应;
(3)反应结束后,将反应体系中的缓冲液用50K超滤管置换为pH5.5-6的磷酸盐缓冲液,得到酶分子赖氨酸残基被修饰的芳基醛化合物的溶液。
根据本发明较佳实施例,步骤(3)中,还包括使用脱盐柱,通过透析或分子排阻色谱纯化酶分子赖氨酸残基被修饰的芳基醛化合物;透析或色谱法纯化时,采用0.1M醋酸钠、0.15M NaCl,pH 5.5-6的结合缓冲液作为透析或色谱溶液。
根据本发明的较佳实施,S3的反应过程为:将S1制备的氨基氧基修饰的抗体的溶液和S2制备的酶分子赖氨酸残基被修饰的芳基醛化合物的溶液按照摩尔比1:4~15进行偶联反应,反应过程中添加反应体系总体积8-12%的苯胺为催化剂,室温震荡反应后,再于2-8℃反应12-14h,使用凝胶过滤层析柱进行分离纯化,收集第一个出峰,即为酶标偶联二抗。在加入苯胺为催化剂时,可加快反应速度。
收集后,使用50k超滤管浓缩,添加1%BSA及0.05%Proclin300,保存,备用。
根据本发明较佳实施例,所述抗体为羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、驴抗羊IgG、马抗羊IgG、鼠抗羊、兔抗羊IgG、马抗羊IgG、马抗兔IgG、马抗鼠IgG中的任一种;所述标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
(三)有益效果
本发明的酶标偶联二抗,是利用异(基)双功能试剂,分别对抗体的赖氨酸和标记酶的赖氨酸残基进行修饰,分别在抗体和标记酶上创造(对原有基团改造)或引入(连接外源基团)一个新的反应基团,当抗体和标记酶混合时,借助所述新的反应基团之间发生的缩合键接反应,从而形成异二聚体结合物(即标记酶偶联抗体)。利用此方法得到的酶标二抗大小适中,结构稳定,灵敏度高、特异性好。
本发明可以方便地利用异(基)双功能试剂的分子链中所含PEG长度(m,n的取值)来调节酶标偶联抗体的分子结构大小,以满足进入细胞核膜或其他特殊环境的要求。
附图说明
图1为将本发明的酶标偶联羊抗鼠抗体分别放置于4℃和37℃六周后进行免疫组化检测的效果图,二者都能清楚有效的检测出目的抗原。
图2为使用本发明酶标偶联羊抗鼠抗体(4μg/ml)和市购酶标羊抗鼠抗体(8μg/ml)在相同操作条件下进行免疫组化检测的染色强度比较图。
图3为使用本发明酶标偶联羊抗兔抗体(6μg/ml)和市购酶标二抗(20μg/ml)在相同操作条件下进行细胞核类抗原检测的染色强度比较图。
图4为本发明较佳实施例中抗体的修饰过程的表达图。
图5为本发明较佳实施例中标记酶的修饰过程的表达图。
图6为被修饰的抗体与被修饰的标记酶以肟键偶联连接的表达图。
具体实施方式
实施例1
本实施例制备酶标偶联羊抗鼠抗体,按照如下方法制备:
(1)抗体的修饰;其修饰方法如下:
①将羊抗鼠IgG在室温下溶解于0.1M磷酸钠,0.15M NaCl,pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液中,浓度为5mg/ml。
④反应结束后,将上述反应体系的缓冲液用50k超滤管置换为0.1M磷酸钠,0.15MNaCl,pH5.5的磷酸盐缓冲溶液。
⑤采用5mL脱盐柱,通过透析或分子排阻色谱纯化,得到邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体的溶液。其中,使用0.1M醋酸钠、0.15M NaCl,pH 5.5的结合缓冲液作为透析或色谱溶液。
⑥在通风橱中,穿戴合适的个人防护装备的同时,向邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体的溶液中加入3.1μL肼(Sigma,53847),混匀至溶解。
⑦室温孵育过夜,去除修饰位点氨基氧基末端的邻苯二甲酰亚胺基。
⑧采用5mL脱盐柱,通过透析或分子排阻色谱法纯化,得氨基氧修饰的抗体的溶液。其中,使用0.1M醋酸钠、0.15M NaCl,pH 5.5(结合缓冲液)作为透析或色谱溶液。
⑨使用离心浓缩器将氨基氧修饰的抗体的溶液浓缩至约200μL。
抗体的修饰过程参见图4。
(2)标记酶的修饰;其修饰方法如下:
①将辣根过氧化物酶在室温下溶解于0.1M磷酸钠,0.15M NaCl,pH7.5的磷酸盐缓冲溶液中,浓度为10mg/ml。
④反应结束后,将反应体系的缓冲液用50k超滤管置换为0.1M磷酸钠,0.15MNaCl,pH5.5的磷酸盐缓冲溶液。
⑤使用5mL脱盐柱,通过透析或分子排阻色谱纯化修饰后的标记酶。其中,使用0.1M醋酸钠、0.15M NaCl,pH 5.5结合缓冲液作为透析或色谱溶液。
标记酶的修饰过程参见图5。
(3)修饰后的抗体和标记酶偶联以及纯化,方法如下:
①确保抗体和标记酶的缓冲液都为0.1M磷酸钠,0.15M NaCl,pH5.5的磷酸盐缓冲溶液,将经修饰后的抗体溶液和标记酶溶液按照摩尔比1:8进行偶联反应,添加反应体系总体积10%的苯胺作为催化剂,室温震荡2h,2-8℃过夜(>12h,<24h)。
②使用Superdex200凝胶过滤层析柱进行分离纯化,收集第一个峰。
③收集后,使用50k超滤管进行浓缩,添加1%BSA及0.05%Proclin300即为酶标偶联羊抗鼠抗体。
抗体和标记酶偶联过程参见图6。
对上述制备的酶标偶联羊抗鼠抗体进行热稳定性和免疫组化检测灵敏度进行验证,包括:
(1)热稳定性实验
将酶标偶联羊抗鼠抗体配置成4μg/ml浓度,分别放置于4℃和37℃,六周后取出进行免疫组化检测。
如图1所示,为将相同浓度的酶标偶联羊抗鼠抗体分别放置于4℃和37℃六周后进行免疫组化检测(其他试剂,步骤均一致),实验结果表明二者都能清楚有效的检测出目的抗原,表明该抗体的热稳定较好。
(2)免疫组化检测性能实验
①样本切片准备:将经福尔马林固定石蜡包埋后的组织切片于60℃恒温箱中烤片2h,保存备用。
②切片脱蜡:石蜡切片先置于新鲜二甲苯中进行脱蜡,浸泡2次,每次10min;
③切片水化:依次经过无水乙醇,无水乙醇,95%乙醇,85%乙醇,70%乙醇浸泡5分钟进行水化,后纯化水冲洗2次,每次3min。
④抗原修复:推荐使用高温热修复法修复3min(如果使用自动修复仪可设置98℃高温修复20min),切片自然冷却至室温后用免疫组化笔将待测组织圈起来,纯化水冲洗2次,每次3min。
⑤内源性过氧化物酶灭活:滴适量内源性过氧化物酶阻断剂完全覆盖组织,室温孵育10min后,纯化水冲洗2次,每次3min,PBST冲洗一次。
⑥一抗及空白对照抗体孵育:分别加入100ul的E-Cadherin抗体和空白对照抗体完全覆盖组织,置于37℃恒温箱中孵育1h,PBST冲洗3次,每次5min。
⑦二抗孵育:依照所用二抗染色系统DAB染色液试剂盒的说明书进行二抗孵育,孵育完毕后PBST冲洗片3次,每次5min,纯化水冲洗1次。
⑧DAB显色:依照所用DAB染色液试剂盒说明书进行配制DAB显色液,滴适量配制好的DAB显色液至完全覆盖组织,待颜色无加深终止染色,纯化水冲洗3次。
⑨苏木素复染:依照苏木素厂家说明书操作步骤及建议对切片进行复染,PBST或自来水冲洗返蓝。
⑩脱水透明:依次浸泡70%,85%,95%,100%,100%梯度酒精,每次3min;2次二甲苯透明,每次5min。
如图2所示,使用酶标偶联羊抗鼠抗体(4μg/ml)进行免疫组化检测染色强度明显高于市面上购买的酶标羊抗鼠抗体(8μg/ml),表明本发明酶标偶联羊抗鼠抗体具有更高的灵敏度。
实施例2
本实施例制备酶标偶联羊抗兔抗体,按照如下方法制备:
(1)抗体的修饰;其修饰方法如下:
①将羊抗兔IgG在室温下溶解于0.1M磷酸钠,0.15M NaCl,pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液中,浓度为10mg/ml。
④反应结束后,将上述反应体系的缓冲液用50k超滤管置换为0.1M磷酸钠,0.15MNaCl,pH5.5的磷酸盐缓冲溶液,得到邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体的溶液。
⑤在通风橱中,穿戴合适的个人防护装备的同时,向邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体的溶液中加入3.0μL肼(Sigma,53847),混匀至溶解。
⑥室温孵育过夜,去除修饰位点氨基氧基末端的邻苯二甲酰亚胺基。
⑦采用5mL脱盐柱,通过透析或分子排阻色谱法纯化,得氨基氧修饰的抗体的溶液。其中,使用0.1M醋酸钠、0.15M NaCl,pH 5.5(结合缓冲液)作为透析或色谱溶液。
⑧使用离心浓缩器将氨基氧修饰的抗体的溶液浓缩至约200μL。
抗体的修饰过程可参见图4。
(2)标记酶的修饰;其修饰方法如下:
①将辣根过氧化物酶在室温下溶解于0.1M磷酸钠,0.15M NaCl,pH7.5的磷酸盐缓冲溶液中,浓度为10mg/ml。
④反应结束后,将反应体系的缓冲液用50k超滤管置换为0.1M磷酸钠,0.15MNaCl,pH5.5的磷酸盐缓冲溶液。
⑤使用5mL脱盐柱,通过透析或分子排阻色谱纯化修饰后的标记酶。其中,使用0.1M醋酸钠、0.15M NaCl,pH 5.5结合缓冲液作为透析或色谱溶液。
标记酶的修饰过程可参见图5。
(3)修饰后的抗体和标记酶偶联以及纯化,方法如下:
①确保抗体和标记酶的缓冲液都为0.1M磷酸钠,0.15M NaCl,pH5.5的磷酸盐缓冲溶液,将经修饰后的抗体溶液和标记酶溶液按照摩尔比1:10进行偶联反应,添加反应体系总体积10%的苯胺作为催化剂,室温震荡2h,2-8℃过夜(>12h,<24h)。抗体和标记酶偶联过程可参见图6。
②使用Superdex200凝胶过滤层析柱进行分离纯化,收集第一个峰。
③收集后,使用50k超滤管进行浓缩,添加1%BSA及0.05%Proclin300即为酶标偶联羊抗兔抗体。
对上述制备的酶标偶联羊抗兔抗体对细胞核类抗原进行免疫组化检测实验。
①样本切片准备:将经福尔马林固定石蜡包埋后的组织切片于60℃恒温箱中烤片2h,保存备用。
②切片脱蜡:石蜡切片先置于新鲜二甲苯中进行脱蜡,浸泡2次,每次10min;
③切片水化:依次经过无水乙醇,无水乙醇,95%乙醇,85%乙醇,70%乙醇浸泡5分钟进行水化,后纯化水冲洗2次,每次3min。
④抗原修复:推荐使用高温热修复法修复3min(如果使用自动修复仪可设置98℃高温修复20min),切片自然冷却至室温后用免疫组化笔将待测组织圈起来,纯化水冲洗2次,每次3min。
⑤内源性过氧化物酶灭活:滴适量内源性过氧化物酶阻断剂完全覆盖组织,室温孵育10min后,纯化水冲洗2次,每次3min,PBST冲洗一次。
⑥一抗及空白对照抗体孵育:分别加入100ul的MLH1抗体和空白对照抗体完全覆盖组织,置于37℃恒温箱中孵育1h,PBST冲洗3次,每次5min。
⑦二抗孵育:依照所用二抗染色系统DAB染色液试剂盒的说明书进行二抗孵育,孵育完毕后PBST冲洗片3次,每次5min,纯化水冲洗1次。
⑧DAB显色:依照所用DAB染色液试剂盒说明书进行配制DAB显色液,滴适量配制好的DAB显色液至完全覆盖组织,待颜色无加深终止染色,纯化水冲洗3次。
⑨苏木素复染:依照苏木素厂家说明书操作步骤及建议对切片进行复染,PBST或自来水冲洗返蓝。
⑩脱水透明:依次浸泡70%,85%,95%,100%,100%梯度酒精,每次3min;2次二甲苯透明,每次5min。
如图3所示,在相同操作下使用本发明酶标偶联羊抗兔抗体(6μg/ml)对细胞核类抗原进行免疫组化检测,能够很清晰的检测出细胞核的染色,与市面上购买酶标二抗(20μg/ml)染色强度相比几乎无差。本发明在抗体浓度仅为对照酶标二抗浓度1/3的情况下,表现出几乎无差异的染色强度,表明本发明酶标偶联羊抗兔抗体对检测细胞核类抗原具有更高的灵敏度。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种酶标偶联二抗,其特征在于,所述酶标偶联二抗是由经修饰的抗体与经修饰的标记酶二者之间以肟键偶联连接;所述经修饰的抗体为抗体赖氨酸残基的氨基被修饰连接氨基氧基,所述经修饰的标记酶为酶分子的赖氨酸残基被修饰使酶分子变为芳基醛。
2.根据权利要求1所述的酶标偶联二抗,其特征在于,所述抗体为羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、驴抗羊IgG、马抗羊IgG、鼠抗羊、兔抗羊IgG、马抗羊IgG、马抗兔IgG、马抗鼠IgG中的任一种。
3.根据权利要求1所述的酶标偶联二抗,其特征在于,所述标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
4.一种酶标偶联二抗的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1:对抗体进行修饰,使抗体赖氨酸残基的氨基被修饰连接氨基氧基;
S2:对标记酶进行修饰,使酶分子的赖氨酸残基的氨基被修饰连接芳基醛;
S3:在弱酸性水溶液中,经修饰的标记酶所含的芳基醛与经修饰的抗体所含的氨基氧基发生缩合反应形成肟键,得到以稳定的肟键连接的酶标偶联二抗。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,S3中,加入苯胺作为催化剂,催化肟键生成。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,S1中,对抗体的修饰方法如下:
(1)将抗体溶解于pH 7-7.5的磷酸盐缓冲液中,得到5-10mg/ml的抗体溶液,将邻苯二甲酰亚胺氧基-十二聚乙二醇-NHS-酯溶解于DMSO,得到5-15mg/ml的修饰溶液;
(2)将抗体溶液与修饰溶液按照抗体与邻苯二甲酰亚胺氧基-十二聚乙二醇-NHS-酯的摩尔比为1:8-12进行混合反应;
(3)反应结束后,将反应体系中的缓冲液用50K超滤管置换为pH5.5-6的磷酸盐缓冲液,得到邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体的溶液;
(4)向邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体的溶液中加入肼(N2H4),溶解混匀,室温孵育过夜,去除修饰位点氨基氧基末端的邻苯二甲酰亚胺基;然后,采用脱盐柱,通过透析或分子排阻色谱法纯化,得到氨基氧基修饰的抗体的溶液。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,S2中,对标记酶的修饰方法如下:
(1)将标记酶溶解于pH 7-7.5的磷酸盐缓冲液中,得到5-15mg/ml的标记酶溶液,将4-甲酰-苯甲酰胺-十二聚乙二醇-TFP酯溶解于DMSO,得到5-15mg/ml的修饰溶液;
(2)将标记酶溶液与修饰溶液按照抗体与4-甲酰-苯甲酰胺-十二聚乙二醇-TFP酯的摩尔比为1:8-12进行混合反应;
(3)反应结束后,将反应体系中的缓冲液用50K超滤管置换为pH5.5-6的磷酸盐缓冲液,得到酶分子赖氨酸残基被修饰的芳基醛化合物的溶液。
9.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,S3的反应过程为:将S1制备的氨基氧基修饰的抗体的溶液和S2制备的酶分子赖氨酸残基被修饰的芳基醛化合物的溶液按照摩尔比1:4~15进行偶联反应,在弱酸性条件下,添加反应体系总体积8-12%的苯胺为催化剂,室温震荡反应后,再于2-8℃反应12-14h,使用凝胶过滤层析柱进行分离纯化,收集第一个出峰,即为酶标偶联二抗。
10.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述抗体为羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、驴抗羊IgG、马抗羊IgG、鼠抗羊、兔抗羊IgG、马抗羊IgG、马抗兔IgG、马抗鼠IgG中的任一种;所述标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
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