CN112649601A - 一种酶标偶联二抗及其制备方法 - Google Patents
一种酶标偶联二抗及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112649601A CN112649601A CN202110064811.8A CN202110064811A CN112649601A CN 112649601 A CN112649601 A CN 112649601A CN 202110064811 A CN202110064811 A CN 202110064811A CN 112649601 A CN112649601 A CN 112649601A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- enzyme
- modified
- solution
- labeled
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 112
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 112
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 6
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 17
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 15
- -1 aryl aldehyde Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 125000002344 aminooxy group Chemical group [H]N([H])O[*] 0.000 claims abstract description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 63
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 38
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 21
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 21
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 20
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 18
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 17
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 11
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 10
- 238000011033 desalting Methods 0.000 claims description 9
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 4
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 claims description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 125000005543 phthalimide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 4
- SNYAHKMHEROASO-UHFFFAOYSA-N [O].C1(C=2C(C(N1)=O)=CC=CC2)=O Chemical compound [O].C1(C=2C(C(N1)=O)=CC=CC2)=O SNYAHKMHEROASO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 2
- XKJCHHZQLQNZHY-UHFFFAOYSA-N phthalimide Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NC(=O)C2=C1 XKJCHHZQLQNZHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 15
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 abstract description 12
- 238000010186 staining Methods 0.000 abstract description 12
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 abstract description 9
- 230000008878 coupling Effects 0.000 abstract description 8
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 abstract description 6
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 abstract description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 abstract description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 6
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 abstract description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 36
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 10
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 10
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 10
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 8
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 8
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 6
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 6
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 5
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- YLFIGGHWWPSIEG-UHFFFAOYSA-N aminoxyl Chemical group [O]N YLFIGGHWWPSIEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 4
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 4
- HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N benzenecarboxaldehyde Natural products O=CC1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- GHPSCBAZRWEYJT-UHFFFAOYSA-N Sappanin Natural products OC1=CC(O)=CC=C1C1=CC=C(O)C(O)=C1 GHPSCBAZRWEYJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 230000000887 hydrating effect Effects 0.000 description 2
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 2
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N para-ethylbenzaldehyde Natural products CCC1=CC=C(C=O)C=C1 QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000013609 MutL Protein Homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010026664 MutL Protein Homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 1
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000036632 reaction speed Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种酶标偶联二抗，所述酶标偶联二抗是由经修饰的抗体与经修饰的标记酶二者之间以肟键偶联连接；所述经修饰的抗体为抗体赖氨酸残基的氨基被修饰连接氨基氧基，所述经修饰的标记酶为酶分子的赖氨酸残基的氨基被修饰连接芳基醛。本发明的酶标偶联二抗其结构稳定，大小适中，灵敏度高、特异性好，不会因生物体组织自身存在的生物素的干扰而出现非特异性染色，其结构大小适中，尤其适于对一些细胞核内抗原的检测，具有非常高的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及酶标抗体技术领域，尤其涉及一种酶标偶联二抗及其制备方法。
背景技术
免疫分析是一种基于“抗原-抗体特异性结合”的原理，对生物样品内的蛋白质进行检测继而可定性定量分析的方法，具有灵敏度高和特异性强等优点。酶标二抗在免疫分析中的应用尤为广泛，主要包括免疫组织化学(IHC)，酶联免疫吸附(ELISA)，蛋白免疫印迹(WB)等。
(1)目前市场上的酶标二抗主要有以下三种：1)抗体—酶直接标记法，即通过小分子试剂直接将单个的二抗和HRP酶进行偶联标记。由于标记酶通常体积较大，而抗体表面积和官能团数量有限，因此，每个抗体只能标记非常有限个数的酶分子，容易造成检测灵敏度不足或者抗体特异性降低等问题。2)利用生物素-亲合素放大法，生物素为有机小分子，体积较小，可以较多的标记于二抗分子上且对抗体的特异性和亲和力影响较小，利用生物素与亲合素之间的高亲和力，可以将标有生物素的二抗与标有亲合素的酶分子结合，形成复合物。此方法可大大提高检测的灵敏度，但由于生物体组织自身普遍存在生物素，因此极易出现非特异性染色，对实验结果造成大的干扰。3)链式高分子—酶—抗体聚合物，此方法利用亲水性的链式高分子(比如葡聚糖，多聚赖氨酸多肽等)的链式结构可以先将酶分子标记在其骨架上，然后再与二抗分子连接。这样可以减少标记酶对抗体特异性和亲和力的影响，提高检测灵敏度。然而该方法也存在一定的缺点，链式高分子—酶—抗体聚合物整体结构较为松散、体积较大，进入细胞核膜时具有一定的阻力，对检测一些细胞核内抗原的灵敏度不够。因此，获得一种稳定性好，特异性强，灵敏度高的酶标二抗具有十分重要的意义。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种酶标偶联二抗，其结构稳定，大小适中，灵敏度高、特异性好，不会因生物体组织自身存在的生物素的干扰而出现非特异性染色，其结构大小适中，尤其适于对一些细胞核内抗原的检测，具有非常高的灵敏度。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明提供一种酶标偶联二抗，是由经修饰的抗体与经修饰的标记酶二者之间以肟键偶联连接；所述经修饰的抗体为抗体赖氨酸残基的氨基被修饰连接氨基氧基，所述经修饰的标记酶为酶分子的赖氨酸残基被修饰使酶分子变为芳基醛。
根据本发明较佳实施例，所述抗体为羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、驴抗羊IgG、马抗羊IgG、鼠抗羊、兔抗羊IgG、马抗羊IgG、马抗兔IgG、马抗鼠IgG中的任一种。
根据本发明较佳实施例，所述标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
第二方面，本发明提供一种酶标偶联二抗的制备方法，其包括：
S1:对抗体进行修饰，使抗体赖氨酸残基的氨基被修饰连接氨基氧基；
S2:对标记酶进行修饰，使酶分子的赖氨酸残基的氨基被修饰连接芳基醛；
S3:在弱酸性水溶液中，经修饰的标记酶所含的芳基醛与经修饰的抗体所含的氨基氧基发生缩合反应形成肟键，得到以稳定的肟键连接的酶标偶联二抗。
根据本发明的较佳实施，S3中，加入苯胺作为催化剂，催化肟键生成。S1和S2中修饰成功与否可通过凝胶层析柱判断，分子量变大表示在抗体或标记酶上引入了相应的基团。
根据本发明的较佳实施，S1中，对抗体采用式(I)结构的化合物进行修饰，其中，n＝4-16的整数；S2中，对标记酶采用式(II)结构的化合物进行修饰，其中m＝4-16的整数；
根据本发明的较佳实施，S1中，上述结构式中n可以取12，对抗体的修饰方法如下：
(1)将抗体溶解于pH 7-7.5的磷酸盐缓冲液中，得到5-10mg/ml的抗体溶液，将邻苯二甲酰亚胺氧基-十二聚乙二醇-NHS-酯溶解于DMSO，得到5-15mg/ml的修饰溶液；
(2)将抗体溶液与修饰溶液按照抗体与邻苯二甲酰亚胺氧基-十二聚乙二醇-NHS-酯的摩尔比为1:8-12进行混合反应；
(3)反应结束后，将反应体系中的缓冲液用50K超滤管置换为pH5.5-6的磷酸盐缓冲液，得到邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体的溶液；
(4)向邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体的溶液中加入肼(N2H4)，溶解混匀，室温孵育过夜，去除修饰位点氨基氧基末端的邻苯二甲酰亚胺基；采用脱盐柱，通过透析或分子排阻色谱法纯化，得到氨基氧基修饰的抗体的溶液。
根据本发明较佳实施例，步骤(3)中，还包括使用脱盐柱，通过透析或分子排阻色谱纯化邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体；透析或色谱法纯化时，采用0.1M醋酸钠、0.15MNaCl，pH5.5-6的结合缓冲液作为透析或色谱溶液。
根据本发明较佳实施例，步骤(4)中，透析或色谱法纯化时，采用0.1M醋酸钠、0.15M NaCl，pH5.5-6的结合缓冲液作为透析或色谱溶液。纯化后，使用离心浓缩器，将氨基氧基修饰的抗体的溶液浓缩至预定体积。
根据本发明的较佳实施，S2中，上述结构式中m可以取12，对标记酶的修饰方法如下：
(1)将标记酶溶解于pH 7-7.5的磷酸盐缓冲液中，得到5-15mg/ml的标记酶溶液，将4-甲酰-苯甲酰胺-十二聚乙二醇-TFP酯溶解于DMSO，得到5-15mg/ml的修饰溶液；
(2)将标记酶溶液与修饰溶液按照抗体与4-甲酰-苯甲酰胺-十二聚乙二醇-TFP酯的摩尔比为1:8-12进行混合反应；
(3)反应结束后，将反应体系中的缓冲液用50K超滤管置换为pH5.5-6的磷酸盐缓冲液，得到酶分子赖氨酸残基被修饰的芳基醛化合物的溶液。
根据本发明较佳实施例，步骤(3)中，还包括使用脱盐柱，通过透析或分子排阻色谱纯化酶分子赖氨酸残基被修饰的芳基醛化合物；透析或色谱法纯化时，采用0.1M醋酸钠、0.15M NaCl，pH 5.5-6的结合缓冲液作为透析或色谱溶液。
根据本发明的较佳实施，S3的反应过程为：将S1制备的氨基氧基修饰的抗体的溶液和S2制备的酶分子赖氨酸残基被修饰的芳基醛化合物的溶液按照摩尔比1:4～15进行偶联反应，反应过程中添加反应体系总体积8-12％的苯胺为催化剂，室温震荡反应后，再于2-8℃反应12-14h，使用凝胶过滤层析柱进行分离纯化，收集第一个出峰，即为酶标偶联二抗。在加入苯胺为催化剂时，可加快反应速度。
收集后，使用50k超滤管浓缩，添加1％BSA及0.05％Proclin300，保存，备用。
根据本发明较佳实施例，所述抗体为羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、驴抗羊IgG、马抗羊IgG、鼠抗羊、兔抗羊IgG、马抗羊IgG、马抗兔IgG、马抗鼠IgG中的任一种；所述标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
(三)有益效果
本发明的酶标偶联二抗，是利用异(基)双功能试剂，分别对抗体的赖氨酸和标记酶的赖氨酸残基进行修饰，分别在抗体和标记酶上创造(对原有基团改造)或引入(连接外源基团)一个新的反应基团，当抗体和标记酶混合时，借助所述新的反应基团之间发生的缩合键接反应，从而形成异二聚体结合物(即标记酶偶联抗体)。利用此方法得到的酶标二抗大小适中，结构稳定，灵敏度高、特异性好。
本发明可以方便地利用异(基)双功能试剂的分子链中所含PEG长度(m,n的取值)来调节酶标偶联抗体的分子结构大小，以满足进入细胞核膜或其他特殊环境的要求。
具体地，在本申请中，利用
12-NHS ester修饰抗体，使抗体的赖氨酸残基上的氨基变为氨基氧基，再利用
12-TFP ester修饰标记酶分子，使酶分子被修饰成苯基醛化合物，然后在弱酸性条件下，氨基氧基与苯基醛缩合脱去1分子水形成稳定的肟键，通过该肟键将标记酶分子和抗体连接，得到酶标偶联二抗。所述酶标偶联二抗表现出更好的稳定性以及更高的灵敏度。
附图说明
图1为将本发明的酶标偶联羊抗鼠抗体分别放置于4℃和37℃六周后进行免疫组化检测的效果图，二者都能清楚有效的检测出目的抗原。
图2为使用本发明酶标偶联羊抗鼠抗体(4μg/ml)和市购酶标羊抗鼠抗体(8μg/ml)在相同操作条件下进行免疫组化检测的染色强度比较图。
图3为使用本发明酶标偶联羊抗兔抗体(6μg/ml)和市购酶标二抗(20μg/ml)在相同操作条件下进行细胞核类抗原检测的染色强度比较图。
图4为本发明较佳实施例中抗体的修饰过程的表达图。
图5为本发明较佳实施例中标记酶的修饰过程的表达图。
图6为被修饰的抗体与被修饰的标记酶以肟键偶联连接的表达图。
具体实施方式
实施例1
本实施例制备酶标偶联羊抗鼠抗体，按照如下方法制备：
(1)抗体的修饰；其修饰方法如下：
①将羊抗鼠IgG在室温下溶解于0.1M磷酸钠，0.15M NaCl，pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液中，浓度为5mg/ml。
②将
12-NHS ester在室温下溶解于DMSO中，制备浓度为10mg/ml的反应修饰液。注意使用通风橱处理有机溶剂。
③按照羊抗鼠IgG与
12-NHS ester的摩尔比为1:10的比例进行抗体修饰，室温下反应30分钟。
④反应结束后，将上述反应体系的缓冲液用50k超滤管置换为0.1M磷酸钠，0.15MNaCl，pH5.5的磷酸盐缓冲溶液。
⑤采用5mL脱盐柱，通过透析或分子排阻色谱纯化，得到邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体的溶液。其中，使用0.1M醋酸钠、0.15M NaCl，pH 5.5的结合缓冲液作为透析或色谱溶液。
⑥在通风橱中，穿戴合适的个人防护装备的同时，向邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体的溶液中加入3.1μL肼(Sigma，53847),混匀至溶解。
⑦室温孵育过夜，去除修饰位点氨基氧基末端的邻苯二甲酰亚胺基。
⑧采用5mL脱盐柱，通过透析或分子排阻色谱法纯化，得氨基氧修饰的抗体的溶液。其中，使用0.1M醋酸钠、0.15M NaCl，pH 5.5(结合缓冲液)作为透析或色谱溶液。
⑨使用离心浓缩器将氨基氧修饰的抗体的溶液浓缩至约200μL。
抗体的修饰过程参见图4。
(2)标记酶的修饰；其修饰方法如下：
①将辣根过氧化物酶在室温下溶解于0.1M磷酸钠，0.15M NaCl，pH7.5的磷酸盐缓冲溶液中，浓度为10mg/ml。
②将
12-TFP ester在室温下溶解于DMSO中，制备浓度为10mg/ml的反应修饰液。注意使用通风橱处理有机溶剂。
③按照辣根过氧化物酶与
12-TFP ester的摩尔比为1:10的比例进行抗体修饰，室温反应30分钟。
④反应结束后，将反应体系的缓冲液用50k超滤管置换为0.1M磷酸钠，0.15MNaCl，pH5.5的磷酸盐缓冲溶液。
⑤使用5mL脱盐柱，通过透析或分子排阻色谱纯化修饰后的标记酶。其中，使用0.1M醋酸钠、0.15M NaCl，pH 5.5结合缓冲液作为透析或色谱溶液。
标记酶的修饰过程参见图5。
(3)修饰后的抗体和标记酶偶联以及纯化，方法如下：
①确保抗体和标记酶的缓冲液都为0.1M磷酸钠，0.15M NaCl，pH5.5的磷酸盐缓冲溶液，将经修饰后的抗体溶液和标记酶溶液按照摩尔比1:8进行偶联反应，添加反应体系总体积10％的苯胺作为催化剂，室温震荡2h，2-8℃过夜(>12h，<24h)。
②使用Superdex200凝胶过滤层析柱进行分离纯化，收集第一个峰。
③收集后，使用50k超滤管进行浓缩，添加1％BSA及0.05％Proclin300即为酶标偶联羊抗鼠抗体。
抗体和标记酶偶联过程参见图6。
对上述制备的酶标偶联羊抗鼠抗体进行热稳定性和免疫组化检测灵敏度进行验证，包括：
(1)热稳定性实验
将酶标偶联羊抗鼠抗体配置成4μg/ml浓度，分别放置于4℃和37℃，六周后取出进行免疫组化检测。
如图1所示，为将相同浓度的酶标偶联羊抗鼠抗体分别放置于4℃和37℃六周后进行免疫组化检测(其他试剂，步骤均一致)，实验结果表明二者都能清楚有效的检测出目的抗原，表明该抗体的热稳定较好。
(2)免疫组化检测性能实验
①样本切片准备：将经福尔马林固定石蜡包埋后的组织切片于60℃恒温箱中烤片2h，保存备用。
②切片脱蜡：石蜡切片先置于新鲜二甲苯中进行脱蜡，浸泡2次，每次10min；
③切片水化：依次经过无水乙醇，无水乙醇，95％乙醇，85％乙醇，70％乙醇浸泡5分钟进行水化，后纯化水冲洗2次，每次3min。
④抗原修复：推荐使用高温热修复法修复3min(如果使用自动修复仪可设置98℃高温修复20min)，切片自然冷却至室温后用免疫组化笔将待测组织圈起来，纯化水冲洗2次，每次3min。
⑤内源性过氧化物酶灭活：滴适量内源性过氧化物酶阻断剂完全覆盖组织，室温孵育10min后，纯化水冲洗2次，每次3min，PBST冲洗一次。
⑥一抗及空白对照抗体孵育：分别加入100ul的E-Cadherin抗体和空白对照抗体完全覆盖组织，置于37℃恒温箱中孵育1h，PBST冲洗3次,每次5min。
⑦二抗孵育：依照所用二抗染色系统DAB染色液试剂盒的说明书进行二抗孵育，孵育完毕后PBST冲洗片3次，每次5min，纯化水冲洗1次。
⑧DAB显色：依照所用DAB染色液试剂盒说明书进行配制DAB显色液，滴适量配制好的DAB显色液至完全覆盖组织，待颜色无加深终止染色，纯化水冲洗3次。
⑨苏木素复染：依照苏木素厂家说明书操作步骤及建议对切片进行复染，PBST或自来水冲洗返蓝。
⑩脱水透明：依次浸泡70％，85％，95％，100％，100％梯度酒精，每次3min；2次二甲苯透明，每次5min。
如图2所示，使用酶标偶联羊抗鼠抗体(4μg/ml)进行免疫组化检测染色强度明显高于市面上购买的酶标羊抗鼠抗体(8μg/ml)，表明本发明酶标偶联羊抗鼠抗体具有更高的灵敏度。
实施例2
本实施例制备酶标偶联羊抗兔抗体，按照如下方法制备：
(1)抗体的修饰；其修饰方法如下：
①将羊抗兔IgG在室温下溶解于0.1M磷酸钠，0.15M NaCl，pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液中，浓度为10mg/ml。
②将
12-NHS ester在室温下溶解于DMSO中，制备浓度为10mg/ml的反应修饰液。注意使用通风橱处理有机溶剂。
③按照羊抗鼠IgG与
12-NHS ester的摩尔比为1:10的比例进行抗体修饰，室温下反应30分钟。
④反应结束后，将上述反应体系的缓冲液用50k超滤管置换为0.1M磷酸钠，0.15MNaCl，pH5.5的磷酸盐缓冲溶液，得到邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体的溶液。
⑤在通风橱中，穿戴合适的个人防护装备的同时，向邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体的溶液中加入3.0μL肼(Sigma，53847),混匀至溶解。
⑥室温孵育过夜，去除修饰位点氨基氧基末端的邻苯二甲酰亚胺基。
⑦采用5mL脱盐柱，通过透析或分子排阻色谱法纯化，得氨基氧修饰的抗体的溶液。其中，使用0.1M醋酸钠、0.15M NaCl，pH 5.5(结合缓冲液)作为透析或色谱溶液。
⑧使用离心浓缩器将氨基氧修饰的抗体的溶液浓缩至约200μL。
抗体的修饰过程可参见图4。
(2)标记酶的修饰；其修饰方法如下：
①将辣根过氧化物酶在室温下溶解于0.1M磷酸钠，0.15M NaCl，pH7.5的磷酸盐缓冲溶液中，浓度为10mg/ml。
②将
12-TFP ester在室温下溶解于DMSO中，制备浓度为10mg/ml的反应修饰液。注意使用通风橱处理有机溶剂。
③按照辣根过氧化物酶与
12-TFP ester的摩尔比为1:10的比例进行抗体修饰，室温反应30分钟。
④反应结束后，将反应体系的缓冲液用50k超滤管置换为0.1M磷酸钠，0.15MNaCl，pH5.5的磷酸盐缓冲溶液。
⑤使用5mL脱盐柱，通过透析或分子排阻色谱纯化修饰后的标记酶。其中，使用0.1M醋酸钠、0.15M NaCl，pH 5.5结合缓冲液作为透析或色谱溶液。
标记酶的修饰过程可参见图5。
(3)修饰后的抗体和标记酶偶联以及纯化，方法如下：
①确保抗体和标记酶的缓冲液都为0.1M磷酸钠，0.15M NaCl，pH5.5的磷酸盐缓冲溶液，将经修饰后的抗体溶液和标记酶溶液按照摩尔比1:10进行偶联反应，添加反应体系总体积10％的苯胺作为催化剂，室温震荡2h，2-8℃过夜(>12h，<24h)。抗体和标记酶偶联过程可参见图6。
②使用Superdex200凝胶过滤层析柱进行分离纯化，收集第一个峰。
③收集后，使用50k超滤管进行浓缩，添加1％BSA及0.05％Proclin300即为酶标偶联羊抗兔抗体。
对上述制备的酶标偶联羊抗兔抗体对细胞核类抗原进行免疫组化检测实验。
①样本切片准备：将经福尔马林固定石蜡包埋后的组织切片于60℃恒温箱中烤片2h，保存备用。
②切片脱蜡：石蜡切片先置于新鲜二甲苯中进行脱蜡，浸泡2次，每次10min；
③切片水化：依次经过无水乙醇，无水乙醇，95％乙醇，85％乙醇，70％乙醇浸泡5分钟进行水化，后纯化水冲洗2次，每次3min。
④抗原修复：推荐使用高温热修复法修复3min(如果使用自动修复仪可设置98℃高温修复20min)，切片自然冷却至室温后用免疫组化笔将待测组织圈起来，纯化水冲洗2次，每次3min。
⑤内源性过氧化物酶灭活：滴适量内源性过氧化物酶阻断剂完全覆盖组织，室温孵育10min后，纯化水冲洗2次，每次3min，PBST冲洗一次。
⑥一抗及空白对照抗体孵育：分别加入100ul的MLH1抗体和空白对照抗体完全覆盖组织，置于37℃恒温箱中孵育1h，PBST冲洗3次,每次5min。
⑦二抗孵育：依照所用二抗染色系统DAB染色液试剂盒的说明书进行二抗孵育，孵育完毕后PBST冲洗片3次，每次5min，纯化水冲洗1次。
⑧DAB显色：依照所用DAB染色液试剂盒说明书进行配制DAB显色液，滴适量配制好的DAB显色液至完全覆盖组织，待颜色无加深终止染色，纯化水冲洗3次。
⑨苏木素复染：依照苏木素厂家说明书操作步骤及建议对切片进行复染，PBST或自来水冲洗返蓝。
⑩脱水透明：依次浸泡70％，85％，95％，100％，100％梯度酒精，每次3min；2次二甲苯透明，每次5min。
如图3所示，在相同操作下使用本发明酶标偶联羊抗兔抗体(6μg/ml)对细胞核类抗原进行免疫组化检测，能够很清晰的检测出细胞核的染色，与市面上购买酶标二抗(20μg/ml)染色强度相比几乎无差。本发明在抗体浓度仅为对照酶标二抗浓度1/3的情况下，表现出几乎无差异的染色强度，表明本发明酶标偶联羊抗兔抗体对检测细胞核类抗原具有更高的灵敏度。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种酶标偶联二抗，其特征在于，所述酶标偶联二抗是由经修饰的抗体与经修饰的标记酶二者之间以肟键偶联连接；所述经修饰的抗体为抗体赖氨酸残基的氨基被修饰连接氨基氧基，所述经修饰的标记酶为酶分子的赖氨酸残基被修饰使酶分子变为芳基醛。
2.根据权利要求1所述的酶标偶联二抗，其特征在于，所述抗体为羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、驴抗羊IgG、马抗羊IgG、鼠抗羊、兔抗羊IgG、马抗羊IgG、马抗兔IgG、马抗鼠IgG中的任一种。
3.根据权利要求1所述的酶标偶联二抗，其特征在于，所述标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
4.一种酶标偶联二抗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1:对抗体进行修饰，使抗体赖氨酸残基的氨基被修饰连接氨基氧基；
S2:对标记酶进行修饰，使酶分子的赖氨酸残基的氨基被修饰连接芳基醛；
S3:在弱酸性水溶液中，经修饰的标记酶所含的芳基醛与经修饰的抗体所含的氨基氧基发生缩合反应形成肟键，得到以稳定的肟键连接的酶标偶联二抗。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S3中，加入苯胺作为催化剂，催化肟键生成。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S1中，对抗体采用式(I)结构的化合物进行修饰，其中，n＝4-16的整数；S2中，对标记酶采用式(II)结构的化合物进行修饰，其中m＝4-16的整数；
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，S1中，对抗体的修饰方法如下：
(1)将抗体溶解于pH 7-7.5的磷酸盐缓冲液中，得到5-10mg/ml的抗体溶液，将邻苯二甲酰亚胺氧基-十二聚乙二醇-NHS-酯溶解于DMSO，得到5-15mg/ml的修饰溶液；
(2)将抗体溶液与修饰溶液按照抗体与邻苯二甲酰亚胺氧基-十二聚乙二醇-NHS-酯的摩尔比为1:8-12进行混合反应；
(3)反应结束后，将反应体系中的缓冲液用50K超滤管置换为pH5.5-6的磷酸盐缓冲液，得到邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体的溶液；
(4)向邻苯二甲酰亚胺氧修饰的抗体的溶液中加入肼(N2H4)，溶解混匀，室温孵育过夜，去除修饰位点氨基氧基末端的邻苯二甲酰亚胺基；然后，采用脱盐柱，通过透析或分子排阻色谱法纯化，得到氨基氧基修饰的抗体的溶液。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，S2中，对标记酶的修饰方法如下：
(1)将标记酶溶解于pH 7-7.5的磷酸盐缓冲液中，得到5-15mg/ml的标记酶溶液，将4-甲酰-苯甲酰胺-十二聚乙二醇-TFP酯溶解于DMSO，得到5-15mg/ml的修饰溶液；
(2)将标记酶溶液与修饰溶液按照抗体与4-甲酰-苯甲酰胺-十二聚乙二醇-TFP酯的摩尔比为1:8-12进行混合反应；
(3)反应结束后，将反应体系中的缓冲液用50K超滤管置换为pH5.5-6的磷酸盐缓冲液，得到酶分子赖氨酸残基被修饰的芳基醛化合物的溶液。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，S3的反应过程为：将S1制备的氨基氧基修饰的抗体的溶液和S2制备的酶分子赖氨酸残基被修饰的芳基醛化合物的溶液按照摩尔比1:4～15进行偶联反应，在弱酸性条件下，添加反应体系总体积8-12％的苯胺为催化剂，室温震荡反应后，再于2-8℃反应12-14h，使用凝胶过滤层析柱进行分离纯化，收集第一个出峰，即为酶标偶联二抗。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述抗体为羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、驴抗羊IgG、马抗羊IgG、鼠抗羊、兔抗羊IgG、马抗羊IgG、马抗兔IgG、马抗鼠IgG中的任一种；所述标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110064811.8A CN112649601A (zh) | 2021-01-18 | 2021-01-18 | 一种酶标偶联二抗及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110064811.8A CN112649601A (zh) | 2021-01-18 | 2021-01-18 | 一种酶标偶联二抗及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112649601A true CN112649601A (zh) | 2021-04-13 |
Family
ID=75368487
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110064811.8A Pending CN112649601A (zh) | 2021-01-18 | 2021-01-18 | 一种酶标偶联二抗及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112649601A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112881691A (zh) * | 2020-12-24 | 2021-06-01 | 杭州百殷生物科技有限公司 | 一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫细胞化学标记显色试剂盒 |
| CN113391059A (zh) * | 2021-06-10 | 2021-09-14 | 泰州市百英生物科技有限公司 | 一种micropolymer-HRP-纳米抗体复合物及其制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0326074A1 (de) * | 1988-01-25 | 1989-08-02 | Roche Diagnostics GmbH | Neue Haptenderivate und davon abgeleitete Hapten-Protein-Konjugate |
| CN111551709A (zh) * | 2020-05-13 | 2020-08-18 | 河南赛诺特生物技术有限公司 | 一种酶标二抗复合物及其制备方法 |
-
2021
- 2021-01-18 CN CN202110064811.8A patent/CN112649601A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0326074A1 (de) * | 1988-01-25 | 1989-08-02 | Roche Diagnostics GmbH | Neue Haptenderivate und davon abgeleitete Hapten-Protein-Konjugate |
| CN111551709A (zh) * | 2020-05-13 | 2020-08-18 | 河南赛诺特生物技术有限公司 | 一种酶标二抗复合物及其制备方法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112881691A (zh) * | 2020-12-24 | 2021-06-01 | 杭州百殷生物科技有限公司 | 一种用于宫颈癌辅助诊断的免疫细胞化学标记显色试剂盒 |
| CN113391059A (zh) * | 2021-06-10 | 2021-09-14 | 泰州市百英生物科技有限公司 | 一种micropolymer-HRP-纳米抗体复合物及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI80345C (fi) | Visualiseringsfoerfarande foer direkt eller indirekt detektering av ett agglomerat bildat av ett specifikt bindande aemne och en motsvarande acceptorsubstans vid blot overlay-bestaemningar och i dessa bestaemningar anvaendbar testfoerpackning | |
| CA1213579A (en) | Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives | |
| US4810638A (en) | Enzyme-labeled antibody reagent with polyalkyleneglycol linking group | |
| JPS6018940B2 (ja) | 免疫学的分析法 | |
| CN112649601A (zh) | 一种酶标偶联二抗及其制备方法 | |
| CN109406778A (zh) | 一种检测烟叶中青枯病菌的时间分辨荧光定量试纸条及其制备方法和应用 | |
| EP1767947B1 (en) | An immunoassay method and kit to leucomalachite green and malachite green | |
| CN114544934A (zh) | 一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条及其应用 | |
| US5998156A (en) | Color developing method, enzyme immunoassay using the color developing method, and immunochromatography incorporating the enzyme immunoassay | |
| JP4174016B2 (ja) | 競合法によるサイロシン類のイムノクロマトグラフィー検出法及びテストキット | |
| DE19811196C2 (de) | Verwendung von Anti-Creatinin-Antikörpern oder anderen Creatinin bindenden Substanz en zur Bestimmung von Creatinin in physiologischen Flüssigkeiten und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
| CN102295698B (zh) | 环孢霉素a免疫原、特异性抗体、检测试剂及检测试剂盒 | |
| FI86145B (fi) | Histaminderivat, immmunogenkonjugater och mot dessa producerade antikroppar. | |
| CN110117286B (zh) | 一种杂环胺8-MeIQx半抗原、抗体及其制备方法和应用 | |
| CN114354525A (zh) | 一种α-银环蛇毒素检测探针、一种非诊断目的检测α-银环蛇毒素的方法 | |
| CN114113614B (zh) | 一种单宁酸免疫网络及盐酸克伦特罗试纸条检测方法 | |
| US4489157A (en) | Chloramphenicol derivatives | |
| US5427907A (en) | Assay for equine infectious anemia virus | |
| CN112142756A (zh) | 黄曲霉毒素m1半抗原与全抗原制备及其快速转移定量试剂盒制备与应用 | |
| CN109738630A (zh) | 一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法 | |
| US4608200A (en) | Chloramphenicol derivatives, antigens and antibodies | |
| CN108490171A (zh) | 一种高灵敏唾液抗体检测试剂盒 | |
| JP2004125750A (ja) | 反応性染料を使用して水溶性タンパク質を選択的に染色する方法およびその用途 | |
| CN111781367A (zh) | 一种定量麻痹性贝类毒素检测试纸的制作方法及应用 | |
| JPH0792456B2 (ja) | カテコ−ルアミン酸性代謝物の酵素標識体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |