CN116023312A - 生物活性交联剂、生物交联物、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生物活性交联剂、生物交联物、试剂盒及应用，交联剂结构式如下：
本发明的交联剂，有效提高了灵敏度，增加信号强度，特异性地增加了两个不同的功能基团，以达到交联的特异性。
Description
优先权号：2021116716420
优先权日：2021.12.31
技术领域
本发明是关于生物检测技术，特别是关于一种生物活性交联剂、生物交联物、试剂盒及应用。
背景技术
交联剂是指一类分子两端各有一个相同或者不同的活性基团，它们可与其他分子上的氨基、巯基、羟基等发生共价结合而产生交联作用的试剂，交联剂可分为三种类型:同型双功能试剂、异型双功能试剂和可被光活化试剂。目前，免疫类技术标记用的偶联方法包括共价交联方法和物理吸附法两种。其中，共价交联方法最多。共价交联方法又分为同型共价交联剂和异型共价交联剂。同型共价交联剂主要有戊二醛、戊二酸、己二胺、乙酸酐、二缩水甘油基乙醚、辛二亚氨酸甲酯等，此类交联剂容易形成分子内或者分子间的自身交联，没有方向选择性。异型交联剂使单个分子上两个末端的不同的活性基团分别与两个不同的分子交联，不会形成分子内或分子间的自身交联。现有的交联剂受限于支链结构、空间构象、空间位阻等方面的限定，标记放大能力受到了较大的限制。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物活性交联剂、制备方法、组合物、试剂盒及应用。
为实现上述目的，本发明的实施例提供了生物活性交联剂，其结构式如下：
这里是对交联剂的一种可能的举例，而非对上述通式的限定，各部分可替代基团，均可以进行灵活性替代。
在本发明的一个或多个实施方式中，生物交联物，包括如前述的生物活性交联剂形成的主链以及连接到异硫氰基的抗原或抗体，和/或连接到羧基的小分子物质。
在本发明的一个或多个实施方式中，小分子物质包括荧光小分子化合物和/或化学发光物质和/或电化学发光物质和/或放射性同位素和/或胶体金。
在本发明的一个或多个实施方式中，小分子物质包括荧光素类、吖啶酯类、胶体金类、三联吡啶钌类、铕Eu类衍生物、放射性同位素中的至少一种。
在本发明的一个或多个实施方式中，抗原或抗体选自睾酮-BSA、叶酸-BSA、雌二醇-BSA、半抗原如睾酮、叶酸、雌二醇、降钙素原PCT标记抗体、肌钙蛋白标记抗体、CRP标记抗体、BNP标记抗体。
在本发明的一个或多个实施方式中，标记试剂盒，包括如前述的生物活性交联剂或如前述的生物交联物。
在本发明的一个或多个实施方式中，如前述的生物活性交联剂或如前述的生物交联物或如前述的标记试剂盒在标记含活性氨基物质中的应用。
针对现有技术，本发明提出一种新型的交联剂，具有异型特异性交联的优点，同时又能增加标记物信号强度，实现1：n的优势。通过这种新型交联剂的桥接作用，促使，一个抗体或者抗原等或其他的分子可以交联一个或多个交联剂分子，而一个交联剂分子可以交联n个标记物分子。从而，实现信号增强作用。
说明书附图
图1是本发明一种实施方式的交联剂的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
在以下实施例中以如下式所示的交联剂为例，对本发明的创新之处进行说明，但不作为对本发明保护范围的限定。
交联剂(记为J，或者SCN-J-(COOH)n)
该交联剂合成路线如下，同理本发明的其它可能交联剂也可以参照本路线或者其它路线进行合成：
如上所示的展示了本发明一种可行的合成路线，交联剂2-(4-异硫氰酸基苄基)-乙二胺四乙酰四乙二胺八丙酰八乙二胺十六乙酸可以以对硝基苯丙氨酸等为原料反应获得的。
MSm/z(ESI)：2447.1[M-1]。
1HNMR(400MHz，D2O)δ:2.50-2.77(44H，m)，3.14(24H，t，J＝7.1Hz)，3.24(1H，m)，3.25(8H，s)，3.30(32H，s)，3.65(16H，t，J＝7.1Hz)，7.17-7.30(4H，d，J＝7.5Hz)。
如上得到的交联剂，可以满足对睾酮-BSA、叶酸-BSA、雌二醇-BSA、睾酮、叶酸、雌二醇、降钙素原PCT标记抗体、肌钙蛋白标记抗体、CRP标记抗体、BNP标记抗体等抗原/抗体与吖啶酯、荧光素、胶体金类、三联吡啶钌、镧系金属、铕类衍生物、放射性同位素等生物发光标记物的放大关联。如下实施例中以降钙素原PCT标记抗体为例对本发明方案在不同发光体系下的放大效能和实用性进行说明，需要注意的是如下举例并非对抗原/抗体的选择进行限定。而在进行发光检测时，可以针对性地采用不同的分析检测设备进行检测，比如当为吖啶酯、三联吡啶钌等，则采用全自动化学发光免疫分析仪，如重庆科斯迈的SMART 500S全自动化学发光免疫分析仪或者罗氏的E170全自动化学发光免疫分析仪等；当为荧光素等，则是干式免疫荧光分析仪；当为镧系金属(Eu)，则可以采用全自动荧光免疫分析仪。
实施例1：抗原(包括半抗原，完全抗原)或抗体，记为P-NH2，与化学发光类物质，如吖啶酯修饰物(AE)的交联；交联剂记为SCN-J-(COOH)n。
吖啶酯己二胺修饰物(记为AE)
生物交联物的反应路线如下:
具体如取1.0mg降钙素原PCT标记抗体，用pH7.4的PBS溶解，振荡混匀。加入小分子交联物10.0mg，振荡混匀，4℃振荡反应过夜。取出反应液后，用透析袋透析，4℃过夜。
取出透析液后，加入吖啶酯修饰物(AE，如图)10.0mg，加入EDC和NHS各5.0mg，振荡混匀，4℃振荡反应过夜。取出反应液后，用透析袋透析，4℃过夜。
取出透析液后，用保存液溶解稀释，并定容到合适浓度(见下表)，样品备用。
通过抗原抗体免疫反应(下同)，即样品再与校准品如化学发光免疫试剂盒中的的PCT抗原、PCT磁珠包被抗体一起反应，在37℃反应10min，形成双抗夹心磁珠免疫复合物；洗涤后，去除未结合的标记物，测定交联后的标记物的效果，与常规交联工艺(这里为将降钙素原PCT标记抗体的氨基直接与吖啶酯的羧基反应形成酰胺键而共价结合)后的标记物比对，如以重庆科斯迈的SMART 500S全自动化学发光免疫分析仪检测，检测结果如下表所示:
实施例2：抗原(包括半抗原，完全抗原)或抗体与荧光素类物质，如丹磺酰胺己胺修饰物(D6)、FITC修饰物(F)等的交联。
丹磺酰胺己胺(记为D6)
FITC己二胺修饰物(记为F)
生物交联物的反应路线如下:
具体如取1.0mg降钙素原PCT标记抗体，用pH7.4的PBS溶解，振荡混匀。加入小分子交联物(J，如图)10.0mg，振荡混匀，4℃振荡反应过夜。取出反应液后，用透析袋透析，4℃过夜。
取出透析液后，加入FITC修饰物(F，如图)10.0mg，加入EDC和NHS各5.0mg，振荡混匀，4℃振荡反应过夜。取出反应液后，用透析袋透析，4℃过夜。
取出透析液后，用保存液溶解稀释，并定容到合适浓度(见下表)，样品备用。
通过抗原抗体免疫反应，即样品再与校准品如检测试纸中的PCT抗原、PCT包被抗体一起反应，在37℃反应10min，形成双抗夹心免疫复合物；洗涤后(或者层析后)，去除未结合的标记物，测定交联后的标记物的效果，与常规交联工艺后(这里为将降钙素原PCT标记抗体的氨基直接与FITC的硫氰酸基反应而共价结合)的标记物比对，可以采用干式免疫荧光分析仪，检测结果如下表所示：
实施例3：抗原(包括半抗原，完全抗原)或抗体与电化学发光类物质，如三联吡啶钌修饰物(R6)等的交联。
三联吡啶钌Ru(bpy)3 2+己二胺(HDA)修饰物(记为R6)
生物交联物的反应路线如下:
具体如取1.0mg降钙素原PCT标记抗体，用pH7.4的PBS溶解，振荡混匀。加入小分子交联物(J，如图)10.0mg，振荡混匀，4℃振荡反应过夜。取出反应液后，用透析袋透析，4℃过夜。
取出透析液后，加入三联吡啶钌修饰物(R6，如图)10.0mg，加入EDC和NHS各5.0mg，振荡混匀，4℃振荡反应过夜。取出反应液后，用透析袋透析，4℃过夜。
取出透析液后，用保存液溶解稀释，并定容到合适浓度(见下表)，样品备用。
通过抗原抗体免疫反应，即样品再与校准品如试剂盒中的PCT抗原、PCT包被抗体一起反应，在37℃反应10min，形成双抗夹心免疫复合物；洗涤后，去除未结合的标记物，测定交联后的标记物的效果，与常规交联工艺后(这里为将降钙素原PCT标记抗体的氨基直接与三联吡啶钌的羧基反应而共价结合)的标记物比对，可以采用罗氏的E170全自动化学发光免疫分析仪检测，检测结果如下表所示：
实施例4：抗原(包括半抗原，完全抗原)或抗体与镧系金属类物质，如用于时间分辨的金属铕修饰物(E6)等的交联。
Eu(TTA)3L-己二胺(HDA)修饰物(记为E6)
生物交联物的反应路线如下:
具体如取1.0mg降钙素原PCT标记抗体，用pH7.4的PBS溶解，振荡混匀。加入小分子交联物(J，如图)10.0mg，振荡混匀，4℃振荡反应过夜。取出反应液后，用透析袋透析，4℃过夜。
取出透析液后，加入铕修饰物(E6，如图)10.0mg，加入EDC和NHS各5.0mg，振荡混匀，4℃振荡反应过夜。取出反应液后，用透析袋透析，4℃过夜。
取出透析液后，用保存液溶解稀释，并定容到合适浓度(见下表)，样品备用。
通过抗原抗体免疫反应，即样品再与校准品如检测试纸中的PCT抗原、PCT包被抗体一起反应，在37℃反应10min，形成双抗夹心免疫复合物；洗涤后(或者层析后)，去除未结合的标记物，测定交联后的标记物的效果，与常规交联工艺后(这里为将降钙素原PCT标记抗体通过SPDP直接关联铕修饰物)的标记物比对，可以采用全自动荧光免疫分析仪检测，结果如下表所示：
实施例5：抗原(包括半抗原，完全抗原)或抗体与小分子类物质，如碘化吡啶修饰物(P0)等的交联。
碘化丙啶PI12(记为P0)
生物交联物的反应路线如下:
具体如取1.0mg降钙素原PCT标记抗体，用pH7.4的PBS溶解，振荡混匀。加入小分子交联物(J，如图)10.0mg，振荡混匀，4℃振荡反应过夜。取出反应液后，用透析袋透析，4℃过夜。
取出透析液后，加入碘化吡啶修饰物(P0，如图)10.0mg，加入EDC和NHS各5.0mg，振荡混匀，4℃振荡反应过夜。取出反应液后，用透析袋透析，4℃过夜。
取出透析液后，用保存液溶解稀释，并定容到合适浓度(见下表)，样品备用。
通过抗原抗体免疫反应，即样品再与校准品如检测试纸中的PCT抗原、PCT包被抗体一起反应，在37℃反应10min，形成双抗夹心免疫复合物标记物；洗涤后(或者层析后)，去除未结合的标记物，测定交联后的标记物的效果，与常规交联工艺后(这里为将降钙素原PCT标记抗体通过SPDP直接关联碘化吡啶修饰物，下同)的标记物比对，可以采用干式免疫荧光分析仪，检测结果如下表所示：
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (7)
1.一种生物活性交联剂，其结构式如下：
2.生物交联物，包括如权利要求1所述的生物活性交联剂形成的主链以及连接到异硫氰基的抗原或抗体，和/或连接到羧基的小分子物质。
3.如权利要求2所述的生物交联物，其特征在于，所述小分子物质包括荧光小分子化合物和/或化学发光物质和/或电化学发光物质和/或放射性同位素和/或胶体金。
4.如权利要求3所述的生物交联物，其特征在于，所述小分子物质包括荧光素类、吖啶酯类、胶体金类、三联吡啶钌类、铕类衍生物、放射性同位素中的至少一种。
5.如权利要求3所述的生物交联物，其特征在于，所述抗原或抗体选自睾酮-BSA、叶酸-BSA、雌二醇-BSA、半抗原如睾酮、叶酸、雌二醇、降钙素原PCT标记抗体、肌钙蛋白标记抗体、CRP标记抗体、BNP标记抗体。
6.标记试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的生物活性交联剂或如权利要求2-5任一所述的生物交联物。
7.如权利要求1所述的生物活性交联剂或如权利要求2-6任一所述的生物交联物或如权利要求6所述的标记试剂盒在标记含活性氨基物质中的应用。
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