JPS60252684A - 螢光組合せ体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の主体は、金属キレートを形成し得るジアミン三
酢酸である。よ）詳細には、本発明は、金属イオンを有
機種、たとえば有機ターゲット分子または抗体に結合さ
せるのに有効な、好ましくは、螢光分析技術に有効な種
結合螢光希土類金属キレートを形成するのに有効な、三
官能配位子に関する。

螢光技術は、化学および生化学および医学分析で用途が
増大しつつある。螢光屓１１定法は本質的には著しく敏
感なものである。これら測定法は放射、線に伴う危険な
しに、少なくとも放射化学法の感゛度を提供することが
できる。

米国特許第４，１５０，２９５および第４，０５８，７
３２号各明Ｊ香（各々１９７９年４月１７日付および１
９７７（１９７’、８．　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔ
ｈ’Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓ
ｓ）の６７〜８０頁の章には、周囲の螢光に比較して長
め崩壊ライフタイムを有する発螢光団を用いて非螢゛光
種を螢光的に定量する一般的概念が開示されてｂる。こ
の方法では、原子規模螢光タッグ（ｔａｇ）（発螢光団
）が種の個々の分子に化学的に共有結合的に固定される
。この種は、有機ターゲット分子自身であることができ
まだはターゲット分子と本質的に同じ分子であることが
できまたはターゲット分子に特異の抗体であることがで
きる。分析形態に応じて適当な手順後、タッグされた種
は励起され、上記３つの文献に教示されているタイムゲ
ート（ｔｉｍｅ−ｇａｔｅｄ　）技術を用いて、上記種
の螢光が測定される。観察された螢光の大きさおよび前
以って用意した螢光／濃度種属曲線を用いて、ターゲッ
トの量が測定される。

そのような決定において有効な発螢光団およびタッグ種
は、長い螢光崩壊ライフタイムを有しかつ分析期間中螢
光を発する能力を保持するのが理想的である。敏感な分
析には、発螢光団およびそれの他の種との結合は、非常
に低い濃度、だζえばナノグラム／ｃｃの範囲およびそ
れ以下のたとえばフエムトダラム（ｆｅｍｔｏｇｒａｍ
　）／　’ＣＧの範囲においてさえ安定であることが重
要である。多くの免疫分析にとっては、発螢光、団は免
疫反応性を保持する環境で抗体と反応せしめられるよう
に水溶性であることが望ましい。

本発明の金属キレートは、その緬囲内に、これらの所望
の特性のすべてを有する種結合配位子の一群を包含する
。さらに、本発明の金属キレートは製造が簡単でかつ廉
価である。

最も広い意味で述べれば、本発明は、官能基、も一種を
有する有機種（本発明においてＩＴＪと称す）を、ジア
ミン四酢酸の４個のカルボキシル基の１つ、および本質
的に１つのみを結合させて一般式１（Ｒは２個またはそ
れ以上の原子長共有結合型ブリッジ（以下、単に共有結
合ブリッジと称す）であり、Ｌは種分子Ｔ上の上記官能
基の脱プロトン化等何物（ｄｅｐｒｏｔｏｎａｔｅｄ　
ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ　）である）で示される形状を有
する安定な構造を形成することができるということであ
る。

Ｔは１個以上のＬ基を含有することができるので、１個
以上のジアミン三酢酸をこの大円に共有結合させること
ができる。

これらの共有結合生成物（式りを「種結合ジアミン三酸
」と呼ぶ。これらの生成物は種々の金属イオンと安定な
キレ−１形成する。これらのキレート錯体（式■）は、
本発明の他の面を構成する。

（式中、Ｍはジアミントリーまたはテトラ酸と配位錯体
を形成することができる金属イオンである。）好ましい
実施態様においては、金属イオンＭは、螢光キレート錯
体を形成し得る希土類金属のイオンである。

本発明の奸三の面において、特に好ましい錯体は、活性
剤またはフラッグ−（ｆｌｏｏｄｅｒ　）たとえばサリ
チル酸も又希土類金属イオンおよび種結合ジアミントリ
駿と三成分錯体結合として存在する場合に形成される。

第四の面において、本発明は有機種Ｔ、たとえば基−Ｎ
−Ｈ，−Ｎ−Ｈ，−０−Ｈまたは−８−Ｉ（の少な青 くとも１個を含有するターゲット分子捷たは抗体の濃度
または存在を測定する方法を提供する。この方法は、そ
のような種発生を一般弐■の（Ｒは２個またはそれ以上
の原子長共有結合ブリッジである） ジアミン四詐酸二無水化物の実質的過剰量と、種分子上
の上記基の少なくとも１つと二無水化物の無水物基の１
つとの反応を行５条件下で接触させて種結合ジアミント
リ酸無水物を生成し；残シの無水物基を加水分解して種
結合ジアミントリ酸を生成し；上記種結合ジアミントリ
酸を溶解して希土類金属イオンと混合して種結合希土類
キレート全形成し；次いで、随意に問題の分析の種類に
応じて適当な手順後、この種結合希土類キレートを活性
剤たとえばサリチル酸でフラッド（ｆｌｏｏｄ　）し；
上記螢光錯体の螢光強度を測定し、；そして観察された
螢光強度をそのような螢光錯体の公知濃度の螢光強度に
関連づけることを包含する。

第五の面において、本発明は弐■の１個またはジアミン
トリ酸分子を共有結合して有する抗体を形成し；上記抗
体結合トリ酸の希土類キレートを形成し；結合抗体のあ
る量をターゲット分子を含有すると思われる組織、液体
または固体基体にさらして上記ターゲットを抗体に結合
させ；過剰の未結合抗体を除去し；液体、組織または固
体基体に、希土類トリ酸キレートに特異の螢光活性剤を
フラッドさせ；そして螢光を上記ターゲット分子の量ま
たは存在のインジケーターとして測定または検出するこ
と如よシ、ターゲット分子の存在捷たは量を検出する方
法を提供する。

本発明の詳細な説明は、次の部分に分けられる二種結合
ジアミントリ酸化合物、 金属錯体、 フラツダーとの三成分結合、 調製方法、 増分子、および 分析技術。

種結合ジアミントリ酸化合物 これらの化合物は、一般式Ｉで示される構造を有する。

式■において、Ｒは２つまたはそれ以上の原子共有結合
ブリッジである。２個またはそれ以上の原子はブリッジ
自身中の原子を指す。これらの原子・ｊ−ｊ：所望なら
他の原子または基で置換することができる。Ｒの機能は
、間隔をあけて離れてｂる２個のアミンジ酢酸基を互い
に共有結合させて２個のアミンジ酢酸基に金属イオンで
もって安定な化合物を形成させることである。したがっ
てアミンジ酢酸基のキレート形成能を妨害することなく
この機能を果すいかなる基もＲとして使用することがで
きる。

Ｒば、炭素−酸素エーテルブリッジ、炭素−窒素ポリア
ルキル第二または第三アミドブリッジおよびすべて未置
換かまたはブリッジから垂下している置換基を含有する
アルキレン、シクロアルキレンまたはアリーレンを包含
する炭素−炭素ブリッジから選ばれる随意に置換された
２〜８原子共有結合ブリッジであるのが好ましい。置換
基としてたとえば、１〜約１０炭素原子のアルキル、６
〜１０炭素原子のアリール、７〜約１４炭素原子のアラ
ルキルおよびアルカリールが挙げられる。ブリッジまた
は前述した置換基は、カルボキシル、カルボニル、エー
テル、カルバメート、第ニアミド、スルホネート、サル
ファメート等で置換することもできる。Ｒ基の例として
、エチレン、ｎ−プロピレン、イノプロピレン、ｎ−ブ
チレンを含む種々のブチレン、１−および２−メチルプ
ロピレン、１−プロピルエチレン、１−シクロヘキシル
エチレン、１−フェニルエチレン、アルキル１ａｉ−フ
ェニルエチレンおよヒフロビレン、ｌ−ベンジルエチレ
ン、２−アミドプロピレン、シクロへキシル−１，２−
エン、フェニル−１，３−エン、ジエチレン−エーテル
−ＣＨ２−ＣＨ２−０−ＣＨ２−Ｃ’Ｈ２−、トリエチ
レンジエーテル−ＣＩ（２−ＣＨ２−０−ＣＨ２−ＣＨ
２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＩ（２−等が挙げられる。この例は
総括的なものではなく、Ｒ基の典型的実施態様を単に示
すだけである。

、製造が簡単なことから、長さが２〜５炭素、好ましく
け２〜４炭素の未置換アルキレンが好ましいＲであり、
エチレンおよびプロピレンがより好ましく、エチレンが
最も好ましいＲである。

本発明の種結合ジアミン）　ＩＪ酸化合物は、第一また
は第ニアミド窒素、エステル酸素またはチオエステル硫
黄である１個またはそれ以上の官能性りを含有する。Ｌ
の各単位は、ジアミン配立子の１単位と種分子Ｔ間の共
有結合リンクとして働く。

Ｌの選定はＬが種分子上て存在するアミン（第一または
第二）、ヒドロキシルまたはチオールから誘導され得る
ので種分子の性質だより決定される。

・一般に、アミド窒素が好ましいＬ基であり、アミド基
（したがってＴ上の第一アミン基から誘導される）が最
も好ましい。

本発明の種結合ジアミントリ酸化合物は、２個のアミン
基を含有し、その１つは２個の酢酸基を担持し、もう一
方は１個の酢酸基と１個の酢酸／Ｌ−Ｔ付加物を担持す
る。簡単のため、本明紹書および特許請求の範囲におり
て、３個の酢酸基がプロトン化（ｐｒｏ！ｏｎａｔｅｄ
　）形として示されている。

実際には、弱酸であるこれらの基は示されているプロト
ン化形と対応すえ脱プロトン塩形−ＣＯＯ−との間で平
衡をなして存在することは理解されるであろう。２つの
形態の正確な割合は、使用環境のｐＩ（および組成によ
る。示されているプロトン化形は実際に存在する２つの
形態の平衡を表わすことが意図されている。

金属錯体 本発明の種結合ジアミントル酸は有効なキレート形成配
位子である。それらの錯体形成能は、対応する非種結合
ジアミン四酢酸醒位子（たとえばエチレンジアミン四酢
酸−ＥＤＴＡ）のそれと本質的に同じてなくとも、同様
であると思われる。さらに種への結合において使用され
るけれども、第四カルボニル基は金属イすンとの配位点
として機能することができ、したがって、本発明のジア
ミン）　ＩＪ酸と共に形成された錯体の解離定数は当業
界のジアミン四酢酸で得られる錯体のそれと非常に類（
ＬＪしていると思われる。

錯化され得る金属イオンＭとして放射性ヌクレ、オチド
のイオンならびに非放射性金属イオンが挙げられる。広
範に証明されていないけれども、金属イオンとＥＤＴＡ
およびその非種結合同族体との当業界で公知の錯体の実
質的すべては、本発明の種結合配位子を用いて調製でき
るようである。たとえば、錯体は遷移金属およびアクチ
ニド系列ならびにランメニド系列の希土類金属のイオン
に等′　しいＭでもって形成することができる。Ｍによ
シ表わされる金属イオンの例として、Ａ、　＋＋＋、十
＋＋　＋＋＋　＋＋＋ Ａｍ　、　Ｃｄ　、　Ｃｅ　、　ｃ、＋＋＋、ｃｒｎ＋
＋＋、十＋　十＋＋　＋＋　＋＋＋　＋＋　＋＋＋Ｃｏ
　、Ｃｏ　、Ｃｒ　、Ｃｒ　、Ｃｕ　、Ｄｙ　１＋＋＋
　＋＋＋　＋＋　＋←　十＋＋ Ｅｒ　％Ｅｕ　、Ｆｅ　、Ｆｅ　％Ｇａ　。

＋＋＋　＋＋　＋＋＋＋＋−＋−＋＋十Ｇｄ　１Ｋｇ　
、Ｈｏ　、Ｉｎ　、Ｌａ　。

Ｌｕ＋＋＋、Ｍｎ←、胤＋＋＋、Ｎｄ＋←、ＮＩ＋＋、
Ｐｂ＋＋、Ｐｄ＋＋、Ｐｍ＋→、Ｐｒ＋←、　Ｐｕ＋←
、Ｐ、＋＋＋＋、ｓｂ＋＋＋、　ｓｏ＋＋＋、　ｓｍ＋
＋＋、　Ｓｍ＋＋、　Ｓｎ＋十、　Ｔｂ＋、Ｔｈ＋＋−
Ｈ−１ＴＩ＋＋＋、　Ｔｌ＋＋＋、　Ｔｍ＋＋＋、　■
＋＋＋＋■＋＋＋＋＋、ｖｏ２＋、Ｙ＋＋＋、Ｙｂ＋＋
＋、ｚｎ＋十、およびｚｒ＋＋＋１が挙げられる。

配合可能な金属イオンの範囲およびそのような金属イオ
ンが示す特性の広範囲および多様性のために、本発明に
よる金属イオン錯体は化学分析の分野で有効に使用され
る。本発明によシ種分子に結合された金属イオンの存在
は、配合された金属イオンに応じて放射能分析、Ｘ線散
乱または螢光。

ＮＭＲ′１だはＥＳＲシフトのような技術により検出す
ることができる。好ましい実施態様では、使用される金
属イオンはＥＤＴＡ型キレート化配位子と錯体を形成す
る希土類金属イオンである。これらの中で、テルビウム
、ジスプロシウム、ユウロピウム、サマリウムおよびネ
オジムが好ましく、テルビウムおよびユウロピウムがよ
シ好ましく、テルビウムが金属イオンＭを形成するのに
最も好ましい希土類である。

金属イオン２．４と種結合ジアミントリ酸間で形成され
る錯体は、１：１等モル金属：キレート錯体であると考
えられる。それは構造的には一般弐■とじて与えられる
構造により表わされる。

フラツダーとの三成分組合せ 本発明の種結合ジアミントリ酸の好ましい用途は、螢光
希土類金属錯体のキレート配位子として使用することで
ある。これら錯体の螢光分析技術での有効性は錯体に第
三成分が存在する場合に実質的に高められることが見い
出された。この第三成分である促進剤は、普通大過剰に
添加されるので「フラツダー」と総称される。促進剤ま
たは増感剤とも称されるフラツダーは、希土類キレート
の螢光励起効率を増大させるもので、非種結合希土類イ
オンおよびキレート中に開示されてｂる。

ＤａｇｎａｌｌらのＡＮＡＬＹＳＴ、　９２．３５８−
３６３　、　（１９６７）　１Ｈｅｌｌｅｒ　ａｎｄＷ
ａｓｓｅｒｍａｎ、　Ｊ、　ＣＨＥＭ、　ＰＨＹＳ、　
、　４２　。

９４９−９５５　、　（１９６５）　；　Ｍｅ　Ｃａｒ
ｔｈｙ　ａｎｄ　Ｗｉｎｅｆｏｒｄ’ｎｅｒ　。

ＡＮＡＬ、　ＣＨＥＭ、　、　３８．８４８　（１９６
６）　；　ＴａｋｅｔａｔｓｕらのＴＡＬＡＮ’ｒＡ、
　１３　、１０８１−１０８７．　（１９６６）　；Ｃ
ＨＥＭ、、鍛、　５２９−５３６　、　（１９６６）参
照。これらの文猷および有効なフラツダーの記載は、参
考として本発明において引用するものとする。これは完
全なリストではないが、本発明の種結合ジアミントリ酸
と共に使用できるフラッド剤（ｆｌｏｏｄｉｎｇａｇｅ
ｎｔ　）の多数を示唆するものである。

これらフラツダーの多くは、配位性を有しかつ種結合ジ
アミントリ酸配位子によりすでに占められていない希土
類金属イオン上の場所を占拠することにより作用すると
思われる。そうすることにより、フラツダーは金属イオ
ンと緊密に結合し、フラツダーから希土類金属への効果
的なエネルギー転移を可能にする。

錯体形成フラツダーの例は、５−スルホサリチル酸（５
−３ＳＡ）、４−アミノサリチル酸、サリチル酸、池の
貨換サリチル酸、ジピコリン酸等である。これらの物質
１はテルビウム錯体に対して特に有効であり、その応用
がそれらの作用を証明する。

種結合ジアミントリ酸とテルビウムの錯体は、はｖ２４
０ＯＡの励起帯を呈する。これは比較的弱１、Ａ帯域で
あり、この波長では、スペクトルの便利な部分ではない
。５−３ＳＡ　、をフラツダーとして添加すると、は’
、”３１００Ａの近紫外に強い励起帯が観察され、この
波長はサンプル透過の見地からはるかに便宜的な波長で
ある。

ユウロピウムに対して特に有効なフラッダーの例として
、塩たとえば炭酸カリウム、タングステン酸ナトリウム
等、および有機物質たとえばフェナントロリンが皐げら
れる。

種結合ジアミントリ酸の濃度が高いたとえば１０　〜Ｉ
Ｑ　Ｍである場合（この場合フラツダー濃度は同じであ
る）を除いて、フラツダーの使用量は種結合ジアミント
リ酸の号に対して非常に多い。

モル基準で金属イオンまたはジアミントリ酸の少なくと
も１０　倍のフラツダーを使用することが一般に好まし
く　、　１０’〜１０１０のモル過剰がより好ましい。

これらの大過剰は、フランダーージアミン錯体の安定性
がジアルカリ土類金属間の錯体の安定性より何分の１も
低いため要求される。

フラツダー含有錯体（ｆ４ｏｏｄｅｄ　ｃｏｍｐｌｅｘ
　）は、すでに形成された希土類キレート錯体を溶解し
たものにフラツダーを添加することによシ簡単に形成さ
れる。これは一般だ、フラツダー含有錯体の螢光を測定
する直前に行われる。確実性を以って知られていないけ
れども、生成するフラツターー含有錯体は、種結合ジア
ミントリ酸：希土類金属イオン：フラツダーの１　：　
］、　：　１モル三成仕組合せであると思われる。

調製方法 −０−Ｈ基を含有しなければならなｌＡ）を、一般式ｍ
で示されたジアミン四酢酸二無水物の実質的モル過剰と
極性中性液体有機反応媒体中で液相で接触させることに
より簡単に形成することができる。

有効な反応媒体として、アセトン、ジメチルホルムアミ
ド（ＤＭＦ　）　、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ　Ｏ
）およびＩ−ｒＭＰＡ等が挙げられる。これら物質の混
合物も期用できる。種分子上の反応性基がアミン、特に
第一アミンの場合、溶剤として水および水を含有する混
合溶剤を１更用することができる。　・この接触は、種
の活性基を、ジアミンの２個の無水物基の１つと反応さ
せる条件下で行われる。

種分子の活性基がアミンの場合、接触は穏やかな条件た
とえば約５〜約１００℃、好ましくは約１０〜約７５℃
の温度で行われる。種の活性基がチオールまたけヒドロ
キシルである場合１．幾らかより激しい条件たとえば２
５〜約１５０℃の赤変が一般に使用される。この場合、
３５〜約１２５°Ｃのし度が好ましい。この反応性の差
（は、もしそのようにすることが有利であれば、アミン
基との選択的反応を行い、チオールまたはヒドロキシル
との反応を排除することを行うために利用することがで
きる。もちろん、使用される反応時間は使用＠１変と逆
比例する。

一般に約０．５時間〜約２日の時間が使用され、１〜約
３６時間が好ましい。これらの時間および温度は指標と
して与えられる。ある場合、たとえば著しく熱敏感性ま
たは熱非敏感性ターゲットの場合、こ＼に示した例示的
範囲外であることが有利なこともある。一般に、これら
の範囲内でより低い温度の使用は無水物と種分子間でよ
シ良好な反応選択性をもたらすのセ好ましす。

二無水物の過剰量を使用することは必須である。

少なくとも４：１の二無水物：種分子比を使用すべきで
あ、９．！５：１〜約１０：１の比が好ましい。

この比の上限は、経済性に基因で任意に決められる。こ
の範囲に要求されるより多量の無水物を使用して良好な
結果を得ることができる。そのような操作方式は、本発
明の範囲内であると考えられるが、しかし、過剰の無水
物は続く作業で加水分解により破壊されるので無益であ
るとも考えられる。

本発明で使用される二無水物は、当業界で知られている
物質（米国特許第３．４９７，５３５号明細書）である
かまたは反応するジアミン四酢撤から、カルボキシルジ
酸無水物の普通の製造方法によシたとえばテトラ酸をモ
ル過剰量の無水酢酸および第三アミンの存在下で１５０
℃またはその付近のｉ度（すなわち８０〜１８０℃）に
長時間たとえば１２〜３６時間加熱することによυ調製
することができる。

種分子を二無水物に結合させた後、残シの無水物基は加
水分解されて対応するジ酢酸とされる。

この加水分解は、カップリング反応混合物を加水分解す
べき無水物のモル数を超える過剰量の水と混合し、そし
て加熱することにより容易に行われる。適当な温度は、
約３０〜約１２５“Ｃである。適当な時間は約１分〜約
２瞳間である。好ましい温度および時間は、４０〜１０
５℃、および２〜９０分である。別法として、カルボン
酸無水物を酸に（たとえば無水酢酸を酢酸に）加水分解
するために当業界で知られている他の灸注を使用するこ
とができる。

種結合トリ酸の形成に使用される化学量論過剰艙の無水
物（は、准結合物質と分離される。この過剰の無水物の
除去は無水物の酸への加水分解前または後に最も便宜的
であるように行うことができる。過剰量の無水物が除去
されないと、金属イオンおよび存在する場合は任意のフ
ラッダーと反応し、種結合ジアミントリ酸の量の正確な
測定を訪問の分離を行う任意の方法で行うことができる
。

、２つの種は大きさが異なるので、クロマトグラフィー
技術たとえばゲル透過クロマトグラフィー、高圧液体ク
ロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー（たとえ
ばシリカゲル基材を使用する）または薄層クロマトグラ
フィーを使用することができる。透析および限外濾過を
含む膜技術を用すてとの分離を行うこともできる。多く
の場合、結合物質は、非結合無水物、あるいは酸とある
物性たとえば電荷または溶解度が異なる。そのような特
性の相違を分離基準として使用してたとえば選択的抽出
または電気泳動を行うことができる。本発明忙おいては
クロマトグラフィー分離が使用されかつ一般に好ましい
が、使用される正確な方法は問題の実際の物質および分
離に基いて決定されるべきである。過剰の無水物または
酸を含まない慣結合ジアミントリ酸は次いで金属錯体に
形成される。

加水分解によシ式１の所望の種結合ジアミントリ酸が生
成される。これらは、トリ酸を所望の金属イオンと接触
させること忙より式■の金属配位（ヒ合物に変換するこ
とができる。この接触は一般に溶液中で行われる。金属
イオンの匝用量は、トリ酸１モル当シ約１モルのイオン
であることが必要である。金属イオンとトリ酸の錯体は
、大きな安定度定数を有する強い錯体である。これは、
錯体形成反応を押し進めるのに大過剰址の金属イオンを
使用することが必要でなくかつ過剰のイオン（はある場
合には後の螢光測定の精度を妨害し得ることを意味する
。

金属錯体形成工程は、一般に水性反応媒体中で行われる
。所望なら、水含有加水分解反応媒体を適当に使用する
ことができる。これは、金属イオンが一般に水溶性塩た
とえばハロゲン化物、硝酸塩、酢酸塩等として適当に添
加されることを意味する。

金属イオンの添加は、周囲条件で行うのが適当である。

錯体形成には、高い温度は有利でなく、また相当に低い
温度は何ら利点をもたらさない。

５〜約４０℃の温度範囲が便宜上一般に好ましい。

螢光分析技術に対しての希土類金属イオン錯体Ω場合「
フラツダー」を金属イオン錯体く添加することがしばし
ば望ましｂｏこのフラッダー添加は、一般に、螢光測定
直前に行われる。それは。

過剰のフラツダーを金属イオン錯体の溶液に添加するこ
とにより行われる。この添加は穏やかな条件たとえば５
〜４０℃の温度で行われる。

種分子 本発明の種結合ジアミントリ酸物質および錯体に共有結
合的に混入することができる種分子は、前記米国特許第
４，１５０，２９５号明細書および４　＋’　０５８゜
７３２号明細書（参考として本発明に引用）（て記載、
されているような「ターゲット分子」、「ターゲソト分
子」と本質的に同一の分子および「ターゲット分子」に
特異の抗体から選ばれる有機分子である。これらの種分
子は、第一アミン、第二アミン、チオール、捷たはヒド
ロキシル基の少なくとも１回を含有する。これらの活性
基ば、踵分子上に本来的Ｃて存在することかでき、ある
いは種分子１（共有結合された「スペーサー（５ｐａｃ
ｅｒ　）ゴユニット上に存在することができる。スペー
サーは、ジアミントリ酸基と種分子自身間の妨害の可能
性を最小限（でするのに有効である。そのような妨害は
、ある場合、たとえば種分子が免疫反応性を示さなけれ
ばならなｌ／−１場合またはある他の基質認識工程に関
与しなければならない時に右寄であり得る。「スペーサ
ー」は・必要なアミン、チオールまたはヒドロキシル活
性基を提供するために使用することもできる。「種」と
は、スペーサーが添加されたおよび適加されない物質を
包含する。

活性分子を非活性基たとえば基質に結合させるためにス
ペーサー１だに「ブリッジ」分子を使用する仁とは酵素
固定化、クロマトグラフィー等の分野で開発されてきた
。たとえば、米国特許第３．２７８，３９２ｈよび第３
，８７３．５１４号各明細書およびＷｉｌｃｈｅ、　Ｆ
ＥＢＳ　ＬＥＴＴ、　３３　（１）　７０−７２を参照
。これらの技術は本発明に２いて関与する正確な系を述
べていないけれども、広範囲の試剤およびスペーサーの
ｔｙ＝　、ｑ　Ｖｃより導かれる利点を開示している、
本発明は、本来的にまたはスペーサーの使用を介して所
要のアミン、チオールまたはヒドロキシル基を含有する
いかなる種分子についても実施することができるけれど
も、治療薬、酵素、ホルモン、ペプチド、蛋白質および
脂質を含む巨大分子、ハブテン、抗原等を含む生物学的
活性ターゲット分子に特に有利に利用できる。そのよう
な分子は普通所要の活性基を少なくとも１個有し、生物
学的系で存在し得る微小量のために分析または検出がし
ばしば困酷かまたけ不可能でさえある。

よって種分子の例は、所要の官能基を有する簡単な有機
ターゲット分子たとえば低級アルカノール−メタノール
、エタノール、ブタノール、ヘキサノール、シクロヘキ
サノール等；低級芳香族ヒドロキシ化合物−７エノール
、コ、弘−ジニトロフェノールおよびクレゾールｉ低級
アルキルおよび芳香！アミンーエチルアミン、ジエチル
アミン、ブチルアミン、およびインプロピルアミン；低
級チオール−プロパンチオールおよびブタンチオールカ
ラ、ホルモンチロキシン、トリョードチロニン、人間成
長ホルモンゴナドトロピン、胃腸ホルモン、インシュリ
ン等；治療医薬たとえばジゴキシン、モルホン、プロ力
インアミド等ｉ蛋白質、抗体等を含むよシ複雑な医薬お
よび生物学的分子に至るターゲットにまたがることが出
来る′。大分子たとえば蛋白質および抗体の場合、各種
分子上に所要の官能場所が１個以上（大きな数でさえ）
存在することが出来、その結果各種分子はそこに共有結
合された１個以上のジアミントリ酸基を有−）　７＋＞
　１一端；中車ム　との〒他か括へヱのＩＩブｋｌ汁木
本発明よシジアミントリ酸に結合出来る広範囲のターゲ
ットを証明するためである。それは、本発明の範囲を限
定するものではない。

分析技術 すでに述べたように、本発明は、金属イオンの錯体が種
分子または種分子の抗体に共有結合することを可能にす
る。これら金属イオンの当業界で知られている方法（支
）よる検出を用いて、種分子の存在または量を測定する
ことが出来る。またすでに述べたように、配合される金
属イオンが放射性ヌクレオチドである場合、放射能分析
技術を用いて種の存在量を測定することが出来る。別法
として、原子吸収技術を用いて金属の量およびそれ故タ
ーゲットの量を測定することが出来る。

１つの好ましい実施態様では、金属は希土類であり、生
成キレートは、フラツダーまたは他の手段により活性化
されて螢光を発生せしめられる。

放射線免疫分析分野で展開された多数の技術を一般に螢
光免疫分析に適用することが出来る。これらの技術とし
て、培養技術、競合的結合方法および結合したおよび遊
離のラベル付ターゲットの分離が挙げられる。たとえば
、 ＲＡｐｘｏｘＭＭｕＮｏＡｓｓＡｙ　ＡＮＤ　ＲＥＬＡ
ＴＥＤＴＥＣＨＮＩ　ＱＵＥＳ　（Ｊ、　１．　Ｔｈｏ
ｒｅｕらによる。　Ｃ，Ｖ。

Ｍｏ５ｂｙ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　Ｍｉｓ
ｓｏｕｒｉ　、　（／　Ｐ７１　）　）およびＲＡＤＩ
ＯＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ／ｌＮ（：ＬＩＮＩＣＡＬＢ
ＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　（編集Ｃ，Ａ、　Ｐａ５ｔｅ
ｒｎａａｋ、　Ｈｅｙ−ｄｅｎ、　Ｌｏｎｄｏｎ、　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒ＄ｃ、　Ｒｈｅｉｎｅ　、　（／り７ｊ）
）を参男・ 放射能免疫分析と螢光免疫分析間の主な差は、最終の読
みの段階である。前者の場合、放射性壊変が計算され、
後者の場合、螢光が励起されそして測定される。

米国特許第≠、／Ｊ′０，２り５号および第≠、０！Ｉ
’ｒ、７３２号明細書に開示されているタイムゲート螢
光技術は実質的に高められた感度を達成出来るので使用
するのに好ましい技術である。

本発明の希土類キレートがタッグされた螢光抗体の場合
、それらは、体液中の遊離ターゲットの分析に使用する
ことが出来または他の好ましい用途では、表面に独特な
ターゲットまたはターゲツト群を有する限シ生物光学的
細胞またはバクテリアの特定種類の存在を検出する（か
あるいは量をはかる）のに使用することが出来る。

本発明を下記の調製例および例でさらに説明する。これ
らは本発明を例示するものであシ、本発明の範囲を限定
するものではない。

３μりのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｒｉｏ
ｇの無水酢酸およびｔｏｏｉのピリジンの混合物を６５
°Ｃに加熱し、その温度で２μ時間保持する。次に、こ
の混合物を冷却し、グローブボックス中で濾過する。取
得された固体をジエチルエーテルで洗浄し、乾燥する。

それは、ＥＤＴＡ二無水物の理論重量のりｔＳに達する
。元素分析により、この二無水物は得られた生成物であ
ることが確認される。

（ｂ）　プロピレンジアミン四　二　物米国特許第３，
６６０．３１ｇ号明細書に記載の方法によシ、りλｌの
／、Ｊ−プロピレンジアミン四酢酸、ｌよ２ｙの無水酢
酸および１１３ＩＩのピリジンを６３”Ｑで３時間攪拌
する。反応生成物を真空下で蒸発乾固する。残渣を回収
し、ジエチルエーテルで３回すすぎ、１００℃の真空オ
ーブンで乾燥する。乾燥生成物は所望の二無水物である
。

（ｃ）　フェニレン／、２−ジアミン四酢酸二無水物米
国特許第３．ｌｔＯ，，３ｙ１号明細書に記載の方法に
よｐ、ｉａｙの／、３−フェニレイジアミン四酢酸、７
２ｇの無水酢酸および３９ｇのピリジンを６ｊ℃で２を
時間攪拌する。この混合物を冷却し、濾過する。分離し
た固体をベンゼンで洗浄し、乾燥する。それは、所望の
二無水物である。

９１Ｊ　／ Ａ、チロキシンをＥＤＴＡ二無水物に結合ｉｏｏｍｉの
フラスコを真空にし、炎乾燥し、次いで３サイクルの真
空および乾燥アルゴンの充填を行う。フラスコを冷却し
、Ｊυ１で製造したＥＤＴＡ二無水物≠３３９およびｊ
ｏｏｔｖのＬ−チロキシンナトリウム塩五水化物を充填
する。この甲状腺ホルモンは正常の成長および代謝に基
本的に重要なものであシ、市販されている。二無水物：
ホルモンのモル比は、ｔ：ｉである。

１０ｒｔｔｌのＤＭＦを添加すると、淡黄色溶液が得ら
れる。フラスコに箔の蓋をし、５５℃に９時間加温する
。スポットテストにより、ホルモンのすべてが二無水物
と反応して下記生成物を与えることが分る。

（５） ■１ Ｂ、残留無水物の加水 生成物（４）を単離しない。その代り、弘−の蒸留水を
フラスコに添加し、さらにｉ、ｚ時間加熱を続ける。こ
れによシ、残留無本物基は加水分解されてチロキシン結
合エチレンジアミン三酢酸が生成する。生成するトリ酸
およびＥＤＴＡを適当な濾過法によりＦ液として回収す
る。

Ｃ，ＥＤＴＡとトリ酸の分 上記Ｂの粗生成物を、充填シリカゲルカラムを介して溶
離剤としてエタノール：水（り！：Ｊ−）を使用し、次
いで♂Ｏ：〃りＪ−％水性エタノール：３０チ水性アン
モニアを用いて溶離する。トリ酸は、水性エタノール：
水性アンモニアで溶離され、ＴＬＣＫよシ純粋化合物と
して集められる。

ＮＭＲ１元素分析およびＩＲ定走査より、回収生成物は
アンモニウム塩として所望のチロキシン結合トリｅ　（
Ｃ）であシ、収率はり９％であることが証明される。

Ｄ、Ｃと希土類イオンの錯体の形成 上記のＣで回収されたチロキシン結合ジアミン三酢酸の
公知量を秤り取り、数ｍｌの０．／Ｎ　ＮａＯＨ・に溶
解する。数分以内に、化学量論的量の希土類ハライド（
特にこの例では塩化テルビウム）を添加し、混合して所
望の希土類（テルビウム）イオ７／−←チロキシン結合
ジアミンミ酢酸ｌ：ｌ錯体■）および妨害要因でない塩
化ナトリウムを含有する均質溶液を形成する。

Ｅ、Ｄとフラッダーとの三成分錯体の形成上記のＤのテ
ルビウム錯体の部分標本を１０ｖｒｌの水に導入し、約
、／θ−８モル濃度とする。１０−２モルＨｆのｓ−ス
ルホサリチル酸を添加してテルビウム：チロキシン結合
ジアミントリ酸：７ラツダ一錯体を形成する。約３３ｏ
ｏＸで励起すると、この錯体は、！≠！ｏＸで検出出来
る強い螢光を呈する。この螢光特性のチロキシンの分析
への応用を以下に示す。

１区 例１の調製をλつの変更を加えて繰シ返えす。

工程りで塩化テルビウムの代シに、塩化ユウロピウムを
使用する。フェナントロ’）ンをｊ−８ＳＡの代シに７
ラツダーとして使用する。この結果、ユウロピウムキレ
ートおよび例／で生成するテルビウム錯体に相当する三
成分錯体力３生成する。ユウロピウム錯体は、フェナン
トロリンフラッグ−と共に使用すると螢光性になシ、以
下に示す方法により溶液中に存在するチロキシンの量の
測定が可能になる。

例３ Ａ、ＥＤＴＡ二無水物へコレステロールを結合子加水分
解 １０ｍ１丸底フラスコを炎加熱によシ乾燥し、次いでア
ルゴンを充填する。次に、２００ｍｙ　（０，ｊＪｍｍ
ｏｌ）の再結晶コレステロールおよび６乙λ７．（Ｊ３
ｒ９　ｍｍｏｌ　）の調製ａ）の二無水物を仕込む。７
′ラスコを真空下で動労放置し、次いで、３ｍｌの乾燥
ＤＭＦを添加し、混合物をり０℃で３６時間保持する。

この期間中混合物は本質的に均質で無色の状態である。

それを室温に冷却し、３ｍｌの脱イオン水をさらに冷却
しながら添加する。沈殿が生成し、不均一混合物を７０
時間攪拌する。

この混合物を、ｌｌ０ｍ１のジエチルエーテル−アセト
ン（／　：＋）で希釈すると、さらに沈殿が生成する。

この混合物を濾過し、固体を１０　ｍｌのエーテル−ア
セトン混合物で洗浄する。戸液を集め、蒸発させ、追加
のエタノールで希釈し、さらに固体を生成させる。これ
を集め、前に集めた固体に添加する。乾燥後、３−２２
”’；’（理論量の弘ざチ）の所望のＮ−（エタノール
−０−コレステロール）エチレンジアミン三酢酸が得ら
れる。ＮＭＲおよびＴＬＣで分析すると、生成物は非常
に純粋でああことが分る。元素分析は所望の化合物と一
致する。

Ｂ、金属イオン錯体の形成 上記のＡの物質（３ｏＷ）を３ｍｌの。、／ＮＮａＯＨ
に溶解する。希土類金属イオン（テルビウムまたはジス
プロシウム）をほぼ化学量論的量（への化合物１モル”
４　ｔ）　ｉ、ｏｏ〜／、０区モル）で添加スる。これ
により、Ａの物質の希土類金属イオン錯体か生成する。

この物質は過剰のフラッダーの添加により促進すると、
螢光分析法に有効な螢光特性を示す。このフラッダーの
添加は例１と同様にして行われる。

３ヱ 簡単なアルカノールのＰ　合 イソプロパツール（／ｍｍｏｌ　）を１０ｒｎｌの乾燥
ＤＭＦと例３の方法によシ混合する。ｊｍｍｏｌの調製
ａ）の二無水物を添加し、混合物をり０℃で２１Ｉ時間
保持する。この結果、アルカノールのヒドロキシル基は
無水物と反応し、アルカノールはエステル形で結合され
る。このエステルは無水物単位の加水分解の前または後
で残留無水物と分離することが出来る。錯体はエステル
を所望の金属イオンと混合することにより形成すること
が出来る。

１ユ 巣なアミンの結ム 例≠の手順をλつの変更を行つて繰シ返えす。

ｉｆ、イソプロパツールの代υにエチルアミンを等モル
基準で使用する。第二に、反応条件の強さを軽減し、３
５℃の温度」使用する。エチルアミンは二無水物にアミ
ド形で付加する。

例弘で使用したインプロパツールの代りに、フェノール
、エチルチオールおよびジエチルアミンを用いて例弘の
結合を繰シ返えす０ジエチルアミンの場合、よシ低い温
度（３５°Ｃ）が使用されるＯこれらの繰り返えしによ
り、新しい出発物質の各りに基づく結合生″成物が生じ
るＯ所望なら、これらの生成物をさらに処理して金属イ
ーオン錯体を形成することが出来る◎ 例り 水性環境中でアミンの結合 ２つの追加の変更を加えて例５のカーフプリングを繰り
返えす。ＤＭＦ溶剤の代りに、水を使用し３５″（１，
Ｊ’時〜間の代りに、３０℃、？Ａ待時間使用するＯこ
れらの穏やかな条件で、より活性なアミン基が反応し、
アミンが二無水物に優先的に結合して所望のトリ酸が生
成する◇この反応は、水性環境におけるアミンと無水酢
酸との優先的反応と同じである（　Ｃａｌｄｗｅｌｌら
によるＪＡＣ８，Ａｌｌ、＃りｚ、（１９４Ｌ−２）参
照）０これはトリ酸を蛋白質および抗体に結合させるの
に好ましい方法である例１０ Ａ、チロニンをＰＤＴＡ二無水物へ結合乾燥フラスコに
、調製で製造したＰＤＴＡ二無水物Ａｍｍｏｌおよび市
販の供給原から得られる必須アミノ酸チロニン／　ｍｍ
ｏｌを仕込む０二無水物：チロニンのモル比は６：ｌで
あるｏｋＯｍｌ量のＤＭＦを添加し、生成する溶液をＪ
ｊ”Ｃに加温し、その温度で３０時間保持する０この混
合物をＴＬＣ板でスポーツトチストし、未反応チロニン
が存在せずかつ所望のチロニン結合プロピレンジアミン
三酢酸無水物を含有することが判明する◎ Ｂ、加水分解、分離および錯化 例１に示す一般的方法により、への無水物を現場で加、
水分解し、生成する過剰のＰＤＴＡとカラムクロマトグ
ラフィーにより分離する◎とれにより、所望のチロニン
結合三酢酸が得られる０所望のトリ酸の溶液をＬつの等
しい部分に分割する◇最初の部分（約Ｑ、Ｊｍｍｏｌの
トリ酸を含有すると推定・される）を水溶液としての！
−２ｍｍｏｌｅの塩化コバルトと混合する。この結果、
チロニン結合三酢酸のコバルトキレートが生成する０第
二の部分を県北テルビウムの溶液としての１７．−Ｚｍ
ｍｏｌのテルビウムと接触させる０この結果、トリ酸の
テルビウムキレートが生成するり例／の方法により、／
　ｘｌｏ　ｍｍｏｌｅ　のフラーＩダーである弘−アミ
ンサリチル酸を添加して／　：／　：／テルビウム／ト
リ酸／フラッダー錯体を形成する・第三部分を塩化物と
してのＩｎ１１１−　／−、Ｚｍｍｏｌに注意深く接触
させる・これに′よシ、チロニン結合トリ酸のＩｎｕｌ
　錯体が生成するり 例ＩＩ 例５の調製を１つの変更を加えて繰シ返えす・ＥＤＴＡ
二無水物の代シに、シクロヘキシレーン−！。

コーシアミン四酢酸二無水物を使用する。この結果、エ
チルアミン結合三酢酸が生成する。この化合物 をユウロピウムイオンと接触させてユウロピウム錯体を
生成し１次いでこのものを−ｉｏｇモル過剰の７ラツダ
ーである炭酸カリウムを添加して螢光的に活性な錯体に
変換する。この錯体は螢光技術により検出することが出
来る。

第一工程として、種結合ジアミントリ酸−′希土類金属
イオン錯体の螢光は、錯体の濃度に関連するという事実
を証明する。

チロキシン結合ジアミン三酢酸錯体の溶液のテルビウム
（例１のＤと同様にして調製）による連続的希釈を＋１
０’〜２．　！　Ｘ　１０−”　モルのチロキシン濃度
で行う。フラッグ−を添加する（１０””’モルのｊ−
スルホサリチル酸）６約１１．ｊのＤｌ＋で、各サンプ
ルの螢光を、ＩＭＭＵＮＯＦ’Ｌ、ＵＯＲＥＳＣＥＮＣ
Ｅ駅ＤＲＥＬＡＴＥＤ　５ＴＡＩＮＩＮＧ　ＴＥＣＨＮ
ＩＱＵＥＳ　、Ｋｎａｐｐ　らの編集、６７−♂０−　
Ｅｌｒｅｖｉｅｒ　／Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｂ
ｉｏ　−ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ　、　Ａｍｓｔｅ
ｒｄａｍ、　／７７ｇに記載されているタイムゲート螢
光計（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ　）　および測定技術を
用いて測定する。信号を対数一対数紙にプロットし、こ
の範囲で直線であることが分る。

曲線は限界検出値として約１０−２モルまで外挿するこ
とが出来る。検出限界は、螢光信号がブランクサンプル
からの信号変動に丁度等しくなる濃度である。ブランク
サンプルからの信号は、光倍率器暗ノイズおよびサンプ
ル容器、溶剤、緩衝液等からの残留背景信号を包含する
。直線プロットが得られるという事実は、タッグ種の濃
度をその螢光を測定することにより測定出来るというこ
とを示す０ この発見は、血漿中の未知濃度サンプルのチロオキシ濃
度を測定することによシ実用化される。

第一に、放射能免疫分析の場合のようにラインに沿って
標準曲線をつくる。非種結合チロキシンの連続希釈物を
チロキシン不含血漿で調製する。チロキシン不含血漿は
全チロキシン結合血漿蛋白質の変性を含む当業界で公知
の技術によりつくる。

濃度は／、２、≠、ｒおよび／ルμｇ／ｄｅであるｏｐ
Ｈｒ。

を調節し、一定量の錯体結合チロキシン（例１のＤ〕を
、チロキシンに対する一定量の抗体と共に各希釈物に添
加する。この混合物を通常の競争的結合条件で培養する
◇次いで抗体結合チロキシンおよび遊離チロキシンを、
硫酸アンモニウム沈殿、二重抗体沈殿、ポリエチレング
リコール沈殿、デキストラン−木炭沈殿、カラム分離等
の当業界で公知の分離工程を用いて分離する。次に、結
合分別を緩衝液に懸濁させ、フラッダーを添加し、前述
したタイムゲート法を用いて螢光を測定する。

観察された螢光を、標準サンプル中の未結合チロキシン
の濃度に対してプロットする０曲線をつくると、未結合
チロキシンのより大きい濃度では、結合物質は抗体場所
への競合能力が低く、観察されろ螢光はより低いことが
確認される。次に、つくった曲線を用いて未知サンプル
中のチロキシン濃度を測定する。

未知量のチロキシンを含有する血清サンプルの全チロキ
シンを分析する。まず、サンプルを酸性化して結合蛋白
質を変性し、チロキシンを結合から遊離させる。次に、
閾（調節後、サンプルを標準曲線の形成の際行ったよう
に１例／、ｌ）部のチロキシン結合、ジアミントリ酸金
属錯体の標準量および標準量のチロキシン結合で処理す
る。この混合物を前記と同様にして培養する。結合およ
び未結合物質を分離する。フラッダーを添加し、螢光を
測定する。未知サンプル中のチロキシン濃度を、観察さ
れた螢光に基いて標準曲線から読む。

ある場合には、ターゲット分子（検出すべきまたは測定
すべき分子）は、抗体である。たとえば、アレルギーに
かっている人間の患者の免疫グロビジン（ＩｇＥ　）抗
体の範囲を測定することは医学的に重要であり得る。患
者は、種々のアレルゲンに対して異なる量のＩｇＥ抗体
を有することが出来、適当な治療のためには、との分布
を知ることは重要である０血液または他の体液中のＩｇ
Ｅ抗体量を測定するために、問題のアレルゲンは公知技
術を用いて固相基質に共有結合され、基質は患者の体液
にさらされ゛る。適当な千件下で適当な培養期間後、基
質は取り出されそして洗浄されろ。固体基質上のアレル
ゲンに％異のＩｇＥ抗体の代表的量が基質上に存在し、
アレルゲンに結合されるＯ基質を、人間のＩｇＥに対す
るテルビウムキレートジアミントリ酸結合抗体にさらす
０この抗ＩｇＥ抗体は一般に含まれるアレルゲンとは無
関係に人間のＩｇＥの全サブクラス（５ｕｂ−ｃｌａｓ
ｓｅｓ　）に特異である。再び適当な条件下で第二の暴
露後、固体基質を再び洗浄し、７ラツダーたとえばタン
グステン酸ナトリウムにさらす。次に、好ましくは前述
したタイムゲートフルロオマイド（ｆｌｕｏｒｏｒｎｉ
ｄｅ　）を用いて螢光を測定する０公知量のＩｇＥを有
する各アレルゲンに対して公知技術法を用いて標準曲線
をつくることが出来、かくして、標準曲線との比較によ
り人間サンプル中の未知量のＩｇｎを測定することが出
来る。

Ｂ、細胞またはバクテリアに対する分析細胞またはバク
テリアはその表面に種々の分子マーカーを有することが
出来る。これらのマーカーはある場合には、確認、単離
または精製することが出来、そしてマーカーに特異の抗
体をつくるために使用することが出来るＯそのような抗
体は、本発明のジアミン）ＩＪ酸金金属錯体結合される
と、表面にマーカーを有するある細胞またはバクテリア
を確認するために使用することが出来る。細胞またはバ
クテリアは、ジアミントリ酸金属結合抗体にさらされ、
マーカＬが存在する場合、比較的高濃度の結合抗体が表
面に結合される。これらの細胞は、次に、螢光顕微鏡ま
たは螢光細胞流動系で調らべられ、そして螢光細胞また
はバクテリアがある一定の容積に対して計算され、かく
して細胞またはバクテリアの存在が定量的にまたは定性
的に判明する。

これらは、本発明の種結合ジアミン三酢酸錯体を用いて
行うことが出来る多くの可能な分析の２つの例に過ぎな
い０他の等価の方法を同様に使用することが出来る。

出願人代理人　猪　股　清 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、４　識別記号　庁内整理番号３３／）
３３　７９０６−２Ｇ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下式を有する種結合ジアミン三酢酸と本質的に１：
   １モルキｖ−）錯体にある金属イオンを含む金属キＶ−
   トおよびフラツダーを含むことを特徴とする螢光組合せ
   体。 〔式中、Ｒけ２個またはそれ以上の原子長共有結合ブリ
   ッジ、Ｔは−Ｎ−Ｈ，−Ｎ−Ｈ，−０−Ｈおよび−Ｓ−
   Ｈから選ばれる官能基を有する有槻種分子、Ｌはジアミ
   ン三酢酸のカルボニル炭素へＴを共有結合させる脱プロ
   トン形の上記官能基である〕。 ２、フラツダーがサリチＶ−トである、特許請求の範囲
   第１項に記載の螢光組合せ体。 ３、フラツダーが５−スルホサリチル酸である、特許請
   求の範囲第台項に記載の螢光′結合せ体。 ４、下記のａ〜θの工程を含むことを特徴とする螢光種
   結合ジアミン三酢酸を製造する方法。 ａ、−Ｎ−Ｈ，−Ｎ−Ｈ，−０−Ｈ，および−８−Ｈか
   ら選ばれる官能基を有する種分子１モル当シ少なくとも
   ４モルの下式 〔式中Ｒは２個またはそれ以上の原子長共有結合ブリッ
   ジでるる〕のジアミンニ無水物と約５〜約１００Ｃの温
   度で約０．５時間〜約２日の間液相で接触させる工程、 跣　残留無水物基を加水分ｗＫ、＋る工程、Ｃ５■程す
   で生成する種結合ジアミン三酢酸を回収する工程、 已　回収された種結合ジアミン三酢酸を、この三酢酸と
   螢光錯体を形成し得る希土類金属イオンの溶液と接触さ
   せる工程、および ｅ、上記螢光錯体を実質的にモル過剰量のフラツダーと
   接触させる工程。 ５、下記のａおよびｂの工程を含む、特許請求の範囲第
   １項に記載の螢光組合せ体を螢光分析する方法。 ａ、上記螢光組合せ体を少なくとも１つの放射線パルス
   で励起する工程でろって、上記パルスは、上記螢光組合
   せ体の螢光崩壊ライフタイムに比較して短いパルス期間
   を有する工程および す０周囲物質の螢光が実質的に崩壊した後に、上記螢光
   組合せ体の螢光を測定する工程。 ６、螢光組合せ体がチロキシン結合ジアミン三酢Ｍｌ　
   −ｆルビラム−５−スルホサリチル酸錯体であり、放射
   線が約３３００Ａの波長を有し、そして検出が約５４５
   ０Ａの波長で行われる、特許請求の範囲第５項に記載の
   方法。