JPS6189557A - 硫黄−３５による有機分子の標識化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、硫黄−３ｓ　（Ｓ−３５）　　で有機分子、
とくに有機高分子を標識化された分子に標識する方法及
び試薬そしてそれらのオートラジオグラフィーに於ける
利用に関するものである。５−３５＋１８７．２日の半
減期を持ち、０．１６７メーガエレクトロンボルトのエ
ネルギーのイータ粒子の生成を伴い崩壊する。非放射性
同位体を含まない５−３５は約１５００キユリー／ミリ
モルの比活性を持ち、これは、市販されており利用する
ことができる。５−３５を含む栄養物を適当な微生物に
資化させ、希望の化合物を合成させる方法では、限られ
た範囲の有機化合物（含硫アミノ　酸やタウリンを含む
もの）しか生産されることがない。ポＩＪ　６プチド類
では各々を５−３５で標識したアミノ酸の利用を含む骨
の折れる方法によって合成は可能である。他の化合物は
、同位体交換の技術や他の合成法で標識することが可能
だが、一般に低い比活性を示すもののみである。標識さ
れるべき化合物の特定のかつ希望の基を標識する５−３
５標識試薬に関しては、一般的なものは無い。

対照的に、ｌ−１２５標識試薬については、数多く報告
が有り、特に蛋白質やポリはプチドの標識にもひろく利
用されている、アミノ基とカップリングする試薬で最も
よく知られているのは、ポルトン−ハンター（Ｂｏｌｔ
ｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ）試薬であり、これはニー１２５で
標識化した３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン
酸Ｎ−サクシニミジルであってジュイ、ジュイ、ランゴ
ノ（Ｊ、Ｊ、Ｌａｎｇｏｎｅ）のメンツズ　イン　エン
ザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ）　、　７３　、６　、１１２−１２７　の総説に
著されている通りである。もう一つの同様な試薬は、ｔ
ｅｒｔ−ブトキシカルボ＝＃−Ｌ−（ニー１２５）ヨー
ドチロシン　Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステルであ
りこれは、ポルトン・ハンター（Ｂｏｌｔｏｎ−ＥＩｕ
ｎｔｅｒ）　　試薬より優れている、反応後のペプチド
が簡単に保護基をはずすことができ、出発物質と同じ電
荷を持つ標識化合物にすることができるという利点を有
する。

■−１２５で標識された蛋白質やポリはプチドは、オー
トラジオグラフィーによる分析にひろく利用されている
。この方面への応用には、５−３５で標識された蛋白質
やポリはプチドはニー１２５で標識したものと比べより
短い感光時間と優れた分解能（検体のパンＰやスポット
のうち近接しているもの同志を区別できる能力）を、与
えることかできる。トリチウム標識試薬、例えばＨ−３
プロピオン酸Ｎ−サクシニミジル（（３ＥＩ）ＮＳＰ）
、についても報告はよ（なされている。（３Ｈ）ＮＳＰ
で標識された分子は１００キュリー／ミリモル１１換ア
ミノ基末端の比活性のものにしかならず、それゆ１ｓ−
３５で標識された分子より低い感度のものとなる。すな
わち、蛋白質やポリ、、１プチドな５−３５で標識する
ための一般的な方法及び試薬が望まれている。本発明は
その要求を満たすうえに、現在のニー１２５標識試薬を
利用する方法に比べ安全性が向上している。

第一の特徴として、本発明は反応性の有する基を持つ有
機分子の標識化の方法をもたらすもので、その方法は、
合価アミノ酸やタウリンを人工的に高濃度で５−３５で
標識したものの誘導体であり該有機分子の反応性基と反
応性のカップリング基を持つ標識試薬を用意すること、
及び反応性基とカップリング基との反応によって標識試
薬と有機分子とがカップリングする条件下で有機分子と
標識試薬を共存せしめることから成るものである。

もう一つの特徴は、本発明は、合価アミノ酸やタウリン
を人工的に高濃度で５−３５で標識したものの誘導体で
あり、標識すべき有機分子の反応基に対して反応性のあ
るカップリング基を持つ標識試薬を供与するものである
ことである。

本発明の方法は、標識試薬と有機分子をカップリングさ
せることを′含む、有機分子の性質は重大なことでばな
いが、本発明は、高分子との関係に於いては特に重要で
ある。例えば、蛋白質とポリはプチドはプロテインブロ
ツテインク（ｐｒｏｔｅｉｎｂｌｏｔｔｉ、ｎｇ）への
応用として広（利用されており、この方法で有利に標識
することができる。／ｌ！′機分子は反応性のＭる基を
持つが、唯一の必要条件はそれが標自ト試薬のカップリ
ング基と反応することであるから、その性質は重大なこ
とではない、蛋白質やポリペプチドにおいては反応性の
有る基とは、一般的に言って第一級アミノ基あるいはチ
オール基であろう。他に可能性があるのは、フェノール
性水酸基、脂肪族性水酸基、イミダゾール及びグアニジ
ル基であろう。

標識試薬は、合価アミノ酸、例えばシスティン、システ
ィン酸、シスチンそして、特にメチオニン、及びタウリ
ンの誘導体である。二つまたはそれ以上の別々の異性体
が存在する場合にはこれらのアミノ酸のｄ−または！−
異性体を用いてもよく、あるいは異性体の混合物でもよ
い。　　　　゛その試薬は一般的には少なくとも１キュ
リー／ミリモルの比活性にて人工的に高濃度にされた５
−３５で標識され、この程度で充分な比活性となる用途
もいくつか有る。オートラジオグラフィーを含む他の用
途には１００キュリー／ミリモル以上できれば１０００
キュリー／ミリモル以上の高い比活性が要求される。こ
れらの標識試薬は、各々の標識されたアミノ酸から調製
することができるが、これら全ては高い比活性のものが
市販されている。アミノ酸を基にした５−３５標識試薬
の長所は高い比活性のものが調製できることであるが、
このことは５−３５で標識化した化合物に一般的にあて
はまることではない。

標識試薬は、標識すべき有機分子の持つ反応性のある基
と反応するカップリング基を持つ。必ずという訳ではな
いが、通常カルボキシル基が修飾されてカップリング基
となる。よく用いられるカップリング基は、カルボジイ
ミドの存在下でカルボン酸とＮ−ヒドロキシルサクシニ
ミト９の縮合でそしてこれは穏やかな反応条件で一級ア
ミノと容易にカップリングをする。

もう一つ似たカップリング基は、水溶性を向上させたＮ
−スルホサクシニミジル基であり、Ｎ−ヒドロキシスル
ホサクシニミドから誘導される。

マレイミドを基本形とするカップリング基はチオール基
との反応に適している。ヒト°ラジドを基本形とするカ
ップリング基は炭水化物との反応に適している。他、多
くのカップリング基について文献として報告されており
使用してもよい。ザラジオケミカルセンター　テクニカ
ル　ブリティン（Ｔｈｅ　ＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａＩ
Ｃｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｘ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
）７９／６に１蛋白質標識試薬と応用への参考１として
完壁ではないが、表が与えられており、蛋白質やポリは
プチドの異なった反応性のある基について、各々に適し
た反応と標識試薬とについての参考文献が載っている。

本発明に含まれる標微試薬のアミノ基は、自己縮合が起
こらぬように採掘する必要が有る。アミノ保ａ基につい
ては文献に詳しく記載されている。

広汎な記載のある本としては、「有機合成に於ける保護
基Ｊ　（”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ
　ＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”）、ティー、ダ
ブル、グリーン著（Ｔ、Ｗ、Ｇｒｅｅｎｓ　）、１９８
１　ジュイ、ワイリー　アンド　サン（Ｊ、Ｗｉｌｅｙ
＆　５ｏｎ）があり２１８は−ジを参照せよ。特に重要
なアミノ保護基は以下のとおりである： 酸性条件下で開裂する： １、　カルバミン酸　ｔ−゛ブチル ２　カルバミン酸　１−メチル−１−（１−アダマンチ
ル）エチル ３、カルバミン酸　２−トリメチルシリルエチル塩基性
条件下でしく１裂する： １、　カルバミン酸　９−フルオレニルメチルｚ　カル
バミンＧｆ９−（２−スルホノフルオルニルメチル３、
カルバミン酸　２−ホスホノエチル４、カルバミンｄ　
　１，１−ジメチル−２−シアノエチル５、アセトアミ
ド　ピリジニウム 中性条件下で開裂： １、　カルバミン１ン　８−キノリル 光分解で開裂： １、　カルバミン酸　メタ−ニトロフェニルこれらの逆
洗、保護基としては、芳香族アジド基のような光活性化
を受ける基となるように選択することができ、高い比活
性の放射性と光年安定性の二機能性の試薬をつくること
がある。光アフィニティー試薬についての総説は［生化
学と分子生物学における光生成試薬Ｊ　（’Ｐｈｏｔｏ
ｇｅｎｅｒａｔｅｃｌｒｅａｇｅｎｔａｉｎ　ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕ　ｌａｒｂｉ
ｏｌｏｇ’）、エイチ、ベイリー署（Ｈ，Ｂａｙｌｅｙ
）、１９８３（エルセピア（ε１ｓｅｖｉｅｒ）　）　
　という本に記されている。光活性化を受ける基は、活
性比されると近接したものと無差別に反応する。それゆ
え特定の反応性ある基を狙って反応させることはできな
い。

この理由のため、本発明においては、このような光活性
化をうける基をカップリング基として利用することにつ
いて考えていない。

代りにアミノ１９．のアミノ基をＮ−サクシニミジルや
ヨードアセチルなどに変えてカップリング基を作ること
が可能である。こういう場合、カルボン酸はエステル化
して保１ｉ３ｉすればよい。本発明による望ましい標識
試奈は以下の式で表せられる。

ｅ）　タウリ：／　　　　　ＨＯ３”ＳＣＭ２ＣＭｍｆ
）　　（ａｌ、１１））、（ｃ）ｌｄｌの脱炭酸誘導体
　すなわちＺ＊５ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＹ　等々（Ｒ
） ｇ　ｇ）　　１ａｌ（ｂ）（ｃ）［ｄ）の脱アミノ化誘
導体　すなわちｚ＊５ｃａ２ｃａ２ａＨ２ｃｏＹ等ｈ ＲＩ 以上（Ｄ　ｔｊｃ　式中テ＊３は人工的に高１１Ｆｉｔ
に５−３５を含むＳを示すものとする。

Ｒはないか或はあれば０か０２かアルキル基を示す。

Ｘは三級ブトキシカルボニルや光年安定化するような保
護基を示す。

ＹはＮ−サクシニミジルのようなカップリング基を示す
。

モして　Ｚは不活性な、例えばアルキル基又は光子安定
な基を示す。

これら標識された試薬は、標識されたアミノ酸やタウリ
ンから標準的な化学合成の経路で調製できる。

次に挙げる反応の図式１から５は、関連する化学反応を
要約したものである。これらの図式の甲には以下の略号
が使われている。

＊Ｓ　は５−３５の濃度を上昇させであるＳを示す。

ＢＯＣはｔａｒｔ−ブトキシカルボニルを示す。

ＮＨ３はＮ−ヒドロキシサクシニミド、又は（標識化合
物の部分をなす時は）Ｎ−サクシニミジルを示す。

ＢＯＣ−ＯＮは２−（ｔθｒｔ−プトキシカルボニルオ
キシイミ／）−２−フェニルアセト￥トリルを示す。

ＤＣＣはジシクロへキシルカルボジイミドを示す。

ｐｅｒ　ＴＦＡは過三フッ化酢酸を示す。

ＭＣＰＢＡはメタクロロ過安息香酸を示す。

これらの要約は、全てを網碌しようとするものではない
、従って図１式１でメチオニンをもとにしたどの試薬も
酸化してスルホンかスルホキシドにすることもできる丁
これらの反応につ（・て一つの試薬についてのみしか例
示してはいないが。

更に図式１．２．３と４それぞれにおいて、示されては
いないが、どのアミノ酸も脱炭酸、脱アミノ化のどちら
も可能であるであろう。脱炭酸や脱アミノ化は通常、誘
導体化前に行なうものであろう。このような脱炭酸もし
くは脱アミノ化したアミノ酸を基にした標識試薬はカッ
プリング基を持つが保護基は持たないであろう。

本発明によって標識されるべき有機分子の性質は重大な
ことではない。この方法により標識可能な高分子の種類
には、核酸、オリゴサツカライド、ポリサッカ２イド、
ヘテロポリサッカライドが含まれる。しかし本発明は、
特に蛋白質とポリペプチド９の標識に重要であるといえ
よう。なお、蛋白質とポリペプチドという語は定義され
る範囲も広く糖タンパク、リポタンツク、核タンツク、
ムコタンパク、ヘムタンパク及びレクチンをも含む。

他の化合物で、有効に標識できるものは、ビオシチンの
ようなビオチン類似体とヨード０ピンやアジドピンとい
ったカルシウムチャンネル阻害剤類似体及び関連化合物
等である。

本発明の方法は、反応性のある基を持つ有機分子、と（
に多くの反応性のある基を持つ蛋白質やペプチドのよう
な高分子と標識試薬とを反応させることである。この反
応の化学は、標準的でありその標識試薬のカンプリング
基の性質に依存する。

蛋白質とベプチｒを標識することについて、本反応はポ
ルトン−ハンター（Ｂｏ１ｔｏｎ４ｕｎｔｅｒ）試薬に
よっておこる反応と似たものである。しかしポルトン−
ハンター試薬は、分離して極小量の揮発性の１２５工２
を遊離するという欠点を持つことが知られている。ニョ
ウ化化合物についてこの欠点は確かにとても現実的問題
である。この理由で、使用前のベンゼン留去の際活性炭
のトラップを使うの、つ・普通である。本発明の５−３
５標識試薬はこの欠点がない。

例として、蛋白質のリジンのイプシロン位のＮＨ２基と
メチオニンをもとにした標識試薬との反応は次のように
すること１ノ・できる。

ここで保護基Ｘは、つけたままにしておくこともできる
しはずして−級アミノ基を生じさせることもできる。は
ずした時は、これによりもとの分子と同じ電荷を持たせ
ることができる。Ｘが光活性化する基とすれば、例えば
受容体といった別の蛋白質に標識試薬／蛋白質複合体を
クロスリンクするように、これを活性化することが可能
である。

別の特徴として、本発明は、少なくとも５０キュリー／
ミリモルうまくすれば少なくとも１００キュリー／ミリ
モルの比活性にて５−３５で標識し蛋白質やポリペプチ
ドのような高分子をも含む。

本発明による方法がこれだげ高い比活性での高分子の標
識化をはじめて可能にしたものである。

本発明の方法で我々が標識した化合物としては、プロテ
ィンＡ１抗マウス免疫グロブリン全抗体、抗ウサギ免疫
グロブリン全抗体及びストレゾタビジンがある。同様の
方法で標識可能な化合物としては、Ｆ（ａｂ’）２フラ
グメント、蛋白質の分子量マーカー及びレクチンがある
。

これらの化合物は、人為的に５−３５を高濃度に含ませ
た含硫アミノ酸から誘導された試薬で修飾された側鎖を
持つという特徴を持つ。これら生成物のうちの多くは、
各々独立した新物質であり、本発明の範囲内に含まれる
ものである。標識された化合物は、分子中の反応性の基
の数や試薬と反応基質のモル比によって通常少なくとも
１キュリー／ミリモルの比活性を持ち、うま（すると５
０キュリー／ミリモル以上の比＠性を持つ。

５−３５で標識された生成物は、オートラジオグラフィ
ーを含む応用面で特に価値あるものである。この手法で
は放射性標識された物質の上に直接写真のフィルムを置
く。銀ハロゲン化物の結晶がエマルジョンの甲にあり、
５−３５より放射されるベータ粒子に反応する。飽和状
態になるまでは放射されたベータ粒子の数が増えるに従
いフィルムはより黒くなる。

本文に記された試薬は、蛋白質をボリアクリルアミツゲ
ルから膜（例えばニトロセルロース）の表面に移してか
ら免疫化学的方法で検出を行なうプロッティング（ｂｌ
ｏｔｔｉｎｇ）　実験に、特に有用である。この手法に
ついては、ジエイ、エム、ゲルショニ（Ｊ、Ｍ、Ｇｅｒ
ｓｈｏｎｉ）らによりアナリテイカルバイオケミストリ
ー誌（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）１３１１−１５（１９８３）に総説が著されている
。

蛋白質のプロッティングに最も広く利用されている放射
活性の検出試薬は、ニー１２５で標識された蛋白質及び
ポＩＪ　ｄプチドである。しかし５−３５で標識された
蛋白質及びポリはプチドはこれに比べいくつか長所を持
つ。それは次のようなことである。

ａ）Ｓ−３５の半減期（８１２日）はニー１２５の半減
期（６０日）より長い。

ｂ）ポルトン−ハンター（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ
）試薬を使ってのニー１２５での蛋白質やポリはプチド
の標識化に於いては、前述の様に、揮発性の１２町２に
より幾分危険である。

０）■−１２５より生ずるガンマ想は、写真のフィルム
を通り抜けてしまい、それゆえ放出されるエネルギーの
うちのわずかだげがフィルムにとらえられ、フィルムに
記録されることになる。はとんどのエネルギーは無駄に
なるのである。この問題は、増感スクリーンの利用（フ
ィルムを増感　”スクリーンと試料の間にはさんで行な
う）によっである程度解決されるが、この感度の改善は
、分解能を犠牲にすることによって得られ総体的に、我
々の研究によれば、ニー１２５で標識した化合物の代り
に５−３５で標識した化合物を使えば感度と分解能の向
上が同時に得られることがわかった。

これらの長所があるにもかかわらず、オートラジオグラ
フィーを検出法として利用する時、５−３５で標識され
た蛋白質やポリはプチドがニー１２５でラベルされたも
のにとってかわっていないということは、驚りべきこと
である。この理由は、一般式な５−３５標識試粟がなか
ったことと高い比活性の標識化合物の調製することが難
しいということのためだと考えられる。本発明による標
識試銚と調製法はこの問題を解決するはずである。

５−３５標識化合物とニー１２５標識化合物はいっしょ
に使って二重オートラジオグラフィーの手法に利点を与
える。試料を、一部分を５−３５で標識し、別の部分を
ニー１２５で標識することでオートラジオグラフィーに
適したものとする。

試料の上に写真のフィルムをのせ、次に紙をのせそして
第二の写真フィルムをのせる。第一のフィルムは５−３
５とニー１２５の両方の放射性輻射を記録し第二のフィ
ルムはニー　１２５からのもののみを記録する。従って
二つの蛋白質の場所と濃度（あるいは他の化学種につい
てのこれらのこと）の試料中での値がわかる。これが−
回のオートラジオグラフィー実験でわかるのである。

標識試薬は組織切片上の受容体の分布をオートラジオグ
ラフィーで研究をするのに利用するために受容体結合物
質を標識するのにも利用できる。

現時点では、Ｈ−３とニー１２５とがこの研究に利用さ
れている。例えば、 アール、クイリオｙ　（Ｒ，、Ｑｕｉｒｉｏｎ）ら、ラ
イフサイｘン、ｘ、誌（Ｌｉｔｅ　５ｃｉｅｎｃｅ）　
３３　、２２７−２３０（１９８３）及びシー、ダブル
、シュルツ（Ｃ，Ｗ。

５ｈｕ１ｔ）ら、ベプチズ誌（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）　３
　１０７３−１０７５（１９８３）。これらの受容体は
極微量しかないので３Ｂを利用してのオートラジオグラ
フに１−３ケ月を要する。

５−３５の高い比活性と高ベータエネルギー（、［（−
：ｌ）０．０１８６メガエレクトロンボルトに比べ５−
３５のは０．１６７メガエレクトロンボルト）とは、５
−３５で標識した結合物質を用いれば、感光時間を太い
に短縮する。ｌ−１２５の検出にはよく増感スクリーン
が利用されるが、結果として分解能を悪くする。５−３
５には、こういうものは不要でこのための分解能の劣下
もない。

以下の実施例は、本発明を例示するものである。

実施例１はメチオニンを基にした標識試薬の調製法につ
いて述べたものである。

実施例２は実施例１の標識試薬と反応させて蛋白質を標
識する方法について述べている。

天施例３は５−３５とニー１２５で標識された蛋白質を
用いた二重標識の実験について述べている。

実施例４はニー１２５で標識した蛋白質のかわりに５−
３５で標識したものを使ったオートラジオグラフィーで
より良い分解能と短い感光時間が可能であることを示す
実験について述べている。

実施例１ を経て調製する。メチオニンのアミノ基を、ｔθｒｔ−
ブトキシカルボニル基（ＢＯＣ）で保護し、ジシクロヘ
キシルカルボジイミト”　（ＤＣＣ）を使いメチオニン
とＮ−ヒドロキシルサクシニミドを縮合させてカルボキ
シル基を活性化する。生成物をＨＰＬＣテ精製する。

Ｎ Ｂ ｂ）Ｎ回、’ＤＣＣ 実験法 ３５Ｓ、メチオニン（ＳＪ２０４．２キユリー、５０ミ
サギユ＋１　　／々１１１トソにル　ｌ−１／活轢Ｃ８
Ａ１’＞　１ｎｎＯキュリー／ミリモルジオキサン溶液
）３０ミリリツトルの水浴液を攪拌しトリエチルアミノ
１００マイクロリツ、トル（トリエチルアミノ２３４マ
イクロリツトル／ミリリツトルジオキサン溶液）と２−
（ニーブトキシカルボニルオキシイミノ）−２−フェニ
ルアセトニトリル（ＢＯＣ−ｆＭ）　１６０マイクロリ
ツトル（５００ミリグラム／ミリリツトルジオキサン溶
液）を加える。その反応物を３時間室温で攪拌スる。ジ
オキサンの大部分を減圧下でロータリーエバポレーター
で留去し水屋は酢酸エチルで抽出（１０ミリリツトルず
つ２回）する。その水層に酢酸エチル１０ミＩＪ　ＩＪ
ットルと５パーセントクエンハ浴液１．４　ミ＋）　＋
）ットルを加え、その混合物室温で１０分攪拌する。有
機層と水層を分離し、更に水層な酢酸エチルで（１０ミ
リリツトルずつ４回）抽出する。減圧により酢酸エチル
を完全に除き、乾燥したジオキサン４０ミリリツトルＩ
Ｃ交換する。ジシクロへキシルカルボジイミド１６０マ
イクロリツトル（５００ミリグラム／ミリリツトルジオ
キサン浴故）を加えて後Ｎ−ヒドロキシサクシニミド１
２５マイクロリットル（４００ミリグラム／ミリリツト
ル乾燥ジオキサン溶液）を加え攪拝したまま室温で一晩
おく。沈澱となったジシクロヘキシル尿素を濾別し残っ
た溶液なＨＰＬＣで精製する。その生成物は以下に記述
する多くの標識化反応における挙動により、ＨＰＬＣ及
びＴＬＣ上で市販されている基準試料０ト標識化合物）
と比較・確認した。収率〜２５パーセント、　　ＳＡ＞
１０００キュリー／ミリモル過沃素酸テトラブチルアン
モニウムを使うことにより酸化型の試薬を得ることがで
き、これはより安定で水に可溶性の生成物を与える。シ
スティン、システィン酸及びシスチンに由来する標識試
薬も同様にして得ることができる。

実施例２ ｊ −〇−ＮＨ−ＣＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ２３５ＳＬＲ（
，０ ■ ｆ１ 区 実験法　３５ＳＬＲ（ｌミリキュリー／ミリリットルば
／ゼン溶液）　１０　ミＩＪキュリーを緩やかな乾燥窒
素気流下で蒸発乾固する。反応容器の内壁を１００マイ
クロリツトルの乾燥ベンゼンで注意深く洗い、ベンゼン
を窒素気流下で留去する。その反応を氷冷し蛋白質（１
０ミリグラム／ミリリットル燐酸緩価ｇ（ｐＨ＆６）溶
液）を加える。、３０分後手ロシン水溶液（１８ミリグ
ラム／ミリリツトル）１００マイクロリツトルを加え反
応を終了させる。生成物の精製はセファデックスＧ２５
でのクロマドグ之フィーによって行なう。収率２〇−５
０ノーセント５Ａ２００−１０００キュリー／ミリモル
（蛋白質に含まれるＭＨ２量と蛋白質と使用した３５Ｓ
ＬＲのモル比とに依存）この反応を利用して５−３５標
識化されたものとしては、 プロティンＡ ７７チ一マウス免疫グロブリン全抗体、アンチ−ウサギ
免疫グロブリン全抗体、ストレプタビジン 生成物の性能は、プロティンプロッティング（ｐｒｏｌ
；ｅｉｎ　ｂｌｏｔｒｉｎｇ）実験における挙動により
検定し、また反却の１２５ニ一標識化化合物と比較した
。

実施例３ 二重標識 ３５Ｂ及び１２５工で標識したプロティンＡと特異的な
第二抗体は二つのフィルムを使う１回のオートラジオグ
ラフィー過程での蛋白のプロット（ｂｌｏｔ）において
、同−試料中の二つの抗原を検出、区別する機会を与え
る。

ヒト脳のホモジェネートを５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルで電気泳動しニトロセルロースにうつしとった。そ
のプロットをβ−チューブリンに対するモノクローナル
抗体続いて３５Ｂで標識した抗マウス免疫グロブリン抗
体（５マイクロキュＩＪ−１比活性〜２４０キュリー／
ミリモル）にて探索しそしてさらにα−チュー゛プリン
に対するモノクローナル抗体、引き続いて　　工で標識
した抗マウス免疫グロブリン（５マイクロキユリー、比
活性〜１６００キュリー／ミリモル）にて探索した。

次にこの上に直接３５Ｓと１２５工（すなわちαとβ−
チューブリン）を検出するフィルムを置き、このフィル
ムの上に紙をおいてその上に１２５１スなわちα−チュ
ープリンのみを検出する第二のフィルムをおくことでオ
ートラジオグラフィーを行なった。

実施例４ ３５Ｂで標識した蛋白質を使う場合の短い感光時間と高
分解能についての利点を示すために、３５Ｓで標識した
抗ウサギ免疫グロブリン抗体と　　エでライルした同じ
ものとをヒトの脳のホモシェードを使う実験系で比較し
た。ヒト脳ホモジエネー）（２００マイクログラム蛋白
質）を５ＤＳ−ｙｔソリアクリルアミド上電気泳動しニ
トロセルロース上にうつしとってからヒト大脳に対する
ウサギ抗血清にて探索した。抗原抗体複合物は３ＳＳで
標識した抗ウサギ免疫グロブリン抗体（５マイクロキュ
リー；比活性〜２４０キュリー／′ミリモル）か１２５
工で標識した同じもの（５マイクロキュリー；約１６０
０キユリー／ミリモル）のいずれかで検出乞行なった。

３５８−で標識した蛋白質を使った場合にバンドがより
はっきりと分かれていた。

はっきりと分かれたバンドの像を得るのに３５８で標識
した抗ウサギ免疫グロブリンを用いると四時間以内の感
光時間で充分であったが、一方、１２５工で標識した試
薬を用いると増感スクリーンを使っても１６時間は必要
であった。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）人為的に高濃度にＳ−３５で標識された含硫アミ
   ノ酸またはタウリンの誘導体であり、かつ有機分子の反
   応性のある基に対して反応性があるカップリング基（ｃ
   ｏｕｐｌｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ）を持つ標識試薬を作製し
   、そしてその反応性のある基とカップリング基との反応
   でその標識試薬とその有機分子を結合させる条件下でそ
   の標識試薬とその有機分子を連結させることを特徴とす
   る、反応性のある基を持つ有機分子の標識方法。
2. （２）該有機分子が、蛋白質とポリペプチドから選択し
   た高分子であるものとする特許請求の範囲第（１）項に
   記載の方法。
3. （３）その反応性のある基がリジンのイプシロン位のア
   ミノ基若しくは、Ｎ末端の一級アミノ基であるものとす
   る特許請求の範囲第（２）項に記載の方法。
4. （４）その標識された有機分子が少なくとも５０キュリ
   ー／ミリモルの比活性を有するものとする特許請求の範
   囲第（１）項より第（３）項のうちのいずれかの項に記
   載の方法。
5. （５）該有機分子がプロテインＡ、抗マウス全抗体、抗
   ウサギ全抗体及びストレプタビジンから選択した蛋白質
   であるものとする特許請求の範囲第（１）項より第（４
   ）項のうちいずれかの項に記載の方法。
6. （６）人為的に高濃度にＳ−３５で標識された含硫アミ
   ノ酸またはタウリンの誘導体であり、標識されるべき有
   機分子の反応性のある基に対して反応性があるカップリ
   ング基を持つ標識試薬。
7. （７）その含硫アミノ酸がメチオニン、メチオニンスル
   ホキシド、メチオニンスルホン、システイン、システイ
   ン酸及びシスチンから選択されるものとする特許請求の
   範囲第（６）項記載の標識試薬。
8. （８）そのカップリング基がＮ−サクシニミジルまたは
   Ｎ−スルホサクシニミジル基であるものとする特許請求
   の範囲第（６）項または第（７）項記載の標識試薬。
9. （９）いずれのアミノ基も保護基で保護されているもの
   とする特許請求の範囲第（６）項より第（８）項のうち
   いずれかの項に記載の標識試薬。
10. （１０）その保護基が光活性化可能でそれによつて該試
    薬を二機能性にするものとする特許請求の範囲第（９）
    項に記載の標識試薬。
11. （１１）以下に示す式のうちのいずれかを有する特許請
    求の範囲第（６）項より第（９）項のいずれかの項に記
    載の標識試薬 ａ）（メチオニン）▲数式、化学式、表等があります▼ ｂ）（システイン）▲数式、化学式、表等があります▼ ｃ）（システイン酸）▲数式、化学式、表等があります
    ▼ ｄ）（シスチン）▲数式、化学式、表等があります▼ ｅ）（タウリン）ＨＯ＿３＾＊ＳＣＨ＿２ＣＨＮＨＹ ｆ）前記（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）の脱炭酸誘導体、す
    なわち▲数式、化学式、表等があります▼など ｇ）前記（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）の脱アミノ化誘導体
    、すなわちＺ＾＊ＳＣＨ＿２ＣＨ＿２ＣＨ＿２ＣＯＹな
    どただし＾＊Ｓは人為的に高濃度にＳ−３５を含むＳを
    意味する。 Ｒは無いかあるいはあればＯ又はＯ＿２又はアルキル基
    を意味する。 Ｘは保護基である。 Ｙはカップリング基である。そして Ｚは不活性基または光不安定性の基である。
12. （１２）Ｓ−３５で標識され少なくとも５０ミリキュリ
    ー／ミリモルの比活性を有する蛋白質及びポリペプチド
    から選択した高分子物質。
13. （１３）その標識基が特許請求の範囲第（６）項から第
    （１１）項のうちのいずれかに記載した標識試薬のその
    残基であるものとするＳ−３５で標識された蛋白質及び
    ポリペプチドより選択した高分子物質。
14. （１４）固体膜と、検出されるべき分子に対して反応性
    を有する放射性標識された物質とを接触させ、未反応標
    識化物質を除き、その膜をオートラジオグラフィーにか
    けることがら成る方法において、標識物質がＳ−３５で
    標識されていることを特徴とする固体膜に付着した分子
    の検出方法。
15. （１５）組織切片と、検出されるべき受容体に対して反
    応性を有する放射性標識された物質とを接触させ、未反
    応標識化物質を除き、その組織切片をオートラジオグラ
    フィーにかけることから成る方法において標識物質がＳ
    −３５で標識されていることを特徴とする組織切片中の
    受容体の検出方法。
16. （１６）その放射性標識された物質が特許請求の範囲第
    （１２）項または第（１３）項で請求した高分子である
    ものとする特許請求の範囲第（１４）項または第（１５
    ）項記載の方法。