JP3174729B2 - アクリジン誘導体、その製法およびこれを用いた標識法 - Google Patents
アクリジン誘導体、その製法およびこれを用いた標識法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なアクリジン
誘導体に関し、更に詳細には、アミノ酸、蛋白質等の被
測定物質に含まれるＳＨ基に結合することができ、化学
発光標識物質として有用なアクリジン誘導体、その製法
およびこれを用いた標識法に関する。
誘導体に関し、更に詳細には、アミノ酸、蛋白質等の被
測定物質に含まれるＳＨ基に結合することができ、化学
発光標識物質として有用なアクリジン誘導体、その製法
およびこれを用いた標識法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アクリジン誘導体であるアクリジニウム
エステルは、高い発光効率を持つことから化学発光標識
物質として有用である。 このアクリジニウムエステル
を臨床検査の免疫発光分析におけるケミルミネッセント
ラベルとして使用することについては、例えばヨーロッ
パ特許出願公開第８２６３６号や米国特許第４７４５１
８１号明細書に開示されている。
エステルは、高い発光効率を持つことから化学発光標識
物質として有用である。 このアクリジニウムエステル
を臨床検査の免疫発光分析におけるケミルミネッセント
ラベルとして使用することについては、例えばヨーロッ
パ特許出願公開第８２６３６号や米国特許第４７４５１
８１号明細書に開示されている。
【０００３】既知のアクリジニウムエステルの中には、
末端にスルフィニウムイオンを有するもの（特開平５−
２５５２６４号）、スペーサー部にヒドラゾニウムイオ
ンを有するもの（特開平５−２５５２６３号）やアクリ
ジニウムのメチル基などをカルボキシル基に代えたもの
（特開平６−２２８１０２号）等親水性構造を有するも
のが知られているが、これらの親水性構造を有するアク
リジニウムエステルは実質的にアミノ基を標識すること
を目指すものであり、アミノ酸や、蛋白質等を標識し、
臨床検査の免疫発光分析におけるケミルミネッセントラ
ベルとして使用するのに適した化合物とされている。
末端にスルフィニウムイオンを有するもの（特開平５−
２５５２６４号）、スペーサー部にヒドラゾニウムイオ
ンを有するもの（特開平５−２５５２６３号）やアクリ
ジニウムのメチル基などをカルボキシル基に代えたもの
（特開平６−２２８１０２号）等親水性構造を有するも
のが知られているが、これらの親水性構造を有するアク
リジニウムエステルは実質的にアミノ基を標識すること
を目指すものであり、アミノ酸や、蛋白質等を標識し、
臨床検査の免疫発光分析におけるケミルミネッセントラ
ベルとして使用するのに適した化合物とされている。
【０００４】ところで、臨床検査の免疫発光分析におけ
る測定対象物質は、アミノ酸や蛋白質がほとんどである
が、これら物質には多くのアミノ基が存在するので、上
記の既知アクリジニウム化合物は標識の実行がたやすい
という点では大きな利点がある。
る測定対象物質は、アミノ酸や蛋白質がほとんどである
が、これら物質には多くのアミノ基が存在するので、上
記の既知アクリジニウム化合物は標識の実行がたやすい
という点では大きな利点がある。
【０００５】しかし逆に、アミノ酸や蛋白質中に多く含
まれるアミノ基を標識する結果、被標識部位が多くな
り、標識の均一性、再現性、抗体蛋白等対象物の不溶化
の問題や、抗体に標識する場合には抗原認識部位にある
アミノ基に標識化合物が結合し、抗体としての働きを低
下させ、ないしは失わせるという問題があった。 ま
た、被標識物質がアミノ基の数が限定される低分子であ
る場合は、標識反応を制御し、容易に一定のモル比で標
識できる場合もあるが、被標識物質が抗体蛋白等の高分
子でアミノ基の数が必ずしも限定できない場合は、試行
錯誤により、一定のモル比で標識できる条件を予備検討
しなければならないという欠点もあった。
まれるアミノ基を標識する結果、被標識部位が多くな
り、標識の均一性、再現性、抗体蛋白等対象物の不溶化
の問題や、抗体に標識する場合には抗原認識部位にある
アミノ基に標識化合物が結合し、抗体としての働きを低
下させ、ないしは失わせるという問題があった。 ま
た、被標識物質がアミノ基の数が限定される低分子であ
る場合は、標識反応を制御し、容易に一定のモル比で標
識できる場合もあるが、被標識物質が抗体蛋白等の高分
子でアミノ基の数が必ずしも限定できない場合は、試行
錯誤により、一定のモル比で標識できる条件を予備検討
しなければならないという欠点もあった。
【０００６】一方、ある化合物を化学発光標識試薬とし
て実用に供するためには、その化合物の標識反応が容易
であると共に、その標識条件では発光ないし分解には至
らないことが必須である。 アクリジニウムエステルで
標識される相手方は、アミノ酸等低分子化合物をはじめ
として酵素あるいは抗体等の高分子化合物まで様々であ
るが、上記のように被標識物質のアミノ基を利用する場
合、上記引用文献にみられるように、アクリジニウムエ
ステルにイミド基を与えてアミノ基と結合させる場合が
多い。 そして、このイミド基を用いてアミノ基と結合
反応させる場合の反応は、アルカリ性で効率良く進む
が、一般にアクリジニウム化合物はアルカリ性で発光な
いし分解に至る不安定な化合物であるため、発光活性を
有したまま標識を効率良く進めるということは、相矛盾
する反応条件を求めることとなって不都合である。
て実用に供するためには、その化合物の標識反応が容易
であると共に、その標識条件では発光ないし分解には至
らないことが必須である。 アクリジニウムエステルで
標識される相手方は、アミノ酸等低分子化合物をはじめ
として酵素あるいは抗体等の高分子化合物まで様々であ
るが、上記のように被標識物質のアミノ基を利用する場
合、上記引用文献にみられるように、アクリジニウムエ
ステルにイミド基を与えてアミノ基と結合させる場合が
多い。 そして、このイミド基を用いてアミノ基と結合
反応させる場合の反応は、アルカリ性で効率良く進む
が、一般にアクリジニウム化合物はアルカリ性で発光な
いし分解に至る不安定な化合物であるため、発光活性を
有したまま標識を効率良く進めるということは、相矛盾
する反応条件を求めることとなって不都合である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、免疫発光分析
等に用いる化学発光標識法において、アミノ酸や蛋白質
等の被測定物質と穏和な条件下で結合することができ、
しかも高い特異性を有しながら十分な結合力を有するよ
うな標識化合物を見出し、これを利用して安定に精度良
く被測定物質を検出する方法の提供が要望されていた。
等に用いる化学発光標識法において、アミノ酸や蛋白質
等の被測定物質と穏和な条件下で結合することができ、
しかも高い特異性を有しながら十分な結合力を有するよ
うな標識化合物を見出し、これを利用して安定に精度良
く被測定物質を検出する方法の提供が要望されていた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題の
解決のために、まず、標識基として、従来利用されてい
るアミノ基に代え、アミノ酸や蛋白質等に一般にはあま
り含まれないが、良好な反応性を有するＳＨ基を利用す
ることに思い至った。 そして、このＳＨ基を標識基と
して使用しうる化合物として、マレイミド基を導入した
アクリジニウム化合物を見出し、本発明を完成した。
解決のために、まず、標識基として、従来利用されてい
るアミノ基に代え、アミノ酸や蛋白質等に一般にはあま
り含まれないが、良好な反応性を有するＳＨ基を利用す
ることに思い至った。 そして、このＳＨ基を標識基と
して使用しうる化合物として、マレイミド基を導入した
アクリジニウム化合物を見出し、本発明を完成した。
【０００９】すなわち、本発明は一般式（I）
【化２１】 ［式中、Ｘ- はアニオン、Ｒは炭素数１〜６のアルキル
基またはアリール基を示し、Ｑは基 −Ｓ+ＲＸ-− 、基
−Ｎ+ＲＲ1Ｘ-− （ここで、Ｒ1は炭素数１から６のア
ルキル基またはアリール基を示す）、
基またはアリール基を示し、Ｑは基 −Ｓ+ＲＸ-− 、基
−Ｎ+ＲＲ1Ｘ-− （ここで、Ｒ1は炭素数１から６のア
ルキル基またはアリール基を示す）、
【化２２】 （ここで、Ｒ2およびＲ3は同一または異なって、それぞ
れ基−（ＣＨ2）k−（ｋは１〜３の数を意味する）を示
す）または基 −Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−）l− （ｌは１
〜３の数）を示し、ｍは０〜２の数を、ｎは１〜２の数
を意味する］で表されるアクリジン誘導体、その製法お
よびこれを用いた標識法を提供するものである。
れ基−（ＣＨ2）k−（ｋは１〜３の数を意味する）を示
す）または基 −Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−）l− （ｌは１
〜３の数）を示し、ｍは０〜２の数を、ｎは１〜２の数
を意味する］で表されるアクリジン誘導体、その製法お
よびこれを用いた標識法を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の化合物（I）の具体例と
しては、例えば、以下の式で表される化合物が挙げられ
る。
しては、例えば、以下の式で表される化合物が挙げられ
る。
【化２３】
【００１１】本発明の一般式（I）で表される化合物
は、例えば、次の反応式に従い、一般式（II）で表され
る化合物（以下、「中間体（II）」という）に、常法に
従いアルキル化剤を反応させることにより得られる。
は、例えば、次の反応式に従い、一般式（II）で表され
る化合物（以下、「中間体（II）」という）に、常法に
従いアルキル化剤を反応させることにより得られる。
【００１２】
【化２４】 ［式中、Ｑ'は基 −Ｓ−、基 −ＮＲ1− （ここで、Ｒ1
は炭素数１から６のアルキル基を示す）、
は炭素数１から６のアルキル基を示す）、
【化２５】 （ここで、Ｒ2およびＲ3は同一または異なって、それぞ
れ基−（ＣＨ2）k−（ｋは１〜３の数を意味する）を示
す）または基 −Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）l− （ｌは１〜３
の数）を示し、Ｑ、Ｒ、Ｘ-、ｍおよびｎは前記した意
味を有する］
れ基−（ＣＨ2）k−（ｋは１〜３の数を意味する）を示
す）または基 −Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）l− （ｌは１〜３
の数）を示し、Ｑ、Ｒ、Ｘ-、ｍおよびｎは前記した意
味を有する］
【００１３】この反応において使用されるアルキル化剤
（Ｒ−Ｘ）としては、例えばヨウ化メチル、臭化エチル
やヨウ化エチル等のアルキルハライド、トリフルオロメ
タンスルホン酸メチル、フルオロスルホン酸メチル、メ
タンスルホン酸メチルやｐ−トルエンスルホン酸メチル
等が挙げられる。 従って、前記した式（I）中のＸ-は
Ｉ-、Ｂｒ-等のハロゲンイオン、ＣＦ3ＳＯ3 -、ＦＳＯ3
-、ＣＨ3ＳＯ3 -やｐ−ＣＨ3Ｃ6Ｈ4ＳＯ3 -が最も代表的
であり、またＲはメチル、エチル等の炭素数１から６の
アルキル基またはアリール基である。 また、この反応
において用いる溶媒としては、例えばエーテル、トルエ
ン、アセトニトリル等が例示される。
（Ｒ−Ｘ）としては、例えばヨウ化メチル、臭化エチル
やヨウ化エチル等のアルキルハライド、トリフルオロメ
タンスルホン酸メチル、フルオロスルホン酸メチル、メ
タンスルホン酸メチルやｐ−トルエンスルホン酸メチル
等が挙げられる。 従って、前記した式（I）中のＸ-は
Ｉ-、Ｂｒ-等のハロゲンイオン、ＣＦ3ＳＯ3 -、ＦＳＯ3
-、ＣＨ3ＳＯ3 -やｐ−ＣＨ3Ｃ6Ｈ4ＳＯ3 -が最も代表的
であり、またＲはメチル、エチル等の炭素数１から６の
アルキル基またはアリール基である。 また、この反応
において用いる溶媒としては、例えばエーテル、トルエ
ン、アセトニトリル等が例示される。
【００１４】また、化合物（I）を製造するための原料
である、 中間体（II）の具体例としては、例えば以下
の式で表される化合物が挙げられる。
である、 中間体（II）の具体例としては、例えば以下
の式で表される化合物が挙げられる。
【化２６】
【００１５】この中間体（II）は、次の方法に何れかに
より製造することができる。 （i） 次の反応式に従い、脱離基を有するフェノール化
合物（IV）と９−アクリジンカルボン酸の反応性誘導体
（V）とを反応させ、末端に脱離基を有するアクリジン
エステル誘導体（VI）を製造した後、これに末端に必要
に応じ保護基で保護した一級アミノ基を有しかつ他端に
一級または二級のアミノ基を有するポリアミン（VII）
を適当な塩基のもとで反応させ、末端に必要に応じ保護
基で保護した一級アミノ基を有するアクリジンエステル
（VIII）を製造し、末端の一級アミノ基の保護基が存在
する場合は、その保護基をはずした後、無水マレイン酸
（IX）と該一級アミノ基とを反応させマレイミド基とし
て化合物（IIa）を得る。
より製造することができる。 （i） 次の反応式に従い、脱離基を有するフェノール化
合物（IV）と９−アクリジンカルボン酸の反応性誘導体
（V）とを反応させ、末端に脱離基を有するアクリジン
エステル誘導体（VI）を製造した後、これに末端に必要
に応じ保護基で保護した一級アミノ基を有しかつ他端に
一級または二級のアミノ基を有するポリアミン（VII）
を適当な塩基のもとで反応させ、末端に必要に応じ保護
基で保護した一級アミノ基を有するアクリジンエステル
（VIII）を製造し、末端の一級アミノ基の保護基が存在
する場合は、その保護基をはずした後、無水マレイン酸
（IX）と該一級アミノ基とを反応させマレイミド基とし
て化合物（IIa）を得る。
【００１６】
【化２７】 （式中、Ｒaはそれぞれ水素原子またはアミノ保護基を
示し、Ｙ1およびＹ2は脱離基を、Ｑ1は基 −ＮＲ1− ま
たは基
示し、Ｙ1およびＹ2は脱離基を、Ｑ1は基 −ＮＲ1− ま
たは基
【化２８】 を示し、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は前記した意味を有する）
【００１７】（ii） 次の反応式に従い、末端に保護基
で保護された一級アミノ基がついたチオエーテルまたは
ポリエーテルを有するフェノール誘導体（X）とアクリ
ジンカルボン酸ハライド（V）とを反応させてアクリジ
ニウムエステル（XI）を製造し、次いで、末端にあるア
ミノ基の脱保護を行った後、無水マレイン酸（IX）を末
端の一級アミノ基に反応させマレイミド基として化合物
（IIb）を得る。
で保護された一級アミノ基がついたチオエーテルまたは
ポリエーテルを有するフェノール誘導体（X）とアクリ
ジンカルボン酸ハライド（V）とを反応させてアクリジ
ニウムエステル（XI）を製造し、次いで、末端にあるア
ミノ基の脱保護を行った後、無水マレイン酸（IX）を末
端の一級アミノ基に反応させマレイミド基として化合物
（IIb）を得る。
【００１８】
【化２９】 （式中、Ｑ2は基 −Ｓ− または基 −Ｏ（ＣＨ2ＣＨ
2Ｏ）l− を示し、ＲaおよびＹ2は前記した意味を有す
る）
2Ｏ）l− を示し、ＲaおよびＹ2は前記した意味を有す
る）
【００１９】方法（i）の、脱離基を有するフェノール
化合物（IV）のフェノール化合物の例としては、４−
（トシルオキシメチル）フェノール、４−（３−クロロ
プロピル）フェノール、４−（２−トシルオキシエチ
ル）フェノール等が挙げられ、その脱離基としては、ト
シルオキシ基、メシルオキシ基、ハロゲン原子（Ｃｌ、
Ｂｒ、Ｉ）が例示される。 また、９−アクリジンカル
ボン酸の反応性誘導体（V）としては、クロリド、ブロ
ミド等の酸ハライド、酸無水物、活性酸エステル等が例
示される。 更に、ポリアミン（VII）としては、Ｎ−
（２−アミノエチル）ピペラジン、１,３−ジアミノプ
ロパン、４−（アミノメチル）ピペリジン等が挙げら
れ、その保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂ
ｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、フタル
イミド等が例示される。 更にまた、化合物（IV）と
（V）の反応および化合物（VI）と（VII）の反応に用い
られる塩基としては、トリエチルアミン、ピリジン等が
例示される。 なお、この反応においては、溶媒として
塩化メチレン、クロロホルム（ＣＨＣｌ3）、エーテ
ル、トルエン、ピリジン等が挙げられる。
化合物（IV）のフェノール化合物の例としては、４−
（トシルオキシメチル）フェノール、４−（３−クロロ
プロピル）フェノール、４−（２−トシルオキシエチ
ル）フェノール等が挙げられ、その脱離基としては、ト
シルオキシ基、メシルオキシ基、ハロゲン原子（Ｃｌ、
Ｂｒ、Ｉ）が例示される。 また、９−アクリジンカル
ボン酸の反応性誘導体（V）としては、クロリド、ブロ
ミド等の酸ハライド、酸無水物、活性酸エステル等が例
示される。 更に、ポリアミン（VII）としては、Ｎ−
（２−アミノエチル）ピペラジン、１,３−ジアミノプ
ロパン、４−（アミノメチル）ピペリジン等が挙げら
れ、その保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂ
ｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、フタル
イミド等が例示される。 更にまた、化合物（IV）と
（V）の反応および化合物（VI）と（VII）の反応に用い
られる塩基としては、トリエチルアミン、ピリジン等が
例示される。 なお、この反応においては、溶媒として
塩化メチレン、クロロホルム（ＣＨＣｌ3）、エーテ
ル、トルエン、ピリジン等が挙げられる。
【００２０】また、化合物（VII）からの一級アミノ基
の保護基の除去を行う場合は、常法に従い、酸、接触還
元条件または塩基を用いて無溶媒または適当な溶媒中で
行うことができる。用いる酸としては、例えば三フッ化
ホウ素（ＢＦ3）、トリフルオロ酢酸、塩酸等が挙げら
れ、接触還元の溶媒としては、パラジウム−炭素、パラ
ジウム黒、白金黒等が挙げられ、塩基としてはヒドラジ
ン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等とが挙げられ
る。 溶媒としては、例えばエーテル、１,４−ジオキサ
ン、メタノール、エタノール、水、アセトニトリル、酢
酸等が挙げられる。
の保護基の除去を行う場合は、常法に従い、酸、接触還
元条件または塩基を用いて無溶媒または適当な溶媒中で
行うことができる。用いる酸としては、例えば三フッ化
ホウ素（ＢＦ3）、トリフルオロ酢酸、塩酸等が挙げら
れ、接触還元の溶媒としては、パラジウム−炭素、パラ
ジウム黒、白金黒等が挙げられ、塩基としてはヒドラジ
ン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等とが挙げられ
る。 溶媒としては、例えばエーテル、１,４−ジオキサ
ン、メタノール、エタノール、水、アセトニトリル、酢
酸等が挙げられる。
【００２１】更に、必要により保護基を除去した化合物
（VIII）の一級アミノ基のマレイミド化は、無水マレイ
ン酸と塩基の存在下、溶媒中で加熱して反応させること
により行うことができる。 用いる塩基としては、例え
ば酢酸ナトリウム、炭酸カリウム等が挙げられ、また溶
媒としては、例えば酢酸、プロピオン酸等が挙げられ
る。
（VIII）の一級アミノ基のマレイミド化は、無水マレイ
ン酸と塩基の存在下、溶媒中で加熱して反応させること
により行うことができる。 用いる塩基としては、例え
ば酢酸ナトリウム、炭酸カリウム等が挙げられ、また溶
媒としては、例えば酢酸、プロピオン酸等が挙げられ
る。
【００２２】一方、方法（ii）の、末端アミノ基を有す
るチオエーテルまたはポリエーテル構造を有する基を持
つフェノール誘導体（IX）のうち、チオエーテルを有す
るフェノール誘導体の例としては、４−（２−アミノエ
チルチオ）フェノール、４−（３−アミノプロピルチ
オ）フェノール等が、また、ポリエーテル構造を有する
フェノール誘導体の例としては、４−［３−（２−アミ
ノエトキシ）プロピルオキシ］フェノール、４−［２−
（２−アミノエトキシ）エトキシ］フェノール等がそれ
ぞれ挙げられ、これらのアミノ保護基としては、Ｂｏ
ｃ、Ｃｂｚ、フタルイミド等が挙げられる。 また用い
られる塩基としては、トリエチルアミン、ピリジン等が
挙げられ、溶媒としては塩化メチレン、エーテル、トル
エン、ピリジン等が挙げられる。
るチオエーテルまたはポリエーテル構造を有する基を持
つフェノール誘導体（IX）のうち、チオエーテルを有す
るフェノール誘導体の例としては、４−（２−アミノエ
チルチオ）フェノール、４−（３−アミノプロピルチ
オ）フェノール等が、また、ポリエーテル構造を有する
フェノール誘導体の例としては、４−［３−（２−アミ
ノエトキシ）プロピルオキシ］フェノール、４−［２−
（２−アミノエトキシ）エトキシ］フェノール等がそれ
ぞれ挙げられ、これらのアミノ保護基としては、Ｂｏ
ｃ、Ｃｂｚ、フタルイミド等が挙げられる。 また用い
られる塩基としては、トリエチルアミン、ピリジン等が
挙げられ、溶媒としては塩化メチレン、エーテル、トル
エン、ピリジン等が挙げられる。
【００２３】１級のアミノ基の保護の除去およびマレイ
ミド化は、（i）の方法で説明したのと同様にして行う
ことができる。
ミド化は、（i）の方法で説明したのと同様にして行う
ことができる。
【００２４】次に、本発明の化合物（I）を、アミノ酸
または蛋白質中のＳＨ基に反応させ、これら物質を標識
する方法について説明する。
または蛋白質中のＳＨ基に反応させ、これら物質を標識
する方法について説明する。
【００２５】例えば、本発明の化合物（I）により抗体
を標識する場合には、まず、抗体をペプシン消化してＦ
（ａｂ'）2を得、これを穏和な条件下で還元してＦａ
ｂ'を調製する。 次いで、溶液中でこのＦａｂ'のＳＨ
基に本発明化合物（I）のマレイミド基を反応させ、標
識することができる。
を標識する場合には、まず、抗体をペプシン消化してＦ
（ａｂ'）2を得、これを穏和な条件下で還元してＦａ
ｂ'を調製する。 次いで、溶液中でこのＦａｂ'のＳＨ
基に本発明化合物（I）のマレイミド基を反応させ、標
識することができる。
【００２６】Ｆａｂ'と本発明化合物（I）の反応は、反
応溶液中の溶存酵素によるＳＨ基の酸化を１〜５ｍＭ程
度のＥＤＴＡにより保護しつつ、ｐＨ５〜７、好ましく
は、ｐＨ６〜６.５の水溶液中で、温度１〜３７℃、好
ましくは、４〜１０℃で、１０分から７２時間、好まし
くは、４８時間程度、Ｆａｂ'と本発明の化合物（I）と
をモル比１：１〜１０で反応させればよい。
応溶液中の溶存酵素によるＳＨ基の酸化を１〜５ｍＭ程
度のＥＤＴＡにより保護しつつ、ｐＨ５〜７、好ましく
は、ｐＨ６〜６.５の水溶液中で、温度１〜３７℃、好
ましくは、４〜１０℃で、１０分から７２時間、好まし
くは、４８時間程度、Ｆａｂ'と本発明の化合物（I）と
をモル比１：１〜１０で反応させればよい。
【００２７】化合物（I）による標識は、一般に水系媒
体中、ｐＨ７以下で行うことができるが、もし被標識物
質が水に難溶または不溶の場合には、以下の方法で標識
を行うことができる。 すなわち、被標識物質を水と良
く混じり合う不活性な少量の溶媒（以下、「不活性な溶
媒」という）で溶解した液に水を加え、被標識物質の水
系溶液とし、その液に化合物（I）の水系溶液を混和
し、ｐＨ７以下でＳＨ基とマレイミド基の反応を行えば
よい。 この反応は、本発明の化合物（I）のマレイミド
基の不飽和結合に対して被標識物質が求核付加すること
により進むため、被標識物質にＳＨ基のほかにアミノ基
が存在する場合でも、ｐＨ７以下で反応を行うためにこ
のアミノ基の求核性が抑えられ、アミノ基との反応生成
物は作らない点で、本発明の化合物はＳＨ基に選択的な
試薬として使うことができる。
体中、ｐＨ７以下で行うことができるが、もし被標識物
質が水に難溶または不溶の場合には、以下の方法で標識
を行うことができる。 すなわち、被標識物質を水と良
く混じり合う不活性な少量の溶媒（以下、「不活性な溶
媒」という）で溶解した液に水を加え、被標識物質の水
系溶液とし、その液に化合物（I）の水系溶液を混和
し、ｐＨ７以下でＳＨ基とマレイミド基の反応を行えば
よい。 この反応は、本発明の化合物（I）のマレイミド
基の不飽和結合に対して被標識物質が求核付加すること
により進むため、被標識物質にＳＨ基のほかにアミノ基
が存在する場合でも、ｐＨ７以下で反応を行うためにこ
のアミノ基の求核性が抑えられ、アミノ基との反応生成
物は作らない点で、本発明の化合物はＳＨ基に選択的な
試薬として使うことができる。
【００２８】ここで、標識に用いる不活性な溶媒として
は、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキ
シド、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１,４
−ジオキサンあるいはピリジン等が挙げられる。
は、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキ
シド、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１,４
−ジオキサンあるいはピリジン等が挙げられる。
【００２９】この標識後、ゲルクロマトグラフ法、イオ
ン交換クロマトグラフ法、アフィニティークロマトグラ
フ法、高速液体クロマトグラフ法等の分離手法により、
被標識体を単離することができる。 すなわち、以上の
方法により、モル比一定の標識が可能である。
ン交換クロマトグラフ法、アフィニティークロマトグラ
フ法、高速液体クロマトグラフ法等の分離手法により、
被標識体を単離することができる。 すなわち、以上の
方法により、モル比一定の標識が可能である。
【００３０】また、被標識物質がＳＨ基を有しない場合
は、例えば被標識物質の水酸基やアミノ基等に対し、Ｓ
−アセチルメルカプトこはく酸無水物等を用いて穏和な
条件下でＳＨ基を導入し、本発明の標識法を適用するこ
とができる。 この場合、導入されたＳＨ基の定量によ
り、被標識物質とＳＨ基とのモル比を見積もることがで
きる。 したがって、本発明の標識法において利用でき
る被測定物質としては、ＳＨ基を有するか、あるいはＳ
Ｈ基を導入できる物質であれば何でもよく、アミノ酸等
の低分子にも、上記同様、穏和な条件により本発明の化
合物（I）を標識することができる。
は、例えば被標識物質の水酸基やアミノ基等に対し、Ｓ
−アセチルメルカプトこはく酸無水物等を用いて穏和な
条件下でＳＨ基を導入し、本発明の標識法を適用するこ
とができる。 この場合、導入されたＳＨ基の定量によ
り、被標識物質とＳＨ基とのモル比を見積もることがで
きる。 したがって、本発明の標識法において利用でき
る被測定物質としては、ＳＨ基を有するか、あるいはＳ
Ｈ基を導入できる物質であれば何でもよく、アミノ酸等
の低分子にも、上記同様、穏和な条件により本発明の化
合物（I）を標識することができる。
【００３１】斯くして得られた被標識物質は、公知のア
クリジニウムエステルの発光条件、例えば、アルカリ性
条件下、Ｈ2Ｏ2等の添加により化学発光させ、この発光
を化学発光検出器により検出することにより、その存在
を知ることができ、またその化学発光量から、被標識物
質の量を知ることができ、微少量の検出が必要な、医薬
品の体内動態の追跡および診断薬等の各種分野で定性分
析や定量分析に応用することができる。
クリジニウムエステルの発光条件、例えば、アルカリ性
条件下、Ｈ2Ｏ2等の添加により化学発光させ、この発光
を化学発光検出器により検出することにより、その存在
を知ることができ、またその化学発光量から、被標識物
質の量を知ることができ、微少量の検出が必要な、医薬
品の体内動態の追跡および診断薬等の各種分野で定性分
析や定量分析に応用することができる。
【００３２】次に、本発明の化合物（I）を利用した標
識法の具体的応用例について説明する。本発明の標識法
の応用としては、例えば、いわゆるケミルミネッセント
イムノアッセイサンドイッチ法におけるように、試料中
の被測定物質と、担体に結合させておいた被測定物質と
特異的に結合する物質との結合反応により被測定物質を
捕捉後、この被測定物質に対し別途特異的に結合する物
質を本発明の化合物（I）で標識したものとを結合さ
せ、この発光強度を測定することによる被測定物質の測
定法が挙げられる。
識法の具体的応用例について説明する。本発明の標識法
の応用としては、例えば、いわゆるケミルミネッセント
イムノアッセイサンドイッチ法におけるように、試料中
の被測定物質と、担体に結合させておいた被測定物質と
特異的に結合する物質との結合反応により被測定物質を
捕捉後、この被測定物質に対し別途特異的に結合する物
質を本発明の化合物（I）で標識したものとを結合さ
せ、この発光強度を測定することによる被測定物質の測
定法が挙げられる。
【００３３】また、いわゆるケミルミネッセントイムノ
アッセイ競合法におけるように、被測定物質を本発明の
化合物（I）で標識し、これを予め一定濃度で添加し、
試料中の被測定物質と標識された被測定物質のいずれに
も特異的に結合する物質に対してこれらの被測定物質同
士が拮抗的に結合する反応を利用し、この発光強度を測
定することによる被測定物質の測定法が挙げられる。こ
れらの場合、特異的に結合する物質の組合せの例として
は、抗原と抗体、核酸と相補的配列、エフェクター分子
とレセプター分子、酵素とインヒビター、アビジンとビ
オチン、糖鎖を有する物質と対応するレクチン等が挙げ
られる。
アッセイ競合法におけるように、被測定物質を本発明の
化合物（I）で標識し、これを予め一定濃度で添加し、
試料中の被測定物質と標識された被測定物質のいずれに
も特異的に結合する物質に対してこれらの被測定物質同
士が拮抗的に結合する反応を利用し、この発光強度を測
定することによる被測定物質の測定法が挙げられる。こ
れらの場合、特異的に結合する物質の組合せの例として
は、抗原と抗体、核酸と相補的配列、エフェクター分子
とレセプター分子、酵素とインヒビター、アビジンとビ
オチン、糖鎖を有する物質と対応するレクチン等が挙げ
られる。
【００３４】また別の応用としては、例えば、いわゆる
ポストカラム高速液体クロマトグラフ法におけるよう
に、被測定物質を本発明の化合物（I）で標識し、前記
のクロマトグラフ法等の分離手法により単離し、化学発
光検出器により、被測定物質を測定する方法が挙げられ
る。
ポストカラム高速液体クロマトグラフ法におけるよう
に、被測定物質を本発明の化合物（I）で標識し、前記
のクロマトグラフ法等の分離手法により単離し、化学発
光検出器により、被測定物質を測定する方法が挙げられ
る。
【００３５】以上説明した標識法において、本発明の化
合物（I）により、従来知られたアクリジニウムエステ
ルが有していた欠点である、標識された被測定物質の不
溶化、生物活性に必要なアミノ基まで標識により失活さ
せる恐れや、一定の結合モル比で結合させにくく、結合
反応に再現性を得ることが容易でなく、結合反応条件下
で既に発光や分解が生じること等の各種問題を克服でき
る。
合物（I）により、従来知られたアクリジニウムエステ
ルが有していた欠点である、標識された被測定物質の不
溶化、生物活性に必要なアミノ基まで標識により失活さ
せる恐れや、一定の結合モル比で結合させにくく、結合
反応に再現性を得ることが容易でなく、結合反応条件下
で既に発光や分解が生じること等の各種問題を克服でき
る。
【００３６】更に、本発明の応用の別の例としては、以
下の方法も挙げられる。 すなわち、まず、本発明化合
物（I）合成のためにも利用される化合物（II）を、予
めＳＨ基を有する被測定物質に反応させて結合（以下、
「前標識」という）させる。次いで、適当なＮ−アルキ
ル化剤を反応させ、更にアルカリ性条件下、Ｈ2Ｏ2等適
当な化学発光剤を作用させ、この化学発光を化学発光検
出器により検出し、被測定物質を測定する方法が挙げら
れる。
下の方法も挙げられる。 すなわち、まず、本発明化合
物（I）合成のためにも利用される化合物（II）を、予
めＳＨ基を有する被測定物質に反応させて結合（以下、
「前標識」という）させる。次いで、適当なＮ−アルキ
ル化剤を反応させ、更にアルカリ性条件下、Ｈ2Ｏ2等適
当な化学発光剤を作用させ、この化学発光を化学発光検
出器により検出し、被測定物質を測定する方法が挙げら
れる。
【００３７】一般式（II）で表されるアクリジンエステ
ルは、その末端のマレイミド基がＳＨ基に対し結合活性
があり、しかも安定な化合物として単離可能であるた
め、予めＳＨ基を有する物質と結合させることができ
る。
ルは、その末端のマレイミド基がＳＨ基に対し結合活性
があり、しかも安定な化合物として単離可能であるた
め、予めＳＨ基を有する物質と結合させることができ
る。
【００３８】上記の化合物（II）による被測定物質の前
標識反応における結合方法、得られた前標識体の分離方
法等は、化合物（I）についての方法とほぼ同様にして
行うことができる。
標識反応における結合方法、得られた前標識体の分離方
法等は、化合物（I）についての方法とほぼ同様にして
行うことができる。
【００３９】上記の前標識体は、更に、Ｎ−アルキル化
剤と適当な溶媒中で反応させることにより、アクリジニ
ウムエステル標識体とすることができる。 使用される
Ｎ−アルキル化剤としては、例えばヨウ化メチル、ヨウ
化エチル、臭化エチル等のハロゲン化アルキル、トリフ
ルオロメタンスルホン酸メチル、フルオロスルホン酸メ
チル、メタンスルホン酸メチルやｐ−トルエンスルホン
酸メチル等が挙げられる。 また、用いる溶媒として
は、例えば上記の前標識反応に用いられた溶媒のほか、
テトラヒドロフラン、アセトニトリル等が挙げられる。
剤と適当な溶媒中で反応させることにより、アクリジニ
ウムエステル標識体とすることができる。 使用される
Ｎ−アルキル化剤としては、例えばヨウ化メチル、ヨウ
化エチル、臭化エチル等のハロゲン化アルキル、トリフ
ルオロメタンスルホン酸メチル、フルオロスルホン酸メ
チル、メタンスルホン酸メチルやｐ−トルエンスルホン
酸メチル等が挙げられる。 また、用いる溶媒として
は、例えば上記の前標識反応に用いられた溶媒のほか、
テトラヒドロフラン、アセトニトリル等が挙げられる。
【００４０】この反応後用いた溶媒中より、結晶として
析出する場合はアクリジニウムエステル標識体を濾取し
て単離することができるし、析出してこない場合は、カ
ラムクロマトグラフ法を用い単離することができる。
析出する場合はアクリジニウムエステル標識体を濾取し
て単離することができるし、析出してこない場合は、カ
ラムクロマトグラフ法を用い単離することができる。
【００４１】化合物（II）による前標識反応後、更にＮ
−アルキル化で標識された被測定物質の化学発光や、そ
の利用等も化合物（I）について説明したのと同様であ
る。
−アルキル化で標識された被測定物質の化学発光や、そ
の利用等も化合物（I）について説明したのと同様であ
る。
【００４２】なお、化合物（II）を用いる標識方法は、
結合後、Ｎ−アルキル化で標識するということから見
て、ＳＨ基以外のアルキル化剤に活性な基がある被測定
物質には適さず、この場合にはこれらの活性な基を適当
な保護基で保護する等の手段を採る必要性がある。
結合後、Ｎ−アルキル化で標識するということから見
て、ＳＨ基以外のアルキル化剤に活性な基がある被測定
物質には適さず、この場合にはこれらの活性な基を適当
な保護基で保護する等の手段を採る必要性がある。
【００４３】
【発明の効果】本発明の化合物（I）または（II）によ
る被測定物質の標識は、ＳＨ基とマレイミド基の安定な
結合であって、穏和な条件下で行われるものである。
そして、穏和な条件で標識が行われる結果、例えば標識
された抗体等の抗原認識部位は損なわれることなく、ま
た、アクリジンエステルが発光して消耗することや、分
解失活することもない。
る被測定物質の標識は、ＳＨ基とマレイミド基の安定な
結合であって、穏和な条件下で行われるものである。
そして、穏和な条件で標識が行われる結果、例えば標識
された抗体等の抗原認識部位は損なわれることなく、ま
た、アクリジンエステルが発光して消耗することや、分
解失活することもない。
【００４４】また、本発明の標識法では、アミノ酸や蛋
白質中では、比較的少ない基であるＳＨ基を使用するた
めに、被測定物質に対し特異的な標識をすることがで
き、ひいては被測定物質と化学発光物質と一定の結合モ
ル比での結合が得られる。
白質中では、比較的少ない基であるＳＨ基を使用するた
めに、被測定物質に対し特異的な標識をすることがで
き、ひいては被測定物質と化学発光物質と一定の結合モ
ル比での結合が得られる。
【００４５】従って、化学発光量から、被測定物質の定
性や定量が容易にでき、とりわけ、微少量の検出が必要
な診断薬の分野に応用することができる。
性や定量が容易にでき、とりわけ、微少量の検出が必要
な診断薬の分野に応用することができる。
【００４６】
【実施例】以下、実施例を挙げ、本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれら実施例等になんら制約され
るものではない。
説明するが、本発明はこれら実施例等になんら制約され
るものではない。
【００４７】実 施 例 １ ４−（２−トシルオキシエチル）フェノール（１）の合
成：３.２ｇの４−ヒドロキシフェネチルアルコールを
５０ｍｌのピリジンに溶かし、氷冷下４.０ｇのトシル
クロリドを少量ずつ添加した。 室温に戻し２時間撹拌
後、不溶物を濾去し、ピリジンを減圧留去した。 残渣
をシリカゲルカラムクロマト（溶離液：ＣＨＣｌ3）に
て単離精製し、（１）を３.４ｇ得た（収率 ５９％）。
成：３.２ｇの４−ヒドロキシフェネチルアルコールを
５０ｍｌのピリジンに溶かし、氷冷下４.０ｇのトシル
クロリドを少量ずつ添加した。 室温に戻し２時間撹拌
後、不溶物を濾去し、ピリジンを減圧留去した。 残渣
をシリカゲルカラムクロマト（溶離液：ＣＨＣｌ3）に
て単離精製し、（１）を３.４ｇ得た（収率 ５９％）。
【００４８】実 施 例 ２ ９−アクリジンカルボン酸クロリド（２）の合成：９−
アクリジンカルボン酸 ２.２ｇに塩化チオニル ２０ｍ
ｌを加え、５時間加熱還流した。 塩化チオニルを減圧
留去した後、更に塩化メチレン ２０ｍｌを加え、減圧
留去を２回繰り返し、（２）を２.４ｇ得た（収率 定量
的）。
アクリジンカルボン酸 ２.２ｇに塩化チオニル ２０ｍ
ｌを加え、５時間加熱還流した。 塩化チオニルを減圧
留去した後、更に塩化メチレン ２０ｍｌを加え、減圧
留去を２回繰り返し、（２）を２.４ｇ得た（収率 定量
的）。
【００４９】実 施 例 ３ ４−（２−トシルオキシエチル）フェニル ９−アクリ
ジルカルボキシレート（３）の合成：実施例２で得た
（２） ２.４ｇを３０ｍｌのピリジンに溶かし、水冷撹
拌下実施例１で得た（１） ２.９ｇを少量ずつ添加し、
室温で２時間撹拌した後、ピリジンを減圧留去した。
更にＣＨＣｌ3を加え、減圧留去を２回行なった。 残渣
をシリカゲルカラムクロマト（溶離液：ＣＨＣｌ3）に
て単離精製し、（３）を２.７ｇ得た（収率 ５４％）。
ジルカルボキシレート（３）の合成：実施例２で得た
（２） ２.４ｇを３０ｍｌのピリジンに溶かし、水冷撹
拌下実施例１で得た（１） ２.９ｇを少量ずつ添加し、
室温で２時間撹拌した後、ピリジンを減圧留去した。
更にＣＨＣｌ3を加え、減圧留去を２回行なった。 残渣
をシリカゲルカラムクロマト（溶離液：ＣＨＣｌ3）に
て単離精製し、（３）を２.７ｇ得た（収率 ５４％）。
【００５０】実 施 例 ４ ４−［２−（４−アミノメチルピペリジン−１−イル）
エチル］フェニル９−アクリジンカルボキシレート
（４）の合成：実施例３で得た（３） ２.９ｇを３０ｍ
ｌのＤＭＦに溶かし、０.５９ｇの４−アミノメチルピ
リジンを加えた。 室温で撹拌し、氷冷下０.６０ｇのｔ
−ＢｕＯＫを加え、室温で５時間撹拌した。 ＤＭＦを
減圧留去し、残渣をＣＨＣｌ3に溶かし、水洗した後、
無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4）にて乾燥させ、溶
媒を減圧留去した。 残渣をシリカゲルカラムクロマト
（溶離液：ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝７：３）にて単離精
製し、（４）を０.４１ｇ得た（収率 １８％）。
エチル］フェニル９−アクリジンカルボキシレート
（４）の合成：実施例３で得た（３） ２.９ｇを３０ｍ
ｌのＤＭＦに溶かし、０.５９ｇの４−アミノメチルピ
リジンを加えた。 室温で撹拌し、氷冷下０.６０ｇのｔ
−ＢｕＯＫを加え、室温で５時間撹拌した。 ＤＭＦを
減圧留去し、残渣をＣＨＣｌ3に溶かし、水洗した後、
無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4）にて乾燥させ、溶
媒を減圧留去した。 残渣をシリカゲルカラムクロマト
（溶離液：ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝７：３）にて単離精
製し、（４）を０.４１ｇ得た（収率 １８％）。
【００５１】実 施 例 ５ ４−［２−［４−［（マレイミド−１−イル）メチル］
ピペリジン−１−イル］エチル］フェニル ９−アクリ
ジンカルボキシレート（５）の合成：実施例４で得た
（４） ０.４１ｇ、無水マレイン酸 ０.３０ｇおよび酢
酸ナトリウム ０.３０ｇを酢酸 ２０ｍｌ中に加え、３
時間加熱還流した。 次いで、酢酸を減圧留去し、水を
加え、ＣＨＣｌ3にて抽出した。 ＭｇＳＯ4で乾燥さ
せ、ＣＨＣｌ3を減圧留去した。 残渣をシリカゲルカラ
ムクロマト（溶離液：ＣＨＣｌ3）にて精製し、（５）
を０.２２ｇ得た（収率 ４３％）。 この物質の分析値
を下記する。
ピペリジン−１−イル］エチル］フェニル ９−アクリ
ジンカルボキシレート（５）の合成：実施例４で得た
（４） ０.４１ｇ、無水マレイン酸 ０.３０ｇおよび酢
酸ナトリウム ０.３０ｇを酢酸 ２０ｍｌ中に加え、３
時間加熱還流した。 次いで、酢酸を減圧留去し、水を
加え、ＣＨＣｌ3にて抽出した。 ＭｇＳＯ4で乾燥さ
せ、ＣＨＣｌ3を減圧留去した。 残渣をシリカゲルカラ
ムクロマト（溶離液：ＣＨＣｌ3）にて精製し、（５）
を０.２２ｇ得た（収率 ４３％）。 この物質の分析値
を下記する。
【００５２】ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ：８.３（ｍ,４
Ｈ）, ８.０−７.６（ｍ,４Ｈ）, ７.３（ｓ−ｌｉｋ
ｅ,４Ｈ）, ６.７（ｓ,２Ｈ）, ３.４（ｄ,Ｊ＝７,２
Ｈ）, ３.１−２.５（ｍ,６Ｈ）, ２.２−１.５（ｍ,７
Ｈ） ＭＡＳＳ（ＦＡＢ）：５２０（Ｍ＋１）
Ｈ）, ８.０−７.６（ｍ,４Ｈ）, ７.３（ｓ−ｌｉｋ
ｅ,４Ｈ）, ６.７（ｓ,２Ｈ）, ３.４（ｄ,Ｊ＝７,２
Ｈ）, ３.１−２.５（ｍ,６Ｈ）, ２.２−１.５（ｍ,７
Ｈ） ＭＡＳＳ（ＦＡＢ）：５２０（Ｍ＋１）
【００５３】実 施 例 ６ ４−［２−［４−（マレイミド−１−イル）メチル−１
−メチルピペリジニウム−１−イル］エチル］フェニル
１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレート
（６）の合成：実施例５で得た（５） ０.２２ｇを２０
ｍｌのトルエンに溶かし、室温撹拌下、０.３０ｇのト
リフルオロメタンスルホン酸メチルを加え、室温で１時
間撹拌した後、一晩放置した。 赤色析出物を濾取し、
トルエンで洗浄後、風乾し、（６）を３０ｍｇ得た（収
率 ９.２％）。この物質の分析値を下記する。
−メチルピペリジニウム−１−イル］エチル］フェニル
１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレート
（６）の合成：実施例５で得た（５） ０.２２ｇを２０
ｍｌのトルエンに溶かし、室温撹拌下、０.３０ｇのト
リフルオロメタンスルホン酸メチルを加え、室温で１時
間撹拌した後、一晩放置した。 赤色析出物を濾取し、
トルエンで洗浄後、風乾し、（６）を３０ｍｇ得た（収
率 ９.２％）。この物質の分析値を下記する。
【００５４】ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：８.８−８.
０（ｍ,８Ｈ）, ７.５（ｓ−ｌｉｋｅ,４Ｈ）, ６.８
（ｓ,２Ｈ）, ５.１（ｓ,３Ｈ）, ３.３（ｓ,３Ｈ）,
３.７−３.０（ｍ,１０Ｈ）,２.０−１.６（ｍ,５Ｈ） ＭＡＳＳ（ＦＡＢ）：５５０（Ｍ＋１）
０（ｍ,８Ｈ）, ７.５（ｓ−ｌｉｋｅ,４Ｈ）, ６.８
（ｓ,２Ｈ）, ５.１（ｓ,３Ｈ）, ３.３（ｓ,３Ｈ）,
３.７−３.０（ｍ,１０Ｈ）,２.０−１.６（ｍ,５Ｈ） ＭＡＳＳ（ＦＡＢ）：５５０（Ｍ＋１）
【００５５】実 施 例 ７ ４−（２−アミノエチルチオ）フェノール（７）の合
成：４−メルカプトフェノール １.２ｇ、２−ブロモエ
チルアミン塩酸塩 ２.１ｇおよび炭酸カリウム １.４ｇ
を３０ｍｌのエタノールに加え、３時間室温で撹拌し
た。 水を加え、エーテル抽出した。 ＭｇＳＯ4にて乾
燥させ、エーテルを減圧留去し、（７）を１.７ｇ得た
（収率 定量的）。
成：４−メルカプトフェノール １.２ｇ、２−ブロモエ
チルアミン塩酸塩 ２.１ｇおよび炭酸カリウム １.４ｇ
を３０ｍｌのエタノールに加え、３時間室温で撹拌し
た。 水を加え、エーテル抽出した。 ＭｇＳＯ4にて乾
燥させ、エーテルを減圧留去し、（７）を１.７ｇ得た
（収率 定量的）。
【００５６】実 施 例 ８ ４−（２−Ｎ−Ｂｏｃアミノエチルチオ）フェノール
（８）の合成：実施例７で得た（７） １.７ｇを３０ｍ
ｌのアセトニトリルに溶かし、無水Ｂｏｃ ２.４ｇを加
え、１時間撹拌した。 溶媒を減圧留去後、ピリジンを
加え、減圧留去し、（８）を２.７ｇ得た（収率 定量
的）。
（８）の合成：実施例７で得た（７） １.７ｇを３０ｍ
ｌのアセトニトリルに溶かし、無水Ｂｏｃ ２.４ｇを加
え、１時間撹拌した。 溶媒を減圧留去後、ピリジンを
加え、減圧留去し、（８）を２.７ｇ得た（収率 定量
的）。
【００５７】実 施 例 ９ ４−（２−Ｎ−Ｂｏｃアミノエチルチオ）フェニル ９
−アクリジンカルボキシレート（９）の合成：実施例２
で得た（２） ２.４ｇを３０ｍｌのピリジンに溶かし、
水冷撹拌下、実施例８で得た（８） ２.７ｇを少量ずつ
添加した。 室温で２時間撹拌した後、ピリジンを減圧
留去した。 更にＣＨＣｌ3を加え、減圧留去を２回行な
った。残渣をシリカゲルカラムクロマト（溶離液：ＣＨ
Ｃｌ3）にて単離精製し、（９）を３.２ｇ得た（収率
６８％）。
−アクリジンカルボキシレート（９）の合成：実施例２
で得た（２） ２.４ｇを３０ｍｌのピリジンに溶かし、
水冷撹拌下、実施例８で得た（８） ２.７ｇを少量ずつ
添加した。 室温で２時間撹拌した後、ピリジンを減圧
留去した。 更にＣＨＣｌ3を加え、減圧留去を２回行な
った。残渣をシリカゲルカラムクロマト（溶離液：ＣＨ
Ｃｌ3）にて単離精製し、（９）を３.２ｇ得た（収率
６８％）。
【００５８】実 施 例 １０ ４−（２−アミノエチルチオ）フェニル ９−アクリジ
ンカルボキシレート（１０）の合成：実施例９で得た
（９）１.９ｇに、２０ｍｌのＣＦ3ＣＯ2Ｈを加え、室
温で３０分撹拌した。 ＣＦ3ＣＯ2Ｈを減圧留去し、
（１０）を１.４ｇ得た（収率 定量的）。
ンカルボキシレート（１０）の合成：実施例９で得た
（９）１.９ｇに、２０ｍｌのＣＦ3ＣＯ2Ｈを加え、室
温で３０分撹拌した。 ＣＦ3ＣＯ2Ｈを減圧留去し、
（１０）を１.４ｇ得た（収率 定量的）。
【００５９】実 施 例 １１ ４−［２−（マレイミド−１−イル）エチルチオ］フェ
ニル ９−アクリジンカルボキシレート（１１）の合
成：実施例１０で得た（１０） １.４ｇ、無水マレイン
酸 １.０ｇおよび酢酸ナトリウム １.０ｇを酢酸 ２０
ｍｌ中に加え、３時間加熱還流した。 次いで酢酸を減
圧留去し、水を加えＣＨＣｌ3にて抽出した。 ＭｇＳＯ
4で乾燥させ、ＣＨＣｌ3を減圧留去した。 残渣をシリ
カゲルカラムクロマト（溶離液：ＣＨＣｌ3）にて精製
し、（１１）を１.１ｇ得た（収率 ６３％）。 この物
質の分析値を下記する。
ニル ９−アクリジンカルボキシレート（１１）の合
成：実施例１０で得た（１０） １.４ｇ、無水マレイン
酸 １.０ｇおよび酢酸ナトリウム １.０ｇを酢酸 ２０
ｍｌ中に加え、３時間加熱還流した。 次いで酢酸を減
圧留去し、水を加えＣＨＣｌ3にて抽出した。 ＭｇＳＯ
4で乾燥させ、ＣＨＣｌ3を減圧留去した。 残渣をシリ
カゲルカラムクロマト（溶離液：ＣＨＣｌ3）にて精製
し、（１１）を１.１ｇ得た（収率 ６３％）。 この物
質の分析値を下記する。
【００６０】ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ：８.３（ｍ,４
Ｈ）, ８.０−７.６（ｍ,４Ｈ）, ７.３（ｓ−ｌｉｋ
ｅ,４Ｈ）, ６.７（ｓ,２Ｈ）, ３.８（ｔ,Ｊ＝７,２Ｈ
ｚ）, ３.２（ｔ,Ｊ＝７,２Ｈ） ＭＡＳＳ（ＦＡＢ）：４５５（Ｍ＋１）
Ｈ）, ８.０−７.６（ｍ,４Ｈ）, ７.３（ｓ−ｌｉｋ
ｅ,４Ｈ）, ６.７（ｓ,２Ｈ）, ３.８（ｔ,Ｊ＝７,２Ｈ
ｚ）, ３.２（ｔ,Ｊ＝７,２Ｈ） ＭＡＳＳ（ＦＡＢ）：４５５（Ｍ＋１）
【００６１】実 施 例 １２ ４−［［２−（マレイミド−１−イル）エチル］メチル
スルホニウム］フェニル １０−メチルアクリジニウム
−９−カルボキシレート（１２）の合成： 実施例１１で得た（１１） ０.９０ｇを２０ｍｌのトル
エンに溶かし、室温攪拌下、１.０ｇのトリフルオロメ
タンスルホン酸メチルを加え、室温で１時間攪拌した
後、一晩放置した。 赤色析出物を濾取し、トルエンで
洗浄後、風乾し、（１２）を１.１ｇを得た（収率 ７１
％）。 この物質の分析値を下記する。
スルホニウム］フェニル １０−メチルアクリジニウム
−９−カルボキシレート（１２）の合成： 実施例１１で得た（１１） ０.９０ｇを２０ｍｌのトル
エンに溶かし、室温攪拌下、１.０ｇのトリフルオロメ
タンスルホン酸メチルを加え、室温で１時間攪拌した
後、一晩放置した。 赤色析出物を濾取し、トルエンで
洗浄後、風乾し、（１２）を１.１ｇを得た（収率 ７１
％）。 この物質の分析値を下記する。
【００６２】ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ：９.０−８.
０（ｍ,８Ｈ）, ７.６（ｄ,Ｊ＝７,２Ｈ）, ７.４（ｄ,
Ｊ＝７,２Ｈ）, ６.７（ｓ,２Ｈ）, ５.１（ｓ,３Ｈ）,
３.８（ｔ,Ｊ＝７,２Ｈ）, ３.７（ｓ,３Ｈ）, ３.２
（ｔ,Ｊ＝７,２Ｈ） ＭＡＳＳ（ＦＡＢ）：４６７（Ｍ＋１）
０（ｍ,８Ｈ）, ７.６（ｄ,Ｊ＝７,２Ｈ）, ７.４（ｄ,
Ｊ＝７,２Ｈ）, ６.７（ｓ,２Ｈ）, ５.１（ｓ,３Ｈ）,
３.８（ｔ,Ｊ＝７,２Ｈ）, ３.７（ｓ,３Ｈ）, ３.２
（ｔ,Ｊ＝７,２Ｈ） ＭＡＳＳ（ＦＡＢ）：４６７（Ｍ＋１）
【００６３】実 施 例 １３ ２−（２−Ｎ−Ｂｏｃ−アミノエトキシ）エタノール
（１３）の合成：２−アミノエトキシエタノール ２.１
ｇを３０ｍｌのアセトニトリルに溶かし、無水Ｂｏｃ
４.８ｇを加え、１時間撹拌した。 溶媒を減圧留去後、
ピリジンを加え、減圧留去し、（１３）を３.７ｇ得た
（収率 定量的）。
（１３）の合成：２−アミノエトキシエタノール ２.１
ｇを３０ｍｌのアセトニトリルに溶かし、無水Ｂｏｃ
４.８ｇを加え、１時間撹拌した。 溶媒を減圧留去後、
ピリジンを加え、減圧留去し、（１３）を３.７ｇ得た
（収率 定量的）。
【００６４】実 施 例 １４ ２−（２−トシルオキシエトキシ）−Ｎ−Ｂｏｃエチル
アミン（１４）の合成：実施例１３で得た（１３） ３.
７ｇを５０ｍｌのピリジンに溶かし、氷冷撹拌下、４.
０ｇのトシルクロリドを少量ずつ添加した。 室温に戻
し２時間撹拌した。 不溶物を濾去し、ピリジンを減圧
留去した。 残渣をシリカゲルカラムクロマト（溶離
液：ＣＨＣｌ3）にて単離精製し、（１４）を５.５ｇ得
た（収率 ７６％）。
アミン（１４）の合成：実施例１３で得た（１３） ３.
７ｇを５０ｍｌのピリジンに溶かし、氷冷撹拌下、４.
０ｇのトシルクロリドを少量ずつ添加した。 室温に戻
し２時間撹拌した。 不溶物を濾去し、ピリジンを減圧
留去した。 残渣をシリカゲルカラムクロマト（溶離
液：ＣＨＣｌ3）にて単離精製し、（１４）を５.５ｇ得
た（収率 ７６％）。
【００６５】実 施 例 １５ ４−［２−（２−Ｎ−Ｂｏｃアミノエトキシ）エトキ
シ］フェニルベンジルエーテル（１５）の合成：ｐ−ベ
ンジルオキシフェノール ２.０ｇを３０ｍｌのＤＭＦに
溶かし、ｔ−ＢｕＯＫ １.２ｇを加え、室温で３０分撹
拌した後、実施例１４で得た（１４）３.９ｇを加え、
３時間室温で撹拌した。 ＤＭＦを減圧留去した後、エ
ーテルに溶かし、希塩酸で１回、水で２回、飽和食塩水
で１回洗浄した。 ＭｇＳＯ4にて乾燥させた後、エーテ
ルを減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマト（溶
離液：ＣＨＣｌ3）にて精製し、（１５）を３.２ｇ得た
（収率 ８３％）。
シ］フェニルベンジルエーテル（１５）の合成：ｐ−ベ
ンジルオキシフェノール ２.０ｇを３０ｍｌのＤＭＦに
溶かし、ｔ−ＢｕＯＫ １.２ｇを加え、室温で３０分撹
拌した後、実施例１４で得た（１４）３.９ｇを加え、
３時間室温で撹拌した。 ＤＭＦを減圧留去した後、エ
ーテルに溶かし、希塩酸で１回、水で２回、飽和食塩水
で１回洗浄した。 ＭｇＳＯ4にて乾燥させた後、エーテ
ルを減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマト（溶
離液：ＣＨＣｌ3）にて精製し、（１５）を３.２ｇ得た
（収率 ８３％）。
【００６６】実 施 例 １６ ４−［２−（２−Ｎ−Ｂｏｃアミノエトキシ）エトキ
シ］フェノール（１６）の合成：実施例１５で得た（１
５） ３.０ｇを４０ｍｌの酢酸に溶かし、２.０ｇのパ
ラジウム黒を加え、水素雰囲気下、室温で２時間撹拌し
た。 パラジウムを濾去し、濾液を減圧留去した。 残渣
をシリカゲルカラムクロマト（溶離液：ＣＨＣｌ3：Ｍ
ｅＯＨ＝９：１）にて単離精製し、（１６）を２.４ｇ
得た（収率 定量的）。
シ］フェノール（１６）の合成：実施例１５で得た（１
５） ３.０ｇを４０ｍｌの酢酸に溶かし、２.０ｇのパ
ラジウム黒を加え、水素雰囲気下、室温で２時間撹拌し
た。 パラジウムを濾去し、濾液を減圧留去した。 残渣
をシリカゲルカラムクロマト（溶離液：ＣＨＣｌ3：Ｍ
ｅＯＨ＝９：１）にて単離精製し、（１６）を２.４ｇ
得た（収率 定量的）。
【００６７】実 施 例 １７ ４−［２−（２−Ｎ−Ｂｏｃアミノエトキシ）エトキ
シ］フェニル ９−アクリジンカルボキシレート（１
７）の合成：実施例２で得た（２） ２.４ｇを３０ｍｌ
のピリジンに溶かし、水冷撹拌下、実施例１６で得た
（１６） ２.０ｇを少量ずつ添加し、室温で２時間撹拌
した後、ピリジンを減圧留去した。 更にＣＨＣｌ3を加
え減圧留去を２回行なった後、残渣をシリカゲルカラム
クロマト（溶離液：ＣＨＣｌ3）にて単離精製し、（１
７）を２.１ｇ得た（収率 ４７％）。
シ］フェニル ９−アクリジンカルボキシレート（１
７）の合成：実施例２で得た（２） ２.４ｇを３０ｍｌ
のピリジンに溶かし、水冷撹拌下、実施例１６で得た
（１６） ２.０ｇを少量ずつ添加し、室温で２時間撹拌
した後、ピリジンを減圧留去した。 更にＣＨＣｌ3を加
え減圧留去を２回行なった後、残渣をシリカゲルカラム
クロマト（溶離液：ＣＨＣｌ3）にて単離精製し、（１
７）を２.１ｇ得た（収率 ４７％）。
【００６８】実 施 例 １８ ４−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］フェニル
９−アクリジンカルボキシレート（１８）の合成：実
施例１７で得た（１７） ２.１ｇに２０ｍｌのＣＦ3Ｃ
Ｏ2Ｈを加え、室温で３０分撹拌した。 ＣＦ3ＣＯ2Ｈを
減圧留去し、水を加え、ＮａＨＣＯ3にて中和し析出物
を濾取した。 濾取物をシリカゲルカラムクロマト（溶
離液：ＣＨＣｌ3 ：ＭｅＯＨ＝９：１）にて単離精製
し、（１８）を１.７ｇ得た（収率 定量的）。
９−アクリジンカルボキシレート（１８）の合成：実
施例１７で得た（１７） ２.１ｇに２０ｍｌのＣＦ3Ｃ
Ｏ2Ｈを加え、室温で３０分撹拌した。 ＣＦ3ＣＯ2Ｈを
減圧留去し、水を加え、ＮａＨＣＯ3にて中和し析出物
を濾取した。 濾取物をシリカゲルカラムクロマト（溶
離液：ＣＨＣｌ3 ：ＭｅＯＨ＝９：１）にて単離精製
し、（１８）を１.７ｇ得た（収率 定量的）。
【００６９】実 施 例 １９ ４−［２−［２−（マレイミド−１−イル）エトキシ］
エトキシ］フェニル ９−アクリジンカルボキシレート
（１９）の合成：実施例１８で得た（１８） １.７ｇ、
無水マレイン酸 １.２ｇおよび酢酸ナトリウム １.２ｇ
を酢酸 ４０ｍｌ中に加え、３時間加熱還流した。 冷
後、酢酸を減圧留去し、水を加えＣＨＣｌ3にて抽出し
た。 ＭｇＳＯ4で乾燥させ、ＣＨＣｌ3を減圧留去し
た。 残渣をシリカゲルカラムクロマト（溶離液：ＣＨ
Ｃｌ3）にて精製し、（１９）を０.８１ｇ得た（収率
４２％）。 この物質の分析値を下記する。
エトキシ］フェニル ９−アクリジンカルボキシレート
（１９）の合成：実施例１８で得た（１８） １.７ｇ、
無水マレイン酸 １.２ｇおよび酢酸ナトリウム １.２ｇ
を酢酸 ４０ｍｌ中に加え、３時間加熱還流した。 冷
後、酢酸を減圧留去し、水を加えＣＨＣｌ3にて抽出し
た。 ＭｇＳＯ4で乾燥させ、ＣＨＣｌ3を減圧留去し
た。 残渣をシリカゲルカラムクロマト（溶離液：ＣＨ
Ｃｌ3）にて精製し、（１９）を０.８１ｇ得た（収率
４２％）。 この物質の分析値を下記する。
【００７０】ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ：８.３（ｍ,８
Ｈ）, ７.４−７.０（ｍ,４Ｈ）, ６.８（ｓ,２Ｈ）,
４.２（ｍ,２Ｈ）, ３.９（ｍ,２Ｈ）, ３.８（ｓ−ｌ
ｉｋｅ,４Ｈ） ＭＡＳＳ（ＦＡＢ）：４８３（Ｍ＋１）
Ｈ）, ７.４−７.０（ｍ,４Ｈ）, ６.８（ｓ,２Ｈ）,
４.２（ｍ,２Ｈ）, ３.９（ｍ,２Ｈ）, ３.８（ｓ−ｌ
ｉｋｅ,４Ｈ） ＭＡＳＳ（ＦＡＢ）：４８３（Ｍ＋１）
【００７１】実 施 例 ２０ ４−［２−［２−（マレイミド−１−イル）エトキシ］
エトキシ］フェニル １０−メチルアクリジニウム−９
−カルボキシレート（２０）の合成：実施例１９で得た
（１９） ０.８１ｇを５０ｍｌのトルエンに溶かし、室
温撹拌下、０.６０ｇのトリフルオロメタンスルホン酸
メチルを加え、室温で１時間撹拌した後、一晩放置し
た。黄色析出物を濾取しトルエンで洗浄後風乾し、（２
０）を０.３９ｇ得た（収率 ３７％）。 この物質の分
析値を下記する。
エトキシ］フェニル １０−メチルアクリジニウム−９
−カルボキシレート（２０）の合成：実施例１９で得た
（１９） ０.８１ｇを５０ｍｌのトルエンに溶かし、室
温撹拌下、０.６０ｇのトリフルオロメタンスルホン酸
メチルを加え、室温で１時間撹拌した後、一晩放置し
た。黄色析出物を濾取しトルエンで洗浄後風乾し、（２
０）を０.３９ｇ得た（収率 ３７％）。 この物質の分
析値を下記する。
【００７２】ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：９.０−８.
０（ｍ,８Ｈ）, ７.４（ｄ,Ｊ＝７,２Ｈ）, ７.１（ｄ,
Ｊ＝７,２Ｈ）, ６.８（ｓ,２Ｈ）, ５.１（ｓ,３Ｈ）,
４.２（ｍ,２Ｈ）, ３.９（ｍ,２Ｈ）, ３.８（ｓ−ｌ
ｉｋｅ,４Ｈ） ＭＡＳＳ（ＦＡＢ）：４９７（Ｍ＋１）
０（ｍ,８Ｈ）, ７.４（ｄ,Ｊ＝７,２Ｈ）, ７.１（ｄ,
Ｊ＝７,２Ｈ）, ６.８（ｓ,２Ｈ）, ５.１（ｓ,３Ｈ）,
４.２（ｍ,２Ｈ）, ３.９（ｍ,２Ｈ）, ３.８（ｓ−ｌ
ｉｋｅ,４Ｈ） ＭＡＳＳ（ＦＡＢ）：４９７（Ｍ＋１）
【００７３】実 施 例 ２１ 抗ヒトヘモグロビン抗体の標識：０.１Ｍ ＮａＣｌを含
む、０.１Ｍ 酢酸ソーダ緩衝液（ｐＨ４.５） ３ｍｌ中
に精製抗ヒトヘモグロビンウサギポリクローナル抗体
１０ｍｇを加えた溶液へ、ブタ胃液由来精製ペプシン粉
末 ０.４ｇを添加溶解し、３７℃で４８時間インキュベ
ートし、ウサギＩｇＧのＦｃ部分を消化した。 これ
を、溶離液として５ｍＭ ＥＤＴＡを含む、０.１Ｍ リ
ン酸ソーダ緩衝液（ｐＨ６）［以下ｐＨ６緩衝液と略
す］と、スーパーデックス２００カラム（ファルマシア
製）とを用いるゲル濾過により分画し、ｐＨ６緩衝液
３ｍｌ中にＦ（ａｂ'）2 ５ｍｇを得た。
む、０.１Ｍ 酢酸ソーダ緩衝液（ｐＨ４.５） ３ｍｌ中
に精製抗ヒトヘモグロビンウサギポリクローナル抗体
１０ｍｇを加えた溶液へ、ブタ胃液由来精製ペプシン粉
末 ０.４ｇを添加溶解し、３７℃で４８時間インキュベ
ートし、ウサギＩｇＧのＦｃ部分を消化した。 これ
を、溶離液として５ｍＭ ＥＤＴＡを含む、０.１Ｍ リ
ン酸ソーダ緩衝液（ｐＨ６）［以下ｐＨ６緩衝液と略
す］と、スーパーデックス２００カラム（ファルマシア
製）とを用いるゲル濾過により分画し、ｐＨ６緩衝液
３ｍｌ中にＦ（ａｂ'）2 ５ｍｇを得た。
【００７４】そこへ、２−メルカプトエチルアミン ２
４ｍｇを添加し、３７℃で２４時間インキュベートし、
Ｆ（ａｂ'）2をＦａｂ'に還元した。 次いで、セファデ
ックスＧ２５カラム（ファルマシア製、溶離液ｐＨ６緩
衝液）によりゲル濾過し、ｐＨ６緩衝液 ３ｍｌ中にＦ
ａｂ' ２ｍｇを得た。 この一部分を、４,４'−ジチオ
ピリジンと反応させ、Ｆａｂ'のＳＨ基と４,４'−ジチ
オピリジンの定量的反応の結果生じる４−メルカプトピ
リジンの量を波長３２４ｎｍで吸光度測定し、ＳＨ基の
定量を実施した。 この結果、Ｆａｂ'１分子当たりＳＨ
基は１個であった。
４ｍｇを添加し、３７℃で２４時間インキュベートし、
Ｆ（ａｂ'）2をＦａｂ'に還元した。 次いで、セファデ
ックスＧ２５カラム（ファルマシア製、溶離液ｐＨ６緩
衝液）によりゲル濾過し、ｐＨ６緩衝液 ３ｍｌ中にＦ
ａｂ' ２ｍｇを得た。 この一部分を、４,４'−ジチオ
ピリジンと反応させ、Ｆａｂ'のＳＨ基と４,４'−ジチ
オピリジンの定量的反応の結果生じる４−メルカプトピ
リジンの量を波長３２４ｎｍで吸光度測定し、ＳＨ基の
定量を実施した。 この結果、Ｆａｂ'１分子当たりＳＨ
基は１個であった。
【００７５】次いで、Ｆａｂ' ０.５ｍｇを含むｐＨ６
緩衝液 ０.７５ｍｌに、実施例６で合成された化合物
（６） ０.０４ｍｇを含むｐＨ６緩衝液 ０.５ｍｌを加
えた。すなわち、Ｆａｂ'と化合物（６）の結合反応の
モル比が１対５となるように加え、４℃で４８時間イン
キュベートし、Ｆａｂ'を化合物（６）で標識し、反応
後、セファデックスＧ２５カラム（ファルマシア製、溶
離液ｐＨ６緩衝液）によりゲル濾過し過剰に加えられた
化合物（６）を分離してｐＨ６緩衝液 ３ｍｌ中に標識
抗体 ０.５ｍｇを得た（標識抗体Ａ）。 これを、Ｆａ
ｂ'のＥ280および化合物（６）のＥ260モル吸光係数よ
り定量したところ、得られた標識抗体ＡはＦａｂ'と化
合物（６）とが１対１のモル比で結合していた。
緩衝液 ０.７５ｍｌに、実施例６で合成された化合物
（６） ０.０４ｍｇを含むｐＨ６緩衝液 ０.５ｍｌを加
えた。すなわち、Ｆａｂ'と化合物（６）の結合反応の
モル比が１対５となるように加え、４℃で４８時間イン
キュベートし、Ｆａｂ'を化合物（６）で標識し、反応
後、セファデックスＧ２５カラム（ファルマシア製、溶
離液ｐＨ６緩衝液）によりゲル濾過し過剰に加えられた
化合物（６）を分離してｐＨ６緩衝液 ３ｍｌ中に標識
抗体 ０.５ｍｇを得た（標識抗体Ａ）。 これを、Ｆａ
ｂ'のＥ280および化合物（６）のＥ260モル吸光係数よ
り定量したところ、得られた標識抗体ＡはＦａｂ'と化
合物（６）とが１対１のモル比で結合していた。
【００７６】同様にして、Ｆａｂ' ０.５ｍｇを含むｐ
Ｈ６緩衝液 ０.７５ｍｌに、実施例１２で合成された化
合物（１２） ０.０４ｍｇを含むｐＨ６緩衝液 ０.５ｍ
ｌを加えて反応後ゲル濾過し、ｐＨ６緩衝液 ３ｍｌ中
に標識抗体 ０.５ｍｇを得た（標識抗体Ｂ）。 また同
様にして、Ｆａｂ' ０.５ｍｇを含むｐＨ６緩衝液 ０.
７５ｍｌに、実施例２０で合成された化合物（２０）
０.０３ｍｇを含むｐＨ６緩衝液 ０.５ｍｌを加えて反
応後ゲル濾過し、ｐＨ６緩衝液 ３ｍｌ中に標識抗体０.
５ｍｇを得た（標識抗体Ｃ）。 得られた標識抗体Ｂお
よび標識抗体Ｃはともに、それぞれＦａｂ'と化合物
（１２）およびＦａｂ'と化合物（２０）とが１対１の
モル比で結合していた。
Ｈ６緩衝液 ０.７５ｍｌに、実施例１２で合成された化
合物（１２） ０.０４ｍｇを含むｐＨ６緩衝液 ０.５ｍ
ｌを加えて反応後ゲル濾過し、ｐＨ６緩衝液 ３ｍｌ中
に標識抗体 ０.５ｍｇを得た（標識抗体Ｂ）。 また同
様にして、Ｆａｂ' ０.５ｍｇを含むｐＨ６緩衝液 ０.
７５ｍｌに、実施例２０で合成された化合物（２０）
０.０３ｍｇを含むｐＨ６緩衝液 ０.５ｍｌを加えて反
応後ゲル濾過し、ｐＨ６緩衝液 ３ｍｌ中に標識抗体０.
５ｍｇを得た（標識抗体Ｃ）。 得られた標識抗体Ｂお
よび標識抗体Ｃはともに、それぞれＦａｂ'と化合物
（１２）およびＦａｂ'と化合物（２０）とが１対１の
モル比で結合していた。
【００７７】実 施 例 ２２ 標識抗体によるヒトヘモグロビンのアッセイ：０.１５
Ｍ ＮａＣｌを含む、ｐＨ７の０.０５Ｍ リン酸緩衝液
（以下ＰＢＳと略す） ０.１ｍｌ中に、精製抗ヒトヘモ
グロビンマウスモノクローナル抗体 ５μｇを含む液を
調製した。 この液をマイクロプレートの各ウエルに０.
１ｍｌずつ分注し、４℃で一昼夜放置してこのモノクロ
ーナル抗体をウエル内部表面に吸着させ固相化した。
Ｍ ＮａＣｌを含む、ｐＨ７の０.０５Ｍ リン酸緩衝液
（以下ＰＢＳと略す） ０.１ｍｌ中に、精製抗ヒトヘモ
グロビンマウスモノクローナル抗体 ５μｇを含む液を
調製した。 この液をマイクロプレートの各ウエルに０.
１ｍｌずつ分注し、４℃で一昼夜放置してこのモノクロ
ーナル抗体をウエル内部表面に吸着させ固相化した。
【００７８】この抗体固相化プレートを、ウシ血清アル
ブミン １ｍｇを含むＰＢＳ ０.１ｍｌにてブロッキン
グ処理した。 別途、精製ヒトヘモグロビンをそれぞれ
０、０.２、１、５、２５および１２５μｇ／ｍｌとな
るようにＰＢＳにて溶解しておき、これらのそれぞれ
０.１ｍｌを前記マイクロプレートの各ウエルに分注
し、４℃で一昼夜放置して試料中のヒトヘモグロビンを
固相化抗体に捕捉させた。
ブミン １ｍｇを含むＰＢＳ ０.１ｍｌにてブロッキン
グ処理した。 別途、精製ヒトヘモグロビンをそれぞれ
０、０.２、１、５、２５および１２５μｇ／ｍｌとな
るようにＰＢＳにて溶解しておき、これらのそれぞれ
０.１ｍｌを前記マイクロプレートの各ウエルに分注
し、４℃で一昼夜放置して試料中のヒトヘモグロビンを
固相化抗体に捕捉させた。
【００７９】次いで、各ウエルをＰＢＳで洗浄し、結合
しなかったヒトヘモグロビンを分離後、実施例２１で作
成した標識抗体Ａ ５μｇをそれぞれ含むＰＢＳ ０.１
ｍｌを各ウエルに分注し、４℃で一昼夜放置して反応さ
せた。 各ウエルをＰＢＳで洗浄し、結合しなかった標
識抗体Ａを分離後、０.１Ｎ−ＮａＯＨ ０.０５ｍｌお
よび０.５％Ｈ2Ｏ2 ０.０４ｍｌを加えることで発光さ
せ、化学発光測定用マイクロプレートリーダーの一種で
あるルミナスＣＴ−９０００Ｄ（ダイアヤトロン製）に
より測定した。 発光量は２秒間の積算値とした。同様
にして、標識抗体Ｂによるヒトヘモグロビンのアッセイ
および標識抗体Ｃによるヒトヘモグロビンのアッセイを
実施した。 以上の結果をまとめて表１に示す。
しなかったヒトヘモグロビンを分離後、実施例２１で作
成した標識抗体Ａ ５μｇをそれぞれ含むＰＢＳ ０.１
ｍｌを各ウエルに分注し、４℃で一昼夜放置して反応さ
せた。 各ウエルをＰＢＳで洗浄し、結合しなかった標
識抗体Ａを分離後、０.１Ｎ−ＮａＯＨ ０.０５ｍｌお
よび０.５％Ｈ2Ｏ2 ０.０４ｍｌを加えることで発光さ
せ、化学発光測定用マイクロプレートリーダーの一種で
あるルミナスＣＴ−９０００Ｄ（ダイアヤトロン製）に
より測定した。 発光量は２秒間の積算値とした。同様
にして、標識抗体Ｂによるヒトヘモグロビンのアッセイ
および標識抗体Ｃによるヒトヘモグロビンのアッセイを
実施した。 以上の結果をまとめて表１に示す。
【００８０】
【００８１】この表のごとく、ヒトヘモグロビン濃度に
応じて、標識抗体Ａ、標識抗体Ｂおよび標識抗体Ｃに由
来する化学発光量は、いずれも増大し、ヒトヘモグロビ
ンの定量に有用であることを示している。 以 上
応じて、標識抗体Ａ、標識抗体Ｂおよび標識抗体Ｃに由
来する化学発光量は、いずれも増大し、ヒトヘモグロビ
ンの定量に有用であることを示している。 以 上
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｂ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07D 401/12 C07D 401/14 C09B 15/00 C09K 11/07 G01N 21/78 G01N 33/532 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (7)
- 【請求項１】 一般式（I） 【化１】 ［式中、Ｑは基 −Ｓ+ＲＸ-− 、基 −Ｎ+ＲＲ1Ｘ-−
（ここで、Ｒ1は炭素数１から６のアルキル基またはア
リール基を示す）、 【化２】 （ここで、Ｒ2およびＲ3は同一または異なって、それぞ
れ基−（ＣＨ2）k−（ｋは１〜３の数を意味する）を示
す）または基 −Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）l− （ｌは１〜
３の数）を示し、Ｒは炭素数１〜６のアルキル基または
アリール基を、Ｘ-はアニオンを示し、ｍは０〜２の数
を、ｎは１〜２の数を意味する］で表されるアクリジン
誘導体。 - 【請求項２】 上記一般式（I）で表されるアクリジン
誘導体の中間体である下記一般式（II） 【化３】 ［式中、Ｑ'は基 −Ｓ−、基 −ＮＲ1− （ここで、Ｒ1
は炭素数１から６のアルキル基を示す）、 【化４】 （ここで、Ｒ2およびＲ3は同一または異なって、それぞ
れ基−（ＣＨ2）k−（ｋは１〜３の数を意味する）を示
す）または基 −Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）l− （ｌは１〜３
の数）を示し、ｍは０〜２の数、ｎは１〜２の数を意味
する］で表されるアクリジン誘導体。 - 【請求項３】 次の式（II） 【化５】 ［式中、Ｑ'は基 −Ｓ−、基 −ＮＲ1− （ここで、Ｒ1
は炭素数１から６のアルキル基を示す）、 【化６】 （ここで、Ｒ2およびＲ3は同一または異なって、それぞ
れ基−（ＣＨ2）k−（ｋは１〜３の数を意味する）を示
す）または基 −Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）l− （ｌは１〜３
の数）を示し、ｍは０〜２の数、ｎは１〜２の数を意味
する］で表されるアクリジン誘導体に、次の式（III） 【化７】 （式中、Ｒは炭素数１〜６のアルキル基またはアリール
基を、Ｘは容易にアニオンとなる脱離基を示す）で表さ
れるアルキル化剤を作用させることを特徴とする、次の
式（I） 【化８】 ［式中、Ｑは基 −Ｓ+ＲＸ-− 、−Ｎ+ＲＲ1−（ここ
で、Ｒ1は炭素数１から６のアルキル基またはアリール
基を示す）、 【化９】 （ここで、Ｒ2およびＲ3は同一または異なって、それぞ
れ基−（ＣＨ2）k−（ｋは１〜３の数を意味する）を示
す）または基 −Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）l− （ｌは１〜
３の数）を示し、Ｒ、Ｘ、ｍおよびｎは前記した意味を
有する］で表されるアクリジン誘導体の製法。 - 【請求項４】 次の式（IV） 【化１０】 （式中、Ｙ1は脱離基を示し、ｍは０〜２の数を示す）
で表される脱離基を有するフェノール化合物と、次の式
（V） 【化１１】 （式中、Ｙ2は脱離基を示す）で表される９−アクリジ
ンカルボン酸誘導体とを反応させて、次の式（VI） 【化１２】 （式中、Ｙ1およびｍは前記した意味を有する）で表さ
れる化合物とし、次いでこの化合物に次の式（VII） 【化１３】 ［式中、Ｑ1は基 −ＮＲ1− （ここで、Ｒ1は炭素数１
から６のアルキル基を示す）または 【化１４】 （ここで、Ｒ2およびＲ3は同一または異なって、それぞ
れ基−（ＣＨ2）k−（ｋは１〜３の数を意味する）を示
す）を示し、Ｒaはそれぞれ水素原子またはアミノ保護
基を示し、ｎは１〜２の数を意味する］で表される末端
に必要に応じ保護基で保護した一級アミノ基を有しかつ
他端に一級または二級のアミノ基を有するポリアミンと
を適当な塩基のもとで反応させ、次の式（VIII） 【化１５】 （式中、Ｑ1、Ｒa、ｍおよびｎは前記した意味を有す
る）で表される９−アクリジンエステルを製造し、末端
の一級アミノ基の保護基が存在する場合は、その保護基
をはずした後、無水マレイン酸を作用させることを特徴
とする次の式（IIa） 【化１６】 （式中、Ｑ1、ｍおよびｎは前記した意味を有する）で
表されるアクリジン誘導体の製法。 - 【請求項５】 次の式（Ｘ） ［式中、Ｑ２は基−Ｓ−または基−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ
２Ｏ）１−（１は１〜３の数）を、Ｒａはそれぞれ水素
原子またはアミノ保護基を示し、ｍは０〜２の数、ｎは
１〜２の数を意味する］で表される末端に保護基で保護
された一級アミノ基かついたチオエーテルまたはポリエ
ーテル構造を有する基を持つフェノール誘導体と、次の
式（Ｖ） （式中、Ｙ２は脱離基を示す）で表される９−アクリジ
ンカルボン酸誘導体とを反応させて次の式（ＸＩ） （式中、Ｑ２、Ｒ ａ 、ｍおよびｎは前記した意味を有す
る）で表されるアクリジンエステルとし、次いで末端に
あるアミノ基の脱保護を行った後、無水マレイン酸を作
用させることを特徴とする次の式（ＩＩｂ） （式中、Ｑ２、ｍおよびｎは前記した意味を有する）で
表されるアクリジン誘導体の製法。 - 【請求項６】 請求項第１項記載の一般式（I）で表さ
れるアクリジン誘導体を、ＳＨ基を有する被測定物質に
反応させることを特徴とする該物質の標識法。 - 【請求項７】 請求項第２項記載の一般式（II）で表さ
れるアクリジン誘導体を、ＳＨ基を有する被測定物質に
反応させることを特徴とする該物質の前標識法。
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|---|---|---|---|
| JP08596596A JP3174729B2 (ja) | 1996-03-15 | 1996-03-15 | アクリジン誘導体、その製法およびこれを用いた標識法 |
| US08/945,885 US6171520B1 (en) | 1996-03-15 | 1997-03-14 | Reagents for labeling SH groups, process for the preparation of them and method for labeling with them |
| CA002221306A CA2221306A1 (en) | 1996-03-15 | 1997-03-14 | Reagents for labeling sh groups, process for the preparation of them, and method for labeling with them |
| KR1019970708057A KR100259761B1 (ko) | 1996-03-15 | 1997-03-14 | 에스에이치기 표지용시약, 그의 제조방법 및 이를 이용한 표지법 |
| EP97907321A EP0844246A4 (en) | 1996-03-15 | 1997-03-14 | REAGENTS FOR LABELING SH GROUPS, PROCESS FOR PREPARING SAME AND METHOD FOR MARKING SAME |
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| US8293908B2 (en) * | 2007-11-20 | 2012-10-23 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Facile N-alkylation of acridine compounds in ionic liquids |
-
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- 1996-03-15 JP JP08596596A patent/JP3174729B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JPH09249662A (ja) | 1997-09-22 |
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