KR100259761B1 - 에스에이치기 표지용시약, 그의 제조방법 및 이를 이용한 표지법 - Google Patents

에스에이치기 표지용시약, 그의 제조방법 및 이를 이용한 표지법 Download PDF

Info

Publication number
KR100259761B1
KR100259761B1 KR1019970708057A KR19970708057A KR100259761B1 KR 100259761 B1 KR100259761 B1 KR 100259761B1 KR 1019970708057 A KR1019970708057 A KR 1019970708057A KR 19970708057 A KR19970708057 A KR 19970708057A KR 100259761 B1 KR100259761 B1 KR 100259761B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
group
formula
compound
represented
acridine
Prior art date
Application number
KR1019970708057A
Other languages
English (en)
Other versions
KR19990014715A (ko
Inventor
가즈히로 이마이
히로미치 에토
다케시 코츠가이
타다시 나리타
Original Assignee
타이도 나오카타
에스에스 세야쿠 가부시키 가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP08596596A external-priority patent/JP3174729B2/ja
Priority claimed from JP08596696A external-priority patent/JP3220000B2/ja
Application filed by 타이도 나오카타, 에스에스 세야쿠 가부시키 가이샤 filed Critical 타이도 나오카타
Publication of KR19990014715A publication Critical patent/KR19990014715A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100259761B1 publication Critical patent/KR100259761B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • C09K11/07—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials having chemically interreactive components, e.g. reactive chemiluminescent compositions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Abstract

다음 일반식 (I)
Figure kpo00046
[식중, A는 다음 기
-(CH2)m1-
또는
-(CH2)m2-Q-(CH2)n-
[여기서, Q는 기 -S+RX--, 기 N+RR1X-- (여기서, R1은 탄소수 1 내지 6의 알킬기 또는 아릴기를 나타낸다), 기
Figure kpo00047
(여기서, R2및 R3는 동일 또는 상이한 것으로 각각 기 -(CH2)k- (k는 1∼3의 수를 의미한다)를 나타낸다) 또는 -O(CH2CH2O)l- (l은 1∼3의 수를 의미한다)를 나타내고, m1은 1∼6의 수를, m2는 0∼2의 수를, n은 1∼6의 수를 의미한다], R은 탄소수 1∼6의 알킬 또는 아릴기를, X-는 아니온을 나타낸다]로 표시되는 아크리딘 화합물을 또는 그의 중간체를 함유하는 SH기 표지용 시약, 당해 아크리딘 화합물의 제조방법 및 이 화합물을 사용하는 피측정물질의 표지법이 개시되어 있다.

Description

에스에이치기 표지용 시약, 그의 제조방법 및 이를 이용한 표지법
아크리딘 화합물인 아크리디늄 에스테르는 높은 발광효과를 가지므로 화학발광 표지물질로서 유용하다. 이 아크리디늄 에스테르를 임상검사의 면역 발광분석에서의 케미루미네센트 라벨로서 사용하는 것에 대하여는, 예를 들면 유럽특허 출원공개 제 82636호 및 미국특허 제 4745181호 명세서에 개시되어 있다.
공지의 아크리디늄 에스테르 중에는 말단에 술포늄 이온을 갖는 것 (일본국 특개평 5-255264호), 스페이서 일부에 히드라조늄 이온을 갖는 것(일본국 특개평 5-255263호) 및 아크리디늄의 메틸기 등을 카르복실기에 대체한 것(일본국 특개평 6-228192호) 등 친수성 구조를 갖는 것이 알려져 있으나, 이들의 친수성 구조를 갖는 아크리디늄 에스테르는 실질적으로 아미노기를 표지하는 것을 목적으로 하는 것이며, 아미노산이나 단백질 등을 표지하고, 임상검사의 면역 발광분석에서의 케미루미네센트 라벨로서 사용하는 것에 적합한 화합물로 되어 있다.
그런데 임상검사의 면역발광분석에서 측정대상물질은 아미노산이나 단백질이 대부분이나 이들 물질에는 많은 아미노기가 존재하기 때문에 상기 공지의 아크리디늄 화합물은 표지의 실행이 쉽다는 점에서는 큰 이점이 있다.
그러나, 역으로 아미노산이나 단백질 중에는 많이 함유된 아미노기를 표지하는 결과, 피표지부분이 많게 되고, 표지의 균일성, 재현성, 항체 단백 등 대상물의 불용화의 문제나, 항체에 표지하는 경우에는 하원인식부위에 있는 아미노기에 표지 화합물이 결합하고, 항체로서 작용을 저하시키거나 잃어버리는 문제가 있었다. 또한 표지물질이 아미노기의 수의 한정된 저분자인 경우에는 표지반응을 억제하고 용이하게 일정의 몰비로 표지할 수 있는 경우도 있으나, 피표지물질이 항체 단백 등의 고분자에서 아미노기의 수가 반드시 한정되지 않는 경우는 시행착오에 의해 일정의 몰비로 표지로 표지할 수 있는 조건을 예비검토하지 않으면 안되는 결점도 있다.
한편, 어떤 화합물은 화학발광표지 시약으로서 실용에 제공하기 위하여는 그의 화합물의 표지반응이 용이함과 동시에 그의 표지조건에서는 발광 내지 분해에는 이르지 않는 것이 필수이다. 아크리디늄 에스테르에서 표지되는 상대방은 아미노산 등 저분자 화합물을 비롯하여 효소 또는 항체 등의 고분자 화합물까지 여러 가지이나, 상기와 같이 피표지물질의 아미노기를 이용하는 경우, 상기 인용문헌에 보여지는 바와 같이 아크리디늄 에스테르에 이미드기를 주어 아미노기와 결합되는 경우가 많다. 그리하여 이 이미노기를 사용하여 아미노기와 결합 반응시키는 경우의 반응은 알카리성에서 효율좋게 진행하나, 일반적으로 아크리디늄 화합물은 알카리성에서 발광 내지 분해에 이르는 불안정한 화합물이기 때문에 발광활성을 가진 채 표지를 효율좋게 진행하는 것은 서로 모순하는 반응조건을 구하는 것으로 되어 불합리하다.
따라서, 면역발광분석 등에 사용되는 화학발광표지법에서 아미노산이나 단백질 등의 피측정물질과 온화한 조건하에서 결합할 수 있으며, 더욱이 높은 특이성을 가지면서 충분한 결합력을 갖는 표지 화합물을 발견하고 이를 이용하여 안정하게 정밀도가 좋은 피측정물질을 검출하는 방법의 제공이 요망되고 있다.
본 발명은 말레이미드기를 갖는 아크리딘 화합물을 이용하는 SH기 표지용 시약에 관한 것이며, 더 상세히는 아미노산, 단백질 등의 피측정물질에 함유되거나, 또는 용이하게 도입될 수 있는 SH기에 결합하는 말레이미드기를 가지며, 화학발광하는 아크리딘 화합물을 표지물질로 하는 SH기 표지용 시약, 그의 제조방법 및 이를 이용한 표지법에 관한 것이다.
본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위하여, 우선 표지기로서 종래 이용되고 있는 아미노기 대신에 아미노산이나 단백질 등에 일반적으로 충분히 함유되지 않으나, 양호한 반응성을 갖는 SH기를 이용하는 것에 생각하게 되었다. 그리하여 이 SH기를 표지하기 위한 SH기 표지용 시약으로서 말레이미드기를 도입한 아크리디늄 화합물이 유리하게 이용할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명의 목적은 일반식(I)
Figure kpo00000
[식중, A는 다음 기
-(CH2)m1-
또는
-(CH2)m2-Q-(CH2)n-
[여기서, Q는 기 -S+RX--, 기 N+RR1X-- (여기서, R1은 탄소수 1 내지 6의 알킬기 또는 아릴기를 나타낸다), 기
Figure kpo00001
(여기서, R2및 R3는 동일 또는 상이한 것으로 각각 기 -(CH2)k- (k는 1∼3의 수를 의미한다)를 나타낸다) 또는 -O(CH2CH2O)l- (l은 1∼3의 수를 의미한다)를 나타내고, m1은 1∼6의 수를, m2는 0∼2의 수를, n은 1∼6의 수를 의미한다], R은 탄소수 1∼6의 알킬 또는 아릴기를, X-는 아니온을 나타낸다]로 표시되는 아크리딘 화합물을 함유하는 SH기 표지용 시약을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 아크리딘 화합물의 중간체인 일반식(II)
Figure kpo00002
[식중, A'는 다음 기
-(CH2)m1-
또는
-(CH2)m2-Q'-(CH2)n-
[여기서, Q'는 기 -S-, 기 NR1- (여기서, R1은 탄소수 1 내지 6의 알킬기를 나타낸다), 기
Figure kpo00003
(여기서, R2및 R3는 동일 또는 상이한 것으로 각각 기 -(CH2)k- (k는 1∼3의 수를 의미한다)를 나타낸다) 또는 -O(CH2CH20)l- (l은 1∼3의 수를 의미한다)를 나타내고, m1, m2, 및 n은 전술한 바와 같다]를 나타낸다]로 표시되는 아크리딘 화합물을 함유하는 SH기 표지용 시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 식(I) 및 (II)로 표시되는 아크리딘 화합물의 제조법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 식(I) 및 (II)을 이용하는 피측정물질의 표지법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일반식(I)로 표시되는 화합물은 예를 들면, 하기 방법 1 및 2의 어느 하나에 따라서 제조할 수 있다.
방법 1:
본 발명의 아크리딘 화합물중, A가 기
-(CH2)m1-
(여기서, m1은 전술한 바와 같다)
인 화합물(Ia)는 다음 반응식에 따라서, 일반식(IIa)로 표시되는 화합물 (이하, 『중간체 (IIa)』라 한다)에 통상의 방법에 따라 알킬화제(III)를 반응시킴으로서 얻어진다.
Figure kpo00004
(식중, X는 용이하게 아니온으로 되는 탈리기를 나타내며, R, m1은 전술한 바와 같다)
이 반응에서 사용되는 알킬화제(R-X)로서는 예를 들면, 요드화메틸, 브롬화메틸 또는 요드화에틸기 등의 알킬할라이드, 트리플루오로메탄술폰산메틸, 플루오로술폰산메틸, 메탄술폰산메틸이나 p-톨루엔술폰산메틸 등을 들 수 있다. 따라서, 식(Ia) 중의 X-는 I-, Br-등의 할로겐 이온, CF3SO3 -, FSO3 -, CH3SO3 -및 p-CH3C6H4SO3 -가 가장 대표적이며, 또한 R은 메틸, 에틸 등의 탄소수 1 내지 6의 알킬기 또는 아릴기이다. 또한, 이 반응에서 사용되는 용매로서는 예를 들면, 에테르, 톨루엔, 아세토니트릴 등을 들 수 있다.
화합물(Ia)를 제조하기 위한 출발원료인 중간체(IIa)는 다음 식에 따라서 ω-아미노알킬렌페닐 9-아크리딘카르복실레이트(IV)와 무수 말레인산(V)을 염기 존재하 반응시킴으로서 제조할 수 있다.
Figure kpo00005
Figure kpo00006
(식중, m1은 전술한 바와 같다)
구체적으로는 예를 들면, 크리닉칼 케미스트리 (Clin. Chem. 1985, 31 (10), 1664-1668)에 기재된 방법에 준하여 염기로서 아세트산나트륨, 탄산칼륨 등을 사용하고, 또한 용매로서 아세트산, 프로피온산 등을 사용하고, 80∼140℃ 정도의 온도에서 화합물(IV)과 (V)를 반응시킴으로서 화합물(II)를 얻을 수 있다.
또, 상기 중간체(IIa)는 일본국 특개소 62-61969호에 일반식의 형태로 기재되어 있으나, 이 공보에서는 실시예는 말할 것도 없고, 이 화합물의 제조에 단서가 될만한 것은 하나도 없다. 따라서, 이 화합물을 사실상 신규의 화합물로 생각된다.
방법 2:
본 발명의 아크리딘 화합물중, A가 기
-(CH2)m2-Q'-(CH2)n-
(여기서, Q', m2 및 n은 전술한 바와 같다)
인 화합물(Ib)는 신규 화합물이며, 의 구체예로서 다음 식으로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
Figure kpo00007
이 화합물(Ib)는 예를 들면 다음 반응식에 따라, 일반식(IIb)로 표시되는 화합물 (이하, 『중간체 (IIb)』라 한다)에 통상의 방법에 따라 알킬화제(III)를 반응시킴으로서 얻어진다.
Figure kpo00008
Figure kpo00009
(식중, Q, Q', R, X-, m2및 n은 전술한 바와 같다)
이 반응에서 사용되는 알킬화제(R-X)로서는 방법 1에서 사용한 것과 동일한 것을 들 수 있다. 따라서, 식(Ib) 중의 X-는 I-, Br-등의 할로겐 이온, CF3SO3 -, FSO3 -, CH3SO3 -및 p-CH3C6H4SO3 -가 가장 대표적이며, 또한 R은 메틸, 에틸 등의 탄소수 1 내지 6의 알킬기 또는 아릴기이다. 또한, 이 반응에서 사용되는 용매로서는 예를 들면, 에테르, 톨루엔, 아세토니트릴 등을 들 수 있다.
또한, 화합물(Ib)를 제조하기 위한 출발원료인 중간체(IIb)는 신규의 화합물이며, 그의 구체예로서 예를 들면 하기 식으로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
Figure kpo00010
이 중간체(IIb)는 다음 방법의 어느 하나에 의해 제조할 수 있다.
(i) 다음 반응식에 따라, 탈리기를 갖는 페놀 화합물(VI)과 9-아크리딘 카르복실산의 반응성 유도체(VII)와 반응시킨 후, 말단에 탈리기를 갖는 아크리딘 에스테르 유도체 (VIII)를 제조한 후, 여기에 말단에 필요에 따라 보호기로 보호한 1급 아미노기를 갖고, 다른 쪽에 1급 또는 2급 아미노기를 갖는 폴리아민(IX)을 적당한 염기하에서 반응시키고, 말단에 필요에 따라 보호기로 보호한 1급 아미노기를 갖는 아크리딘 에스테르(X)를 제조하고, 말단에 1급 아미노기의 보호기가 존재하는 경우는 그의 보호기를 떼어낸 후, 무수 말레인산(V)과 1급 아미노기를 반응시켜 말레이미드기로서 화합물(IIb')를 얻는다.
Figure kpo00011
[식중, Ra는 각각 수소원자 또는 아미노 보호기를 나타내고, Y1및 Y2는 탈리기를, Q1은 기 -NR1- (여기서, R1은 탄소수 1 내지 6의 알킬기를 나타낸다) 또는 기
Figure kpo00012
(여기서, R2및 R3는 전술한 바와 같다)를 나타내고, m2및 n은 전술한 바와 같다]
(ii) 다음 반응식에 따라서, 말단에 보호기로 보호된 1급 아미노기가 붙은 티오에테르 또는 폴리에테르를 갖는 페놀 유도체 (XI)와 9-아크리딘카르복실산의 반응성 유도체(VII)를 반응시킴으로서 아크리디늄 에스테르(XII)를 제조하고, 이어서, 말단에 아미노기의 탈보호를 행한 후, 무수 말레인산 (V)를 말단의 1급 아미노기에 반응시켜 말레이미드기로서 화합물(IIb")를 얻는다.
Figure kpo00013
(식중, Q2는 기 -S- 또는 기 -O(CH2CH2O)l-를 나타내고, R3, Y2, m2및 n은 전술한 바와 같다)
방법 (i)의 탈리기를 갖는 페놀 화합물 (VI)의 페놀 화합물의 예로서는 4-(토실옥시메틸)페놀, 4-(3-클로로프로필)페놀, 4-(2-토실옥시에틸)페놀 등을 들 수 있으며, 그의 탈리기로서는 토실옥시기, 메틸옥시기, 할로겐원자(Cl, Br, I)를 들 수 있다. 또한 9-아크리딘 카르복실산의 반응성 유도체(VII)으로서는 클로라이드, 브로마이드 등의 할라이드, 산무수물, 활성산에스테르 등을 들 수 있다. 또한 폴리아민(IX)으로서는 N-(2-아미노에틸)피페라진, 1,3-디아미노프로판, 4-(아미노메틸)피페리딘 등을 들 수 있으며, 그의 보호기로서는 t-부톡시카르보닐(Boc), 벤질옥시카르보닐(Cbz), 프탈이미드 등을 들 수 있다. 또한, 화합물(VI)과 (VII)의 반응 및 화합물 (VIII) 및 (IX)의 반응에 사용되는 염기로서는 트리에틸아민, 피리딘 등을 들 수 있다. 또, 이 반응에서는 용매로서 메틸렌클로라이드, 클로로포름(CHCl3), 에테르, 톨루엔, 피리딘 등을 들 수 있다.
또한, 화합물(IX)에서 1급 아미노기의 보호기의 제거를 행하는 경우는 통상의 방법에 따라서 산, 접촉환원조건 또는 염기를 사용하여 무용매 또는 적당한 용매중에서 행할 수 있다. 사용되는 산으로서는 예를 들면 삼불화붕소(BF3), 트리플루오로아세트산, 염산 등을 들 수 있으며, 접촉환원의 촉매로서는 팔라듐-탄소, 팔라듐블랙, 백금블랙 등을 들 수 있으며, 염기로서는 히드라진, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등을 들 수 잇다. 용매로서는 예를 들면, 에테르, 1,4-디옥산, 메탄올, 에탄올, 물, 아세토니트릴, 아세트산 등을 들 수 있다.
또 필요에 따라, 보호기를 제거한 화합물(X)의 1급 아미노기의 말레이미드화는 무수 말레인산과 염기의 존재하, 용매중에서 가열하여 반응시킴으로서 행할 수 있다. 사용되는 염기로서는 예를 들면, 아세트산나트륨, 탄산칼륨 등을 들 수 있으며, 또한 용매로서는 예를 들면 아세트산, 프로피온산 등을 들 수 있다.
한편, 방법 (ii)의 말단 아미노기를 갖는 티오에테르 또는 폴리에테르 구조를 갖는 기를 갖는 페놀 유도체 (XI)중, 티오에테르를 갖는 페놀 유도체의 예로서는 4-(2-아미노에틸티오)페놀, 4-(3-아미노프로필티오)페놀 등을, 또한, 폴리에테르 구조를 갖는 페놀 유도체의 예로서는 4-[3-(2-아미노에톡시)프로필옥시]페놀, 4-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]페놀 등을 들 수 있으며, 이들 아미노 보호기로서는 Boc, Cbz, 프탈이미드 등을 들 수 있다. 또한 사용되는 염기로서는 트리에틸아민, 피리딘 등을 들 수 있으며, 용매로서는 메틸렌클로라이드, 에테르, 톨루엔, 피리딘 등을 들 수 있다.
1급 아미노기의 보호의 제거 및 말레이미드화는 (i)의 방법에서 설명한 것과 동일하게 수행할 수 있다.
다음에 본 발명의 화합물(I)을 아미노산 또는 단백질중의 SH기에 반응시켜 이들 물질을 표지하는 방법에 대하여 설명한다.
예를 들면, 본 발명의 화합물(I)에 의해 항체를 표지하는 경우에는, 우선 항체를 펩신 소화하여 F(ab')2를 얻고, 이를 온화한 조건에서 환원하여 Fab'를 조제한다. 이어서 용액중에서 이 Fab'의 SH기에 본 발명 화합물 (I)의 말레이미드기를 반응시켜 표지할 수 있다.
Fab'와 본 발명 화합물(I)의 반응은 반응 용액중의 용존 효소에 의한 SH기의 산화를 1∼5mM 정도의 EDTA로 보호하면서, pH 5-7, 바람직하기로는 pH 6-6.5의 수용액중에서 온도 1-37℃, 바람직하기로는 4-10℃에서 10분 내지 72시간, 바람직하기로는 48시간 정도, Fab'와 본 발명의 화합물(I)을 몰비 1:1∼1:10에서 반응시키면 좋다.
화합물(I)에 의한 표지는 일반적으로 수계 용매중, pH 7이하에서 행할 수 있으나, 만일 피표지물질이 물에 난용 또는 불용인 경우에는 아래의 방법으로 표지를 행할 수 있다. 즉, 피표지물질을 물과 잘 혼합하는 불활성인 소량의 용매 (이하, 『불활성인 용매』라 한다)에서 용해한 액에 물을 가하고, 피표지물질의 수계 용액으로 하고, 그 액에 화합물(I)의 수계 용액을 혼화하고, pH 7이하에서 SH기와 말레이미드기의 반응을 행하면 좋다. 이 반응은 본 발명의 화합물(I)의 말레이미드기의 불포화 결합에 대하여 표지물질이 구핵부가함으로서 진행하기 때문에 피표지물질에 SH기 이외에 아미노기가 존재하는 경우에도, pH 7이하에서 반응을 행하기 때문에, 이 아미노기의 구핵성이 억제되고, 아미노기와 반응생성물은 만들어지지 않는 점에서 본 발명의 화합물은 SH기에 선택적인 시약으로서 사용할 수 있다.
여기서, 표지에 사용하는 불활성 용매로서는 N,N-디메틸아세토아미드, 디메틸술폭시드, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 1,4-디옥산 또는 피리딘 등을 들 수 있다.
이 표지 후, 겔 크로마토그래피법, 이온 교환 크로마토그래피법, 어피니티 크로마토그래피법, 고속액체 크로마토그래피법 등의 분리수법에 의해 피표지체를 분리할 수 있다. 즉, 이상의 방법에 의해 몰비 일정의 표지가 가능하다.
또한, 피표지물질이 SH기를 갖지 않는 경우는, 예를 들면 피표지물질의 수산기나 아미노기 등에 대하여, S-아세틸메르캅토숙신산 무수물 등을 사용하여 온화한 조건하에서 SH기를 도입하고, 피표지물질과 SH기와의 몰비를 견적할 수 있다. 그리하여 본 발명의 표지법에서 이용할 수 있는 피측정물질로서는 SH기를 갖든가 또는 SH기를 도입할 수 있는 물질이면 어느 것이라도 좋고, 아미노산 등의 저분자도 상기와 같이 온화한 조건에 의해 본 발명의 화합물(I)을 표지할 수 있다.
이렇게 하여 얻어진 피표지물질은 공지의 아크리디늄 에스테르의 발광조건, 예를 들면 알카리성 조건하에서 H2O2등의 첨가에 의해 화학 발광시키고, 이 발광을 화학 발광검출기로 검출함으로서 그의 존재를 알 수 있으며, 또한 그의 화학발광량으로부터 피표지물질의 양을 알 수 있으며, 미소량의 검출이 필요한 의약품의 체내동태의 추적 및 진단약 등의 각종 분야에서 정성분석이나 정량분석에 응용할 수 있다.
다음에, 본 발명의 화합물(I)을 이용한 표지법의 구체적 응용예에 대하여 설명한다.
본 발명의 표지법의 응용으로서는 예를 들면, 소위 케미루미네센트 이뮤노앗세이 샌드윗치법에서와 같이 시료중의 피측정물질과 담체에 결합시켜 놓은 피측정물질과 특이적으로 결합하는 물질과 결합반응에 의해 피측정물질을 포촉후, 이 피측정물질에 대하여 별도 특이적으로 결합하는 물질을 본 발명의 화합물(I)에서 표지한 것과 결합시키고, 이 발광 강도를 측정하는 것에 의한 피측정물질의 측정법을 들 수 있다.
또한, 소위 케미루미네센트 이뮤노앗세이 경합법에서와 같이, 피측정물질을 본 발명의 화합물(I)에서 표지하고, 이를 미리 일정 농도로 첨가하고, 시료중의 피측정물질과 표지된 피측정물질의 어느 것에도 특이적으로 결합하는 물질에 대하여 이들의 피측정물질끼리가 길항적으로 결합하는 반응을 이용하여 이 발광강도를 측정하는 것에 의한 피측정물질의 측정법을 들 수 있다.
이들의 경우, 특이적으로 결합하는 물질의 조합의 예로서는 항원과 항체, 핵산과 상보적 배열, 에펙터 분자와 리셉터 분자, 효소와 인히비터, 아비딘과 비오틴, 당사슬을 갖는 물질과 대응하는 렉틴 등을 들 수 있다.
또 다른 응용으로서는 예를 들면, 소위 포스트 칼럼 고속액체크로마토그래피법과 같이 피측정물질을 본 발명의 화합물(I)로 표지하고, 전기 크로마토그래피 등의 분리수법으로 분리하고, 화학발광검출기로 피측정물질을 측정하는 방법을 들 수 있다.
이상 설명한 표지법에서, 본 발명의 화합물(I)에 의해 종래 알려진 아크리디늄 에스테르가 갖는 결정인 표지된 피측정물질의 불용화, 생물활성에 필요한 아미노기까지 표지에 의해 실활시키는 공포나, 일정의 결합 몰비로 결합시키기 어렵고, 결합반응에 재현성을 얻을 것이 용이하지 않고, 결합반응조건하에서 발광이나 분해가 생기는 것 등의 각종문제를 극복할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 응용의 다른 예로서는, 아래의 방법을 들 수 있다. 즉, 본 발명의 화합물(I) 합성을 위하여도 이용되는 중간체(II)를 미리 SH기를 갖는 피측정물질에 반응시켜 결합(이하, 『전표지』라 한다)시킨다. 이어서, 적당한 N-알킬화제를 반응시키고, 다시 알카리성 조건하, H2O2 등 적당한 화학 발광제를 작용시키고, 이 화학발광을 화학발광검출기로 검출하고, 피측정물질을 측정하는 방법을 들 수 있다.
일반식(II)로 표시되는 아크리디늄 에스테르는 그의 말단의 말레이미드기가 SH기에 대하여 결합활성이 있음, 또한 안정한 화합물로서 분리가능하기 때문에 미리 SH기를 갖는 물질과 결합시킬 수 있다.
상기 중간체(II)에 의한 피측정물질의 전표지반응에서의 결합방법, 얻어진 전표지체의 분리방법 등은, 화합물(I)에 대한 방법과 거의 동일하게 하여 수행할 수 있다.
상기 전표지체는 다시, 알킬화제(III)와 적당한 용매중에서 반응시킴으로서 아크리디늄 에스테르 표지체로 할 수 있다. 사용되는 알킬화제(III)로서는 전술한 바와 같은, 예컨대 요드화메틸, 요드화에틸, 브롬화에틸 등의 할로겐화알킬, 트리플루오로메탄술폰산메틸, 플루오로술폰산메틸, 메탄술폰산메틸이나 p-톨루엔술폰산메틸 등을 사용할 수 있다. 또한 사용되는 용매로서는 예를 들면 상기의 전표지반응에 사용된 용매이외에 테트라히드로푸란, 아세토니트릴 등을 들 수 있다.
이 반응후, 사용한 용매중에서 결정으로 석출하는 경우는 아크리디늄 에스테르 표지체를 여과하여 분리할 수 있고, 석출하지 않는 경우는 칼럼크로마토그래피법을 사용하여 분리할 수 있다.
중간체(II)에 의한 전표지반응후, 다시 알킬화제 (III)에 의해 N-알킬되어 표지된 피측정물질의 화학발광이나, 그의 이용 등도 화합물(I)에 대하여 설명한 것과 동일하다.
또, 중간체 (II)를 사용하는 표지방법은 결합후, 알킬화제(III)로 표지하는 것으로부터 보아, SH기 이외의 알킬화제에 활성인 기가 있는 피측정물질에는 적당하지 않으며, 이 경우에는 이들 활성인 기를 적당한 보호기로 보호하는 등의 수단을 채용할 필요가 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 어떠한 제약을 받는 것은 아니다.
실시예 1
4-(2-토실옥시에틸)페놀(1)의 합성:
3.2 g의 4-히드록시펜에틸알코올을 50 ml의 피리딘에 용해하고, 빙냉하 4.0 g의 토실클로라이드를 소량씩 첨가했다. 실온으로 하고 2시간 교반후, 불용물을 여과하고, 피리딘을 감압 증류했다. 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토 (용리액: CHCl3)로 분리 정제하여 표기 화합물(1)을 3.4 g 얻었다 (수율 59%).
실시예 2
9-아크리딘카르복실산 클로라이드(2)의 합성:
9-아크리딘카르복실산 2.2 g과 티오닐클로라이드 20 ml를 가하고, 5 시간 가열 환류했다. 티오닐클로라이드를 감압 증류한 후, 다시 메틸렌클로라이드 20 ml를 가하고, 감압 증류를 2회 반복하여 표기 화합물(2)를 2.4 g 얻었다 (수율 정량적).
실시예 3
4-(2-토실옥시에틸)페닐 9-아크리딘카르복실레이트(3)의 합성:
실시예 2에서 얻은 화합물(2) 2.4 g을 30 ml의 피리딘에 용해하고, 빙냉 교반하 실시예 1에서 얻은 화합물(1)을 소량 씩 첨가하고, 실온에서 2시간 교반한 후, 피리딘을 감압 증류했다. 다시 CHCl3를 가한 후, 감압 증류를 2회 하였다. 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토 (용리액: CHCl3)로 분리 정제하여 표기 화합물(3)을 2.7 g 얻었다 (수율 54%).
실시예 4
4-[2-(4-아미노메틸피페리딘-1-일)에틸]페닐 9-아크리딘카르복실레이트(4)의 합성:
실시예 3에서 얻은 화합물(3) 2.9 g을 30 ml의 DMF에 용해하고, 0.59 g의 4-아미노메틸피리딘을 가했다. 실온에서 교반하고, 빙냉하 0.60 g의 t-BuOK를 가하고, 실온에서 5시간 교반했다. DMF를 감압 증류하고, 잔사를 CHCl3에 용해하고, 수세한 후, 무수 황산마그네슘(MgSO4)에서 건조시키고, 용매를 감압 증류했다 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토 (용리액: CHCl3:MeOH = 7:3)로 분리 정제하여 표기 화합물(4)를 0.41 g 얻었다 (수율 18%).
실시예 5
4-[2-[4-[(말레이미드-1-일)메틸]피페리딘-1-일]에틸]페닐 9-아크리딘카르복실레이트(5)의 합성:
실시예 4에서 얻은 화합물(4) 0.41 g, 무수 말레인산 0.30 g 및 아세트산나트륨 0.30 g을 아세트산 30 ml에 가하고, 3시간 가열 환류했다. 이어서, 아세트산을 감압 증류했다. 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토 (용리액: CHCl3)로 정제하여 표기 화합물(5)를 0.22 g 얻었다 (수율 43%). 이 물질의 분석치는 아래와 같다.
NMR (CDCl3) δ:
8.3(m,4H), 8.0-7.6(m,4H), 7.3(s-like,4H), 6.7(s,2H), 3.4(d,J=7.2H),
3.1-2.5(m,6H), 2.2-1.5(m,7H).
MASS (FAB): 520 (M+1).
실시예 6
4-[2-[4-(말레이미드-1-일)메틸-1-메틸피페디디늄-1-일]에틸]페닐 10-메틸아크리디늄-9-카르복실레이트(6)의 합성:
실시예 5에서 얻은 화합물(5) 0.22 g을 20 ml의 톨루엔에 용해하고, 실온에서 교반하, 0.30 g의 트리플루오로메탄술폰산메틸을 가하고, 실온에서 1 시간 교반한 후, 하룻밤 방치했다. 적색 석출물을 여과하여 모으고, 톨루엔으로 세정후, 풍건하여 표기 화합물(6)을 30 mg 얻었다 (수율 9.2%). 이 물질의 분석치는 아래와 같다.
NMR (DMSO-d6) δ:
8.8-8.0(m,8H), 7.5(s-like,4H), 6.8(s,2H), 5.1(s,3H), 3.3(s,3H),
3.7-3.0(m,10H), 2.0-1.6(m,5H).
MASS (FAB): 550 (M+1).
실시예 7
4-(2-아미노에틸티오)페놀(7)의 합성:
4-메르캅토페놀 1.2 g, 2-브로모에틸아민 염산염 2.1 g 및 탄산칼륨 1.4 g을 30 ml의 에탄올에 가하고, 3 시간 실온에서 교반했다. 물을 가하고, 에테르로 추출했다. MgSO4에서 건조시키고, 에테르를 감압 증류하여 표기 화합물(7)을 1.7 g 얻었다 (수율 정량적).
실시예 8
4-(2-N-Boc아미노에틸티오)페놀(8)의 합성:
실시예 7에서 얻은 화합물(7) 1.7 g을 30 ml의 아세토니트릴에 용해하고, 무수 Boc 2.4 g을 가하고, 1 시간 교반했다. 용매를 감압 증류한 후, 피리딘을 가하고, 감압 증류하여 표기 화합물(8)을 2.7 g 얻었다 (수율 정량적).
실시예 9
4-(2-N-Boc아미노에틸티오)페닐 9-아크리딘카르복실레이트(9)의 합성:
실시예 2에서 얻은 화합물(2) 2.4 g을 30 ml의 피리딘에 용해하고, 빙냉 교반하, 실시예 8에서 얻은 화합물(8)를 소량씩 첨가했다. 실온에서 2시간 교반한 후, 피리딘을 감압 증류했다. 다시 CHCl3를 가하고, 감압 증류를 2회 했다 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토 (용리액: CHCl3)로 분리 정제하여 표기 화합물(9)를 3.2 g 얻었다 (수율 68%).
실시예 10
4-(2-아미노에틸티오)페닐 9-아크리딘카르복실레이트(10)의 합성:
실시예 9에서 얻은 화합물(9) 1.9 g에 20 ml의 CF3CO2H를 가하고, 실온에서 30 분간 교반했다. CF3CO2H를 감압 증류하여 표기 화합물(10)를 1.4 g 얻었다 (수율 정량적).
실시예 11
4-[2-(말레이미드-1-일)에틸티오)페닐 9-아크리딘카르복실레이트(11)의 합성:
실시예 10에서 얻은 화합물(10) 1.4 g, 무수 말레인산 1.0 g 및 아세트산나트륨 1.0 g을 아세트산 20 ml에 가하고, 3시간 가열 환류했다. 이어서, 아세트산을 감압 증류하고, 물을 가하고, CHCl3로 추출했다. MgSO4에서 건조시키고, CHCl3를 감압 증류했다. 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토 (용리액: CHCl3)로 정제하여 표기 화합물(11)를 1.1 g 얻었다 (수율 63%). 이 물질의 분석치는 아래와 같다.
NMR (CDCl3) δ:
8.3(m,4H), 8.0-7.6(m,4H), 7.3(s-like,4H), 6.7(s,2H), 3.8(t,J=7.2H),
3.2(t,J=7.2H).
MASS (FAB): 455 (M+1).
실시예 12
4-[[2-(말레이미드-1-일)에틸)메틸술포늄]페닐 10-메틸아크리디늄-9-카르복실레이트(12)의 합성:
실시예 11에서 얻은 화합물(11) 0.90 g을 20 ml의 톨루엔에 용해하고, 실온에서 교반하, 1.0 g의 트리플루오로메탄술폰산메틸을 가하고, 실온에서 1 시간 교반한 후, 하룻밤 방치했다. 적색 석출물을 여과하여 모으고, 톨루엔으로 세정후, 풍건하여 표기 화합물(12)를 1.1 g 얻었다 (수율 71%). 이 물질의 분석치는 아래와 같다.
NMR (DMSO-d6) δ:
9.0-8.0(m,8H), 7.6(d,J=7.2H), 7.4(d,J=7.2H), 6.7(s,2H), 5.1(s,3H),
3.8(t,J=7.2H), 3.7(s,3H), 3.2(t,J=7.2H).
MASS (FAB): 467 (M+1).
실시예 13
2-(2-N-Boc-아미노에톡시)에탄올(13)의 합성:
2-아미노에톡시에탄올 2.1 g을 30 ml의 아세토니트릴에 용해하고, 무수 Boc 4.8 g을 가하고, 1 시간 교반했다. 용매를 감압 증류한 후, 피리딘을 가하고, 감압 증류하여 표기 화합물(13)을 3.7 g 얻었다 (수율 정량적).
실시예 14
2-(2-토실옥시에톡시)-N-Boc에틸아민 (14)의 합성:
실시예 13에서 얻은 화합물(13) 3.7 g을 50 ml의 피리딘에 용해하고, 빙냉 교반하, 4.0 g의 토실클로라이드를 소량씩 첨가했다. 실온으로 하고 2시간 교반했다. 불용물을 여과하여 제거하고, 피리딘을 감압 증류했다. 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토 (용리액: CHCl3)로 분리 정제하여 표기 화합물(14)를 5.5 g 얻었다 (수율 76%).
실시예 15
4-[2-(2-N-Boc아미노에톡시)에톡시]페닐벤질에테르 (15)의 합성:
p-벤질옥시페놀 2.0 g을 30 ml의 DMF에 녹이고, t-BuOK 1.2 g를 가하고, 실온에서 30분간 교반한 후, 실시예 14에서 얻은 화합물(14) 3.9 g을 가하고, 실온에서 3시간 교반했다. DMF를 감압 증류한 후, 에테르에 녹이고, 묽은 염산으로 1회, 물로 2회 포화 식염수로 1회 세정했다. MgSO4에서 건조시키고, 에테르를 감압 증류하고, 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토 (용리액: CHCl3)로 정제하여 표기 화합물(15)를 3.2 g 얻었다 (수율 83%).
실시예 16
4-[2-(2-N-Boc아미노에톡시)에톡시]페놀 (16)의 합성:
실시예 15에서 얻은 화합물(15) 3.0 g을 40 ml의 아세트산에 녹이고, 2.0 g의 팔라듐블랙을 가하고, 수소 분위기하, 실온에서 2시간 교반했다. 팔라듐을 여과하여 제거하고, 여액을 감압 증류했다. 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토 (용리액: CHCl3:MeOH = 9:1)로 정제하여 표기 화합물(16)를 2.4 g 얻었다 (수율 정량적).
실시예 17
4-[2-(2-N-Boc아미노에톡시)에톡시]페닐 9-아크리딘카르복실레이트 (17)의 합성:
실시예 2에서 얻은 화합물(2) 2.4 g을 30 ml의 피리딘에 용해하고, 빙냉 교반하, 실시예 16에서 얻은 화합물(16)을 소량씩 첨가하고, 실온에서 2시간 교반한 후, 피리딘을 감압 증류했다. 다시 CHCl3를 가하고, 감압 증류를 2회 한 후, 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토 (용리액: CHCl3)로 분리 정제하여 표기 화합물(17)를 2.1 g 얻었다 (수율 47%).
실시예 18
4-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]페닐 9-아크리딘카르복실레이트 (18)의 합성:
실시예 17에서 얻은 화합물(17) 2.1 g에 20 ml의 CF3CO2H를 가하고, 실온에서 30 분간 교반했다. CF3CO2H를 감압 증류하고, 물을 가하고, NaHCO3로 중화하여 석출물을 여과하여 모았다. 여과하여 얻은 물질을 실리카겔 칼럼크로마토 (용리액: CHCl3:MeOH = 9:1)로 정제하여 표기 화합물(18)을 1.7 g 얻었다 (수율 정량적).
실시예 19
4-[2-[2-(말레이미드-1-일)에톡시]에톡시]페닐 9-아크리딘카르복실레이트 (19)의 합성:
실시예 18에서 얻은 화합물(18) 1.7 g, 무수 말레인산 1.2 g 및 아세트산나트륨 1.2 g을 아세트산 40 ml에 가하고, 3시간 가열 환류했다. 냉각후, 아세트산을 감압 증류하고, 물을 가하고, CHCl3로 추출했다. MgSO4에서 건조시키고, CHCl3를 감압 증류했다. 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토 (용리액: CHCl3)로 정제하여 표기 화합물(19)를 0.81 g 얻었다 (수율 42%). 이 물질의 분석치는 아래와 같다.
NMR (CDCl3) δ:
8.3(m,8H), 7.4-7.0(m,4H), 6.8(s,2H), 4.2(m,2H), 3.9(m,2H),
3.8(s-like,4H).
MASS (FAB): 483 (M+1).
실시예 20
4-[2-[2-(말레이미드-1-일)에톡시]에톡시]페닐 10-메틸아크리디늄-9-카르복실레이트(20)의 합성:
실시예 19에서 얻은 화합물(19) 0.81 g을 50 ml의 톨루엔에 용해하고, 실온에서 교반하, 0.60 g의 트리플루오로메탄술폰산메틸을 가하고, 실온에서 1 시간 교반한 후, 하룻밤 방치했다. 황색 석출물을 여과하여 모으고, 톨루엔으로 세정후, 풍건하여 표기 화합물(20)를 0.39 g 얻었다 (수율 37%). 이 물질의 분석치는 아래와 같다.
NMR (DMSO-d6) δ:
9.0-8.0(m,8H), 7.4(d,J=7,2H), 7.1(d,J=7,2H),
6.8(s,2H), 5.1(s,3H), 4.2(m,2H), 3.9(m,2H), 3.8(s-like,4H).
MASS (FAB): 497 (M+1).
실시예 21
4-[2-(말레이미드-1-일)에틸]페닐 9-아크리딘카르복실레이트(22)의 합성:
Figure kpo00014
4-[2-(아미노에틸)페닐 9-아크리딘카르복실레이트(21) 0.71 g 및 무수 말레인산 0.60 g과 아세트산나트륨 0.60 g을 아세트산 20 ml에 가하고, 3시간 가열 환류하였다. 냉각후, 아세트산을 감압 증류하고, 물을 가하고, CHCl3로 추출했다. 추출물을 무수 황산마그네슘에서 건조시키고, CHCl3를 감압 증류했다. 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토 (용리액: CHCl3)로 정제하여 표기 화합물(22)를 0.14 g 얻었다 (수율 95%). 이 물질의 분석치는 아래와 같다.
NMR (CD3OD) δ:
8.2-7.6(m,8H), 7.4(s,4H), 6.8(s,2H), 3.8(t,J=8,2H), 3.0(t,J=8,2H).
MASS (FAB): 423 (M+1).
실시예 22
4-[2-(말레이미드-1-일)에틸]페닐 10-메틸아크리디늄-9-카르복실레이트(23)의 합성:
Figure kpo00015
상기 말레이미드(22) 0.17 g을 20 ml의 톨루엔에 용해하고, 이 용액에 실온, 교반하, 0.10 g의 트리플루오로메탄술폰산메틸을 가하고, 실온에서 1 시간 교반한 후, 하룻밤 방치했다. 방치후, 석출하는 황색 석출물을 여과하여 모으고, 톨루엔으로 세정했다. 이를 풍건하여 표기 화합물(23)를 0.12 g 얻었다 (수율 51%). 이 물질의 분석치는 아래와 같다.
NMR (CD3OD) δ:
8.9-8.0(m,8H), 7.4(s,4H), 6.8(s,2H), 5.1(s,2H),
3.8(t,J=8, 2H), 3.0(t,J=8, 2H).
MASS (FAB): 437 (M+1).
실시예 23
항사람헤모글로빈 항체의 표지:
(1) 0.1 M NaCl을 함유하는 0.1M 아세트산나트륨 완충액 (pH4.5) 3 ml중에 정제 항사람헤모글로빈 토끼폴리클로날 항체 10 mg을 가하고, 이 용액에 돼지 위액 유래 정제 펩신 분말 0.4 g을 첨가하여 용해하고, 37℃에서 48시간 인큐베이트하여 토끼IgG의 Fc부분을 소화했다. 이를 용리액으로 5mM EDTA를 함유하는 0.1 M 인산나트륨 완충액 (pH 6)[이하, pH 6 완충액이라 한다]와 "수퍼덱스 200 칼럼 (파마시아 제)를 사용하는 겔 여과로 분획하고, pH 6 완충액 3 ml중에 F(ab')25mg을 함유하는 용액을 얻었다.
이 용액에 2-메르캅토에틸아민 24 mg을 첨가하고, 37℃에서 24시간 인큐베이트하고, F(ab')2를 Fab'로 환원했다. 이어서, 세파덱스 G25 칼럼(파마시아제, 용리액: pH 6 완충액)에 의해 겔여과하여 pH 6 완충액 3 ml중에 Fab' 2mg을 함유하는 용액을 얻었다.
이 용액의 일부분을 사용하여 4,4-디티오피리딘이 Fab'의 SH기와 정량적으로 반응한 결과 얻어지는 4-메르캅토피리딘의 양을 파장 324 nm에서 흡광도를 측정함으로서 SH기의 정량을 실시했다. 이 결과, Fab' 1분자당의 SH기는 1개이었다.
(2) 이어서, Fab' 0.5 mg을 함유하는 pH 6 완충액 0.75 ml에 실시예 6에서 합성한 화합물 (6) 0.04 mg을 함유하는 pH 6 완충액 0.5 ml를 가했다. 즉, Fab'와 화합물(6)의 결합반응의 몰비가 1:5되도록 가하고, 4℃에서 48시간 인큐베이트하고, Fab'를 화합물(6)으로 표지하고, 반응후, 세파덱스 G25 칼럼 (파마시아제, 용리액: pH 6 완충액)에 의해 겔여과하고, 과잉으로 가해진 화합물 (6)을 분리하여 pH 6 완충액 3 ml중에 표지항체 0.5 mg을 얻었다(표지 항체 A). 이를 Fab'의 E280 및 화합물 (6)의 E260 몰 흡광계수로 정량한 바, 얻어진 표지항체 A는 Fab'와 화합물(6)이 1:1의 몰비로 결합하고 있다.
동일하게 하여, Fab' 0.5mg을 함유하는 pH 6 완충액 0.75 ml에 실시예 12에서 합성한 화합물 (12) 0.04 mg을 함유하는 pH 6 완충액 0.5 ml를 가하고 반응후 겔 여과하고, pH 6 완충액 3 ml중에 표지항체 0.5 mg을 얻었다(표지항체B)
또한 동일하게 하여 Fab' 0.5 mg을 함유하는 pH 6 완충액 0.75 ml에 실시예 20에서 합성한 화합물(20) 0.03 mg을 함유하는 pH 6 완충액 0.5 ml를 가하고 반응후, 겔 여과하고, pH 6 완충액 3 ml중에 표지항체 0.5 mg을 얻었다(표지항체 C).
다시 동일하게 하여 Fab' 0.5 mg을 함유하는 pH 6 완충액 0.75 ml에 실시예 22에서 합성한 화합물(22) 0.04 mg을 함유하는 pH 6 완충액 0.5 ml를 가하고 반응후, 겔 여과하고, pH 6 완충액 3 ml중에 표지항체 0.5 mg을 얻었다(표지항체 D).
얻어진 표지항체 B, 표지항체 C 및 표지항체 D의 어느 것도 각각 Fab'와 화합물 (12), Fab'와 화합물 (20) 또는 Fab'와 화합물 (23)가 1:1의 몰비로 결합하고 있다.
실시예 24
표지항체에 의한 항사람헤모글로빈의 앗세이:
0.15 M NaCl을 함유하는 pH 7의 0.05 M 인산 완충액 (이하 PBS라 한다) 0.1 ml중에 정제 항사람헤모글로빈 마우스모노클로날 항체 10 ㎍을 함유하는 액을 조제했다. 이 액을 마이크로플래이트의 각웰에 0.1 ml씩 분주하고, 4℃에서 하룻밤 방치하고 그의 모노클로날 항체를 웰내부표면에 흡착시켜 고상화했다.
이 항체 고상화 플래이트를 소혈청알부민 1 mg을 함유하는 PBS 0.1 ml로 블록킹 처리했다. 별도로 정제 사람헤모글로빈을 각각 0.2, 1, 5, 25 및 125㎍/ml되도록 PBS로 용해하여 놓고, 이들을 각각 0.1 ml를 전기 마이크로플래이트의 각 웰에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 방치하여 시료중의 사람헤모글로빈을 고상화항체에 포촉시켰다.
이어서, 각 웰을 PBS로 세정하고, 결합하지 않은 사람헤모글로빈을 분리후, 실시예 23에서 작성한 표지항체A 5㎍을 각각 함유하는 PBS 0.1 ml를 각 웰에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 방치시켰다. 각 웰을 PBS로 세정하고, 결합하지 않은 표지항체A를 0.1N-NaOH 0.05 ml 및 0.5% H2O2 0.4 ml를 가하여 발광시키고, 화학 발광측정용 마이크로플래이트 리이더의 일종인 루미나스 CT-9000D (Dia-Iatron Co., Ltd.)로 측정하였다. 발광량은 2초간의 적산치로 했다.
동일하게 하여 표지항체B, 표지항체C 및 표지항체D에 의한 사람헤모글로빈의 앗세이를 실시했다. 이상의 결과를 모아 하기 표 1에 나타낸다.
사람헤모글로빈농도(μg/㎖) 화 학 발 광 량 (카운트)
표지항체 A 표지항체 B 표지항체 C 표지항체 D
0 3852 3089 1655 2037
0.2 39410 33301 18389 19527
1 99784 88131 49136 52410
5 255691 229749 144856 149397
25 727500 707136 501892 443599
125 2511377 2281501 1736876 1354858
표 1로부터 사람헤모글로빈 농도에 따라 표지항체A, 표지항체B, 표지항체C 및 표지항체D에 유래하는 화학발광량은 모두 증대하고, 사람헤모글로빈의 정량에 유용한 것임이 명백하다.
본 발명의 화합물(I) 또는 (II)에 의한 피측정 물질의 표지는 SH기와 말레이미드기의 안정한 결합히며, 온화한 조건하에서 행하여지는 것이다. 그리하여 온화한 조건에서 표지가 행하여지는 결과, 예를 들면 표지된 항체 등의 항원인식부위는 손상되지 않고, 또한 아크리딘 에스테르가 발광하여 소모하는 것이나 분해 실활하는 것도 없다.
또한, 본 발명의 표지법에서는 아미노산이나 단백질중에서는 비교적 작은 기인 SH기를 사용하기 때문에 피측정물질에 대해 특이적인 표지를 할 수 있고, 나아가서는 피측정물질과 화학발광물질과 일정의 결합몰비로 결합이 얻어지는 등의 이점이 있다.
예를 들면, 본 발명의 표지방법을 항체의 Fab'에 적용한 경우, Fab'의 SH기는 1개이기 때문에 본 발명의 화합물(I) (또는 중간체 (II))를 Fab'에 비하여 약간 과잉으로 가하여 Fab'를 모두 표지한 경우에도 높은 몰비 1:1의 표지로 되는 것에 지나지 않으며, 또한 이 결합에 관한 SH기는 Fab'의 생물활성부위와는 무관계이기 때문에 Fab'의 항원인식부위가 손상되는 것은 없다.
따라서, 화학발광으로부터 피측정물질의 정서이나 정량이 용이하게 할 수 있으며, 미소량의 검출이 필요한 의약품의 체내동태의 추적이나 진단약 등의 분야에 응용할 수 있다.

Claims (11)

  1. 일반식(I)
    Figure kpo00016
    [식중, A는 다음 기
    -(CH2)m1-
    또는
    -(CH2)m2-Q-(CH2)n-
    [여기서, Q는 기 -S+RX--, 기
    Figure kpo00017
    (여기서, R2및 R3는 각각 기 -(CH2)2- 를 나타낸다) 또는 -O(CH2CH2O)ℓ- (ℓ은 1~3의 수를 의미한다)를 나타내고, m1은 1~6의ㅣ 수를, m2는 0~2의 수를, n은 1~2의 수를 의미한다]를 나타내고, R은 탄소수 1~6의 알칼기를 나타내고, X-는 아니온을 나타낸다}로 표시되는 아크리딘 화합물을 함유하는 SH기 표지용 시약.
  2. 일반식(II)
    Figure kpo00018
    [식중, A'는 다음 기
    -(CH2)m1-
    또는
    -(CH2)m2-Q'-(CH2)n-
    [여기서, Q'는 기 -S-, 기
    Figure kpo00019
    (여기서, R2및 R3는 각각 기 -(CH2)2- 를 나타낸다) 또는 -O(CH2CH2O)ℓ- (ℓ은 1∼3의 수를 의미한다)를 나타낸고 , m1, m2, 및 n은 전술한 바와 같다]를 나타낸다]로 표시되는 아크리딘 화합물을 함유하는 SH기 표지용 시약
  3. 일반식 (IIa)
    Figure kpo00020
    (식중, m1은 1∼6의 수를 의미한다)
    로 표시되는 아크리딘 화합물에 다음 식(III)
    R-X (III)
    (식중, R은 탄소수 1∼6의 알킬리를 나타내고, X는 용이하게 아니온으로 되는 탈리기를 나타낸다)
    로 표시되는 알킬화제를 작용시킴을 특징으로 하는 다음 식(Ia)
    Figure kpo00021
    (식중, X-는 아니온을 나타내고, R 및 m1은 전술한 바와 같다)
    로 표시되는 아크리딘 화합물의 제조방법.
  4. 다음 식(IV)
    Figure kpo00022
    (식중, m1은 1∼6의 수를 의미한다)
    로 표시되는 ω-아미노알킬렌페닐 9-아크리딘 카르복실레이트와 무수 말레인산을 염기 존재하 반응시킴을 특징으로 하는 다음 식(IIa)
    Figure kpo00023
    (식중, m1은 1∼6의 수를 의미한다)
    로 표시되는 아크리딘 화합물의 제조방법.
  5. 일반식 (Ib)
    Figure kpo00024
    (식중, Q는 기 -S+RX--, 기
    Figure kpo00025
    (여기서, R2및 R3는 각각 기 -(CH2)- 를 나타낸다) 또는 기 -O(CH2CH2O)ℓ- (ℓ은 1∼3의 수를 의미한다)를 나타내고, R은 탄소수 1~2의 알킬리를 나타내고, X-는 아니온을 나타내고, m2는 0∼2의 수를, n은 1∼2의 수를 의미한다]
    로 표시되는 아크리딘 화합물.
  6. 상기 일반식(Ib)로 표시되는 아크리딘 화합물의 중간체인 하기 일반식(IIb)
    Figure kpo00026
    (식중, Q'는 기 -S-, 기
    Figure kpo00027
    (여기서, R2및 R3는 각각 기 -(CH2)2-를 나타낸다) 또는 -O(CH2CH2O)ℓ- (ℓ은 1∼3의 수)를 나타내고, m2는 0∼2의 수를, n은 1∼2의 수를 의미한다]
    로 표시되는 아크리딘 화합물.
  7. 하기 일반식(IIb)
    Figure kpo00028
    (식중, Q'는 기 -S-, 기
    Figure kpo00029
    (여기서, R2및 R3는 각각 기 -(CH2)2-를 나타낸다) 또는 -O(CH2CH2O)ℓ- (ℓ은 1∼3의 수)를 나타내고, m2는 0∼2의 수를, n은 1∼2의 수를 의미한다]
    로 표시되는 아크리딘 화합물에 다음 식 (III)
    R-X (III)
    (식중, R은 탄소수 1∼6의 알킬기를 나타내고, X는 용이하게 아니온으로 되는 탈리기를 나타낸다)
    로 표시되는 알킬화제를 작용시킴을 특징으로 하는 다음 식(Ib)
    Figure kpo00030
    [식중, Q는 기 -S+RX--, 기
    Figure kpo00031
    (여기서, R2및 R3는 각각 기 -(CH2)2-를 나타낸다) 또는 기 -O(CH2CH2O)ℓ- (ℓ은 1∼3의 수)를 나타내고, R, X, m2및 n은 전술한 바와 같다]로 표시되는 아크리딘 화합물의 제조방법.
  8. 하기 일반식(VI)
    Figure kpo00032
    (식중, Y1은 탈리기를 나타내고, m2는 0∼2의 수를 나타낸다)
    로 표시되는 탈리기를 갖는 페놀 화합물과 다음 식(VII)
    Figure kpo00033
    (식중, Y2는 탈리기를 나타낸다]
    로 표시되는 9-아크리딘 카르복실산 유도체를 반응시켜서 다음 식(VIII)
    Figure kpo00034
    (식중, Y1및 m2는 전술한 바와 같다)
    로 표시되는 화합물을 얻고, 이어서 이 화합물에 다음 식 (IX)
    H-Q1-(CH2)n-N(Ra)2(IX)
    [식중, Q1은 기
    Figure kpo00035
    (여기서, R2및 R3는 각각 기 -(CH2)2-를 나타내고, Ra는 각각 수소원자 또는 아미노보호기를 나타내고, n은 1∼2의 수를 나타낸다]
    로 표시되는 말단에 필요에 따라 보호기로 보호된 1급 아미노기를 갖고, 다른 쪽에 1급 또는 2급 아미노기를 갖는 폴리아민을 적당한 염기하에서 반응시켜 하기 식 (X)
    Figure kpo00036
    (식중, Q1, Ra, m2및 n은 전술한 바와 같다)
    로 표시되는 9-아크리딘 에스테르를 제조하고, 말단의 1급 아미노기의 보호기가 존재하는 경우는 그의 보호기를 떼어낸 후, 무수 말레인산을 작용시키는 것을 특징으로 하는 식(IIb')
    Figure kpo00037
    (식중, Q1, m2및 n은 전술한 바와 같다)
    로 표시되는 9-아크리딘 화합물의 제조방법.
  9. 하기 식(XI)
    Figure kpo00038
    [식중, Q2는 기 -S- 또는 기 -O(CH2CH2O)ℓ-(ℓ은 1~3의 수를 의미한다)를 나타내고, Ra는 각각 수소원자 또는 아미노보호기를 나타내고, m2는 0-2의 수, n은 1-2의 수를 나타낸다]
    로 표시되는 말단에 보호기로 보호된 1급 아미노기가 붙은 티오에테르 또는 폴리에테르 구조를 갖는 기를 갖는 페놀 유도체와 다음 식(VII)
    Figure kpo00039
    (식중, Y2는 탈리기를 나타낸다]
    로 표시되는 9-아크리딘 카르복실산 유도체를 반응시키고, 다음 식(XII)
    Figure kpo00040
    (식중, Q2, Ra, m2및 n은 전술한 바와 같다)
    로 표시되는 아크리딘 에스테르로 하고, 이어서 말단에 있는 아미노기의 탈보호를 행한 후, 무수 말레인산을 작용시킴을 특징으로 하는 다음 식(IIb″)
    Figure kpo00041
    (식중, Q2, m2및 n은 전술한 바와 같다)
    로 표시되는 아크리딘 화합물의 제조방법.
  10. 일반식(I)
    Figure kpo00042
    [식중, A는 다음 기
    -(CH2)m1-
    또는
    -(CH2)m2-Q-(CH2)n-
    [여기서, Q는 기 -S+RX--, 또는 기
    Figure kpo00043
    (여기서, R2및 R3는 각각 기 -(CH2)2-를 나타낸다) 또는 -O(CH2CH2O)ℓ- (ℓ은 1∼3의 수를 의미한다)를 나타내고, R은 탄소수 1~6의 알킬리를 나타내고, X-는 아니온을 나타낸다]를 나타내고, m1은 1∼6의 수를 나타내고, m2는 0∼2의 수를 나타내며, n은 1∼2의 수를 의미한다]로 표시되는 아크리딘 화합물을 피측정물질중의 SH기와 반응시킴을 특징으로 하는 피측정물질의 표지법.
  11. 일반식(II)
    Figure kpo00044
    [식중, A'는 다음 기
    -(CH2)m1-
    또는
    -(CH2)m2-Q'-(CH2)n-
    [여기서, Q'는 기 -S-, 기
    Figure kpo00045
    (여기서, R2및 R3는 각각 기 -(CH2)2-를 나타낸다) 또는 -O(CH2CH2O)ℓ- (ℓ은 1∼3의 수를 의미한다)를 나타내고, m1, m2, 및 n은 전술한 바와 같다]를 나타낸다]로 표시되는 아크리딘 화합물을 피측정물질중의 SH기와 반응시킴을 특징으로 하는 피측정물질의 전표지법.
KR1019970708057A 1996-03-15 1997-03-14 에스에이치기 표지용시약, 그의 제조방법 및 이를 이용한 표지법 KR100259761B1 (ko)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP1996/85966 1996-03-15
JP85966/1996 1996-03-15
JP1996/85965 1996-03-15
JP08596596A JP3174729B2 (ja) 1996-03-15 1996-03-15 アクリジン誘導体、その製法およびこれを用いた標識法
JP85965/1996 1996-03-15
JP08596696A JP3220000B2 (ja) 1996-03-15 1996-03-15 Ｓｈ基標識用試薬、その製法及びそれを用いた標識法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR19990014715A KR19990014715A (ko) 1999-02-25
KR100259761B1 true KR100259761B1 (ko) 2000-07-01

Family

ID=26426974

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019970708057A KR100259761B1 (ko) 1996-03-15 1997-03-14 에스에이치기 표지용시약, 그의 제조방법 및 이를 이용한 표지법

Country Status (5)

Country Link
US (1) US6171520B1 (ko)
EP (1) EP0844246A4 (ko)
KR (1) KR100259761B1 (ko)
CA (1) CA2221306A1 (ko)
WO (1) WO1997033884A1 (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998054578A1 (en) * 1997-05-29 1998-12-03 Bio-Rad Laboratories, Inc. Chemiluminescent hemoglobin assay
GB9923146D0 (en) * 1999-09-30 1999-12-01 Imperial College Detector array
AU2002310743A1 (en) 2001-06-01 2002-12-16 Roche Diagnostics Gmbh Novel compounds for chemiluminescense procedures
WO2004036176A2 (en) 2002-10-16 2004-04-29 Duke University Biosensor
JP5292570B2 (ja) * 2005-09-13 2013-09-18 国立大学法人 東京大学 新規マレイミド誘導体
CN101918367B (zh) * 2007-11-20 2016-08-24 西门子医疗保健诊断公司 吖啶化合物在离子液体中的简便n-烷基化方法
US8241915B2 (en) * 2009-01-14 2012-08-14 Abbott Laboratories Methods and kits for detecting hemoglobin in test samples
EP2403340A4 (en) * 2009-03-05 2012-10-31 Mithridion Inc COMPOUNDS AND COMPOSITIONS FOR IMPROVED PERCEPTION, MANUFACTURING METHOD AND TREATMENT PROCESS
WO2012033956A1 (en) 2010-09-08 2012-03-15 Mithridion, Inc. Cognition enhancing compounds and compositions, methods of making, and methods of treating
KR20170074178A (ko) * 2015-12-21 2017-06-29 제이엔씨 주식회사 중합성 액정 화합물, 조성물, 그 액정 중합막류 및 이들의 용도

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0082636B2 (en) 1981-12-11 2006-10-18 The Welsh National School of Medicine Luminescent labelling materials and procedures
JPS6261969A (ja) * 1985-09-06 1987-03-18 アモコ・コーポレーション アクリジニウムエステルの合成法
DE3645292C2 (de) 1986-08-22 1997-12-11 Hoechst Ag Chemilumineszenzimmunoassays und ein Verfahren zu ihrer Herstellung
US4745181A (en) 1986-10-06 1988-05-17 Ciba Corning Diagnostics Corp. Polysubstituted aryl acridinium esters
GB2233450B (en) * 1989-06-24 1993-06-30 Univ Wales Medicine Detecting or quantifing multiple analytes with luminescent reagents
JP3057887B2 (ja) 1992-03-03 2000-07-04 和光純薬工業株式会社 新規なマレイミド誘導体、及びこれを用いたチオール基を有する化合物の蛍光標識化方法
JPH05255263A (ja) 1992-03-10 1993-10-05 Kyowa Medex Co Ltd アクリジウム化合物を用いた物質の測定法
JPH06158039A (ja) 1992-11-20 1994-06-07 Sanyo Chem Ind Ltd 化学発光性標識剤
US5688642A (en) * 1994-12-01 1997-11-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Selective attachment of nucleic acid molecules to patterned self-assembled surfaces

Also Published As

Publication number Publication date
EP0844246A1 (en) 1998-05-27
WO1997033884A1 (fr) 1997-09-18
EP0844246A4 (en) 1999-06-02
US6171520B1 (en) 2001-01-09
CA2221306A1 (en) 1997-09-18
KR19990014715A (ko) 1999-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0273115B1 (en) Chemiluminescent acridinium and phenanthridinium salts
JP2866419B2 (ja) 希土類クリプテート及びその製造方法とその合成中間体とその蛍光トレーサーとしての利用方法
US7297555B2 (en) Hydrophilic chemiluminescent acridinium labeling reagents
EP0108399B1 (en) Substituted carboxyfluoresceins
US5284951A (en) Hydrolytically stable chemiluminescent labels and their conjugates, and assays therefrom
US5395938A (en) Biotinylated chemiluminescent labels and their conjugates, assays and assay kits
JPH0718874B2 (ja) ▲蛍▼光複合体及び生物学的診断アッセイ
KR100259761B1 (ko) 에스에이치기 표지용시약, 그의 제조방법 및 이를 이용한 표지법
JP2750003B2 (ja) 光活性化可能ビオチン誘導体およびイムノアッセイでの干渉を軽減させるためのその使用
US4261974A (en) Valproic acid immunogen conjugates and antibodies thereto
US7090993B2 (en) Method of assaying pyrrole-containing biological compounds
US4292425A (en) βGalactosyl-umbelliferone valproic acid conjugates
EP1539702B1 (en) Hydrophilic chemiluminescent acridinium labeling reagents
JP3174729B2 (ja) アクリジン誘導体、その製法およびこれを用いた標識法
JP3220000B2 (ja) Ｓｈ基標識用試薬、その製法及びそれを用いた標識法
WO1999066780A2 (en) Cinoxacin lanthanide chelates and their use as biomolecular probes
CA1157017A (en) Reagents for use in binding assays to determine valproic acid

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee