JPH06158039A - 化学発光性標識剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 免疫測定あるいはハイブリダイゼーションア
ッセイにおいて臨床検査の現場で要求されている感度を
十分に満足させるアクリジニウム系化学発光性標識剤を
得る。 【構成】 ２−（７−スクシンイミジルオキシカルボニ
ルヘプタンアミド）ナフタレン−４，８−｛Ｎ，Ｎ’−
ジ（１０−メチルアクリジニウムフルオロスルフォネー
ト−９−カルボニル）−Ｎ，Ｎ’−ジ（４−メトキシフ
ェニル）｝スルファミド；４，４−ビス｛４−（１０−
メチルアクリジニウムフルオロスルフォネート−９−フ
ェニルカルボキシレート）吉草酸（４−マレイミド）ア
ニリド；｛ジ（１０−メチルアクリジニウムフルオロス
ルフォネート−９−メチルカルボキシレート）｝メチル
−｛７−（４−ジメチルスルフォニウムメチルスルフェ
ート）オキシカルボニルヘプタンアミド｝などに代表さ
れるアクリジニウム系化学発光性標識剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫測定法またはハイ
ブリダイゼーションアッセイに用いられる化学発光性標
識剤に関するものである。さらに詳しくは、化学発光収
率が高く、高感度な免疫測定・ハイブリダイゼーション
アッセイを可能にする化学発光性標識剤に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】化学発光性標識剤としてのアクリジニウ
ム系化合物は、「イアン・ウィークス他、クリニカル・
ケミストリー、第２９巻、１４７４頁、１９８３年発
行」に記載の４−（２−スクシンイミジルオキシカルボ
ニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジニウム−
９−カルボン酸エステル・フルオロスルホン酸塩が広く
知られており、免疫測定やハイブリダイゼーションアッ
セイなどにおいて、リガンドの標識剤として用いられて
いる。

【０００３】

【本発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記
のような標識剤の場合、標識剤１分子をリガンドに標識
することにより導入されるアクリジン残基は１残基であ
るため、免疫測定あるいはハイブリダイゼーションアッ
セイにおいて臨床検査の現場で要求されている感度を十
分に満足させるものであるとは言い難いものであった。

【０００４】

【課題を解決させるための手段】本発明者らは、上記問
題点を解決すべく鋭意検討を行った結果、１分子中に化
学発光性のアクリジン残基を２〜５個有する標識剤を用
いることにより十分な感度が得られることを見いだし、
本発明に到達した。すなわち、本発明は、１分子中に下
記化２１で表される基（１）および／または下記化２２
で表される基（２）を２〜５個と、下記化２３〜化３１
で表される基（３）を１個有することを特徴とする化学
発光性標識剤に関するものである。

【０００５】

【化２１】

【０００６】

【化２２】

【０００７】［式中、Ｒ₁は水素原子、１〜１０個の炭
素原子を有するアルキル基、アルケニル基、アルキニル
基またはアリール基を表し；Ｒ₂、Ｒ₃は水素原子、１〜
５個の炭素原子を有するアルキル基、アルコキシ基、ア
ミノ基、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、アルデ
ヒド基またはハロゲン原子を表し；Ｒ₄は１〜１０個の
炭素原子を有するアルキレン基、アルケニレン基または
アリーレン基（これらの基における１個以上の水素原子
は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペン
チル基、フェニル基、ベンジル基、メトキシ基、エトキ
シ基、フェノキシ基、ベンジルオキシ基、カルボキシル
基、カルボメトキシ基、カルボエトキシ基、カルボフェ
ノキシ基、カルボベンゾキシ基、カルボキサミド基、ア
ミノ基、水酸基、ニトロ基、シアノ基、アルデヒド基、
モルホリノ基、メルカプト基、フッ素原子、塩素原子、
臭素原子、ヨウ素原子のいずれかで置換されていてもよ
い。）を表し；Ｘ^-はアニオンを表し；Ｙは水素原子、
１〜１０個の炭素原子を有するアルキル基、アリール
基、アルコキシ基、アリールオキシ基、カルボキシル
基、カルボアルコキシ基、カルボアリール基、カルボキ
サミド基、アミノ基、水酸基、ニトロ基、シアノ基、ア
ルデヒド基、モルホリノ基、メルカプト基またはハロゲ
ン原子を表す。］

【０００８】

【化２３】

【０００９】［式中、Ｒ₅、Ｒ₆は１〜１０個の炭素原子
を有するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基また
はアリール基（これらの基における１個以上の水素原子
は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペン
チル基、フェニル基、ベンジル基、メトキシ基、エトキ
シ基、フェノキシ基、ベンジルオキシ基、カルボキシル
基、カルボメトキシ基、カルボエトキシ基、カルボフェ
ノキシ基、カルボベンゾキシ基、カルボキサミド基、ア
ミノ基、水酸基、ニトロ基、シアノ基、アルデヒド基、
モルホリノ基、メルカプト基、フッ素原子、塩素原子、
臭素原子、ヨウ素原子のいずれかで置換されていてもよ
い。）を表し；Ｚ^-はアニオンを表す。］

【００１０】

【化２４】

【００１１】［式中、Ｒ₇は水素原子、スルホン酸基、
スルホン酸ナトリウム基またはスルホン酸カリウム基を
表す。］

【００１２】

【化２５】

【００１３】

【化２６】

【００１４】

【化２７】

【００１５】

【化２８】

【００１６】

【化２９】

【００１７】

【化３０】

【００１８】

【化３１】

【００１９】本発明において、（１）、（２）で表され
る基におけるＲ₁としては、水素原子、１〜１０個の炭
素原子を有するアルキル基（メチル基、エチル基、プロ
ピル基、ブチル基など）、アルケニル基（ビニル基、ア
リル基など）、アルキニル基（エチニル基など）または
アリール基（フェニル基、ベンジル基など）が挙げられ
る。これらのうち好ましいものとしてはメチル基、エチ
ル基、プロピル基、フェニル基、ベンジル基などであ
る。

【００２０】本発明において、（１）、（２）で表され
る基におけるＲ₂、Ｒ₃としては、水素原子、１〜５個の
炭素原子を有するアルキル基（メチル基、エチル基、プ
ロピル基、ブチル基など）、アルコキシ基（メトキシ
基、エトキシ基など）、アミノ基、カルボキシル基、シ
アノ基、ニトロ基、アルデヒド基またはハロゲン原子
（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）が挙
げられる。これらのうち好ましいものとしては、水素原
子、メチル基、エチル基、プロピル基、メトキシ基、エ
トキシ基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ基、ニト
ロ基、アルデヒド基、フッ素原子、塩素原子、臭素原
子、ヨウ素原子などである。

【００２１】本発明において、（１）で表される基にお
けるＲ₄としては、１〜１０個の炭素原子を有するアル
キレン基（メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブ
チレン基など）、アルケニレン基（ビニレン基、プロペ
ニレン基など）またはアリーレン基（フェニレン基な
ど）［これらの基における１個以上の水素原子は、メチ
ル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、
フェニル基、ベンジル基、メトキシ基、エトキシ基、フ
ェノキシ基、ベンジルオキシ基、カルボキシル基、カル
ボメトキシ基、カルボエトキシ基、カルボフェノキシ
基、カルボベンゾキシ基、カルボキサミド基、アミノ
基、水酸基、ニトロ基、シアノ基、アルデヒド基、モル
ホリノ基、メルカプト基、フッ素原子、塩素原子、臭素
原子、ヨウ素原子のいずれかで置換されていてもよ
い。］が挙げられる。これらのうち好ましいものとして
は、メチレン基、エチレン基、プロペニレン基、フェニ
レン基などが挙げられる。

【００２２】本発明において、（１）、（２）で表され
る基におけるＸ^-としては、化学発光性を損なわないよ
うなアニオンであればいかなるものを用いることも可能
であるが、特に好ましいものとしては、スルホン酸イオ
ン、メタンスルホン酸イオン、クロロスルホン酸イオ
ン、フルオロスルホン酸イオン、フルオロメタンスルホ
ン酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン、硝
酸イオン、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨ
ウ素イオンなどである。

【００２３】本発明において、（１）で表される基にお
けるＹとしては、水素原子、１〜１０個の炭素原子を有
するアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基な
ど）、アリール基（フェニル基、ベンジル基など）、ア
ルコキシ基（メトキシ基、エトキシ基など）、アリール
オキシ基（フェノキシ基、ベンジルオキシ基など）、カ
ルボキシル基、カルボアルコキシ基（カルボメトキシ
基、カルボエトキシ基など）、カルボアリール基（カル
ボフェニル基、カルボベンジル基など）、カルボキサミ
ド基、アミノ基、水酸基、ニトロ基、シアノ基、アルデ
ヒド基、モルホリノ基、メルカプト基またはハロゲン原
子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）が
挙げられる。これらのうち特に好ましいものとしてはメ
チル基、エチル基、フェニル基、ベンジル基、メトキシ
基、エトキシ基、フェノキシ基、ベンジルオキシ基、メ
ルカプト基、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、ニト
ロ基、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨ
ウ素原子などである。

【００２４】本発明において、（３）で表される基のう
ち、化２３におけるＲ₅、Ｒ₆としては１〜１０個の炭素
原子を有するアルキル基（メチル基、エチル基、プロピ
ル基、ブチル基など）、アルケニル基（ビニル基、アリ
ル基など）、アルキニル基（エチニル基など）またはア
リール基（フェニル基、ベンジル基など）［これらの基
における１個以上の水素原子は、メチル基、エチル基、
プロピル基、ブチル基、ペンチル基、フェニル基、ベン
ジル基、メトキシ基、エトキシ基、フェノキシ基、ベン
ジルオキシ基、カルボキシル基、カルボメトキシ基、カ
ルボエトキシ基、カルボフェノキシ基、カルボベンゾキ
シ基、カルボキサミド基、アミノ基、水酸基、ニトロ
基、シアノ基、アルデヒド基、モルホリノ基、メルカプ
ト基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子の
いずれかで置換されていてもよい。］が挙げられる。こ
れらのうち特に好ましいものとしてはメチル基、エチル
基、プロピル基、フェニル基、ベンジル基である。Ｚ^-
はアニオンであればいかなるものであってもよいが、メ
タンスルホン酸イオン、フルオロメタンスルホン酸イオ
ン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン、硝酸イオ
ン、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イ
オンなどが好ましいアニオンとして挙げられる。一方、
化２１におけるＲ₇としては水素原子、スルホン酸基、
スルホン酸ナトリウム基、スルホン酸カリウム基が好ま
しいものである。

【００２５】本発明において、（１）と（３）を連結す
る物質としては１分子中にスルホン酸基を２〜５個とア
ミノ基またはカルボキシル基を１個含む化合物であれば
いかなるものを用いることも可能であるが、好ましいも
のとしては１−アミノ−３，５−ベンゼンジスルホン酸
に代表されるアミノベンゼンジスルホン酸類（アミノ
基、スルホン酸基はいかなる位置をとることも可能であ
る。）、１−アミノ−３，４，５−トリスルホン酸に代
表されるアミノベンゼントリスルホン酸類（アミノ基、
スルホン酸基はいかなる位置をとることも可能であ
る。）、３−アミノ−１，５−ナフタレンジスルホン酸
に代表されるアミノナフタレンジスルホン酸類（アミノ
基、スルホン酸基はいかなる位置をとることも可能であ
る。）、１−ナフチルアミン−３，５，８−トリスルホ
ン酸に代表されるナフチルアミントリスルホン酸類（ア
ミノ基、スルホン酸基はいかなる位置をとることも可能
である。）などの化合物、およびC. I. Direct Red 2
0、D89、C. I. Direct Blue 71、C. I. Direct Blue 12
0、C. I. Direct Blue 163、C. I. Direct Green 1、C.
I. Direct Black 56、C. I. Direct Black 74、C. I.
Acid Yellow 23、C. I. Acid Blue 23、C. I. Acid Blu
e 29、C. I. Acid Blue 138、C. I. AcidGreen 19、C.
I. Acid Black、C. I. Mordant Green 15などに代表さ
れる染料類が挙げられる（これらの化合物を「化合物群
−１」とする。）。これらのうち特に好ましいものはス
ルホン酸基を２個とアミノ基を１個含む１−アミノ−
３，５−ベンゼンジスルホン酸に代表されるアミノベン
ゼンジスルホン酸類および３−アミノ−１，５−ナフタ
レンジスルホン酸に代表されるアミノナフタレンジスル
ホン酸類である。

【００２６】本発明において、（２）と（３）を連結す
る物質としては１分子中に水酸基を２〜５個とアミノ基
またはカルボキシル基を１個含む化合物であればいかな
るものを用いることも可能であるが、２〜５個の水酸基
と１個のアミノ基を含む化合物の中で好ましいものとし
ては、２−アミノ−４，６−ジヒドロキシピリミジン、
４−アミノ−２，６−ジヒドロキシピリミジン、２−ア
ミノ−６，８−ジヒドロキシプリン、２−アミノ−１，
３−プロパンジオール、ジエタノールアミン、３−アミ
ノ−１，５−ペンタンジオールなどに代表されるアミノ
アルキルジオール類、アデノシン、グアノシン、シチジ
ン、２，３−ジヒドロキシアニリンに代表されるジヒド
ロキシアニリン類（アミノ基、水酸基はいかなる位置を
とることも可能である。）、２−アミノ−４，７−プテ
リンジオール、２−アミノ−４，６−プテリンジオー
ル、５−ヒドロキシドーパミン、６−ヒドロキシドーパ
ミン、Ｄ−グルコサミンに代表されるアミノ糖類などが
挙げられる（これらの化合物を「化合物群−２」とす
る。）。これらのうち特に好ましいものは、水酸基を２
個とアミノ基を１個含む２−アミノ−４，６−ジヒドロ
キシピリミジン、４−アミノ−２，６−ジヒドロキシピ
リミジン、２−アミノ−６，８−ジヒドロキシプリン、
２−アミノ−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−
２−メチル（エチル、プロピル）−１，３−プロパンジ
オール、ジエタノールアミンに代表されるアミノアルキ
ルジオール類、アデノシン、グアノシン、シチジン、
２，３−ジヒドロキシアニリンに代表されるジヒドロキ
シアニリン類、２−アミノ−４，７−プテリンジオー
ル、２−アミノ−４，６−プテリンジオール、５−ヒド
ロキシドーパミン、６−ヒドロキシドーパミンなどであ
る。

【００２７】また、２〜５個の水酸基と１個のカルボキ
シル基を含む化合物の中で好ましいものとしては、２，
３−ジヒドロキシ安息香酸に代表されるジヒドロキシ安
息香酸類（カルボキシル基、水酸基はいかなる位置をと
ることも可能である。）、２，３−ジヒドロキシプロピ
オン酸に代表されるジヒドロキシプロピオン酸類（カル
ボキシル基、水酸基はいかなる位置をとることも可能で
ある。）、２，３−ジヒドロキシフェニル酢酸に代表さ
れるジヒドロキシフェニル酢酸類（カルボキシル基、水
酸基はいかなる位置をとることも可能である。）、３，
５−ジヒドロキシ−１−ナフテン酸に代表されるジヒド
ロキシナフテン酸類（カルボキシル基、水酸基はいかな
る位置をとることも可能である。）、２，３−ジヒドロ
キシピリミジンカルボン酸に代表されるジヒドロキシピ
リミジンカルボン酸類（カルボキシル基、水酸基はいか
なる位置をとることも可能である。）、２，３，４−ト
リヒドロキシ安息香酸に代表されるトリヒドロキシ安息
香酸類（カルボキシル基、水酸基はいかなる位置をとる
ことも可能である。）、３，５，８−トリヒドロキシ−
１−ナフテン酸に代表されるトリヒドロキシナフテン酸
類（カルボキシル基、水酸基はいかなる位置をとること
も可能である。）、フェノールフタレイン、４、４−ビ
ス（４−ヒドロキシフェニル）吉草酸、４，８−ジヒド
ロキシキノリン−２−カルボン酸、グルクロン酸などが
挙げられる（これらの化合物を「化合物群−３」とす
る。）。これらのうち特に好ましいものは水酸基を２個
とカルボキシル基を１個含む２，３−ジヒドロキシ安息
香酸に代表されるジヒドロキシ安息香酸類、２，３−ジ
ヒドロキシプロピオン酸に代表されるジヒドロキシプロ
ピオン酸類、２，３−ジヒドロキシフェニル酢酸に代表
されるジヒドロキシフェニル酢酸類、３，５−ジヒドロ
キシ−１−ナフテン酸に代表されるジヒドロキシナフテ
ン酸類、２，３−ジヒドロキシピリミジンカルボン酸に
代表されるジヒドロキシピリミジンカルボン酸類、フェ
ノールフタレイン、４、４−ビス（４−ヒドロキシフェ
ニル）吉草酸、４，８−ジヒドロキシキノリン−２−カ
ルボン酸、グルクロン酸などである。

【００２８】本発明における化学発光性標識剤は「化合
物群−１」から選択された化合物のスルホン酸基に
（１）で表される基がスルファミドの型で結合し、アミ
ノ基またはカルボキシル基に（３）で表される基が結合
したものであるか；「化合物群−２」から選択された化
合物の水酸基に（１）で表される基がエステルの型で結
合し、アミノ基に（３）で表される基が結合したもので
あるか；「化合物群−３」から選択された化合物の水酸
基に（１）で表される基がエステルの型で結合し、カル
ボキシル基に（３）で表される基が結合したものであ
る。

【００２９】ここで（３）で表される基は「化合物群−
１〜化合物群−３」から選択された化合物のアミノ基ま
たはカルボキシル基に直接結合していてもよいし、適当
な鎖長を持ったアミノカルボン酸類（グリシン、β−ア
ラニン、アミノプロピオン酸、アミノ安息香酸など）、
ジカルボン酸類（シュウ酸、コハク酸、マレイン酸、ス
ベリン酸など）、ジアミン類（エチレンジアミン、プロ
ピレンジアミンなど）などを介して結合していてもよ
い。

【００３０】本発明における化学発光性標識物の一例と
しては、下記化３２、化３３、化３４に示すような３−
（７−スクシンイミジルオキシカルボニルヘプタンアミ
ド）ナフタレン−１，５−｛Ｎ，Ｎ’−ジ（１０−メチ
ルアクリジニウムフルオロスルフォネート−９−カルボ
ニル）−Ｎ，Ｎ’−ジ（４−メトキシフェニル）｝スル
ファミド（Ｉ）；４，４−ビス｛４−（１０−メチルア
クリジニウムフルオロスルフォネート−９−フェニルカ
ルボキシレート）吉草酸（４−マレイミド）アニリド
（ＩＩ）；ジ（１０−メチルアクリジニウムフルオロス
ルフォネート−９−メチルカルボキシレート）メチル−
｛７−（４−ジメチルスルフォニウムメチルスルフェー
ト）オキシカルボニルヘプタンアミド｝（ＩＩＩ）など
の化合物が挙げられる。

【００３１】

【化３２】

【００３２】

【化３３】

【００３３】

【化３４】

【００３４】上記化合物（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）
の製法を例示すると、それぞれ下記化３５、化３６、化
３７に例示したような工程となる。

【００３５】

【化３５】

【００３６】

【化３６】

【００３７】

【化３７】

【００３８】標識剤（Ｉ）の製法について説明すると、
まず３−アミノナフタレン−１，５−ジスルホン酸にＦ
ｍｏｃ−ＤＳＰ（４−（９−フルオレニルメトキシカル
ボニルオキシ）フェニルジメチルスルフォニウムメチル
スルフェート）を反応させて３−（９−フルオレニルメ
トキシカルボニルアミノ）ナフタレン−１，５−ジスル
ホン酸（ａ）を得、アミノ基を保護した。

【００３９】これに塩化チオニル存在下、ｐ−メトキシ
アニリンを反応させ３−（９−フルオレニルメトキシカ
ルボニルアミノ）ナフタレン−１，５−ジ（４−メトキ
シフェニル）スルファミド（ｂ）を得た。

【００４０】これにアクリジン−９−カルボン酸に塩化
チオニルを反応させて得られたアクリジン−９−カルボ
ニルクロライド（ｃ）を反応させ、３−（９−フルオレ
ニルメトキシカルボニルアミノ）ナフタレン−１，５−
｛Ｎ，Ｎ’−ジ（アクリジン−９−カルボニル）−Ｎ，
Ｎ’−ジ（４−メトキシフェニル）｝スルファミド
（ｄ）を得た。

【００４１】これを炭酸水素ナトリウムなどの希アルカ
リで処理することによりアミノ基の保護基をはずし、３
−アミノナフタレン−１，５−｛Ｎ，Ｎ’−ジ（アクリ
ジン−９−カルボニル）−Ｎ，Ｎ’−ジ（４−メトキシ
フェニル）｝スルファミド（ｅ）を得た。

【００４２】これをスベリン酸ジスクシンイミジルと反
応させることにより３−（７−スクシンイミジルオキシ
カルボニルヘプタンアミド）ナフタレン−１，５−
｛Ｎ，Ｎ’−ジ（アクリジン−９−カルボニル）−Ｎ，
Ｎ’−ジ（４−メトキシフェニル）｝スルファミド
（ｆ）を得た。

【００４３】これをフルオロスルホン酸メチルエステル
と反応させることにより目的物である３−（７−スクシ
ンイミジルオキシカルボニルヘプタンアミド）ナフタレ
ン−１，５−｛Ｎ，Ｎ’−ジ（１０−メチルアクリジニ
ウムフルオロスルフォネート−９−カルボニル）−Ｎ，
Ｎ’−ジ（４−メトキシフェニル）｝スルファミド
（Ｉ）を得た。

【００４４】標識剤（ＩＩ）の製法について説明する
と、４，４−ビス（４−ヒドロキシフェニル）吉草酸と
Ｎ−（４−アミノフェニル）マレイミドをジシクロヘキ
シルカルボジイミドや１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミドなどの脱水縮合剤の存
在下において反応させることにより４，４−ビス（４−
ヒドロキシフェニル）吉草酸（４−マレイミド）アニリ
ド（ｇ）を得た。

【００４５】これに標識剤（Ｉ）の合成における中間体
である（ｃ）を反応させることにより４，４−ビス｛４
−（アクリジン−９−フェニルカルボキシレート）吉草
酸（４−マレイミド）アニリド（ｈ）を得た。

【００４６】これをフルオロスルホン酸メチルエステル
と反応させることにより４，４−ビス｛４−（１０−メ
チルアクリジニウムフルオロスルフォネート−９−フェ
ニルカルボキシレート）吉草酸（４−マレイミド）アニ
リド（ＩＩ）を得た。

【００４７】標識剤（ＩＩＩ）の製法について説明する
と、２−アミノ−１，３−プロパンジオールとＢｏｃ−
ＤＳＰ（４−（ｔ−ブトキシカルボニルオキシ）フェニ
ルジメチルスルフォニウムメチルスルフェート）を反応
させ２−（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ−１，３−
プロパンジオール（ｉ）を得、アミノ基を保護した。

【００４８】これに（３）を反応させてジ（アクリジン
−９−メチルカルボキシレート）メチル−（ｔ−ブトキ
シカルボニル）アミン（ｊ）を得た。

【００４９】これを４規定塩酸／ジオキサンなどの鉱酸
で処理することによりアミノ基の保護基をはずしジ（ア
クリジン−９−メチルカルボキシレート）メチルアミン
（ｋ）を得た。

【００５０】これをスベリン酸とサンセラーＤＳＰ（４
−ヒドロキシフェニルジメチルスルフォニウムメチルス
ルフェート）をジシクロヘキシルカルボジイミドや１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミドなどの脱水縮合剤の存在下に反応させて得られた
スベリン酸−ジ（フェニルジメチルスルフォニウムメチ
ルスルフェート）（ｌ）と反応させることによりジ（ア
クリジン−９−メチルカルボキシレート）メチル−｛７
−（４−ジメチルスルフォニウムメチルスルフェート）
オキシカルボニルヘプタンアミド｝（ｍ）を得た。

【００５１】これをフルオロスルホン酸メチルエステル
と反応させることによりジ（１０−メチルアクリジニウ
ムフルオロスルフォネート−９−メチルカルボキシレー
ト）メチル−｛７−（４−ジメチルスルフォニウムメチ
ルスルフェート）オキシカルボニルヘプタンアミド｝
（ＩＩＩ）を得た。

【００５２】本発明における標識剤は、免疫測定やハイ
ブリダイゼーションアッセイにおけるリガンドの標識剤
として用いられるものであるが、本発明におけるリガン
ドとしては抗原、抗体、ハプテン、プロテインＡ、プロ
テインＣ、アビジン、ビオチン、核酸、核酸を含む分子
などが挙げられる。

【００５３】本発明における標識剤をリガンドに標識す
る方法としては、通常リガンド１モル当り、標識剤１〜
５０モルを室温下（１０〜３５℃）で１０〜６０分程度
反応させることによって行われる。さらに溶媒抽出、シ
リカゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどによって精製
された標識リガンドを得ることができる。しかしなが
ら、この条件に限定されることなく、標識剤や標識され
るリガンドの性質によって最適条件を設定することが重
要である。

【００５４】かくして得られるアクリジニウム標識リガ
ンドは、下記＜１＞〜＜３＞に例示するような、化学発
光免疫測定法や化学発光ハイブリダイゼーションアッセ
イ法に用いることができる。

【００５５】＜１＞ イアン・ウィークス他、クリニカ
ル・ケミストリー、第２９巻、１４８０頁、１９８３年
には、４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエ
チル）フェニル−１０−メチルアクリジニウム−９−カ
ルボン酸エステル・フルオロスルホン酸塩を抗α−フェ
トプロテイン（以下ＡＦＰと略す）抗体に標識させて得
られたアクリジニウム標識抗ＡＦＰ抗体を用いるサンド
イッチ法免疫測定法によるＡＦＰの測定に関する記載が
あるが、本発明により得られた標識物を４−（２−スク
シンイミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０
−メチルアクリジニウム−９−カルボン酸エステル・フ
ルオロスルホン酸塩に代えて用いることによりさらに高
感度なＡＦＰの測定が可能となる。

【００５６】＜２＞ イアン・ウィークス他、メソッズ
・イン・エンザイモロジー、第１３３巻、３６６頁、１
９８６年には、４−（２−スクシンイミジルオキシカル
ボニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジニウム
−９−カルボン酸エステル・フルオロスルホン酸塩をＬ
−サイロキシン（以下Ｔ４と略す）に標識させて得られ
たアクリジニウム標識Ｔ４を用いる競合法免疫測定法に
よる遊離Ｔ４の測定に関する記載があるが、本発明によ
り得られた標識物を４−（２−スクシンイミジルオキシ
カルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジニ
ウム−９−カルボン酸エステル・フルオロスルホン酸塩
に代えて用いることによりさらに高感度な遊離Ｔ４の測
定が可能となる。

【００５７】＜３＞ 遺伝子診断の分野においても、ジ
ェー・ライル他、クリニカル・ケミストリー第３５巻、
１５８８頁、１９８９年に４−（２−スクシンイミジル
オキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアク
リジニウム−９−カルボン酸エステル・フルオロスルホ
ン酸塩とオリゴＤＮＡとを反応させることによって得ら
れたプローブを用いる白血病診断に関する記載がある
が、本発明により得られた標識物を４−（２−スクシン
イミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メ
チルアクリジニウム−９−カルボン酸エステル・フルオ
ロスルホン酸塩に代えて用いることによりさらに高感
度、かつ迅速に白血病の診断が可能となる。

【００５８】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が本発明はこれに限定されるものではない。

【００５９】実施例１ ３−（７−スクシンイミジルオキシカルボニルヘプタン
アミド）ナフタレン−１，５−｛Ｎ，Ｎ’−ジ（１０−
メチルアクリジニウムフルオロスルフォネート−９−カ
ルボニル）−Ｎ，Ｎ’−ジ（４−メトキシフェニル）｝
スルファミド（Ｉ）の合成

【００６０】(1) ３−（９−フルオレニルメトキシカル
ボニルアミノ）ナフタレン−１，５−ジスルホン酸
（ａ）の合成 ３−アミノ−１，５−ナフタレンジスルホン酸ナトリウ
ム（１７．４ｇ、５０．１ｍｍｏｌ、東京化成（株）
製）を脱イオン水（３０ｍｌ）に溶解し、これにＦｍｏ
ｃ−ＤＳＰ（２６．９ｇ、５５．１ｍｍｏｌ、三新化学
工業（株）製）を脱イオン水（３０ｍｌ）に溶解したも
のの全量を加え、室温で５時間反応させ、ＴＬＣ（展開
溶媒：クロロホルム／メタノール＝２／１）にて反応の
終了を確認した。反応液に０．５規定塩酸（２０ｍｌ）
を加え、これを酢酸エチル（４０ｍｌ）で抽出した。酢
酸エチル層を脱イオン水（５０ｍｌ）で２回洗浄した。
酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。無水
硫酸ナトリウムを濾取し、濾液を減圧濃縮した。残渣に
石油エーテルを加えて結晶化させ（ａ）を得た。 収率 ： ２２．０ｇ（９０％） 元素分析 ： 計算値 Ｃ：５７．２％ Ｈ：３．５％
Ｎ：２．７％ 実測値 Ｃ：５７．７％ Ｈ：３．５％ Ｎ：２．６％

【００６１】(2) ３−（９−フルオレニルメトキシカル
ボニルアミノ）ナフタレン−１，５−ジ（４−メトキシ
フェニル）スルファミド（ｂ）の合成 （ａ）（２０．０ｇ、３８．１ｍｍｏｌ）とｐ−メトキ
シアニリン（１０．３ｇ、８３．６ｍｍｏｌ、東京化成
（株）製）を無水ピリジンに溶解し、これに塩化チオニ
ル（５０．０ｇ、４２０．３ｍｍｏｌ、ナカライテスク
（株）製）を加え、加熱還流下７時間反応させた。反応
終了後、反応液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル（４
０ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル層を０．１規定塩酸（４
０ｍｌ）で２回、脱イオン水（４０ｍｌ）で２回洗浄し
た。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。
無水硫酸ナトリウムを濾取し、濾液を減圧濃縮した。残
渣に石油エーテルを加えて結晶化させ（ｂ）を得た。 収率 ： ２３．７ｇ（８４％） 元素分析 ： 計算値 Ｃ：６３．６％ Ｈ：４．７％
Ｎ：５．７％ 実測値 Ｃ：６１．９％ Ｈ：４．５％ Ｎ：５．６％

【００６２】(3) アクリジン−９−塩化カルボニル
（ｃ）の合成 アクリジン−９−カルボン酸（５．０ｇ、２２．４ｍｍ
ｏｌ、シグマ社製）を塩化チオニル（１３．３ｇ、１１
１．８ｍｍｏｌ）に懸濁し、加熱還流下５時間反応させ
た。反応液を減圧濃縮すると結晶が析出した。結晶を集
め、減圧下乾燥させ（ｃ）を得た。

【００６３】(4) ３−（９−フルオレニルメトキシカル
ボニルアミノ）ナフタレン−１，５−ジ｛Ｎ，Ｎ’−
（アクリジン−９−カルボニル）−Ｎ，Ｎ’−（４−メ
トキシフェニル）｝スルファミド（ｄ）の合成 （ｂ）（５．０ｇ、６．８ｍｍｏｌ）を無水ピリジン
（３０ｍｌ）に溶解し、これに（ｃ）（３．６ｇ、１
４．９ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（３０ｍｌ）に溶解し
たものの全量を加え、室温で一昼夜反応させた。反応終
了後、反応液を約１０ｍｌ程度にまで減圧濃縮した。残
渣をシリカゲル６０（メルク社製）を充填した４０ｍｍ
（直径）×１０００ｍｍ（長さ）カラムにチャージし、
クロロホルム／メタノール＝５／１の混液を溶出液とし
てクロマトグラフィーを行った。目的物を含有するフラ
クションを集め、減圧濃縮し、残渣に石油エーテルを加
えて結晶化させ（ｄ）を得た。 収率 ： ５．８ｇ（７５％） 元素分析 ： 計算値 Ｃ：７１．１％ Ｈ：４．２％
Ｎ：４．９％ 実測値 Ｃ：７０．８％ Ｈ：４．４％ Ｎ：４．８％

【００６４】(5) ３−アミノナフタレン−１，５−ジ
｛Ｎ，Ｎ’−（アクリジン−９−カルボニル）−Ｎ，
Ｎ’−（４−メトキシフェニル）｝スルファミド（ｅ）
の合成 （ｄ）（５．０ｇ、４．４ｍｍｏｌ）をジオキサン（３
０ｍｌ）に溶解し、これに１０％炭酸水素ナトリウム溶
液（３０ｍｌ）を加え、室温で２時間反応させ、アミノ
基の保護基を除去した。反応終了後、反応液を減圧濃縮
した。残渣を酢酸エチル（４０ｍｌ）に溶解し、酢酸エ
チル層を脱イオン水（４０ｍｌ）で２回洗浄した。酢酸
エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。無水硫酸
ナトリウムを濾取し、濾液を減圧濃縮した。残渣に石油
エーテルを加えて結晶化させ（ｅ）を得た。 収率 ： ３．６ｇ（９０％） 元素分析 ： 計算値 Ｃ：６８．５％ Ｈ：４．２％
Ｎ：６．１％ 実測値 Ｃ：６８．５％ Ｈ：４．４％ Ｎ：６．０％

【００６５】(6) ３−（７−スクシンイミジルオキシカ
ルボニルヘプタンアミド）ナフタレン−１，５−ジ
｛Ｎ，Ｎ’−（アクリジン−９−カルボニル）−Ｎ，
Ｎ’−（４−メトキシフェニル）｝スルファミド（ｆ）
の合成 （ｅ）（３．０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２
０ｍｌ）に溶解し、これにスベリン酸ジスクシンイミジ
ル（１．３ｇ、３．５ｍｍｏｌ）をジオキサン（２０ｍ
ｌ）に溶解したものの全量を加え、室温で一昼夜反応さ
せた。反応終了後、反応液を減圧濃縮した。残渣を酢酸
エチル（４０ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル層を脱イオン
水（４０ｍｌ）で２回洗浄した。酢酸エチル層を無水硫
酸ナトリウムで乾燥させた。無水硫酸ナトリウムを濾取
し、濾液を減圧濃縮した。残渣に石油エーテルを加えて
結晶化させ（ｆ）を得た。 収率 ： ３．２ｇ（８４％） 元素分析 ： 計算値 Ｃ：６６．３％ Ｈ：４．４％
Ｎ：７．３％ 実測値 Ｃ：６６．８％ Ｈ：４．２％ Ｎ：７．２％

【００６６】(7) ３−（７−スクシンイミジルオキシカ
ルボニルヘプタンアミド）ナフタレン−１，５−ジ
｛Ｎ，Ｎ’−（１０−メチルアクリジニウムフルオロス
ルフォネート−９−カルボニル）−Ｎ，Ｎ’−（４−メ
トキシフェニル）｝スルファミド（Ｉ）の合成 （ｆ）（２．０ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を無水クロロホル
ム（２０ｍｌ）に溶解し、これにフルオロスルホン酸メ
チルエステル（５ｍｌ）を加え、室温で一昼夜反応させ
た。析出した結晶を集め、無水クロロホルム（約１００
ｍｌ）で洗浄し、減圧乾燥させ（Ｉ）を得た。 収率 ： １．５ｇ（６２％） 元素分析 ： 計算値 Ｃ：５５．７％ Ｈ：４．０％
Ｎ：５．９％ 実測値 Ｃ：５６．１％ Ｈ：４．０％ Ｎ：５．７％

【００６７】実施例２ ４，４−ビス｛４−（１０−メチルアクリジニウムフル
オロスルフォネート−９−フェニルカルボキシレート）
吉草酸（４−マレイミド）アニリド（ＩＩ）の合成

【００６８】(1) ４，４−ビス（４−ヒドロキシフェニ
ル）吉草酸（４−マレイミド）アニリド（ｇ）の合成 ４，４−ビス（４−ヒドロキシフェニル）吉草酸（５．
７ｇ、１９．９ｍｍｏｌ、東京化成（株）製）とＮ−
（４−アミノフェニル）マレイミド（４．１ｇ、２１．
８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３０ｍｌ）に溶解し、氷冷しな
がら１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド（３．９ｇ、２０．３ｍｍｏｌ）を加
え、氷冷下１時間反応させ、その後室温で一昼夜反応さ
せた。反応終了後、反応液を減圧濃縮した。残渣を酢酸
エチル（４０ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル層を０．１規
定塩酸（４０ｍｌ）、４％炭酸水素ナトリウム水溶液
（４０ｍｌ）、脱イオン水（４０ｍｌ）でそれぞれ２回
洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥さ
せた。無水硫酸ナトリウムを濾取し、濾液を減圧濃縮し
た。残渣に石油エーテルを加えて結晶化させ（ｇ）を得
た。 収率 ： ７．５ｇ（８３％） 元素分析 ： 計算値 Ｃ：７１．０％ Ｈ：５．３％
Ｎ：６．１％ 実測値 Ｃ：７０．８％ Ｈ：５．３％ Ｎ：６．２％

【００６９】(2) ４，４−ビス｛４−（アクリジン−９
−フェニルカルボキシレート）｝吉草酸（４−マレイミ
ド）アニリド（ｈ）の合成 （ｇ）（３．０ｇ、６．６ｍｍｏｌ）を無水ピリジン
（３０ｍｌ）に溶解し、これに（ｃ）（３．５ｇ、１
４．５ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（３０ｍｌ）に溶解し
たものの全量を加え、室温で一昼夜反応させた。反応終
了後、反応液を約１０ｍｌ程度にまで減圧濃縮した。残
渣をシリカゲル６０（メルク社製）を充填した４０ｍｍ
（直径）×１０００ｍｍ（長さ）カラムにチャージし、
クロロホルム／メタノール＝５／１の混液を溶出液とし
てクロマトグラフィーを行った。目的物を含有するフラ
クションを集め、減圧濃縮し、残渣に石油エーテルを加
えて結晶化させ（ｈ）を得た。 収率 ： ４．０ｇ（７０％） 元素分析 ： 計算値 Ｃ：７６．２％ Ｈ：４．４％
Ｎ：６．５％ 実測値 Ｃ：７５．８％ Ｈ：４．５％ Ｎ：６．７％

【００７０】(3) ４，４−ビス｛４−（１０−メチルア
クリジニウムフルオロスルフォネート−９−フェニルカ
ルボキシレート）｝吉草酸（４−マレイミド）アニリド
（ＩＩ）の合成 （ｈ）（２．０ｇ、２．３ｍｍｏｌ）を無水クロロホル
ム（３０ｍｌ）に溶解し、これにフルオロスルホン酸メ
チルエステル（７ｍｌ）を加え、室温で一昼夜反応させ
た。析出した結晶を集め、無水クロロホルム（約１５０
ｍｌ）で洗浄し、減圧乾燥させ（ＩＩ）を得た。 収率 ： １．６ｇ（６４％） 元素分析 ： 計算値 Ｃ：６２．５％ Ｈ：４．１％
Ｎ：５．１％ 実測値 Ｃ：６２．４％ Ｈ：４．２％ Ｎ：５．０％

【００７１】実施例３ ジ（１０−メチルアクリジニウムフルオロスルフォネー
ト−９−メチルカルボキシレート）メチル−｛７−（４
−ジメチルスルフォニウムメチルスルフェート）オキシ
カルボニルヘプタンアミド｝（ＩＩＩ）の合成

【００７２】(1) ２−（ｔ−ブトキシカルボニル）アミ
ノ−１，３−プロパンジオール（ｉ）の合成 ２−アミノ−１，３−プロパンジオール（３．０ｇ、３
３．０ｍｍｏｌ、東京化成（株）製）を脱イオン水（２
０ｍｌ）に溶解し、これにＢｏｃ−ＤＳＰ（１３．３
ｇ、３６．３ｍｍｏｌ、三新化学工業（株）製）を脱イ
オン水（３０ｍｌ）に溶解したものの全量を加え、室温
で５時間反応させ、ＴＬＣ（展開溶媒：クロロホルム／
メタノール＝２／１）にて反応の終了を確認した。反応
液に４％クエン酸水溶液（３０ｍｌ）を加え、これを酢
酸エチル（４０ｍｌ）で抽出した。酢酸エチル層を脱イ
オン水（５０ｍｌ）で２回洗浄した。酢酸エチル層を無
水硫酸ナトリウムで乾燥させた。無水硫酸ナトリウムを
濾取し、濾液を減圧濃縮した。残渣に石油エーテルを加
えて結晶化させ（ｉ）を得た。 収率 ： ５．７ｇ（９０％） 元素分析 ： 計算値 Ｃ：５０．２％ Ｈ：９．０％
Ｎ：７．３％ 実測値 Ｃ：５０．４％ Ｈ：９．１％ Ｎ：７．３％

【００７３】(2) ジ（アクリジン−９−メチルカルボキ
シレート）メチル−（ｔ−ブトキシカルボニル）アミン
（ｊ）の合成 （ｉ）（１．０ｇ、５．２ｍｍｏｌ）を無水ピリジン
（２０ｍｌ）に溶解し、これに（ｃ）（２．８ｇ、１
１．６ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（３０ｍｌ）に溶解し
たものの全量を加え、室温で一昼夜反応させた。反応終
了後、反応液を約１０ｍｌ程度にまで減圧濃縮した。残
渣をシリカゲル６０（メルク社製）を充填した４０ｍｍ
（直径）×１０００ｍｍ（長さ）カラムにチャージし、
クロロホルム／メタノール＝５／１の混液を溶出液とし
てクロマトグラフィーを行った。目的物を含有するフラ
クションを集め、減圧濃縮し、残渣に石油エーテルを加
えて結晶化させ（ｊ）を得た。 収率 ： ２．３ｇ（７３％） 元素分析 ： 計算値 Ｃ：７１．６％ Ｈ：５．５％
Ｎ：７．０％ 実測値 Ｃ：７１．９％ Ｈ：５．５％ Ｎ：６．９％

【００７４】(3) ジ（アクリジン−９−メチルカルボキ
シレート）メチルアミン（ｋ）の合成 （ｊ）（２．０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）をジオキサン（１
０ｍｌ）に溶解し、これに４規定塩酸／ジオキサン溶液
（１０ｍｌ）を加え、室温で３時間反応させ、アミノ基
の保護基を除去した。反応の終点はＴＬＣ（展開溶媒：
クロロホルム／メタノール＝５／１）で確認した。反応
終了後、反応液を減圧濃縮し、残渣にジオキサン（３０
ｍｌ）を加え、再び減圧濃縮した。この操作を３回繰り
返した。残渣に石油エーテルを加えて結晶化させ（ｋ）
を得た。 収率 ： １．６ｇ（９０％） 元素分析 ： 計算値 Ｃ：６８．９％ Ｈ：４．９％
Ｎ：７．８％ 実測値 Ｃ：６９．１％ Ｈ：４．９％ Ｎ：７．６％

【００７５】(4) スベリン酸−ジ（フェニルジメチルス
ルフォニウムメチルスルフェート）（ｌ）の合成 スベリン酸（５．０ｇ、２８．７ｍｍｏｌ、東京化成
（株）製）とサンセラーＤＳＰ（１６．８ｇ、６３．１
ｍｍｏｌ、三新化学工業（株）製）をジオキサン（５０
ｍｌ）に溶解し、氷冷しながら１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１２．１
ｇ、６３．１ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下１時間反応さ
せ、その後室温で一昼夜反応させた。反応終了後、反応
液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル（４０ｍｌ）に溶
解し、酢酸エチル層を４％炭酸水素ナトリウム溶液（４
０ｍｌ）と脱イオン水（４０ｍｌ）でそれぞれ２回洗浄
した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ
た。無水硫酸ナトリウムを濾取し、濾液を減圧濃縮し
た。残渣に石油エーテルを加えて結晶化させ（ｌ）を得
た。 収率 ： １６．０ｇ（８３％） 元素分析 ： 計算値 Ｃ：４５．５％ Ｈ：５．７％ 実測値 Ｃ：４５．３％ Ｈ：５．８％

【００７６】(5) ジ（アクリジン−９−メチルカルボキ
シレート）メチル−｛７−（４−ジメチルスルフォニウ
ムメチルスルフェート）オキシカルボニルヘプタンアミ
ド｝（ｍ）の合成 （ｋ）（１．５ｇ、２．８ｍｍｏｌ）とトリエチルアミ
ン（０．４ｍｌ、２．８ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２０
ｍｌ）に溶解し、これに（ｌ）（２．１ｇ、３．１ｍｍ
ｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍｌ）に溶解したものの
全量を加え、室温で一昼夜反応させた。反応終了後、反
応液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル（３０ｍｌ）に
溶解し、酢酸エチル層を０．１規定塩酸、４％炭酸水素
ナトリウム水溶液（３０ｍｌ）、脱イオン水（３０ｍ
ｌ）でそれぞれ２回洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸
ナトリウムで乾燥させた。無水硫酸ナトリウムを濾取
し、濾液を減圧濃縮した。残渣に石油エーテルを加えて
結晶化させ（ｍ）を得た。 収率 ： １．９ｇ（７５％） 元素分析 ： 計算値 Ｃ：６３．６％ Ｈ：５．２％
Ｎ：４．６％ 実測値 Ｃ：６３．４％ Ｈ：５．２％ Ｎ：４．７％

【００７７】(6) ジ（１０−メチルアクリジニウムフル
オロスルフォネート−９−メチルカルボキシレート）メ
チル−｛７−（４−ジメチルスルフォニウムメチルスル
フェート）オキシカルボニルヘプタンアミド｝（ＩＩ
Ｉ）の合成 （ｍ）（１．５ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を無水クロロホル
ム（２０ｍｌ）に溶解し、これにフルオロスルホン酸メ
チルエステル（５ｍｌ）を加え、室温で一昼夜反応させ
た。析出した結晶を集め、無水クロロホルム（約１００
ｍｌ）で洗浄し、減圧乾燥させ（Ｉ）を得た。 収率 ： １．３ｇ（６６％） 元素分析 ： 計算値 Ｃ：５１．５％ Ｈ：４．６％
Ｎ：３．６％ 実測値 Ｃ：５１．５％ Ｈ：４．５％ Ｎ：３．８％

【００７８】評価例１ 標識剤（Ｉ）標識抗フェリチン抗体（「標識物−１」）
の調製

【００７９】抗フェリチン抗体（ウサギ由来）（ダコ社
製）（５ｍｌ、タンパク量として約３３ｍｇ）を０．０
２ｍｏｌ／リットル（以下Ｍと略す）ｐＨ８．０のリン
酸緩衝液１リットルを外液として４回透析を行った。透
析終了後、抗体液を試験管にとり２８０ｎｍの吸光度よ
り蛋白濃度（ＩｇＧ濃度）を求めた。

【００８０】標識剤（Ｉ）（２．０ｍｇ、１．４×１０
^-3ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解し、先に透析の
終了している抗体液（１．５ｍｌ、ＩｇＧ量として９．
０ｍｇ、５．６×１０^-5ｍｍｏｌ）がはいった試験管に
標識剤（Ｉ）のＤＭＦ溶液８０μｌを１０分毎に１０回
投入した。全量投入後、１時間室温で靜置反応させ、そ
の後Ｌ−リジン水溶液（０．１ｇ／ｍｌ）を１００μｌ
加え、さらに１時間靜置反応させた。

【００８１】反応終了後、反応液をセファデックスＧ−
２５に通し（溶出液：０．０２Ｍ、ｐＨ７．２リン酸緩
衝液）、未反応の標識剤（Ｉ）とＬ−リジンを除去し
た。２８０ｎｍの吸収を有し、かつ発光活性も有するフ
ラクションを集め、濃縮して「標識物−１」を得た。

【００８２】評価例２ 標識剤（ＩＩ）標識抗フェリチン抗体（「標識物−
２」）の調製

【００８３】標識剤（ＩＩ）（２．０ｍｇ、１．８×１
０^-3ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解し、先に透析
の終了している抗体液（１．５ｍｌ、ＩｇＧ量として
９．０ｍｇ、５．６×１０^-5ｍｍｏｌ）がはいった試験
管に標識剤（ＩＩ）のＤＭＦ溶液６１μｌを１０分毎に
１０回投入した。全量投入後、１時間室温で靜置反応さ
せ、その後Ｌ−リジン水溶液（０．１ｇ／ｍｌ）を１０
０μｌ加え、さらに１時間靜置反応させた。

【００８４】反応終了後、反応液をセファデックスＧ−
２５に通し（溶出液：０．０２Ｍ、ｐＨ７．２リン酸緩
衝液）、未反応の標識剤（ＩＩ）とＬ−リジンを除去し
た。２８０ｎｍの吸収を有し、かつ発光活性も有するフ
ラクションを集め、濃縮して「標識物−２」を得た。

【００８５】評価例３ 標識剤（ＩＩＩ）標識抗フェリチン抗体（「標識物−
３」）の調製

【００８６】標識剤（ＩＩＩ）（２．０ｍｇ、１．７×
１０^-3ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解し、先に透
析の終了している抗体液（１．５ｍｌ、ＩｇＧ量として
９．０ｍｇ、５．６×１０^-5ｍｍｏｌ）がはいった試験
管に標識剤（ＩＩＩ）のＤＭＦ溶液６５μｌを１０分毎
に１０回投入した。全量投入後、１時間室温で靜置反応
させ、その後Ｌ−リジン水溶液（０．１ｇ／ｍｌ）を１
００μｌ加え、さらに１時間靜置反応させた。

【００８７】反応終了後、反応液をセファデックスＧ−
２５に通し（溶出液：０．０２Ｍ、ｐＨ７．２リン酸緩
衝液）、未反応の標識剤（ＩＩＩ）とＬ−リジンを除去
した。２８０ｎｍの吸収を有し、かつ発光活性も有する
フラクションを集め、濃縮して「標識物−３」を得た。

【００８８】比較例 比較対象物として、先に「従来の技術」の項で述べた標
識剤である市販の４−（２−スクシンイミジルオキシカ
ルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジニウ
ム−９−カルボン酸エステル・フルオロスルホン酸塩を
選択し、ウィークスらの方法「イアン・ウィークス他、
クリニカル・ケミストリー、第２９巻、１４７４頁、１
９８３年発行」に従って、標識剤（Ｉ）、（ＩＩ）、
（ＩＩＩ）を標識したのと同じ、透析終了した抗フェリ
チン抗体に標識し、これを「標識物−４」とした。

【００８９】使用例 「標識物−１、２、３」と「標識物−４」の性能比較

【００９０】(1) それぞれの発光量の比較 「標識物−１、２、３」および「標識物−４」のそれぞ
れタンパク量として２μｇ分を１２×７５ｍｍのガラス
製試験管に分注し、アロカ（株）製、ルミネッセンスリ
ーダーＢＬＲ−２０１のサンプルホルダーにセットし
た。発光反応液Ａ（０．６％過酸化水素含有０．１規定
塩酸水溶液）と発光反応液Ｂ（オクチルフェノールエチ
レンオキサイド１０モル付加物０．５％含有０．２規定
水酸化ナトリウム水溶液）のそれぞれ２５０μｌを順次
加え、化学発光反応を行った。測定値は５秒間の積分値
として得た。その際の、それぞれの標識物からの発光量
を下記表１に示したが、「標識物−１、２、３」からの
発光の方が「標識物−４」からの発光量の約２〜３倍多
く、このことからも本発明の標識剤の高い発光性が確認
された。

【００９１】

【表１】

【００９２】(2) フェリチンの免疫測定におけるそれぞ
れの標識物の性能比較 抗フェリチン抗体の試験管内壁への固定化 炭酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ９．５）に抗フェリチン
抗体（ウサギ由来、ダコ社製）を５０μｇ／ｍｌとなる
よう溶解した。ヌンク社製ポリスチレン試験管（１２×
７５ｍｍ）にこの抗フェリチン抗体含有炭酸緩衝液を各
５００μｌずつ分注し、４℃で４８時間反応させ抗体を
試験管内壁に固定化した。反応終了後、アスピレーター
を用いて試験管内の液を除去した。生理食塩水１ｍｌで
試験管内を３回洗浄し、さらに１％牛血清アルブミン
（以下ＢＳＡと略す）を含むリン酸緩衝液（０．０２
Ｍ、ｐＨ７．２）１ｍｌを加え、使用時まで４℃で保存
した。

【００９３】アクリジニウム標識抗体液の調製 実施例１〜４で得られた「標識物１〜４」を１％ＢＳＡ
含有リン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．２）で各標識
物のタンパク濃度が２μｇ／ｍｌとなるよう溶解した。

【００９４】標準液 精製ヒトフェリチン（脾臓由来）を１％ＢＳＡ含有リン
酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．２）で２０、５０、１
００、２００、５００、１０００ｎｇ／ｍｌとなるよう
希釈調製した。

【００９５】測定法 (1)で調製した抗体結合試験管中の浸漬液をアスピレー
ターを用いて除去し、生理食塩水１ｍｌを用いて試験管
内を１回洗浄した。洗浄した試験管に標準液または試料
（血清または血漿）３０μｌをサンプリングし、１％Ｂ
ＳＡ含有リン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．２）５０
０μｌを加え、よく攪拌し、３７℃で３０分間インキュ
ベートした。反応終了後、反応液をアスピレーターを用
いて除去し、生理食塩水１ｍｌを加えて再び同様に操作
した。この操作を３回繰り返し、試料中の未反応物を除
去した。

【００９６】先の試験管にで調製した「標識物１〜
４」の溶液それぞれ５００μｌを加え、よく攪拌し、３
７℃で３０分間インキュベートした。反応終了後、反応
液をアスピレーターを用いて除去し、生理食塩水１ｍｌ
を加え再び同様に操作した。この操作を３回繰り返し、
未反応の「標識物−１〜４」を除去した。

【００９７】洗浄の終了した先の試験管をアロカ（株）
製、ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１のサンプル
ホルダーにセットした。発光反応液Ａ（０．％過酸化水
素含有０．１規定塩酸水溶液）と発光反応液Ｂ（オクチ
ルフェノールエチレンオキサイド１０モル付加物０．５
％含有０．２規定水酸化ナトリウム水溶液）のそれぞれ
２５０μｌを順次加え、化学発光反応を行った。測定値
は５秒間の積分値として得た。

【００９８】それぞれの標識物を用いた場合の標準液を
検体として用いた各標準液濃度における発光量を下記表
２に示した。また各標準液濃度における発光量をグラフ
用紙にプロットし図１に示したような検量線が得られ
た。それによると免疫測定における発光量も「標識物−
１〜３」を用いた場合の方が「標識物−４」を用いた場
合よりも多く、本結果から本発明の標識剤の高い標識反
応性および高い化学発光収率が確認された。

【００９９】

【表２】

【０１００】

【発明の効果】本発明の化学発光性標識剤を用いること
によって、従来の標識剤を用いた場合より２〜３倍高い
標識反応性および化学発光収率が得られる。すなわち本
発明の標識剤を免疫測定あるいはハイブリダイゼーショ
ンアッセイ用キットに用いることにより、臨床検査の現
場で要求されている感度を十分に満足させることが可能
となり、さらに新しい疾病の発見とその治療法の確立に
も貢献できるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】使用例にて得られたフェリチンの化学発光免疫
測定法による検量線である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｂ 8310−2Ｊ //(Ｃ０７Ｄ 401/14 207:00 8314−4Ｃ 219:00） 7431−4Ｃ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １分子中に、下記化１で表される基
   （１）および／または下記化２で表される基（２）を２
   〜５個と、下記化３〜化１１で表される基（３）を１個
   有することを特徴とする化学発光性標識剤。 【化１】 【化２】 ［式中、Ｒ₁は水素原子、１〜１０個の炭素原子を有す
   るアルキル基、アルケニル基、アルキニル基またはアリ
   ール基を表し；Ｒ₂、Ｒ₃は水素原子、１〜５個の炭素原
   子を有するアルキル基、アルコキシ基、アミノ基、カル
   ボキシル基、シアノ基、ニトロ基、アルデヒド基または
   ハロゲン原子を表し；Ｒ₄は１〜１０個の炭素原子を有
   するアルキレン基、アルケニレン基またはアリーレン基
   （これらの基における１個以上の水素原子は、メチル
   基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、フ
   ェニル基、ベンジル基、メトキシ基、エトキシ基、フェ
   ノキシ基、ベンジルオキシ基、カルボキシル基、カルボ
   メトキシ基、カルボエトキシ基、カルボフェノキシ基、
   カルボベンゾキシ基、カルボキサミド基、アミノ基、水
   酸基、ニトロ基、シアノ基、アルデヒド基、モルホリノ
   基、メルカプト基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、
   ヨウ素原子のいずれかで置換されていてもよい。）を表
   し；Ｘ^-はアニオンを表し；Ｙは水素原子、１〜１０個
   の炭素原子を有するアルキル基、アリール基、アルコキ
   シ基、アリールオキシ基、カルボキシル基、カルボアル
   コキシ基、カルボアリール基、カルボキサミド基、アミ
   ノ基、水酸基、ニトロ基、シアノ基、アルデヒド基、モ
   ルホリノ基、メルカプト基またはハロゲン原子を表
   す。］ 【化３】 ［式中、Ｒ₅、Ｒ₆は１〜１０個の炭素原子を有するアル
   キル基、アルケニル基、アルキニル基またはアリール基
   （これらの基における１個以上の水素原子は、メチル
   基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、フ
   ェニル基、ベンジル基、メトキシ基、エトキシ基、フェ
   ノキシ基、ベンジルオキシ基、カルボキシル基、カルボ
   メトキシ基、カルボエトキシ基、カルボフェノキシ基、
   カルボベンゾキシ基、カルボキサミド基、アミノ基、水
   酸基、ニトロ基、シアノ基、アルデヒド基、モルホリノ
   基、メルカプト基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、
   ヨウ素原子のいずれかで置換されていてもよい。）を表
   し；Ｚ^-はアニオンを表す。］ 【化４】 ［式中、Ｒ₇は水素原子、スルホン酸基、スルホン酸ナ
   トリウム基またはスルホン酸カリウム基を表す。］ 【化５】 【化６】 【化７】 【化８】 【化９】 【化１０】 【化１１】
2. 【請求項２】 （１）および（２）においてＲ₁がメチ
   ル基、エチル基、プロピル基、フェニル基またはベンジ
   ル基である請求項１記載の標識剤。
3. 【請求項３】 （１）および（２）においてＲ₂、Ｒ₃が
   水素原子、１〜５個の炭素原子を有するアルキル基、ア
   ルコキシ基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基またはハロ
   ゲン原子である請求項１または２記載の標識剤。
4. 【請求項４】 （１）におけるＲ₄が１〜１０個の炭素
   原子を有するアルキレン基またはフェニレン基である請
   求項１〜３のいずれか記載の標識剤。
5. 【請求項５】 （１）および（２）においてＸ^-がスル
   ホン酸イオン、メタンスルホン酸イオン、クロロスルホ
   ン酸イオン、フルオロスルホン酸イオン、フルオロメタ
   ンスルホン酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イ
   オン、硝酸イオン、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イ
   オンまたはヨウ素イオンである請求項１〜４のいずれか
   記載の標識剤。
6. 【請求項６】 （１）におけるＹが水素原子、メチル
   基、エチル基、プロピル基、ブチル基、フェニル基、ベ
   ンジル基、メトキシ基、エトキシ基、フェノキシ基、ベ
   ンジルオキシ基、カルボキシル基、カルボメトキシ基、
   カルボエトキシ基、カルボフェノキシ基、カルボベンゾ
   キシ基、カルボキサミド基、カルボヒロラジド基、アミ
   ノ基、水酸基、ニトロ基、シアノ基、アルデヒド基、モ
   ルホリノ基、メルカプト基、フッ素原子、塩素原子、臭
   素原子またはヨウ素原子である請求項１〜５のいずれか
   記載の標識剤。
7. 【請求項７】 （３）が下記化１２〜化１７のいずれか
   で表される基である請求項１〜６のいずれか記載の標識
   剤。 【化１２】 ［式中、Ｒ₅、Ｒ₆はメチル基、エチル基、プロピル基、
   フェニル基またはベンジル基であり、Ｚ^-はメタンスル
   ホン酸イオン、フルオロスルホン酸イオン、フルオロメ
   タンスルホン酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸
   イオン、硝酸イオン、フッ素イオン、塩素イオン、臭素
   イオンまたはヨウ素イオンである。］ 【化１３】 ［式中、Ｒ₇は水素原子、スルホン酸基、スルホン酸ナ
   トリウム基またはスルホン酸カリウム基を表す。］ 【化１４】 【化１５】 【化１６】 【化１７】
8. 【請求項８】 １分子中に、（１）および／または
   （２）を２個有する、請求項１〜７のいずれか記載の標
   識剤。
9. 【請求項９】 （１）と（３）、が１分子中にスルホン
   酸基を２個とアミノ基またはカルボキシル基を１個有す
   る分子で連結されている請求項１〜８のいずれか記載の
   標識剤。
10. 【請求項１０】 （２）と（３）が、１分子中に水酸基
    を２個とアミノ基またはカルボキシル基を１個有する分
    子で連結されている請求項１〜８のいずれか記載の標識
    剤。
11. 【請求項１１】 下記化１８〜化２０で表される請求項
    １〜１０のいずれか記載の標識剤。 【化１８】 【化１９】 【化２０】
12. 【請求項１２】 免疫測定法またはハイブリダイゼーシ
    ョンアッセイにおけるリガンドの標識剤である請求項１
    〜１１のいずれか記載の標識剤。