JPH0377463B2 - - Google Patents

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JPH0377463B2
JPH0377463B2 JP59501184A JP50118484A JPH0377463B2 JP H0377463 B2 JPH0377463 B2 JP H0377463B2 JP 59501184 A JP59501184 A JP 59501184A JP 50118484 A JP50118484 A JP 50118484A JP H0377463 B2 JPH0377463 B2 JP H0377463B2
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chelate
fluorescence
fluorescent
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Ueeriimatei Mukara
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Wallac Oy
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    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
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    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
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    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
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    • C07F9/3804—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)] not used, see subgroups
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    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G—PHYSICS
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Description

請求の範囲 １ ランタニドキレートで標識された生物有機分
子の使用によつて被分析物質を測定する方法であ
つて、上記ランタニドキレートはそのランタニド
の放出と蛍光ランタニドキレートの形成の時間分
解蛍光分光分析法による定量によつて測定される
方法において、上記生物有機分子が式 （上記式中、Ｒは２〜８個の炭素原子からなる
直鎖または分枝アルキレン基であり、ｎおよびｍ
は０または１であり、Y1〜Y7の１つは生物有機
分子との共有結合を許容する活性官能基であり、
残りはカルボン酸残基またはホスホン酸残基であ
る） を有する化合物かまたは上記化合物のランタニド
キレート（ここにランタニドは前記蛍光キレート
におけるものと同じである）との反応によつて標
識されていることを特徴とする生特異的親和反応
の定量方法。 ２ 前記活性官能基が、前記生物有機分子と結合
するため、NH2−、HO−、−COOH、イソチオ
シアネートもしくはイソシアネート基を有する２
〜８個の炭素原子を有するアルキレン基またはフ
エニル環である請求の範囲１の定量方法。 ３ Y7が生物有機分子との共有結合を許容する
活性官能基である請求の範囲１の定量方法。 ４ Ｒがエチレン基であり、ｎ＝ｍ＝０であり、
Y1〜Y6がカルボン酸残基であり、そしてY7がｐ
−アミノフエニルまたはｐ−イソチオシアナトフ
エニル基である請求の範囲１の定量方法。 技術分野 本発明は生特異的親和反応の定量方法に関す
る。 背景技術 免疫検定法（immunoassay）は、種々の生物
液体中の被検物質の量が通常非常に少ないため
に、分析の感度が決定的に重要な分野である。そ
のために放射性同位元素がその使用による欠点に
もかかわらず免疫検定法における標識として広く
使用されてきた。しかしこれと同時に放射性同位
元素に代えてこれと少なくとも同等またはそれ以
上の感度を有する標識を見出すために極めて熱心
な研究も行なわれてきた。 放射性同位元素の最も可能性のある代替物質の
一つとして蛍光分子が提示されている。現在知ら
れている蛍光免疫分析法について優れた概観を与
える包括的な調査が最近公表された（参照：
Smithほか（1981）Ann.Clin.Biochem.18．253−
274，Ullman（1981）「螢光イムノアツセイ技術に
おける最近の進歩」）。 免疫検定法における螢光標識の感度は、理論的
には非常に高いという事実にもかかわらず、高い
バツクグラウンド螢光によつて非常に制限されて
いる。通常、バツクグラウンド螢光を減少させて
所望の感度を得ることは可能である。上述の調査
も、放射性同位元素によつて得ることができる感
度に対応する高い感度を必要とする物質の免疫検
定において従来の螢光標識の使用を困難にしてい
る種々の制限について記述している。 しかし、時間分解螢光法（time−resolved
fluorescence）（参照：Soiniほか（1979）Clin.
Chem.25，353−361）の使用により、標識の特定
螢光を不特定な妨害バツクグランド螢光から分離
することができる。生特異的親和反応に関連する
時間分解螢光法の使用原理は、米国特許第
4374120号および欧州特許願第828500777号に開示
されている。時間分解螢光法においては、螢光標
識は短い継続時間の光パルスで励起され、その螢
光は励起パルスから一定の時間が経過するまでは
検出されない。励起と検出の間に経過する時間の
間にいかなる妨害源からの螢光も減衰してしまう
ので、時間分解螢光に使用可能な標識からの信号
のみが検出される。 この種の標識は可及的に強い螢光と、比較的長
い発光波長と、大きいストークスシフトと、標識
を抗原、ハブテン（hapten）、抗体、核酸、ポリ
ヌクレオチドに共有結合させることができる化学
構造とを有していなければならない。上述の要件
を満足させる一つの螢光標識（米国特許第
4374120号）はランタニド（lanthanide）と芳香
族β−ジケトンとによつて形成されたランタニド
キレートからなり、このランタニドはEDTA類
似体を介して抗原、ハプテン、抗体、核酸または
ポリヌクレオチドと結合して螢光ランタニド複合
体が形成される。 この標識の螢光減衰時間は長く50〜1000μsecで
あり時間分解検出原理に極めて適している。標識
からの螢光は、この標識が抗原、ハプテン、抗
体、核酸またはポリヌクレオチドと結合したとき
に測定することができる。あるいはまた適当に選
定された条件下でランタニドとEDTA類似体と
の間の結合を断つことによつてランタニドを上述
の物質から分離することができ、螢光はランタニ
ドとともにランタニドに特有の螢光をもつミセル
系を形成する芳香族β−ジケトン、相乗的化合物
（Synergistic compound）および界面活性剤の存
在下で溶液中に生じる（欧州特許願第82500777
号）。 生特異的親和反応の標識としてランタニドを用
いる場合に、原則として二つの機能を識別するこ
とができる。生特異的親和反応において標識とし
て使用できるために、一方ランタニドは螢光キレ
ートを形成しなければならず、他方、ランタニド
は抗原、ハプテン、抗体、核酸またはポリヌクレ
オチドである生物有機分子と結合しなければなら
ない。 螢光ランタニドキレートを形成するための必要
条件は欧州特許願第838502441号に開示されてい
る。ランタニドの生物有機分子への特定の制御さ
れた結合は、多くの溶液が試験されているけれど
も、困難であることが判明している。このような
結合においては、ランタニドが非常に高い親和力
で生物有機分子と結合すること、およびこの結合
が動的に安定していることが望ましい。生物有機
分子と共有結合するとともに、ランタニドとキレ
ート結合する１次配位子は励起エネルギーを吸収
することができ、このエネルギーが欧州特許願第
838502441号に述べられた原理に基づいてランタ
ニドに伝達される。あるいは１次配位子は単にラ
ンタニドの生物有機分子への結合のための中間体
として作用する。前述のEDTA類似体（米国特
許第4374120号）は後者の原理に従う。アミノフ
エニル−EDTA−Euは例えばジアゾ化され、そ
の後タンパク質中のチロシンまたはヒスチジン残
基と結合することができる。しかし、合成された
タンパク質−EDTA−Eu複合体は励起されると、
長い持続時間の非常に低いランタニド螢光を発生
する。これは１次配位子が必要な励起エネルギー
を吸収せずランタニドに伝達しないからである。
これにもかかわらず、この配位子は米国特許第
4374120号および欧州特許願第828500777号に記載
された原理に基づいて生特異的親和反応において
優れた機能を発揮する。 エチレンジアミン四酢酸（EDTA）はよく知
られた一般に使用されている化合物であり、適当
な条件下で多くの金属イオンと安定したキレート
を形成する（参照：Ringbom（1964）
Kompleksometrisk analys）。この分子のキレー
ト形成特性は、生特異親和反応に使用するために
例えばランタニドを生物有機分子と結合させるの
に使用することができる。但し、この配位子の生
物有機分子への共有結合が行なわれうることが必
要である。これは例えばEDTA二無水物
（dianhydride）を合成することによつてなされ、
この物質は適当な生物有機分子と結合され、第４
カルボキシル基が共役結合に用いられるとき生物
分子のジアミントリ酢酸誘導体が得られる（参
照：Wieder他、米国特許第4353751号）。さらに、
EDTA構造を生物有機分子と結合させるのに使
用することができるアミノフエニル−EDTA誘
導体を合成することができる（参照：Sundbeerg
他、米国特許第3994966号）。 しかし、金属イオンと安定したキレートを形成
するEDTA以外の化合物もある（参照：
Ringbom（1964）Kompleksometrisk analys）。
このような化合物のうちの一つとして例えばジエ
チレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）が腎臓
機能の検査に関して放射性同位元素と結合するの
に使用された（参照：Klopper他（1972）J.
Nucl.Med.13，107−110）。DTPAはまた、その
分子の環式無水物を用いることによつてタンパク
質に結合された。この場合四つのカルボキシル基
がキレート結合のために残存する（参照：
Hnatowich他（1982）Int.J.Appl.Radiat.Isot.33，
327−332）。 発明の開示 本発明の目的はi.a.ランタニドと強力にキレー
ト結合するとともに、金属キレートを生物有機分
子例えばハプテン、抗原、核酸または抗体に結合
させることができる活性官能基からなるキレート
化化合物を提供することである。本発明の特徴は
本明細書に添付された請求の範囲から明らかであ
る。 【図面の簡単な説明】 図面は七つの異なる濃度に対する二つの標準
（duplicate standards）による典型的なAFP定量
結果を示す。 詳細な説明 本発明はランタニドキレートで標識された生物
有機分子の使用によつて被分析物質を測定する方
法であつて、上記ランタニドキレートはそのラン
タニドの放出と螢光ランタニドキレートの形成の
時間分解螢光分光分析法による定量によつて測定
される方法において、上記生物有機分子が式 （上記式中、Ｒは２〜８個の炭素原子からなる
直鎖または分枝アルキレン基であり、ｎおよびｍ
は０または１であり、Y1〜Y7の１つは生物有機
分子との共有結合を許容する活性官能基であり、
残りはカルボン酸残基またはスルホン酸残基であ
る） を有する化合物かまたは上記化合物のランタニド
キレート（ここにランタニドは前記螢光キレート
におけるものと同じである）との反応によつて標
識されていることを特徴とする生特異的親和反応
の定量方法である。 このキレート化化合物は次の方法で合成するこ
とができる。 工程１： 2.0gのジエチレントリアミンを25mlのトルエン
に溶解させ、25mlのトルエンに溶解させた1.0gの
４−ニトロベンジルブロミドを添加する。この反
応混合物を室温で３時間撹拌する。沈澱物をろ過
してトルエン相を水で抽出する。水相をクロロホ
ルムで抽出しこれを蒸発乾燥する。最終生成物は
黄色のシロツプ状である（0.85g、収率77％）。 TLC：シリカゲル；アンモニア エタノール
１：４：RfはN1化合物に対して0.38およ
びN2化合物に対して0.29。 1H−NMR（CDCl3）：δ＝7.8（ｑ，4H，
【式】），N2に対して3.7および N1化合物に対して3.9（Ｓ，2H，
【式】），２，７（ｍ， 8H，−CH2CH2−）１，６（Ｓ，2H−NH−
＆−NH2）。 UV（H2O）：λmax＝273nm。 工程２： N1−およびN2−（４−ニトロベンジル）−ジエ
チレントリアミンの混合物を水に溶解させる。こ
の水溶液を7MKOH溶液でアルカリ性（PH９〜
11）となし、撹拌しつつ50℃に加熱する。ブロム
酢酸（2.5）の水溶液をゆつくり添加し、KOH
溶液によりPHを９〜11に維持する。添加後も撹拌
および加熱（50℃）を少なくとも４時間継続し、
ときどきKOH溶液を添加してPHを９と11の間に
維持する。反応混合液を酸性化（PH約１）し、冷
却により生じる微量の沈澱物をろ別する。溶液を
蒸発減量して塩を沈澱させ、この沈澱をアセトン
を添加することにより容易にする。溶液を蒸発乾
燥させて不純物を含む生成物を得る（3.1g、所望
の化合物約50％を含む）。生成物を調製用液体ク
ロマトグラフイー（Waters PrepPAK−500／
C18，H2O）で精製し、異なる異性体を別々に分
離する。 TLC：シリカゲル；アセトニトリル／水
４：１；RfはN1化合物に対して0.16および
N2化合物に対して0.33。 13C−NMR（D2O）：δ＝52.4および52.6（−CH 2
CH2−），57.8（−CH 2COOH）59.9
【式】126.9，134.3， 141.8および150.7
【式】173.9（−Ｃ OOH）（N2化合物に対して） UV（H2O）：λmax＝269nm IR（KBr）：νmax＝1740，1530，1350cm-1 工程３： 先の合成工程で得られた化合物2.0gを50mlの水
に溶解し、圧力反応容器内の溶液に0.2gの活性炭
上のパラジウム（５％）を添加する。圧力反応器
を０〜＋５℃に冷却し、窒素ガスと水素ガスで洗
浄する。還元が約1MPa（大気圧以上の圧力）０
〜＋５℃で行なわれる。この反応に続いて薄層板
（アセトニトリル／水 ４：１）を用い液体クロ
マトグラフイー（HPLC）またはUV−分光測光
を行なう。最終生成物は1.7g、収率89％。 TLC：シリカゲル；アセトニトリル／水
４：１；RfはEu3+キレートとしてのN1化合
物に対して0.25、N2化合物に対して0.30。 13C−NMR（D2O）：δ＝150.9，140.9，121.7お
よび120.0【式】183（−ＣOOH）（Eu3+キレートとしてのN2化合物
に対して） UV（H2O）：λmax＝284および238nm（〜１：
８） IR（KBr）：νmax＝1580〜1640，1400cm-1 工程４： N2−（４−アミノベンジル）−ジエチレントリ
アミン−N1，N1，N3，N3−テトラ酢酸2.3gを約
15mlの水に溶解させ、この溶液をチオホスゲン
1.7g、クロロホルム15mlおよび炭酸水素ナトリウ
ム1gを含む混合試薬に添加する。この反応混合
物を室温で約20分強力に撹拌する。諸相が分離さ
れ、水相をクロロホルム（３×５ml）で洗浄し、
これを蒸発乾燥させ、得られた生成物をエタノー
ルで洗浄する。最終生成物2.2g、収率83％。 TLC：シリカゲル；アセトニトリル／水
４：１；N1、N2化合物に対するRf0.45。 UV（H2O）：λmax＝268×280nm（〜１：１） IR（KBr）：νmax＝2000〜2200cm-1 反応式 既述の他の化合物は対応するポリアルキレン−
ポリアミンから出発して対応する方法で合成でき
る。カルボキシル基はホスホン酸で代えることも
できる（K.MOEDRITZER−R.R.IRANI，J.
Org.Chem.31，1603（1966））。 以下に本発明の適用性を限定されない実施例に
よつて説明する。 例1.アルフアフエトプロテイン（AFP）の測定。 キレート化化合物N2−（ｐ−イソチオシアナト
ベンジル）−ジエチレントリアミン−N1，N1，
N3，N3−テトラ酢酸（ｐ−ITC−Ｂ−DTTA）
をユーロピウムとキレート結合するのに使用し、
このユーロピウムキレートを単クローン性
（monoclonal）抗AFP抗体に結合する。このユ
ーロピウムで標識された抗体をAFPの免疫検定
に使用した。 抗体のユーロピウムによる標識 ｐ−ITC−Ｂ−DTTA−Euを抗AFP溶液
（200μPBS中0.2mg）に０℃で添加し、この溶液
のPHを1M、Na2CO310μによつて9.5に調整し
た。キレートと抗体間のモル比は60：１であつ
た。この反応混合物を一晩恒温保持し、抗体抱合
体（antibody conjugate）をセフアデツクス
（Sephadex）Ｇ−50カラム（Pharmacia）にお
けるゲルろ過によつて遊離未反応標識から分離し
た。共役結合の度合はユーロピウム螢光を測定す
ることによつて決定したが、それは約7Eu／IgG
であることが判明した。 免疫検定 50mMK2HPO4と9g／NaCl中に抗AFP1μg
を含む溶液250μでポリスチレン管を室温で一
晩処理することにより抗AFPで被覆した。この
管の表面をトリス−HCl緩衝液PH7.70中に
BSA0.5％を含む溶液250μで飽和させた（室温
にて２時間）。この管を洗浄した後、免疫検定に
用いた。 この被覆された管に、0.9％NaCl、0.05％
NaN3、0.5％BSA、0.05％牛ガンマグロブリン、
0.01％トウイ−ン（Tween）−40、および20μM
DTPAを含む225μのトリス−塩酸緩衝液PH7.7
にユーロビウムで標識された抗AFP50ngを添加
したものとともに25μの血清サンプルまたは対
応する標準液を入れて一時間恒温保持した。恒温
保持後、管を0.05％NaN3を含む生理的塩化ナト
リウム溶液２mlで３回吸い出し洗浄した。 時間分割螢光によるユーロピウムの定量 免疫分析においてキレートと標識付き抗体とを
介して管の表面に付着されたユーロピウムの量を
0.5mlの増強溶液（フタレート−アセテート−緩
衝液PH3.2中15μMβ−ナフトイルトリフルオロア
セトン、50μMトリオクチルホスフインオキシ
ド、0.1％トライトン（Triton）Ｘ−100）を加え
て測定した。この溶液はキレートからユーロピウ
ムを分離し、新しい螢光キレートがミセル相中に
形成され、その量は得られた時間分割螢光信号と
分離したユーロピウムの量とに比例する。 結 果 二重の標準液を用い７種の異なる濃度による典
型的なAFP測定結果を表１と添付図に示す。
JP59501184A 1983-03-15 1984-03-13 生特異的親和反応の定量方法 Granted JPS60500767A (ja)

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