SE425439B - Immunologisk analys med lantanidkelatkomplex som markor - Google Patents

Description

15 20 k! (II 30 35 ' ningen av radioaktiva ämnen inom medicin. 8102755-4 lagringstid, dels att man av hälso- och miljöskäl vill minska använd- Ett alternativ till de radioimmunologiska metoderna är därvid de fluoroimmunologiska för- farandena där markören utgöres av ett fluorescerande ämne.

Ett speciellt problem vid fluorescensbestämningar inom immunologi är att serum har en relativt stark fluorescens som ger upphov till höga bakgrundsnivåer för de flesta fluorescens markörer. Denna fluorescens hos serum härrör huvudsakligen från olika proteiner som emellertid har relativt korta exciterings- och emissionsvåglängder (exciteringsmaximum vid 280 nm, emissionsmaximum vid 360 nm) och därför icke utgör någon mera betydelsefull störelsekälla. I serum förekommer också annan fluorescons, förmodligen härrörande från andra föreningar än proteiner vilken uppträder vid längre våglängder (excitering vid 340 nm, emission vid 460-470 nm) och därför ger upphov till mera svårbemästrade stör- ningsfenomen. Utöver egenfluorescensen hos serum påverkas bakgrunden av en stark spridning. Spridningen ger upphov till interferens, i synnerhet då man använder markörer med litet Stoke's shift (under 50 nm). På grund av hög bakgrundsfluorescens och dennas spridning minskar känsligheten för markörer vid prov innehållande serum med 50-100 ggr jämfört med om de används i ren buffert.

Ett ytterligare problem uppkommer vid de fluorescensbestämningar där antíkrnnparna och det biologiskt aktiva ämnet som är föremål för analys föruuzn att de är bundna till varandra därtill är fixerade till en yta som exempelvis en provrörsvägg. De till ytan fixerade ämnena har en kraftig egenfluorescens och ytan bestående exempelvis av glas eller plast är därtill ofta fluorescerande och har dessutom ofta kraftigt stör1nde ljusspridande egenskaper. Fluorescensmätningen från en yta är således rent mättekniskt mera krävande än ifall mätningen sker i lösning.

De krav som ställs på en markör som används i ett immunologiskt system är att den skall ha så hög fluorescens som möjligt, relativt lång emissionsvåglängd (mer än 500 nm), stort Stoke's shift och en möjlighet att hindas fast (kovalent till antikroppen eller antigenet) utan att negativt påverka konjugerlngsegenskaperna.

En fluorescensmarkör som uppfyller de ovan angivna egenskaperna Finnes beskriven i den svenska patentansökan 7902079~8 och utgöres av ett 10 15 20 25 8102753-4 lantanidkelat bildat av en lantanid och en aromatisk ß-diketon, vilket är bundet till ämnet via en EDTA-analog så att ett fluorescerande lantanidkelatkomplex bildas. Denna markör har dessutom den väsentliga egenskapen att fluorescenstiden är lång, 50 - 1000 psek vilket möjliggör användande av en instrumentteknik beskriven i exempelvis det amerikanska patentet 4,058,732 enligt vilken provet exciteras med en laserpuls med kort varaktighet och fluorescensen detekteras först sedan fluorescensen från störkällorna har avklingat.

Nackdelen med användning av den ovan angivna markören är att ß-diketonerna stör immunoreaktionen och då de efter slutförd immunoreaktion tillförs erfordras en mycket lång tid för bildande av det ternära kelator och vidare är det aktuella proteinet ofta bundet till en yta, t.ex. en provrörsvägg, vilket försvårar mätningar med tillräckligt noggrannhet.

Avsikten med föreliggande uppfinning är därför att åstadkomma ett förfarande vid vilket dessa nackdelar elimineras och vid vilket mätning kan ske efter mycket kort tid med hög noggrannhet. Uppfinningens kännetecken framgår därvid av de efter beskrivningen följande patentkraven.

Enligt uppfinningen utnyttjas möjligheten att avskiljs en lantanid, exempelvis europium, från EDWA genom användande av en lämplig detergent, exempelvis Triton-XIOO, under förutsättning att pH-värdet hålles lågt, lämpligen under 3,5. Enligt uppfinningen är det vidare önskvärt att förstärka fluorescensen efter separationen genom att tillsätta ß~diketoner. Nedanstående tabell ger exempel på några av de för detta ändamål bäst lämpade ß-diketonerna: ß~diketon R1-CG-CH2-CO-R2 R1 R2 2~naftoy1trifluoroaceton (2-NTA) 2-naftyl CF3 1-naftoyltrifluoroaceton (1-NTA) l~nafty1 CF3 p-metoxybenzoyltrifluoroac. (M0-BTA) p-metoxyfenyl CF3 p~f1uorihenzoyltrIFluoroac. (F-ETA) p-Fluorifenyl CF3 henzoyltrifluoroaceton (BTA) fenyl CF3 furoyltrifluoroaceton (FTA) 2-furyl CF3 naftovlforoylmetan (NFM) 2-naftyl 2-furyl dithenoylmetan (DTM) 2-tenyl 2-tenyl dihenzovlmctan (DBM) fenyl fenyl 10 15 20 8102753-4 För att ytterligare förbättra fluorescensen speciellt 1 vattenlösningar, då vatten har en stark fluorescenshämmande effekt, bör någon synergistisk förening, exempelvis någon s.k. Lewis bas tillsättes. En grupp sådana baser består av N-heterocykliska föreningar, exempelvis o-fenantrolin och en annan av fosfiner och fosfinoxíder, t.ex. trioktylfosfinoxid (TOPO). sätt på vilka de påverkar fluorescensen finns beskrivna i exempelvis Egenskaperna hos dessa föreningar och de följande publikationer: Halverson 1964 J. Chem. Phys. _l¿_l_, 157; Karesevaëf Karesev, 1975 Koord. Khim. lg 926; Muraveva 1977. Zh. Neorg. Khim. gå, 3009; Makarchuk 1979 Ukr. Khim. Zh. få) 656; Taketatsu 1979, Anal. Chim.

Acta Ägg, 429 and Brittain 1980, Inorg. Chem. lg, 640.

Enligt uppfinningen kan således mätning ske exempelvis i ett system bestående av en buffert med pH 2,8 - 3,5, (exempelvis ftalat-HCL) innehållande 2-NTA 10 - 100 pM, TOPO 10 - 100 pM och Triton XIOO 0.1 - 0.5 Z.

Fig. 1 visar därvid hur fluorescensen i ett sådant system (med ringar markerad kurva) utvecklas som funktion av tiden jämfört med_ett system där lantaniden är fast bunden till proteinet (med kvadrater markerad kurva).

Förfarandet enligt uppfinningen har prövats med användande av Europium i en modell vid vilken Europiet var bundet till Igfi hos får-anti-kanin IgC och samma protein som antikropp 1 fast fas med kanin IgG som antigen.

Bägge metoderna ger därvid ungefär samma standardkurva. Den väsentliga fördelen med förfarandet enligt uppfinningen var därvid att en mätning kunde ske väsentligt tidigare (efter cirka 30 minuters inkubering jämfört med 8-10 timmar) och med högre precision och starkare fluorescens.

Claims (4)

8102753-4 Patentkrav

1. Immunoiogiskt förfarande för fiuorescensspektroskopisk bestämning -av ett bioïogiskt ämne ti11 viiket koppïas en markör bestående av Tantanidkeiatkompiex bildat av en iantanid bundet ti11 ämnet via en keiatbiidande förening, exempeïvis en EDTA-anaïog, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att iantanidjonen före detektionen i icke-fïuorescerande form dissocieras från det aktiva ämnet genom att pH-värdet genom tiilsats av buffert bringas under 4.0 och att en spjäikande detergent tiiisättes varefter iantanidjonen överföras ti11 enfïuoriscerandeform genom ti11- sats av {}~diketon och exciteringen vid bestämningen sker i iösningen med en kort stråïningspuïs och fiuorescensen från markören detekteras sedan fluorescensen från störkäiiorna i huvudsak upphört.

2. Förfarande eniigt patentkrav 1, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att detergenten utgöres av Triton X100.

3. Förfarandet eniigt patentkrav 1, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att efter avspjä1kningen tiïïsättes en Lewis bas.

4. Förfarandet eniigt patentkrav 3, k ä n n e t e c k n a t d ä r a vt att basen utgöres av triktyïfosfinoxid. 2