RU2074859C1 - Криптаты редкоземельных металлов в качестве флуоресцентных маркеров биологических молекул - Google Patents

Криптаты редкоземельных металлов в качестве флуоресцентных маркеров биологических молекул Download PDF

Info

Publication number
RU2074859C1
RU2074859C1 SU884830344A SU4830344A RU2074859C1 RU 2074859 C1 RU2074859 C1 RU 2074859C1 SU 884830344 A SU884830344 A SU 884830344A SU 4830344 A SU4830344 A SU 4830344A RU 2074859 C1 RU2074859 C1 RU 2074859C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cryptate
group
bipyridine
compound
solution
Prior art date
Application number
SU884830344A
Other languages
English (en)
Inventor
Лен Жан-Мари
Матис Жерар
Альфа Беатрис
Дешено Робер
Жан-Пьер Жолю Этьен
Original Assignee
Компани Орис Индюстри С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Компани Орис Индюстри С.А. filed Critical Компани Орис Индюстри С.А.
Application granted granted Critical
Publication of RU2074859C1 publication Critical patent/RU2074859C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic System
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed systems contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/22—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/40—Rare earth chelates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Использование: в медицине в качестве флуоресцентных маркеров биологических молекул. Сущность изобретения: криптаты редкоземельных металлов, образованных по меньшей мере одной солью редкоземельного металла, в сочетании с макрополициклическим соединением, отвечающим одной из приведенных ф-л I или II в описании. 4 з.п.ф-лы, 1 табл.,2 ил.

Description

Изобретение относится к флуоресцентным маркерам, в частности к новой группе макроциклических комплексов редкоземельных металлов, которые можно использовать в качестве флуоресцентных маркеров биологических молекул.
Из заявки на патент Франции N 8414799 известны макрополициклические комплексы редкоземельных металлов, образованные по меньшей мере одной солью редкоземельного металла, образующего комплекс с макрополициклическим соединением общей формулы I
Figure 00000002

в которой Z является атомом, имеющим 3 или 4 валентности, R ничего не означает или означает водород, гидроксильную группу, аминогруппу или углеводородный радикал, двухвалентные радикалы
Figure 00000003
независимо друг от друга являются углеводородными звеньями, которые, возможно, содержат один или несколько гетероатомов и, возможно, прерываются гетеромакроциклом, причем по меньшей мере один из радикалов
Figure 00000004
содержит по меньшей мере одно молекулярное звено.
Эти криптаты находят применение в качестве флуоресцентных маркеров биологических молекул. Цель изобретения разработка новых соединений, которые обладали бы более высокой флуоресцентной активностью.
Эта цель достигается с помощью соединений согласно изобретению, представляющих собой соль редкоземельного металла, в частности, европия или тербия, в виде комплекса с макроциклическим соединением, соответствующим одной из общих формул I или II:
Figure 00000005
(I)
Figure 00000006
(II)
в которых цикл формулы
Figure 00000007

означает один из следующих циклов:
Figure 00000008

Figure 00000009

где Y является линейным или разветвленным алкиленом C1 - C4,
Z является группой NH2,
R является группой метил или группой Y Z,
R1 является водородом или группой COOR", в которой R" означает алкил C1 C4, предпочтительно, метил, этил или трет-бутил.
Новые криптаты согласно изобретению, имеющие функциональную группу Z, способную связываться ковалентной связью с биологической молекулой, соединены с молекулой криптата через группы CO NH Y или
Figure 00000010
, отдельные группы которых также способны ковалентно связываться с биологической молекулой, что значительно увеличивает флуоресцентную активность исходного криптата.
Сказанное можно проиллюстрировать на следующем сравнительном примере, согласно которому измерялась флуоресцентная активность соединений согласно изобретению с известными криптатами.
Замеры проводились на спектрометре PERKIN-ELMER LS 5 в следующих условиях:
ширина щели при возбуждении/эмиссии: 2,5/10 мм
возбуждение при указанной длине волны
измерения выражались в пересчете на концентрацию криптата, равную 10-5 моль/л воды в качестве растворителя;
коэффициент расширения: I.
Испытывались следующие соединения:
Соединения I и II (контроль): 4,4'-динитро или дибромпроизводные соединения I.
Figure 00000011

Соединение III: 4,4'-диамидэтиленаминовое производное соединения I, которое является соединением формулы I согласно изобретению, у которого Y (CH2)2 и Z NH2
Figure 00000012

Результаты описаны в следующей таблице.
Из данных таблицы видно, что соединения согласно изобретению значительно превосходят по флуоресцентному эффекту аналогичные соединения, не содержащие промежуточных групп между функциональной группой и молекулой криптата.
Криптаты согласно изобретению могут быть получены либо:
конденсацией цикла
Figure 00000013
с 6,6'-дигалогенметил-2,2'-бипиридином, двухзамещенным в позициях 4,4' с последующим замещением группой
Figure 00000014
или
Figure 00000015
и образованием комплекса полученного макрополициклического соединения с солью редкоземельного металла, или
конденсацией молекулы 6,6'-диаминметил-2,2'-бипиридина, двузамещенного в позициях 4,4', с двумя молекулами 6,6'-дигалогенметил 2,2'-бипиридина, двузамещенного в 4,4', с последующим замещением группой NH Y Z или группой Y Z и комплексованием полученного макрополициклического соединения солью редкоземельного металла.
В названных способах образование комплекса с солью редкоземельного металла может происходить перед стадией замещения, что является предпочтительным.
Далее подробно описаны различные способы получения криптатов по изобретению.
Figure 00000016

Figure 00000017
,
где Х является галогенгруппой, R1 алкилгруппой, имеющей от 1 до 10 атомов углерода, предпочтительно метил, этил или третичный бутил.
По этому способу конденсируют галогенпроизводное соединение бипиридина
Figure 00000018
с макроциклом
Figure 00000019
.
Эта реакция осуществляется в безводном органическом растворителе, таком, как, например, ацетонитрил, в присутствии основания, такого, как карбонат иона щелочного металла, например, карбонат натрия или карбонат лития при температуре рефлюкса. Получаемый макробицикл 3 находится в форме криптата иона щелочного металла, например, в виде криптата натрия.
Затем осуществляют аминолиз макробициклического соединения
Figure 00000020
путем реакции его с амином формулы N2H Y Z, в которой группы Y и Z определены выше, причем функциональная группа Z может быть блокирована известными средствами. Действуют предпочтительно в атмосфере азота и при температуре окружающей среды.
После завершения реакции избыток амина удаляют с помощью соответствующих средств, а криптат формулы 4 извлекают с помощью обычных средств.
Полученное таким образом соединение преобразуют затем в криптат редкоземельного металла посредством ионообмена, нагревая с обратным холодильником раствор криптата иона щелочного металла макробицикла 4 в метаноле, возможно, в присутствии хлороформа с раствором галогенида редкоземельного металла в метаноле.
Способ Б:
Figure 00000021

Figure 00000022

По этому способу конденсируют две молекулы галогенпроизводного 6 с одной молекулой аминопроизводного 5. Действуют в таких же условиях, что и на первой стадии способа А, т.е. эту конденсацию осуществляют в безводном органическом растворителе, таком, как ацетонитрил, в присутствии такого основания, как карбонат иона щелочного металла, например, карбоната натрия или карбоната лития.
Действуют при температуре рефлюкса. Получают макрополициклическое соединение 7, которое является ключевым промежуточным продуктом при синтезе криптатов по изобретению.
Этот макрополициклический комплекс находится в виде криптата иона щелочного металла, который предпочтительно преобразуют в криптат редкоземельного элемента перед аминолизом по способу, определенному выше.
Как и для способа А, криптат иона щелочного металла 7 может быть декомплексован для получения макрополициклического соединения 7, соответствующего свободному криптанду, который затем повторно подвергают комплексообразованию в криптат редкоземельного металла.
Затем проводят аминолиз соединения 7 по определенному выше способу и получают макрополициклический комплекс 8, т.е. криптат по изобретению формулы I, в которой
Figure 00000023
является макроциклом бисбипиридина, Y, Z и R' такие, как определено выше.
Способ В
Figure 00000024

Согласно этому методу галогенпроизводное бипиридина 9, соответствующим образом замещенное, вначале конденсируют с макроциклом 2.
Эта реакция осуществляется в безводном органическом растворителе, таком, как, например, ацетонитрил, в присутствии основания, такого, как карбонат иона щелочного металла, например, карбоната натрия или карбоната лития.
При этом получают макрополициклическое соединение 10 в виде криптата иона щелочного металла. Работают предпочтительно при температуре рефлюкса.
Затем осуществляют реакцию замещения макрополициклического соединения 10, путем взаимодействия соединения 10 с галогенидом формулы XYZ, причем Z и Y такие, как определено выше, а Х ион галогенида.
Получаемое соединение II затем преобразуется в криптат редкоземельного металла путем ионообмена, например, по определенному способу.
Предпочтительно растворяют галогенид редкоземельного металла в метаноле и добавляют к нему раствор криптата иона щелочного металла в метаноле с небольшим количеством хлороформа в случае необходимости.
Смесь нагревают с обратным холодильником в атмосфере инертного газа и наблюдают за исчезновением иона щелочного металла посредством хроматографии на тонком слое.
Соединения по изобретению могут использоваться в качестве флуоресцентных маркеров биологических продуктов и подходят в качестве реактивов для количественного анализа в способах иммунологического обнаружения и определения с помощью флуоресценции как при количественном анализе по методу конкуренции, так и по методу избытка.
Изобретение будет описано более подробно с помощью описанных примеров.
П р и м е р 1. Криптат редкоземельного металла [(22)(n- OCH3 n - OCH2CH2NH2 дифенилбипиридин)] формула II" R CH3, Y CH2CH2, Z NH2,
Figure 00000025
является макроциклом (22) (способ B).
А-6,6'-Диметил-4,4'-(ди-(n-метоксифенил)-2,2'-бипиридин (соединение 12).
Смесь 1,6-ди(n-метоксифенил)-1,5-гексадиен-3,4-диона (3,07 г, 9,5 ммоль), хлористого -1-пиридиниумпропан-2-она (3,27 г, 19,1 ммоль), полученную смешиванием эквимолекулярных количеств пиридина и 1-хлорацетона и ацетата аммония (19 г) в 95,5 мл CH3OH, нагревают с обратным холодильником 38 ч в атмосфере азота.
После возвращения реакционной смеси к температуре окружающей среды образовавшийся осадок кремового цвета фильтруют и промывают в CH3OH. Сырой продукт используют без дополнительной очистки. Он может быть кристаллизован на CH2Cl2/гексан.
Выход 70%
Хроматография в тонком слое (ХТС): Rf 0,5 CH2Cl2/CH3OH, 95/5.
MC: 396 (M+), 381 (M+ CH3), 365 (M+ - 2CH3), 353 (M+ CH3 CO), 338 (M+ 2CH3 CO), 198 (M+/2).
Б 1,1'-ди-(N-оксид)-6,6'-диметил-4,4'-ди(n-метоксифенил)-2,2'- бипиридин (соединение 13).
К раствору полученного соединения (3,45 г, 8,7 ммоль) в 800 мл CHCl3 добавляют по капле при 0oC раствор м-хлорпербензойной кислоты (6 г, 34,8 ммоль) в 360 мл CHCl3.
Оставляют на ночь при перемешивании при температуре окружающей среды. Смесь затем промывают с насыщенным раствором NaHCO3 до щелочного рН. Органическую фазу отделяют и концентрируют. Добавка гексана вызывает осаждение соединения.
Осадок фильтруют, затем вновь растворяют в смеси CH2Cl2/CH3OH (90/10) и промывают 2 н. раствором щелочи натрия. Органическую фазу, содержащую целевое соединение, отделяют, растворитель выпаривают.
В то же время фильтрат, поступающий с осаждения, также промывают 2 н. раствором щелочи натрия, затем концентрируют и подвергают хроматографии на колонке оксида алюминия с CH2Cl2 в качестве элюента.
Выход: 80% Т.пл. > 250oC.
ХТC: Rf 0,5 (оксид алюминия, CH2Cl2/CH3OH, 95/5)
MC: 429 (MH+), 411 (M+ H2O).
В 6,6'-диацетоксиметил-4,4'-ди(n-метоксифенил)-2,2'-бипиридин (соединение 14).
Суспензию полученного соединения (1,21 г, 2,82 ммоль) в 18 мл уксусного ангидрида нагревают с обратным холодильником 1 ч 30 мин. Полученный раствор концентрируют. Добавляют 5 мл H2O и 20 мл CH2Cl2 в пастообразный остаток и подщелачивают среду водным насыщенным раствором NaHCO3.
Органическую фазу отделяют, водную фазу экстрагируют дважды с 30 мл CH2Cl2. Образующуюся органическую фазу сушат на Na2SO4, а растворитель выпаривают. Сырой продукт подвергают хроматографии на колонке с оксидом алюминия с CH2Cl2 в качестве элюента.
Выход: 90% Т.пл. 140 141oC
ТХС: Rf 0,9 (оксид алюминия, CH2Cl2/CH3OH, 95/5)
MC: 513 (MH+), 469 (M+ C(O)CH3), 453 (M+ - CH3COOH), 256 (M+/2)
Г 6,6'-дибромметил-4,4'-ди(n-метоксифенил)-2,2'-бипиридин (соединение 9a: R2 CH3)
6,6'-дибромметил-(n-4-метоксифенил, n-4'-гидроксифенил),
2,2'-бипиридин (соединение 9б: один из радикалов R2 H, другой - CH3).
Раствор полученного соединения 14 (0,31 г, 0,60 ммоль) в 5 мл HBr/AcOH (33% ) нагревают с обратным холодильником 12 13 ч. Добавляют 20 мл H2O и 60 мл CHCl3 в раствор при температуре окружающей среды. Промывают насыщенным раствором NaHCO3 до нейтрализации. Органическую фазу отделяют, а водную фазу,а водную фазу экстрагируют дважды с 20 мл CH2Cl2.
Растворитель выпаривают из получаемой органической фазы, а остаток подвергается хроматографии на колонке с оксидом глинозема с помощью CH2Cl2, затем CH2Cl2/CH3OH (95/5) в качестве элюанта.
Соединение 9a: R2 CH3; выход: 16%
Разложение: 210 215oC.
XTC: Rf > 0,9 (оксид алюминия, CH2Cl2/CH3OH, 95/5)
MC: 556, 555, 553 (MH+), 556, 554, 552 (M+), 475, 473 (M+ Br), 394 (M+ 2Br).
Соединение 9б: один из радикалов R2 H; выход 35%
XTC: Rf 0,4 (оксид алюминия, CH2Cl2/CH3OH, 95/5).
MC: 542, 540, 538 (M+), 461, 459 (M+ Br), 380 (M+ 2Br).
D Криптат натрия [(22)(n-OCH3-n-OH дифенилбипиридин)] (соединение 10).
Смесь макроцикла (22) (0,262 г, 1 ммоль) и Na2CO3 (1,05 г, 10 ммоль) в 600 мл безводного CH3CN нагревают с обратным холодильником 30 мин в атмосфере азота.
К ней добавляют суспензию соединения 9б (0,54 г, 1 ммоль) в 450 мл безводного CH3CH. Смесь нагревают 20 ч с обратным холодильником в атмосфере азота.
Получаемый раствор фильтруют при нагревании, а растворитель выпаривают. Сырой продукт подвергают хроматографии на оксиде алюминия с помощью CH2Cl2/CH3OH (95/5) в качестве элюанта.
Выход 60 65%
XTC: Rf 0,6 (оксид алюминия, CH2Cl2/CH3OH, 90/10)
MC: 663 (M+), 640 (+ Na), 625 (M+ Na - CH3), 609 (M+ Na OCH3), 595 (M+ Na OCH3 OH).
E криптат натрия [(22) (n OCH3 n OCH3CN дифенилбипиридин)]
(Соединение IIa): Z CN; Y CH2; R CH3.
К раствору криптата натрия соединения 10 (0,042 г, 0,066 ммоль) в минимальном объеме CH3CN добавляют избыток NaH (в порошке) в атмосфере азота. Нагревают с обратным холодильником в атмосфере азота в течение 1 ч. Раствор доводят до температуры окружающей среды перед добавлением бромацетонитрила (1,2 эквивалента). Смесь перемешивают при температуре окружающей среды в атмосфере азота всю ночь.
Добавляют 20 мл H2O и 10 мл CH2Cl2. Нейтрализуют среду насыщенным раствором NaHCO3. Органическую фазу отделяют, а водную фазу экстрагируют дважды с 20 мл CH2Cl2.
Получаемую органическую фазу сушат на Na2SO4, затем растворители выпаривают. Сырой продукт подвергается хроматографии на колонке оксида алюминия с помощью CH2Cl2/CH3OH (96/4) в качестве элюанта.
Выход 75%
XTC Rf 0,5 (сине-фиолетовое пятно), (оксид алюминия, CH2Cl2/CH3OH, 92,5/7,5)
MC: 702 (M+), 679 (M+ Na), 663 (M+ Na H - CH3), 654 (MH+ Na CH), 640 (MH+ Na CH2CN).
Ж криптат натрия [(22) (n OCH3n - OCH2CH2NH2 дифенилбипиридин)]
(Соединение IIb: Z NH2; Y CH2 CH2; R CH3).
К суспензии соединения IIa (0,078 г, 0,1 ммоль) в 8 мл безводного ТГФ добавляют 2 мл B2H6 (IM в ТГФ) и 5 мл дополнительного ТГФ. Перемешивают при температуре окружающей среды в течение ночи. Добавляют 10 мл CH2OH и перемешивают 20 30 мин. Растворители выпаривают. Добавляют к остатку 20 мл смеси H2O/HCl концентрированной (1/1).
Наблюдают осадок желтого цвета и выделение газа. Постепенно происходит растворение. Выпаривают растворители и обрабатывают полученный остаток водным раствором NaOH (6 N). Амин IIб извлекают с помощью 25 мл CH2Cl2. Количественный выход. Образование соединения выявляется с помощью 1H-ЯМР.
З реакция комплексообразования: обмен натрия на ион Zn3+ (Eu, Tb).
Растворяют ZnCl3 х H2O (0,1 ммоль) в 25 мл CH3OН и добавляют туда полученный предварительно раствор криптата натрия (0,06 ммоль) в 4 8 мл CHCl3 (минимальный объем). Нагревают смесь с обратным холодильником в атмосфере азота (от 6 ч до 4 дней в зависимости от рассматриваемого криптата натрия). Следят за исчезновением криптата натрия с помощью хроматографии на колонке (оксид алюминия, CH2Cl2/CH3OH, 90/10).
После окончания реакции фильтруют реакционную смесь в случае необходимости и выпаривают растворители. Вновь растворяют остаток в 15 20 мл CH3OH и добавляют эфир до устойчивого помутнения (5 мл до 25 30 мл).
Образовавшийся криптат редкоземельного элемента кристаллизуют и осаждают очень быстро или после нескольких часов в зависимости от типа криптата. Образование криптата выявляется с помощью 1Н-ЯМР и ультрафиолетовой спектроскопии видимой области.
В соответствии с этим рабочим способом получали соответственно криптат европия и криптат тербия формулы II, которые имеют следующие спектроскопические характеристики.
Криптат европия: ультрафиолетовое излучения видимая часть в CH3OH, 280 нм максимум; 292 нм плечо; 320 нм максимум.
Криптат тербия: ультрафиолетовое излучение видимая часть в H2O 282 нм максимум; 310 нм плечо.
П р и м е р 2. Криптат редкоземельного элемента [бипиридин, бипиридин (n- OCH3 n OCH2CH2NH2 дифенилбипиридин)]
R CH3; Y CH2 CH2 -; Z NH2; R1
Figure 00000026
является макроциклом биспиридина (способ B).
А криптат натрия [бипиридин.бипиридин(n-OCH>3n-OН дифенилбипиридин)] (соединение 10).
Смесь макроцикла бис-бипиридина (0,48 г, 1,21 ммоль) и Na2CO3 (1,16 г, 11 ммоль) в 480 мл безводного CH3CN нагревают с обратным холодильником 30 мин в атмосфере азота. В нее добавляют суспензию 6,6'-диброметил-(n-4-метоксифенил,n-4'-гидроксифенил)-2,2'- бипиридина, приготовленную, как показано выше (см.пример 1, пункт Г) (0,65 г, 1,20 ммоль) в 340 мл CH3CN.
Полученный раствор нагревают 24 ч с обратным холодильником в атмосфере азота. После возвращения к температуре окружающей среды реакционную смесь фильтруют, а растворитель выпаривают. Сырой продукт затем подвергают хроматографии на колонке оксида алюминия с CH2Cl2/CH3OH (98/2) в качестве элюанта.
Выход 45%
XTC. Rf 0,4 (оксид алюминия, CH2Cl2/CH3OH, 90/10)
фиолетовое пятно (254 нм), зеленое (366 нм)
MC: a) IC(NH3): 795 (M+), 773 (MH+-Na)
b) FAB (тиоглицерин): 875 (MBr+), 795 (M+).
Получаемый криптат натрия был переобразован в криптат тербия по способу, описанному в примере 13. Этот криптат имеет следующие спектроскопические характеристики:
Ультрафиолетовое излучение видимой части в H2O:
244 нм (максимум); 303 нм (максимум)
Ультрафиолетовое излучение видимой части в CH3OH:
244 нм (максимум); 301 нм (максимум); 318 нм (закраина).
Б Криптат натрия [бипиридин•бипиридин((n-OCH3-n-OCH2CNдифенилбипирид- ин)]
К раствору криптата натрия 10 (0,21 г, 0,24 ммоль) в 12 мл CH2Cl2 и 12 мл CH3OH добавляют раствор NaOH в CH3OH (1,5 эквивалента в 2 мл). Смесь нагревают 1 ч 30 мин в атмосфере азота с обратным холодильником.
После возвращения к температуре окружающей среды растворитель выпаривают; образующуюся в ходе реакции воду удаляют с помощью азоатропной дистилляции с толуолом.
Полученный таким образом продукт сушат с помощью лопастного насоса всю ночь. Полученное соединение ярко-оранжевого цвета растворяют в 35 мл тетрагидрофурана (раствор мутный). С добавлением бромацетонитрила (30 мкл, 1,8 эквивалента) раствор становится прозрачным.
Оставляют на всю ночь при температуре окружающей среды с перемешиванием в атмосфере азота. Добавляют 20 мл H2O и около 10 мл CH2Cl2. Нейтрализуют среду насыщенным раствором NaHCO3. Органическую фазу отделяют, а водную фазу экстрагируют за два раза с 20 мл CH2Cl2.
Получаемую органическую фазу сушат на Na2SO4, затем растворители выпаривают. Сырой продукт подвергают хроматографии на колонке с оксидом алюминия, используя CH2Cl2/CH3OH (95/5) в качестве элюанта.
Выход 92%
MC: FAB 834 (M+).
Получаемый криптат натрия был преобразован в соответствующий криптат тербия по способу, описанному в примере 1. Этот криптат имеет следующие спектроскопические характеристики:
Ультрафиолетовое излучение видимой части в CH3OH: 300 нм (максимум); 314 нм (плечо).
В Криптат редкоземельного элемента [бипиридин.бипиридин. (n-OCH3-n-OCH2CH2 NH2 дифенилбипиридин)]
Действуя по способу, описанному в пункте Ж примера 1, получают криптат редкоземельного элемента нижеуказанного соединения.
П р и м е р 3. Получение криптата европия [(бисбипиридин)бипиридиндиамидоэтиленамин)] (Способ А).
Соединение формулы I: Z NH2; Y -CH2-CH2-;
Figure 00000027
Макроцикл бипиридина, а R' водород.
А получение криптата натрия [(бис-бипиридин)бипиридин диэфир]
Соединение формулы 1, в которой R1 CH3.
Смесь 0,300 г (7,61•10-4 моль) макроцикла бисбипиридина и 1,10 г (10,4•10-3 моль) Na2CO3 нагревают с обратным холодильником в течение 30 мин в 450 мл CH3CN. Раствор 0,350 г (7,64•10-4 моль) 6,6'-диброметил-6,6'(n-4,4'-диметоксикарбонил)-2,2'-бипиридина (соединение I; X Br) в 375 мл CH3CN добавляют затем при активном перемешивании в течение 60 мин.
Реакционную смесь перемешивают в течение 18 ч с обратным холодильником, затем охлаждают до температуры окружающей среды и фильтруют. Растворитель удаляют в вакууме во вращающемся выпаренном аппарате.
Получаемую твердую фракцию растворяют в CHCl3 и подвергают хроматографии на колонке оксида алюминия (с небольшим количеством оксида кремния в верхней части) посредством элюирования с CHCl3/CH3OH (98/2). Растворители удаляют в вакууме и получают целевой комплекс 0,230 г (38%). Он имеет следующие физико-химические характеристики:
плавление > 240oC
1H-ЯМР (CD3OD): 3,89 (C,8H,CH2-бипиридин), 3,98 (С,4Н, CH2-бипиридинэфир); 4,03 (с, 6H,COOCH3); 7,42 (д, J 7,4 Гц, 4Н-бипиридин); 7,92 (m, J 7,4 Гц, 4Н-бипиридин); 7,96 (д, J 1,2 Гц, 2Н-бипиридинэфир); 8,10 (д, J 7,4 Гц, 4Н-бипиридин); 8,60 (д, J 1,2 Гц, 2Н-бипиридинэфир).
13C-ЯМР (CDCl3): 52,9; 59,5; 119,7; 120,4; 123,4; 124,1; 138,2; 139,7; 155,2; 158,3; 160,4; 164,9;
Вычислено,C55,49; H 4,89;N 12,94.
C40H34N8O4NaBr•4H2O (865,71);
Найдено, C 55,44; H 4,33; N 13,10.
Б Аминолиз указанного криптата.
Полученный криптат (0,100 г; 1,26•10-4 моль) подвергают аминолизу, добавляя его по частям в 4 мл этилендиамина, перегнанного с KOH, предварительно нагретого до 90oC. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч, затем охлаждают до температуры окружающей среды.
Избыток этилендиамина удаляют затем в вакууме и получают масло. Это последнее поглощают 2 мл смеси CHCl3/CH3OH (2/1), которую в свою очередь удаляют в вакууме. Очистку повторяют 5 раз и при этом получают ожидаемый комплекс с выходом 89%
В. Преобразование указанного криптата в соответствующий криптат европия.
Действуя по способу, описанному на стадии 3 примера 1, получают криптат европия [(бис-бипиридин)(бипиридин-ди(амидоэтиленамина))] который имеет следующие спектроскопические характеристики.
Ультрафиолетовое излучение видимой части в H2O 240 нм, 303 нм (максимум).
П р и м е р 4. Получение криптата европия [(бис-бипиридин)-(бипиридин-ди)амидоэтиленамина))] (Способ А).
Соединение формулы 1: Z NH2; Y -CH2-CH2-; R' H
Figure 00000028
является макроциклом бипиридина.
А Получение криптата европия [(бис-бипиридин)-бипиридиндиэфир)]
Криптат натрия, получаемый в пункте А предыдущего примера (0,10 ммоль), растворяют в 8 мл CHCl3 и добавляют к раствору Eu Cl3, 6H2O (0,15 ммоль) в 40 мл CH3OH. Раствор перемешивают с обратным холодильником в атмосфере азота до исчезновения криптата натрия (хроматография на колонке оксид алюминия, элюант; CH2Cl2, CH3OH (90/10)).
Продолжительность реакции порядка 48 ч. Реакционную смесь охлаждают до температуры окружающей среды и фильтруют, если имеется помутнение. Растворители удаляют во вращающемся выпарном аппарате, а остаток повторно растворяют в 20 25 мл CH3OH.
Этиловый эфир добавляют по каплям до устойчивого очень слабого помутнения. Криптат европия кристаллизуют таким образом при температуре окружающей среды. Удаляют растворители пипеткой, а криптат высушивают.
Выход: около 40% (первая кристаллизация). Фильтрат концентрируется сухим способом, а операция повторяется.
Получаемый продукт имеет следующие физико-химические характеристики:
1Н-ЯМР (D2O эталон-трет Бу OH): 10,51 (2H,c,CH (бипиридинэфир), 8,66 (2Н, c, СН-бипиридинидиэфир), 8,06 (4H,т,CH-бипиридин), 7,08 (4Н,д,CH-бипиридин), 6,74 (4Н,д,СН-бипиридин), 4,66 (6Н,с,OCH3), 0,9 (8H,c, CH2-бипиридин), 0,78 (4Н,с,CH2-бипиридиндиэфир).
Вычислено,C44,13; H 3,98;N 10,29.
C40H34N8O4EuCl3NaCl, 9/2 H2O (1088,58)
Найдено, C 43,93; H 3,79; N 9,88.
C 44,06; H 3,70; N 10,03.
Б Аминолиз криптата европия.
Полученный криптат европия (40 мг) добавляют частями к 40 мл этилендиамина, предварительно отогнанного с KOH. Прозрачный раствор перемешивают 3 ч в атмосфере азота при температуре окружающей среды. Этилендиамин удаляют в вакууме во вращающемся выпарном аппарате. Остаток поглощают несколькими миллилитрами CH2Cl2/MeOH (2/1), а растворители удаляют в вакууме. Операцию повторяют 5 раз для получения твердого соединения.
Полученный криптат просушивают 24 ч в вакууме лопастного насоса.
Т.плавления 168 170oC.
Этот криптат европия имеет такие же характеристики, что и криптат европия, полученный в предыдущем примере. Эти два примера показывают, что возможно проводить комплексование криптата щелочного иона ионом редкоземельного элемента до или после замещения.
Пример 5. Получение криптата европия или тербия [(22)бипиридин-ди-(амидоэтиленамина)]
Соединение формулы I
Figure 00000029
-макроцикл (22);
Z NH2; Y -CH2-CH2.
А Получение криптата натрия [(22)бипиридиндиэфир]
Смесь 0,114 г (4,37•10-4 моль) макроцикла (22) и 0,460 г (4,34•10-3 моля) Na2CO3 нагревают 30 мин с обратным холодильником в 130 мл CH3CN. Раствор 0,200 г (4,37•10-4 моль) соединения I в 220 мл CH3CN добавляют затем при сильном перемешивании в течение 60 мин. Реакционную смесь затем перемешивают в течение 15 ч с обратным холодильником, затем охлаждают до температуры окружающей среды и фильтруют. Растворитель удаляют в вакууме во вращающемся выпарном аппарате.
Полученную твердую фракцию растворяют в CH2Cl2 и очищают с помощью хроматографии на колонке с оксидом алюминия (с небольшим количеством оксида кремнезема в верхней части). Примесь вначале элюируют с помощью CH2Cl2.
Образовавшийся макроцикл затем элюируют CH2Cl2/CH3OH (98/2). Растворители удаляют в вакууме и получают 0,135 г (61%) макробицикла.
Б. Получение криптата европия или тербия [(22)бипиридиндиэфир]
Действуя по способу, описанному в примере 1а, получают соответственно криптаты европия и тербия [(22)бипиридиндиэфир] которые имеют следующие спектроскопические характеристики:
криптат европия: ультрафиолетовое излучение видимой части CH3OH, 242 нм и 342 нм (максимум),
криптат тербия: ультрафиолетовое излучение видимой части в CH3OH 242 нм и 325 нм (максимум).
В. Получение криптата европия [(22) бипиридин(амидоэтиленамин)]
Получаемый криптат европия (0,100 г, 1,43•10-4 моль) добавляют по частям к 5 мл этилендиамина, перегнанного с KOH, предварительно нагретого до 90oC. Реакционную смесь перемешивают 1 ч, затем охлаждают при температуре окружающей среды. Избыток этилендиамина удаляют в вакууме. Получают масло.
Это последнее поглощают 2 мл CHCl3, который в свою очередь удаляют в вакууме. Очистку повторяют 3 раза и получают 93 мг (90%) криптата европия. Этот криптат имеет следующие спектроскопические характеристики.
Ультрафиолетовое излучение видимой части в H2O.
240 и 315 нм (максимум).
Таким же образом можно подвергнуть аминолизу криптат тербия, получаемый в пункте Б.
П р и м е р 6. Получение криптата натрия [(бипиридиндикарбометокси)3]
(Способ Б).
Формула 7 R' R" OCH3;
Figure 00000030
является макроциклом биспиридина.
А.Синтез 4,4'-дикарбометокси-6,6'-диазидометрил-2,2'-бипиридина.
Смесь 4,4'-дикарбометокси-6,6'-дибромметил-2,2'-бипиридина (0,50 г, 1,10•10-3 моль) и NaN3 (1,0 г, 15,4•10-3 моль) нагревают с обратным холодильником в течение 36 ч в 15 мл тетрагидрофурана.
Реакционную смесь охлаждают при температуре окружающей среды, фильтруют на целите и концентрируют досуха. Остаток растворяют в CHCl3 и подвергают хроматографии на колонке с оксидом кремния посредством элюации с CHCl3.
Выпаривание растворителя приводит к получению 0,40 г (95%) целевого соединения, которое имеет следующие физико-химические характеристики.
Т.пл. 168 170oC
1Н-ЯМР (CDCl3): 4,02 (с,6Н,COOCH3); 4,63 (c,4H,CH2-H3); 7,94 (д, J 1,3 Гц, 2Н); 8,96 (д, J 1,3 Гц, 2Н);
13C-ЯМР (CDCl3): 52,7; 55,1; 120,0; 121,5; 139,7; 156,0; 156,8; 165,3;
ИК (KBr): 1715 см-1 (эфир), 2090 см-1 (азид).
M.C. 383 (MH+).
Вычислено,C 50,27,H 33,69,N 29,31.
C6H14N8O4 (382,34).
Найдено, C 50,37, H 3,51, N 27,69.
Б.Синтез 4,4'-дикарбометокси-6,6'-диаминометил-2,2'-бипиридина.
(Соединение 5).
Смесь соединения, полученного на стадии А (0,126 г, 3,30•10-4 моль) и 12,6 мг 10% Pd/C в 38 мл CH2Cl2/CH3OH (2/1) перемешивают при температуре окружающей среды в атмосфере водорода в течение 12 ч.
Реакционную смесь фильтруют на целите и после выпаривания растворителей получают 0,100 г (92%) целевого соединения, которое используется без очистки на следующей стадии.
В.Синтез криптата натрия (бипиридин-дикарбометокси)3.
(Соединение 7).
Смесь соединения 6 (R' OCH3; X Br) (0,280 г, 6,11•10-4 моль) и Na2CO3 (0,65 г, 6,13•10-3 моль) нагревают с обратным холодильником в 500 мл CH3CN.
Затем добавляют 0,100 г (3,03•10-4 моль) соединения 5, а реакционную смесь перемешивают с обратным холодильником в течение 48 ч. Реакционную смесь охлаждают до температуры окружающей среды и фильтруют. Растворитель удаляют в вакууме.
Остаток поглощают CHCl3 и подвергают хроматографии на колонке с оксидом алюминия (с небольшим количеством оксида кремния в верхней части), осуществляя элюацию с CHCl3/MeOH (98/2). Выпаривание растворителей приводит к 0,132 г (40%) макробицикла 7 (R" R' OCH3).
Т.пл. > 250oC.
1Н-ЯМР (CDCl3): 4,02 (c, 18H, COOCH3); 4,08 (c, 12H, CH2); 7,96 (д, J 1,2 Гц, 6Н); 8,49 (д, J 1,2 Гц, 6Н).
13C-ЯМР (CDCl3): 53,2; 59,2; 120,0; 123,8; 139,9; 155,6; 159,9; 164,8;
Вычислено,C 53,59;H 4,48;N 10,38.
C48H42N8O12, NaBr, 3H2O (1079,84).
Найдено, C 53,40; H 4,40; N 9,75.
Полученный криптат может подвергаться аминолизу с этилендиамином по описанному в предыдущих примерах способу. Обычно получают смесь моно-, ди- до гексазамещенных криптатов, замещенных группой CO-NH-CH2-NH2; Эти соединения могут разделяться обычными средствами.
Пример 7. Получение криптата европия [бис(бипиридиндикарбоксибутокси), бипиридин-диамидоэтиленамина]
Формула I Y -CH2-CH2-; Z NH2;
Figure 00000031
является макроциклом бис-бипиридина, R' трет.Бу.
А. Получение криптата натрия [бис(бипиридиндикарбоксибутокси), бипиридиндикарбоксиметокси]
Действуя по способу, описанному в примере 6, используя соединение 5, получаемое на стадии Б этого примера, и соединение 6 (R' COO (трет.-C4H9); X Br), получают криптат натрия формулы 7 (R' COO (трет.-C4H9); R" COOCH3), имеющей следующие физико-химические характеристики.
Т.пл. > 220oC.
1Н-ЯМР (CDCl3): 1,60 (с, 36Н, COOБу+); 3,99; 4,02; 4,06, (3c, 18H, CH2бпи ди COO Me + CH2бпи ди COO Бу+, + - COOCH3); 7,81 (c, 4H, бпи ди COO Бу+); 7,95 (с, 2Н, бпи ди COO Me; 8,36 (c, 4H, бпи ди COO Бу+); 8,45 (c, 2H, бпи ди COO Me).
13С-ЯМР (CDCl3): 28,0; 53,1; 59,1; 83,4; 119,8; 119,9; 123,4; 123,7; 139,8; 141,7;
Вычислено,C 57,73;H 5,81;N 8,98.
C60H66N8O12. NaBr, 3H2O (1248,18).
Найдено, C 57,99; H 5,31; N 9,03.
Этот криптат натрия затем преобразуют в соответствующий криптата европия по описанному способу.
Затем его подвергают аминолизу с этилендиамином.
Возможно вначале подвергнуть аминолизу соединение 7, а затем преобразовать полученный криптат натрия в соответствующий криптат европия по описанным способам.
Применение соединений в качестве флуоресцентных маркеров.
Как указано выше, соединения по изобретению подходят в качестве реагентов для маркировки биологических веществ, которая осуществляется путем сочетания соединения по изобретению с помощью ковалентной связи с биологическим веществом, подлежащим анализу и обнаружению.
Это сочетание может быть выполнено классическими методами сочетания, используемыми в этой области, такими, как например, методом с S MCC/S PDP или с карбодиимидом (см.труд Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Practise and Theory on Enzym and Immunoassays P.Tijssen, Elsivier 1 ed.1985).
Криптаты по изобретению подходят в качестве флуоресцентных маркеров во всех типах определения или обнаружения биологических веществ и, в частности, в методах количественного анализа по конкуренции или избытку, в однородной или неоднородной фазе, хорошо известных специалисту и описанных, в частности, Ландоном Аип. Clin.Bioche. 1981, 18, p.253 С уани Clin.Chem. 25, 353, 1979.
Они могут также использоваться в однородном способе обнаружения и/или определения посредством люминесценции, описанном в международной заявке WO 87/00927.
Биологические вещества, подлежащие обнаружению или определению, могут быть, например, антителами, антигенами, токсинами, энзимами, протеинами, гормонами, рецепторами гормонов, стероидами, випином, биотином, стрептадизином, микроорганизмами, гаптенами, нуклеиновыми кислотами, фрагментами дезоксирибонуклеиновой кислоты и рибонуклеиновой кислоты, липидами, углеводами и т.д. Примеры таких веществ приведены в описании заявки на патент ЕР 17098, включенном в настоящее описание в качестве ссылки.
Использование соединений по изобретению в качестве флуоресцентных маркеров показано с помощью пяти приводимых ниже испытаний:
В испытаниях А, Г и Д использовали реактивы СПДП и сульфо-СМЦК, которые являются соответственно: "N-сукцинимидил-3-(2-пиридинтио)пропианат" и "сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циколгексан-1 -карбоксилат".
Испытание А: образование сопряженной пары антитело-криптат посредством СМЦК/СПДП.
1.Активация криптата европия, полученного по примеру 3.
К 500 мкл раствора этого криптата с концентрацией 1,5 мг/мл в фосфатном буфере (20 ммоль, рН 7) добавляют 50 мкл сульфо-СМЦК 13,1 мг/мл в том же буфере.
Затем инкубируют в течение 30 мин при температуре окружающей среды и перемешивают насосом в течение 5 мин. Центрифугируют раствор для удаления осадка. Очищают пропусканием на ионообменной колонке Pharmacia Моно Q с образованием градиента между:
Буфер А: фосфатный 20 ммоль рН 7 + 10% ДМФ.
Буфер Б: фосфатный 20 ммоль рН 7 + 10% ДМФ + 1 молярный NaCl.
Криптат обнаруживается измерением его абсорбции при 307 нм ε + 25000 М-1 см-1 при 307 нм).
Активированный криптат выходит в мертвый объем
Избыток сульфо-СМЦК элюируется в градиенте.
2.Активация антитела.
Используемое моноклональное антитело E1 является антипролактиновым антителом, содержащимся в наборах для иммунорентгенометрического анализа пролактина, изготовляемых компанией Орис Индюстри и известных под названием "EZSA PROZ".
К 1,2 мл раствора антитела Е1 с концентрацией 14,8 мг/мл в фосфатном буфере (50 ммоль, 150 ммоль NaCl, рН 7,1) добавляют 30 мкм раствора СПДП 30 ммоль в абсолютном этаноле.
Выдерживают при температуре окружающей среды в течение 30 мин с перемешиванием.
Раствор пропускается на колонке из геля G25 Pharmacia, уравновешенной тем же фосфатным буфером e 210000 М-1 см-1 при 280 нм).
Извлекают элюированную фракцию из мертвого объема.
Добавляют 60 мкл раствора, содержащего 400 ммоль ДТТ (дитиотреитол) в фосфатном буфере.
Инкубируют 15 мин при температуре окружающей среды с перемешиванием и извлекают фракцию, выходящую из мертвого объема после пропускания на колонке G25, уравновешенной фосфатным буфером.
Сочетание активированного антитела и активированного криптата.
К 60 мкл активированного антитела (2,6 мг/мл) в фосфатном буфере добавляют 50 мкл криптата (200 мкмоль/л).
Инкубируют 12 ч при температуре окружающей среды и центрифугируют. Всплывший продукт подвергается диализу с фосфатным буфером 50 ммоль, рН 7,4.
Испытание Б. Образование сопряженной пары антитело-криптат посредством карбодиимида.
Сукцинилирование антитела.
Добавляют за три раза 83 мкл раствора, содержащего 50 мг/мл янтарного ангидрида в 1/3 ДМСО, 2/3 бората 100 ммоль, рН 9 и 440 мкл антитела Е1 (9,4 мг/мл) в борате 100 ммоль рН 9, погруженного в плавящийся лед.
рН поддерживается равным 9 с помощью щелочи натрия. Реакцию проводят за 30 мин при 0oC.
Очистка.
Она осуществляет с помощью хроматографии высокого давления на колонке геля фильтрации TSK 3000SU, причем элюант является фосфатным буфером 50 ммоль рН 7,4. Расход 1 мл/мин.
Извлекают антитело после сукцинилирования в объеме 3 мл. Концентрируют до получения 370 мкл.
Сочетание сукцинилированное антитело/криптат.
Раствор 1: смешивают 25,5 мг карбодиимида в 1335 мкл фосфатного буфера (50 ммоль рН 7,4).
Раствор 2: 50 мг/мл сульфо-N-гидроксисукцинимида в таком же буфере (14,7 мл в 222,7 мкл).
Раствор 3: 0,95 мг/мл криптата по примеру 3 в таком же буфере.
Проводят реакцию 1 ч при температуре окружающей среды:
175 мкл раствора сукцинилированного антитела;
480 мкл раствора 3;
72,5 мкл раствора 1;
10 мкл раствора 2.
После полного диализа с фосфатным буфером (50 ммоль рН 7,4) продукт концентрируется на конусе Амикона. Получают сопряженный продукт с концентрацией 0,86 мг/мл.
Продукт замораживается в буфере с 1 мг/мл белковой человеческой сыворотки (ВЧС).
Результаты. Анализ пролактина.
Применяют реактивы набора для анализа пролактина EZSA-PROL.
В каждую колбу, содержащую твердую фазу Эльса, добавляют 100 мкл стандартного образца; 300 мкл сопряженного продукта E1-криптат, полученного в испытания А или Б в фосфатном буфере (50 ммоль рН 7,4) и ВЧС 1 мг/мл. Выдерживают в течение 3 ч при 37oC. Промывают твердую фазу 2 раза 3 мл H2O. Добавляют 400 мкл буфера, содержащего 5 ммоль в додецилсульфате натрия (СДН). Отбирают 300 мкл этого раствора для измерения флуоресценции на приборе ARCUS ZKB.
Полученные результаты нанесены на фиг.1. На фиг.1 нанесли по ординате интенсивность флуоресценции, а по абсциссе количество пролактина в мкед./мл.
Результаты показывают, что криптаты по изобретению подходят в качестве флуоресцентных маркеров при иммунологическом анализе.
В приведенном испытании В показывают использование криптатов по изобретению в аналогичном способе по международной заявке WO 87/00927.
Испытание В. Анализ пролактина.
1.Количественный анализ пролактина проводят аналогичным методом.
А. Фиксация кода на антителе.
Маркируют моноклональное антитело антипролактина G2 реактивом Вуда [описанным в Anal.Biochem. 69, 339 349 (1975)] 2,93 мг реактива Вуда растворяют в 400 мкл 0,5 н. щелочи натрия. Добавляют 400 мкл карбонатного буфера (200 ммоль, рН 9,3). Добавляют к этому раствору 200 мкл антитела G2 (10 мг/мл) в карбонатном буфере 100 ммоль, рН 9,3 и выдерживают в течение 17 ч при 30oC. Очищают на колонке Pharmacia PD10 с карбонатным буфером 100 ммоль, рН 9,3.
Элюированные из мертвого объема фракции собирают; сопряженный продукт характеризуется отношением оптической плотности при 320 и 280 нм
Figure 00000032
.
Его концентрация оценивается, допуская, что 90% антител извлекаются. Сопряженное соединение аликвотируется и сохраняется при 20oC.
Б. Количественный анализ пролактина (кривая А).
Используют стандартные растворы пролактина с концентрацией 0, 15, 30, 60 и 150 нг/мл. Анализ осуществляется в образцах из 12 каналов EFZAB, N каталога 9602107.
Добавляют последовательно: 100 мкл стандартного раствора; 100 мкл антитела G2 Вуд с концентрацией 5 мкг/мл; 100 мкл сопряженного соединения Е1 из испытания А с концентрацией 0,375 мкг/мл; инкубируют 15 мин при температуре окружающей среды; снимают показания прибора ARCUS; вычерчивают стандартную кривую, нанося значение ΔF в зависимости от значения стандартов (фиг.2)
Figure 00000033

Флуоресценция стандарта О.
1. Анализ пролактина посредством рентгеноиммунометрии (кривая В).
Используют набор ELSA-PRL (компания Орис). В колбу ELSA добавляют: 300 мкл радиоактивного индикатора, 100 мкл стандартного раствора, после перемешивания инкубируют 3 ч при 37oC, 2 колбы промывают водой за 2 раза, 2 колбы подсчитывают на счетчике, наносят значение B/T для каждого стандартного раствора (фиг. 2), причем B радиоактивность стандартного раствора; Т радиоактивность для 300 мкл радиоактивного индикатора.
Полученные результаты (фиг. 2) показывают, что криптаты по изобретению подходят в качестве маркеров в способе по международной заявке WO 87/00927.
С другой стороны можно отметить, что благодаря криптатам по изобретению этот однородный способ особенно удобен по сравнению с аналитическим способом, использующим радиоактивный элемент, который требует гораздо более длительного времени инкубирования, стадии промывки и операций с радиоактивными элементами.
Испытание Г. Образование сопряженного соединения ДНК-криптат с помощью СМЦК/СПДП.
1. Функционализация ДНК в ДНК-NH2,
Модифицированный нуклеотид, 5-амино(12)дУТР (продукт, продаваемый Калбиохем) вводится в ДНК методом ник-трансляции по способу Калбиохем. Аминированная ДНК затем очищается тремя последовательными промывками на фильтре "Центрикон" (продаваемый Амикон) с фосфатным буфером 10 ммоль, рН 7,4.
2.Сочетание ДНК-NH2 с СПДП.
55 мкл раствора, содержащего 9 мкг ДНК-NH2 (измеренный посредством ультрафиолетового излучения), в обратном буфере (0,1 моль, рН 9,0) добавляют к 5 мкл раствора СПДП (20 ммоль). Реакция длится 4 ч при 45oC.
Непрореагировавший СПДП удаляют тремя промывками на "Центриконе" с фосфатным буфером (50 ммоль, рН 7,0).
3.Снятие защиты ДНК-СПДП и сочетание с криптатом.
90 мкл раствора 6 мкг (оценивается по оптической плотности) ДНК-СПДП в фосфатном буфере (50 моль, рН 7,0) обрабатывают непосредственно перед сочетанием с помощью 10 мкл раствора 10 ммоль ДТТ в том же буфере.
Снятие защиты длится 20 мин при температуре окружающей среды. ДТТ ингибитор последующего сочетания удаляется тремя промывками на "Центриконе" с упомянутым фосфатным буфером. Раствор ДНК-SH концентрируют на "Центриконе" до конечного объема 90 мкл.
К 90 мкл раствора ДНК-SH добавляют 50 мкл криптата европия из примера 3, активированного СМЦК на стадии 1 испытания А (14 ммоль) фосфатном буфере (20 ммоль, рН 7,0), содержащем 10% ДМФ.
Сочетание происходит при 30oC в течение 1 ч. Сопряженное соединение ДНК-криптат очищают тремя последовательными осаждениями в этаноле. Степень сочетания оценивается измерением абсорбции при 260 нм и флуоресценции при 620 нм.
4. Зонд ДНК, связанный таким образом с криптатом, может использоваться для обнаружения и анализа последовательностей комплементарной нуклеиновой кислоты в соответствии с одной из стратегий, описанных в журнале Дж. Маттиус и др. "Аналитикал Биокемистри" 169, 1 25 (1988) под названием "Аналитические стратегии при использовании зондов ДНК".
Испытание Д. Образование ковалентного сопряженного соединения стрептавидин-криптат.
1.Сочетание стрептавидин-СПДП.
20 мкл раствора 20 ммоль СПДП в карбонатном буфере (0,5 ммоль, рН 9,5) добавляются к 180 мкл раствора, содержащего 1 мг стрептавидина в том же буфере.
Реакция длится 1 ч при температуре окружающей среды. Избыток СПДП удаляется за четыре последовательных промывки на "Центриконе" с фосфатным буфером (0,1 моль, рН 7,4).
2.Снятие защиты со стрептавидин-СПДП и сочетание с криптатом.
К 360 мкл раствора стрептавидина-СПДП (около 1 мг) в фосфате (0,1 моль, рН 7,4) добавляют 40 мкл ДТТ 100 ммоль в том же буфере.
Реакция длится 15 мин при температуре окружающей среды с перемешиванием, затем реакционную смесь промывают три раза на "Центриконе" с предыдущим буфером.
Стрептавидин-SH (около 1 мг) в 625 мкл фосфатного буфера 0,1 моль, рН 7,4, сочетают с 43 мкг криптата европия из примера 3, активированного СМЦК согласно стадии 1 испытания А в 175 мкл фосфатного буфера (20 ммоль, рН 7) с 10% ДМФ. Сочетание длится 2 ч 30 мин при температуре окружающей среды. Непрореагировавший криптат-СМЦК удаляют за четыре промывки на "Центриконе" с фосфатным буфером (0,1 моль, рН 7,4).
Степень сочетания оценивается измерением абсорбции при 280 нм и флуоресценции при 620 нм.
Сопряженный продукт очищают гель-фильтрацией на колонке TSRG3000SW с помощью буфера NaCl 1 М, ТФА 0,1% Замер осуществляют по показателю абсорбции при 280 нм и флуоресценции при 620 нм.
3. Соединение стрептавидин-криптат может использоваться в качестве флуоресцентного маркера биотинилированных молекул (нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, антитела, антигены, гептены или другие биологические вещества), к которым они имеют большое сродство.

Claims (5)

1. Криптаты редкоземельных металлов, состоящие по меньшей мере из одной соли европия или тербия в виде комплекса с макрополициклическим соединением, соответствующим общей формуле I
Figure 00000034

или общей формуле II
Figure 00000035

в которых цикл формулы
Figure 00000036

означает один из следующих циклов:
Figure 00000037

где n 0 или 1,
Figure 00000038

(макроцикл бис-бипиридин),
где Y линейный или разветвленный алкилен C1 C4;
Z группа -NH2;
R группа метил или группа -Y-Z;
R' водород или группа -COOR", где R" алкил С1 C4, предпочтительно метил, этил или трет-бутил,
полученные ионообменом соли щелочного металла соответствующего макрополициклического соединения общей формулы I или II с солью европия или тербия при нагревании в растворе метанола, при необходимости в присутствии хлороформа, в качестве флуоресцентных маркеров биологических молекул.
2. Криптаты по п.1 формулы I, где Y -CH2-CH2-.
3. Криптаты по пп.1 и 2, где
Figure 00000039

означает бис-бипиридиновый макроцикл.
4. Криптаты по п.1 общей формулы II, где Y CH2-CH2, R - CH3.
5. Криптаты по п. 1 общей формулы I, где Y -CH2-CH2, R1 COOR", где R" имеет значение, указанное в п.1.
SU884830344A 1987-12-18 1988-12-16 Криптаты редкоземельных металлов в качестве флуоресцентных маркеров биологических молекул RU2074859C1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR8717765A FR2624862B1 (fr) 1987-12-18 1987-12-18 Cryptates de terres rares, procedes d'obtention, intermediaires de synthese et application a titre de marqueurs fluorescents
FR8717765 1987-12-18
PCT/FR1988/000620 WO1989005813A1 (fr) 1987-12-18 1988-12-16 Cryptates de terres rares, procedes d'obtention, intermediaires de synthese et application a titre de marqueurs fluorescents

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2074859C1 true RU2074859C1 (ru) 1997-03-10

Family

ID=9358067

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU884830344A RU2074859C1 (ru) 1987-12-18 1988-12-16 Криптаты редкоземельных металлов в качестве флуоресцентных маркеров биологических молекул

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0321353B1 (ru)
JP (1) JP2866419B2 (ru)
KR (1) KR0133732B1 (ru)
AT (1) ATE76410T1 (ru)
AU (1) AU2908889A (ru)
CA (1) CA1334026C (ru)
DE (1) DE3871353D1 (ru)
ES (1) ES2043874T3 (ru)
FI (1) FI92698C (ru)
FR (1) FR2624862B1 (ru)
RU (1) RU2074859C1 (ru)
WO (1) WO1989005813A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2647578C1 (ru) * 2016-12-20 2018-03-16 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) N,n’-диэтил- n,n’-ди(2-бром-4-r-фенил)диамиды 2,2’-бипиридил-6,6’-дикарбоновой кислоты и способ их получения, циклизация полученных амидов с образованием 6,6’-диэтил-9,9’-диr-дибензо[f]-1,7-нафтиридин-5,5’(6н,6’h)-дионов

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2664699B1 (fr) * 1990-07-13 1995-08-18 Cis Bio Int Procede d'amplification du signal d'emission d'un compose luminescent.
FR2664702B1 (fr) * 1990-07-13 1993-08-06 Cis Bio Int Procede de reduction d'interferences dans un dosage par fluorescence.
US5571897A (en) * 1991-12-05 1996-11-05 Wallac Oy Luminescent lanthanide chelates
FR2769315B1 (fr) * 1997-10-03 2001-06-08 Cis Bio Int Conjugues fluorescents de nucleosides ou de nucleotides, leur procede de preparation et leur utilisation
US6689574B1 (en) 1997-10-07 2004-02-10 Merck & Co., Inc. Assays for nuclear receptor agonists and antagonists using fluorescence resonance energy transfer
FR2778744B1 (fr) 1998-05-14 2000-06-23 Cis Bio Int Dosage immunologique de la chromogranine a humaine (cga) anticorps, reactifs et trousses utilisables pour ce dosage
US6488097B1 (en) 1999-01-08 2002-12-03 Pnm, Inc. Fire protection sprinkler head support
FR2791141B1 (fr) * 1999-03-15 2001-06-01 Cis Bio Int Procede de reduction de l'extinction de fluorescence due au milieu de mesure
FR2792072A1 (fr) * 1999-04-08 2000-10-13 Cis Bio Int Methode homogene de detection ou de determination d'une interaction chimique ou physicochimique
FR2809817B1 (fr) 2000-06-02 2003-08-15 Cis Bio Int Procede de detection de presence d'un liquide dans un melange
FR2810406B1 (fr) * 2000-06-15 2002-09-20 Cis Bio Int Nouveaux cryptates de terre rare peu sensibles a l'extinction de fluorescence
DE102004034517A1 (de) * 2004-07-16 2006-02-16 Covion Organic Semiconductors Gmbh Metallkomplexe
FR2878850B1 (fr) 2004-12-02 2008-10-31 Cis Bio Internat Sa Derives de l'inositol-1-phosphate
FR2890446B1 (fr) 2005-09-05 2008-04-18 Cis Bio Internat Sa Methode de detection d'interaction intracellulaire entre bio-molecules
US7845599B2 (en) 2007-03-22 2010-12-07 The Viking Corporation Mounting coupling for sprinkler support system
RU2009146017A (ru) * 2007-06-20 2011-07-27 Джи-И Хелткер Лимитед (GB) Способы мечения
FR2934684B1 (fr) 2008-07-31 2012-11-16 Cis Bio Int Methode de detection de l'internalisation de proteines membranaires.
FR2940286B1 (fr) 2008-12-19 2011-04-08 Cis Bio Int Nouveaux cryptates de terres rares comportant un motif tetraazatriphenylene
CN102639998B (zh) 2009-04-30 2014-12-03 Cis-生物国际公司 用于检测调节vft域膜蛋白二聚体的化合物的方法
FR2949156B1 (fr) 2009-08-13 2016-04-15 Cis-Bio Int Methode de determination de la liaison d'un compose donne a un recepteur membranaire
FR2977674B1 (fr) 2011-07-06 2015-08-14 Cisbio Bioassays Methode amelioree de detection et/ou de quantification d'un analyte present a la surface d'une cellule
FR2978149B1 (fr) 2011-07-18 2014-01-10 Cisbio Bioassays Nouveaux agents complexants et complexes de lanthanide correspondant, et leur utilisation comme marqueurs luminescents
FR2980271B1 (fr) 2011-09-16 2013-10-11 Cisbio Bioassays Procede de determination de la glycosylation d'un anticorps
US20150185150A1 (en) 2012-02-22 2015-07-02 Cisbio Bioassays Method for normalizing the luminescence emitted by a measuring medium
FR2988174B1 (fr) 2012-03-19 2014-04-25 Cisbio Bioassays Procede de determination de la capacite d'un anticorps a maintenir des cellules a proximite l'une de l'autre
FR3000960B1 (fr) * 2013-01-16 2015-03-06 Cisbio Bioassays Nouveaux agents complexants hydrosolubles et complexes de lanthanide correspondants
FR3004189B1 (fr) 2013-04-04 2015-09-04 Ecole Norm Superieure Lyon Complexes de lanthanide comprenant au moins deux groupes betaines, utiles comme marqueurs luminescents
FR3032797B1 (fr) 2015-02-13 2017-03-03 Cisbio Bioassays Procede de quantification d'une proteine d'interet presente dans un echantillon biologique
FR3045053B1 (fr) 2015-12-09 2018-01-05 Cisbio Bioassays Agents complexants hydrosolubles a base de triazapyridinophane et complexes de lanthanide fluorescents correspondants
AU2017210215B2 (en) 2016-01-21 2022-09-08 SeLux Diagnostics, Inc. Methods for rapid antimicrobial susceptibility testing
US9834808B2 (en) 2016-01-21 2017-12-05 SeLux Diagnostics, Inc. Methods for rapid antibiotic susceptibility testing
CN106432070A (zh) * 2016-09-20 2017-02-22 上海应用技术大学 一种6,6’‑二溴甲基‑2,2’‑联吡啶‑4,4’‑二甲酸二甲酯的制备方法
BR112018016717A2 (pt) 2016-12-16 2018-12-26 H Lundbeck As agentes, usos e métodos
AU2017382404A1 (en) 2016-12-23 2019-07-11 SeLux Diagnostics, Inc. Methods for improved rapid antimicrobial susceptibility testing
FR3067349B1 (fr) 2017-06-12 2020-12-04 Cisbio Bioassays Nouveaux agents mono et di-antennes complexants hydrosolubles et complexes de lanthanide correspondants
FR3067712B1 (fr) 2017-06-14 2019-08-02 Cisbio Bioassays Nouveaux agents complexants de type trimethoxyphenyl pyridine hydrosolubles et complexes de lanthanide correspondants
FR3069644A1 (fr) 2017-07-28 2019-02-01 Cisbio Bioassays Methode pour mesurer la modulation de l'activation d'un recepteur couple a une proteine g
MA51295A (fr) 2017-12-21 2021-05-05 H Lundbeck As Dosage, procédé et traitement d'alpha-synucléinopathies
FR3084365B1 (fr) 2018-07-27 2020-10-23 Cisbio Bioassays Anticorps a domaine unique qui se lient a la proteine g alpha
CN109456309B (zh) * 2018-11-22 2020-11-27 北京工业大学 一种多吡唑含氮杂环化合物及其制备和应用
FR3092172B1 (fr) 2019-01-30 2021-02-12 Cisbio Bioassays Méthode pour mesurer la modulation de l’activation d’un récepteur couplé à une protéine G avec des analogues du GTP
CN111848621B (zh) * 2020-06-29 2022-05-27 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种镧系笼状化合物及其制备方法与用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2570703B1 (fr) * 1984-09-26 1988-07-08 Commissariat Energie Atomique Complexes macropolycycliques de terres rares et application a titre de marqueurs fluorescents

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biol. Chem. 245, 3059, 1970. Хельветика Кимика Acta.- Т. 67, 1984, с.2264 - 2269. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2647578C1 (ru) * 2016-12-20 2018-03-16 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) N,n’-диэтил- n,n’-ди(2-бром-4-r-фенил)диамиды 2,2’-бипиридил-6,6’-дикарбоновой кислоты и способ их получения, циклизация полученных амидов с образованием 6,6’-диэтил-9,9’-диr-дибензо[f]-1,7-нафтиридин-5,5’(6н,6’h)-дионов

Also Published As

Publication number Publication date
FR2624862B1 (fr) 1990-06-08
AU2908889A (en) 1989-07-19
CA1334026C (fr) 1995-01-17
KR900700489A (ko) 1990-08-13
FI92698C (fi) 1994-12-27
WO1989005813A1 (fr) 1989-06-29
FI902981A0 (fi) 1990-06-14
EP0321353B1 (fr) 1992-05-20
FI92698B (fi) 1994-09-15
ATE76410T1 (de) 1992-06-15
DE3871353D1 (de) 1992-06-25
FR2624862A1 (fr) 1989-06-23
KR0133732B1 (ko) 1998-04-21
ES2043874T3 (es) 1994-01-01
JPH03502575A (ja) 1991-06-13
EP0321353A1 (fr) 1989-06-21
JP2866419B2 (ja) 1999-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2074859C1 (ru) Криптаты редкоземельных металлов в качестве флуоресцентных маркеров биологических молекул
US5346996A (en) Rare earth cryptates, processes for their preparation, synthesis intermediates and application as fluorescent tracers
EP0203047B1 (en) Fluorescent lanthanide chelates
EP0273115B1 (en) Chemiluminescent acridinium and phenanthridinium salts
US5457184A (en) Rare earth macrocyclic complexes and use thereof for reduction of disturbances in an assay using fluorescence
Takalo et al. Synthesis of europium (III) chelates suitable for labeling of bioactive molecules
EP0139675B1 (en) Compound
EP0108399B1 (en) Substituted carboxyfluoresceins
US4927923A (en) Macropolycyclic rare earth complexes and application as fluorescent tracers
EP0403593B1 (en) Terpyridine derivatives
US4859777A (en) Terpyridine chelating agents
EP0649020A1 (en) Luminescent lanthanide chelates with decreased non-radiative energy loss
JP2004509075A (ja) 蛍光消光にあまり敏感でない新規な希土類金属クリプテート
US5432101A (en) Macropolycyclic rare earth complexes and application as fluorescent tracers
KR100259761B1 (ko) 에스에이치기 표지용시약, 그의 제조방법 및 이를 이용한 표지법
EP0808829B1 (en) Fluorescent group-containing carbodiimide compound
CN109180571B (zh) 一种联吡啶衍生物及合成方法、用途
EP0232736A1 (en) Preparation of 4'-aminomethylfluorescein derivatives for use in fluorescence polarization immunoassays
JP2002518413A (ja) 新規な化合物

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20071217

REG Reference to a code of a succession state

Ref country code: RU

Ref legal event code: MM4A

Effective date: 20071217