JP2002518413A - 新規な化合物 - Google Patents

新規な化合物

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JP2002518413A
JP2002518413A JP2000555481A JP2000555481A JP2002518413A JP 2002518413 A JP2002518413 A JP 2002518413A JP 2000555481 A JP2000555481 A JP 2000555481A JP 2000555481 A JP2000555481 A JP 2000555481A JP 2002518413 A JP2002518413 A JP 2002518413A
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コリン・アンドリュー・リーチ
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スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ランタニドカチオンと錯形成しうる新規な化合物に、その調製方法に、ならびにその得られたランタニドキレートを生体分子プローブとしての使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明はランタニドカチオンと錯形成しうる新規な化合物、その製法および得
られたランタニドキレートの生体分子プローブとしての使用に関する。特に、本
発明は新規な感光剤を含有する錯形成化合物に関するものであり、生体アフィニ
ティアッセイ、特にＨＴＲＦ（homogeneous time-resolved fluorescence）（均
一時間分解蛍光）の生体アフィニティアッセイに用いるための長寿命蛍光を生成
することができる。
【０００２】 （背景技術） コンビナトリアル化学およびハイスループットスクリーニングの進歩と共に、
特に製薬業界内で、生物学的アッセイに対する要求が劇的に増加した。放射性同
位元素標識によることが多い伝統的なアッセイ法は、アッセイ容量を減少させる
と同時に、所望の処理能力を得ることができない。伝統的方法にはかかる固有の
欠陥がある結果として、その方法は蛍光による新しい方法の使用にシフトする傾
向にある。かかる方法は放射性活性アッセイに比べて多くの利点を有するが、オ
ートメーション化できること、使用が容易であること、小型化できることおよび
感度が良好であることが特に重要な点である。利用される主たる方法の一つが均
一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）エネルギー移動である。この近接効果による方法は
、直接的に、あるいは標識化抗体または標識化ストレプトアビジン（streptavid
in）を介するかのいずれかで、第２の蛍光もしくは発色団標識（アクセプター）
の近くにある場合にドナーの蛍光特性を調節するように誘導する、相互作用性分
子に共有結合した蛍光ドナー部を用いることを必要とする。かかる方法は、巨大
分子の構造、配座、相対位置および／または相互作用について有用な情報を提供
する。特に、ＨＴＲＦは、分子相互作用ならびにドナーおよびアクセプターで標
識した蛋白、リガンドおよび基質を用いる酵素ののハイスループットスクリーニ
ングにて幅広い用途を有する。
【０００３】 フルオレセイン（fluorescein）およびローダミン（rhodamine）などの有機色
素の伝統的蛍光標識が、免疫アッセイにおける生体分析用手段として長く利用さ
れてきた。ランタニドキレートは最近になって開発された蛍光物質であり、それ
が生物アッセイの分野における潜在的標識として非常に適するようになる特性を
有することが判明した。すなわち、ランタニドキレートは励起して長寿命のより
長波長の蛍光を放出することができる。時間−遅延の測定を通して、そのランタ
ニドキレートは、実験の間に、検出感度の増加を示す一方で、クエンチおよびバ
ックグラウンド干渉を減少させ、従来の蛍光標識と比べて明らかに有利な点を示
した。これらの有利な点に加えて、多くのランタニドキレートは溶解特性が改良
されており、その励起状態から隣接するアクセプター分子にエネルギーを効率的
に移動させることができる。そのような、該キレートは、ＨＴＲＦに用いるため
の、特に、イムノアッセイ、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ、受容体結
合アッセイ、酵素アッセイ、細胞ベースアッセイ、免疫細胞化学または免疫組織
化学アッセイを含む、オートメーション化され、小型化されたハイスループット
結合アッセイを開発するための理想的な物質である。
【０００４】 ランタニドキレートは、典型的には、ランタニドと結合するキレート形成基と
、有機感光性基を有する。感光性基は光を吸収し、エネルギーをランタニドに移
す機能を有する。そうすることで、ランタニドイオンに特有の吸収性の低さが解
消される。そのようなキレートは、例えば、LiおよびSelvin（J.Am.Chem.Soc.（
1995）117、8132−8138）にて広く報告されている。通常、複数のポリアミノカ
ルボキシラート基を含むランタニドキレート物質が用いられる。欧州特許ＥＰ０
２０３０４７Ｂ１は「ＴＥＫＥＳ」（４−(４−イソチオ−シナトフェニルエン
チニル−２,６−{Ｎ,Ｎ−ビス(カルボキシメチル)アミノメチル}−ピリジン）型
の感光剤を含む蛍光ランタニドキレートを開示する。特許出願ＷＯ９６／００９
０１Ａ１は、クマリンまたはキノロン様感光剤に共有結合したキレート化剤基Ｄ
ＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）を開示する。HeyduckおよびHeyduck（An
al.Biochem.（1997）248、216−227）はＷＯ９６／００９０１の化合物に類似す
る構造の化合物を記載するが、それらは巨大分子への共有結合を可能とするチオ
ール反応性ピリジルジスルフィド基を有する点で異なっている。
【０００５】 感光性基が励起波長、寿命、収量、クエンチ効果、錯体安定性、光安定性、溶
解性、電荷、非特異的蛋白相互作用、生体カップリング効率および調製の容易性
に関連する種々の物理化学特性をキレートに付与する点で、その感光性基の役割
が極めて重要であることが広く認識される。ＨＴＲＦアッセイに使用し、そのア
ッセイを開発するには、多様性のある新規な蛍光プローブが有利である。結果と
して、蛍光標識するアッセイ成分のより多くのより優れた方法が必要とされる。
【０００６】 したがって、本発明は、第一の態様において、１のランタニドキレート形成基
に共有結合した１またはそれ以上の感光性基を含むランタニドキレートであって
、感光性基が式（Ｉ）：
【化５】 （Ｉ） ［式中、Ｘは当該感光性基を上記キレート形成基にカップリングさせる基を意味
する］ で示される基であることを特徴とするランタニドキレートを提供する。 適当には、Ｘは、感光性基をキレート化基と共有結合させることができ、同時
に、キレート形成基のランタニドカチオンと結合する能力に影響を及ぼさない基
である。好ましくは、Ｘはｐが２、３または４である−ＮＨ(ＣＨ2)pＮＨ−基で
あり、それはキレート形成基と一緒になってアミド結合を形成する。最も好まし
くは、ＸはＮＨ(ＣＨ2)2ＮＨ−である。 好ましくは、ランタニドキレートは１または２個の式（Ｉ）の感光性基を含有
する。
【０００７】 本明細書中に用いる［ランタニド］キレート形成基なる用語は、Ｔｂ3+、Ｅｕ 3+ 、Ｓｍ3+、Ｄｙ3+などのランタニドカオチンと高親和性錯形成能を有する基を
いうのに用いる。いずれの蛍光性ランタニド金属を本発明のキレートに用いるこ
ともできるが、ユーロピウムまたはテルビウムを含むキレートが、最高の蛍光特
性を持つと考えられる。最も好ましくは、ランタミド金属はユーロピウムである
。
【０００８】 キレート形成基の適当な例は、ＷＯ９６／００９０１に記載の基を包含する。
好ましくは、キレート形成基はＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）または
ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラアミン六酢酸）であり、すなわちｎ＝１（ＤＴＰ
Ａ）またはｎ＝２（ＴＴＨＡ）である式（ＩＩ）：
【化６】 （ＩＩ） で示される化合物である。ＤＴＰＡおよびＴＴＨＡはいずれも当該分野で周知で
あり、商業的に入手できる。別法として、キレート形成基は式（ＩＩＩ）：
【化７】 （ＩＩＩ） で示される化合物である。 式（ＩＩＩ）の化合物は、対応するＮ,Ｎ−a−ビス(カルボキシメチル)−Ｌ−
リジンをＯ−(Ｎ−スクシンイミジル)−１,１,３,３−テトラメチルウロニウム
テトラフルオロボレートで活性化されたイソフタル酸と反応させて調製すること
ができる。
【０００９】 典型的には、式（ＩＶ）：
【化８】 （ＩＶ） ［式中、Ｌは−ＮＨ(ＣＨ2)pＮＨ2基（ここに、ｐは２、３または４である）を
意味する］ で示される化合物が、式（Ｉ）の感光性基の調製に用いられる。 式（ＩＶ）の
化合物は、シノキサシン（Cinoxacin）（Sigmaにより提供される商品）の酸塩化
物誘導体を形成し、ついで適当なアルキレンジアミン試薬と反応させることによ
り、その商品から調製することができる。ｐが３または４である式（ＩＶ）の化
合物は新規であると考えれられる。
【００１０】 構造式（Ｉ）の化合物は、溶液中で望ましいスペクトル特性を有するが、それ
らを生物学的アッセイにて用いる場合、例えば蛋白、核酸、脂質、炭水化物また
はペプチドなどの分子に結合させる必要がある。巨大分子の誘導化に適当な反応
基を含有する試薬もまた、本発明の一部を形成する。したがって、本発明は、さ
らなる態様において、さらに１のリンカー基を含むランタニドキレートであって
、そのリンカー基が式（Ｖ）：
【化９】 （Ｖ） ［式中、ＹはＣＨ2、ＣＨ2ＣＨ2または−ＣＨ2ＣＨ(ＣＯＯＨ)−であり、Ｒ2は
巨大分子の誘導化に適当な反応基である］ で示される基であるか、またはリンカー基が式（ＶＩ）： Ｒ2−(ＣＨ2)n−Ｚ−ＮＨ− （ＶＩ） ［式中、ｎは１ないし５、Ｚは結合または−ＣＨ2ＣＨ（ＣＯＯＨ）−基であり
、Ｒ2は式（Ｖ）に記載の通りである］ で示される基である、ランタニドキレートを提供する。
【００１１】 式（Ｖ）および（ＶＩ）の基の場合、キレート形成基に結合するポイントは、
そのアミン官能基を介するものであって、アミド結合を形成する。構造式（Ｖ）
および（ＶＩ）の化合物は、式（Ｉ）の混合無水物を適当なアミンと反応させる
ことにより構造式（Ｉ）の化合物から調製することができる。 式（Ｖ）または（ＶＩ）のリンカー基を含むランタニドキレートは、標的巨大
分子を直接標識するよりもむしろ、別に、ストレプトアビジンまたは抗体を標識
するために用いられ、それが順次標的巨大分子に結合することは当業者に明らか
であろう。かかる環境では、Ｒ2基は、間接的な生体接合に用いられる、抗体用
のエピトープまたは他の蛋白用のリガンドを含有する。 典型的には、Ｒ2基はアミン反応基、チオール反応基または光活性可能な反応
基である。アミン反応基の適当な例は、巨大分子上にあるアミン官能基と共有結
合することができるものであり、例えばイソチオシアネート（ＮＣＳ）および構
造式（ＶＩＩ）：
【化１０】 （ＶＩＩ） で示されるクロロトリアジンを包含する。チオール反応基の適当な例は、巨大分
子上にあるチオール官能基と共有結合することのできるものであり、例えばヨー
ドアセトアミド（−ＮＨＣＯＣＨ2Ｉ）および式（ＶＩＩＩ）：
【化１１】 （ＶＩＩＩ） で示されるマレイミドを包含する。光活性可能な反応基の適当な例は、構造式（
ＩＸ）：
【化１２】 （ＩＸ） または構造式（Ｘ）： （Ｘ） で示されるアジドを包含する。
【００１２】 生物分子へのかかるキレートの接合は、典型的には、ランタニドイオンの存在
あるいは不在下のどちらでも、標的分子の反応基がキレートで誘導されるという
条件下、反応性キレートを目的の標的分子、典型的には生物分子と一緒にインキ
ュベートすることにより行われる。標的分子と同じ反応性官能基を有する過剰量
の試薬でクエンチすることで反応を終了させる。キレート中にすでに存在しない
場合、過剰量のランタニドをクエンチした反応混合物に加える。精製された標的
−キレート−ランタニドイオン錯体は、典型的には、分取ゲル濾過、イオン交換
、逆相またはその他のクロマトグラフ法により過剰キレートおよび、適当であれ
ば、標識した標的分子のランタニドイオンを除去する。 ＨＴＲＦアッセイは、典型的に、目的の酵素反応または分子相互作用を形成さ
せ、研究中の比活性が先導して、直接的または間接的に、ランタニド−キレート
−標的分子およびその他の分子間の平均距離を変化させ、それ自体または別の実
在物（アクセプター）への接合を通して、ランタニドイオンまたはアクセプター
の光学特性の調節が得られるようにすることにより行われる。
【００１３】 例えば、標的分子の、蛋白中のアミン（Ｌｙｓ、Ｎ−末端）、チオール（Ｃｙ
ｓ)、ＨｉｓまたはＴｙｒ残渣をランタニドキレートで直接標識するか、別法と
してそれ自体をランタニドキレートで標識した抗体、蛋白ＡまたはＧあるいはス
トレプトアビジンで間接的に標的分子を標識する。アクセプター分子、例えば反
応青４またはフィコバイオプロテイン（phycobiloprotein）、例えばアロフィコ
シアニン（allophycocyanin）を直接的に目的の共標的に接合させ、また間接的
に標準的な異種二機能性架橋化学作用を介して、例えばストレプトアビジン、抗
体または蛋白Ａ／Ｇ上に接合させることができる。 ドナーおよびアクセプターの間のエネルギー移動量は、例えば、時間分解性蛍
光装置を用いてドナーおよび／またはアクセプターの発光寿命の変化をモニター
することにより、または、例えば、時間ゲート蛍光マイクロタイタープレート読
取器（time gated fluorescence microtitre plate reader）を用いて全体の試
料強度における時間ゲートの変化を測定することにより決定することができる。 次の記載例および実施例により本発明を説明する。
【００１４】 一般的実験項目 すべてのＨＰＬＣによる分析を、０．１％トリフルオロ酢酸中５から５０％勾
配のＭｅＣＮを用いて、１０分かけてヒクロン（Hichrom)ＫＲ１００−５Ｃ８カ
ラム上で行った。ピークは、オンラインＵＶスペクトル（ヒューレット−パッカ
ード（Hewlett-Packard)１０５０ダイオードアレイ検出器）および保持時間によ
って特徴付けられる。分取性ＨＰＬＣを、０．１％トリフルオロ酢酸中１０から
８０％勾配のＭｅＯＨを用いて、１０分かけてDynamax−６０Ａ Ｃ18カラム上
で行った。キレート形成基を含む化合物の場合は、各々、主な位置異性体が見ら
れた。しかしながら、副次的な異性体も形成され、それらもまた本発明の範囲内
にある。
【００１５】 記載例１ Ｎ−（２−アミノエチル）シノキサシンアミド（Ｄ１）
【化１３】 塩化チオニル（４０ｍｌ）を、アルゴン雰囲気下、フレーム乾燥したフラスコ
中のシノキサシン（１．０ｇ、３．８１ミリモル）に加え、得られたスラリーを
シノキサシンが溶解するまで室温で攪拌した（約３０分）。余剰塩化チオニルを
減圧下で除去し、湿気を排除し、得られた黄色固体をクロロホルム（５０ｍｌ）
で希釈した。該スラリーをエチレンジアミン（２ｍｌ）のクロロホルム（５０ｍ
ｌ）中溶液に３０分かけて０℃で滴下し、その後、室温で３０分間攪拌し続けた
。反応物を水を加えてクエンチし、得られた溶液をクロロホルムおよび水の間に
分配した。水相をクロロホルム（４×）で抽出し、合した有機相を乾燥させ（Ｍ
ｇＳＯ4）、溶媒を減圧除去し、黄色固体を得た。残渣を中圧クロマトグラフィ
ー（Biotage flash ４０Ｓ，４．０７．０ｃｍ，ＭｅＯＨ中９：１ ＣＨ2Ｃｌ 2 ／２Ｍ ＮＨ3）により精製し、標記化合物を黄色固体（６０８ｍｇ、５２％）
。ＨＰＬＣ（分析）：保持時間＝４．６分；ＵＶ（λmax）２６０、３６０ｎｍ
。1 H-NMR (250MHz, CD3OD): 7.66 (1H, s), 7.45 (1H, s), 6.25 (2H, s), 4.70
(2H, q, J = 7 Hz), 3.60 (2H, t, J = 6.5 Hz), 2.95 (2H, t, J = 6.5 Hz), 1
.55 (3H, t, J = 7 Hz). MS (APCI+): 305.2 (M+H+, 53%)。
【００１６】 記載例２ シノキサシン−ＤＴＰＡの調製（Ｄ２）
【化１４】 ジエチレントリアミン五酢酸二無水物（７０４ｍｇ、１．９７ミリモル）を、
アルゴン雰囲気下、攪拌しながらＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（無水物）中に
溶解した（約１時間）。得られた溶液にＮ−（２−アミノエチル）シノキサシン
アミド（Ｄ１）を一度に加え、さらに４時間攪拌を続けた。反応物を水（５ｍｌ
）を加えてクエンチし、溶媒を減圧除去した。残渣を水／メタノール（１：１、
１０ｍｌ）で希釈し、不溶性固体を遠心分離により除去した。残った溶液を分取
性ＨＰＬＣにより精製して標記化合物を得、凍結乾燥させて、無色の固体（２４
７ｍｇ、７４％）を得た。 ＨＰＬＣ（分析）：保持時間＝４．７６分；ＵＶ（λmax）２６０，３６０ｎｍ
。ＨＰＬＣ（分取性）：保持時間＝５．６３分。 1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): 9.97 (1H, t, J＝5.5 Hz), 8.15 (1H, t, J＝5.5
Hz), 7.64 (1H, s), 7.54 (1H, s), 6.30 (2H, s), 4.59 (2H, q, J＝7 Hz), 4
.34 (2H, s), 3.53 - 3.17 (16H, m), 3.06 (4H, d, J＝5.5 Hz), 1.40 (3H, t,
J＝7 Hz）。 MS (ES+) 680 (M+H+, 25%), 702 (M+Na+, 55), 718 (M+K+, 100）。
【００１７】 記載例３ シノキサシン−ＤＴＰＡ−ＡＰＡ（Ｄ３）の調製
【化１５】 イソ−ブチルクロロホルメート（２４ｕｌ、０．１８８ミリモル）をシノキサ
シン−ＤＴＰＡ（Ｄ２）（１２２ｍｇ、０．１８ミリモル）のＮ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミド／トリエチルアミン（３：１ｖ／ｖ、４ｍｌ）中溶液に、アルゴン
雰囲気下０℃で加え、反応物を１５分攪拌した。 ｐ−アミノフェニルアラニン（ＡＰＡ）（３２ｍｇ、０．１８ミリモル）を一
度に加え、溶液を室温で４時間攪拌した。反応物を水（２ｍｌ）を加えてクエン
チし、溶媒を減圧除去した。残渣を水／メタノールに溶解し、逆相分取性ＨＰＬ
Ｃにより精製し、その後凍結乾燥させて、無色の固体（９８ｍｇ、６５％）を得
た。 ＨＰＬＣ（分析）：保持時間＝４．８９分；ＵＶ（λmax）２５８，３５５ｎｍ
。ＨＰＬＣ（分取性）：保持時間＝５．４７分。1 H-NMR (400MHz, DMSO-d6): 9.97 (1H, m), 8.31 (1H, m), 8.19 (1H, m), 7.64
(1H, s), 7.54 (1H, s), 7.17 (2H, m), 6.81 (2H, m), 6.30 (2H, s), 4.58 (
2H, q, J＝7 Hz), 4.22 (2H, s), 3.52 - 2.83 (25H, m), 1.58 (3H, t, J＝7 H
z）。 MS (ES+) 842 (M+H+, 25%), 864 (M+Na+, 40), 880 (M+K+, 100）。
【００１８】 記載例４ シノキサシン−ＤＴＰＡ−リジン（Ｄ４）の調製
【化１６】 イソ−ブチルクロロホルメート（３５ｕｌ、０．２６９ミリモル）をシノキサ
シン−ＤＴＰＡ（Ｄ２）（１６６ｍｇ、０．２４４ミリモル）のＮ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド／トリエチルアミン（３：１ｖ／ｖ、６ｍｌ）中溶液に、アルゴ
ン雰囲気下０℃で加え、１５分間攪拌した。Ｎ−ε−（ｔｅｒｔ−ブトキシカル
ボニル）−（Ｌ）−リジン（７８ｍｇ、０，３１８ミリモル）を一度に加え、該
溶液を室温で３時間攪拌した。反応物に水（２ｍｌ）を加えてクエンチし、溶媒
を減圧除去した。残渣に乾クロロホルム（１０ｍｌ）を加え、懸濁液を得、それ
をトリフルオロ酢酸（２００ｕｌ）で処理した。懸濁液を室温で２時間攪拌し続
けた。溶媒を減圧除去し、残渣を逆相分取性ＨＰＬＣにより精製して標記化合物
を得、凍結乾燥させて、無色の固体（１２２ｍｇ、６２％）を得た。ＨＰＬＣ（
分析）：保持時間＝４．６７分；ＵＶ（max）２５８，３５５ｎｍ。ＨＰＬＣ（
分取性）：保持時間＝５．４５分。 MS (ES+) 808 (M+H+, 32%), 830 (M+Na+, 30), 846 (M+K+, 100）。
【００１９】 記載例５ シノキサシン−ＤＴＰＡ−ＡＰＡ−クロロトリアジン（Ｄ５）の調製
【化１７】 塩化シアヌル（８．６ｍｇ、０．０４７ミリモル）をシノキサシン−ＤＴＰＡ
−ＡＰＡ（Ｄ３）（２８ｍｇ、０．０３３ミリモル）およびジイソプロピル（エ
チル）アミン（８ｕｌ、０．０４７ミリモル）のクロロホルム（３ｍｌ）中スラ
リーにアルゴン雰囲気下で加え、反応物を室温で３時間攪拌した。反応物をメタ
ノール（３ｍｌ）で希釈し、溶液を逆相分取性ＨＰＬＣにより精製し、標記化合
物を灰白色固体（１７ｍｇ、５２％）として得た。ＨＰＬＣ（分析）：保持時間
＝７．８３分；ＵＶ（max）２６０，２７５，３５５ ｎｍ。ＨＰＬＣ（分取性
）：保持時間＝７．７４分。 MS (ES+) 989 (M+H+, 35Cl, 100%), 991 (M+H+, 35Cl 37Cl, 85%), 993 (M+H+, 37 Cl, 25%）。 少量のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中エチレンジアミンで処理してクロロト
リアジンがアミン−反応であること確認し、ＨＰＬＣ（分析）の保持時間５．７
４分に付して新規な生成物を得た。
【００２０】 記載例６ シノキサシン−ＤＴＰＡ−ＡＰＡ−イソチオシアネート（Ｄ６）の調製
【化１８】 チオホスゲン（２ｕｌ、０．０２７ミリモル）をシノキサシン−ＤＴＰＡ−Ａ
ＰＡ（Ｄ３）（１６ｍｇ、０．０１９ミリモル）のクロロホルム／ジイソプロピ
ル（エチル）アミン（１０：１ｖ／ｖ、２．２ｍｌ）中溶液に加え、得られた暗
赤色溶液を、アルゴン雰囲気下、室温で３０分間攪拌した。反応物をメタノール
で希釈し、逆相分取性ＨＰＬＣにより直接精製して、標記化合物を灰白色固体（
５．３ｍｇ、３３％）として得た。ＨＰＬＣ（分析）：保持時間＝８．２５分；
ＵＶ（max）２５８，３５５ｎｍ。ＨＰＬＣ（分取性）：保持時間＝７．９６分
。 MS(ES+)884(M+H+,22%),906(M+Na+,25),922(M+K+,100)。
【００２１】 記載例７ シノキサシン−ＤＴＰＡ−リジン−アジド（Ｄ７）の調製
【化１９】 Ｎ−（５−アジド−２−ニロトベンゾイルオキシ）スクシンイミド（１５ｍｇ
、０．０５０ミリモル）をシノキサシン−ＤＴＰＡ−リジン（Ｄ４）（２０ｍｇ
、０．０２５ミリモル）のクロロホルム／ジイソプロピル（エチル）アミン（１
０：１ｖ／ｖ、３．３ｍｌ）中溶液に加え、得られた溶液を、アルゴン雰囲気下
、室温で３時間攪拌した。反応物をメタノールで希釈し、逆相分取性ＨＰＬＣで
直接精製し、標記化合物を淡黄色固体（２１ｍｇ、８５％）として得た。ＨＰＬ
Ｃ（分析）：保持時間＝６．９２分；ＵＶ（max）２５８、３５５ｎｍ。ＨＰＬ
Ｃ（分取性）：保持時間＝７．２４分。 MS (ES+) 998 (M+H+, 50%）。
【００２２】 記載例８ シノキサシン−ＤＴＰＡ−リジン−ヨードアセトアミド（Ｄ８）の調製
【化２０】 ヨード酢酸無水物（１５ｍｇ、０．０４２ミリモル）をシノキサシン−ＤＴＰ
Ａ−リジン（Ｄ４）（２２．５ｍｇ、０．０２８ミリモル）のクロロホルム／ジ
イソプロピル（エチル）アミン（１０：１ｖ／ｖ、２．２ｍｌ）中溶液に加え、
得られた溶液をアルゴン下、室温で５時間攪拌した。反応物をメタノールで希釈
し、逆相分取性ＨＰＬＣにより直接精製し、標記化合物を得、凍結乾燥させて、
黄色／褐色固体（１０ｍｇ、３７％）を得た。ＨＰＬＣ（分析）：保持時間＝５
．９１分；ＵＶ（max）２５８、３５５ｎｍ。ＨＰＬＣ（分取性）：保持時間＝
６．３１分。 MS (ES+) 848 (M-I+, 100%）。
【００２３】 記載例９ シノキサシン−ＤＴＰＡ−リジン−マレイミド（Ｄ９）の調製
【化２１】 ３−マレイミド安息香酸−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（１５ｍ
ｇ、０．０４７ミリモル）をシノキサシン−ＤＴＰＡ−リジン（Ｄ４）（１９ｍ
ｇ、０．０２４ミリモル）のクロロホルム／ジイソプロピル（エチル）アミン（
１０：１ｖ／ｖ、２．２ｍｌ）中溶液に加え、得られた溶液をアルゴン下、室温
で３時間攪拌した。反応物をメタノールで希釈し、逆相分取性ＨＰＬＣにより直
接精製し、標記化合物を灰白色固体（１７ｍｇ、７２％）として得た。ＨＰＬＣ
（分析）：保持時間＝６．４８分；ＵＶ（λmax）２５８、３５５ｎｍ。ＨＰＬ
Ｃ（分取性）：保持時間＝６．８５分。 MS (ES+) 1007 (M+H+, 20%）。
【００２４】 記載例１０ シノキサシン−ＴＴＨＡおよび（シノキサシン）2−ＴＴＨＡ（Ｄ１０（ａ）お
よびＤ１０（ｂ））の調製
【化２２】 トリエチレンテトラミン六酢酸（１５５ｍｇ、０．３１３ミリモル）をＮ，Ｎ
−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ、無水物）およびトリエチルアミン（３ｍｌ
）中に、アルゴン雰囲気下、攪拌しながら溶解した（約３時間）。得られた溶液
にＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテ
トラフルオロボレート（１２３ｍｇ、０．４０８ミリモル）を加えて１５分間０
℃で攪拌し続け、その後Ｎ−（２−アミノエチル）シノキサシンアミド（Ｄ１）
（５７ｍｇ、０．１８８ミリモル）を加えた。室温で３時間攪拌後、反応物を水
（５ｍｌ）を加えることによりクエンチし、溶媒を減圧除去した。残渣を水／エ
タノール（１：１、１０ｍｌ）で希釈し、不溶性固体を遠心分離により除去した
。残った溶液を逆相分取性ＨＰＬＣにより精製し、標記化合物を得、凍結乾燥後
、無色固体を得た。
【００２５】 シノキサシン−ＴＴＨＡ（Ｄ１０（ａ））上記構造式を示す。 （８０ｍｇ、３２％）ＨＰＬＣ（分析）：保持時間＝４．６５分；ＵＶ（max）
２６０，３６０ｎｍ。ＨＰＬＣ（分取性）：保持時間＝５．６２分。1 H−NMR (400MHz, DMSO−d6): 9.99 (1H, t, J＝5.5 Hz), 8.40 (1H, m), 7.66
(1H, s), 7.55 (1H, s), 6.32 (2H, s), 4.61 (2H, q, J＝7 Hz), 3.90 − 3.0
0 (26H, m), 1.41 (3H, t, J＝7 Hz）。 MS (ES+) 781 (M+H+, 10%), 803 (M+Na+, 18), 819 (M+K+, 19）。 （シノキサシン）2−ＴＴＨＡ （Ｄ１０（ｂ）） （８ｍｇ、５％）ＨＰＬＣ（分析）：保持時間＝５．８９分；ＵＶ（max）２６
０，３６０ｎｍ。ＨＰＬＣ（分取性）：保持時間＝６．６９分。 MS (ES+) 1067 (M+H+, 78%), 1089 (M+Na+, 18）。
【００２６】 記載例１１ ビス−リジン−ＮＴＡ（Ｄ１１）（構造ＩＩＩの化合物） Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテ
トラフルオロボレート（８１８ｍｇ、２．７２ミリモル）をイソフタル酸（２１
５ｍｇ、１．２９ミリモル）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）およ
びジイソプロピルエチルアミン（２ｍｌ）中溶液に、アルゴン下室温で加え１５
分間攪拌した。Ｎ，Ｎ−−ビス（カルボニルメチル）−（Ｌ）−リジンを加え、
さらに３時間攪拌し続けた。反応物を水を加えてクエンチし、溶媒を減圧除去し
て残渣を得、それを逆相分取性ＨＰＬＣにより精製して標記化合物を得、凍結乾
燥させて、無色固体（７５０ｍｇ、８９％）を得た。 ＨＰＬＣ（分析）：保持時間＝３．８６分；ＵＶ（max）２６０ｎｍ。1 H−NMR (250MHz, D2O) 7.93 (1H,s), 7.78 (2H, dd, J＝7.75 & 1.5 Hz), 7.48
(1H, t, J＝7.75 Hz), 4.01 (8H, s), 3.97 (2H, m), 3.31 (4H, t, J＝6.25 H
z), 2.00−1.30 (8H, m), 1.21 (4H, dt, J＝ 6.75 & 4.5 Hz）。 MS (ES+) 655 (M+H+, 15%), 677 (M+Na+, 22), 693 (M+K+, 25）。
【００２７】 記載例１２ シノキサシン−（ビス−リジン−ＮＴＡ）および（シノキサシン）2−（ビス−
リジン−ＮＴＡ）（Ｄ１２（ａ）およびＤ１２（ｂ））の調製
【化２３】 イソ−ブチルクロロホルメート（２５ｕｌ、０．１９６ミリモル）をビス−Ｎ
ＴＡ−リジン（１２２ｍｇ、０．１８６ミリモル）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド（１０ｍｌ）およびトリエチルアミン（２ｍｌ）中溶液に加え、反応物を１
５分間攪拌した。Ｎ−（２−アミノエチル）シノキサシンアミド（Ｄ１）（Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド（６ｍｌ）およびトリエチルアミン（１ｍｌ）に溶解
）を該溶液に滴下し、３時間攪拌し続けた。反応物を水を加えてクエンチし、溶
媒を減圧除去した。残渣を逆相分取性ＨＰＬＣで精製して標記化合物を得、凍結
乾燥後、無色固体を得た。 シノキサシン−（ビス−リジン−ＮＴＡ）（Ｄ１２（ａ））上記構造式を示す （５５ｍｇ、３１％）ＨＰＬＣ（分析）：保持時間＝５．９３分；ＵＶ（max）
２６０，３６０ｎｍ。ＨＰＬＣ（分取性）：保持時間＝６．２４分。 MS (ES+) 941 (M+H+, 85%), 963 (M+Na+, 75)。 （シノキサシン）2−（ビス−リジン−ＮＴＡ）（Ｄ１２（ｂ）） （３７ｍｇ、３２％）ＨＰＬＣ（分析）：保持時間＝６．７７分；ＵＶ（max）
２６０，３６０ｎｍ。ＨＰＬＣ（分取性）：保持時間＝６．８４分。 MS (ES+) 1227 (M+H+, 38%), 1250 (M+Na+, 20）。
【００２８】 スペクトル特徴化データ 本発明のユーロピウムキレートについて時間分解蛍光消失と一緒に、いくつか
の典型的な励起および発光スペクトルを以下に示す。スペクトルおよび消失の測
定はすべて、５０μｓの時間分解能を有する、Aminco Bowman Spectrophotomete
r（モデルＡＢ２）に記録した。 図１に関して、上のトレースはＥｕ3+の存在下にあるシノキサシン（Cinoxaci
n）−ＤＴＰＡ（Ｄ２）の励起および発光スペクトルを示す。ユーロピウムの特
徴的な狭い放出バンドが６１４ｎｍ付近に観察される。６１４ｎｍの発光バンド
の代わりに励起スペクトルは３５５ｎｍにピークを有し、この強度の少なくとも
５０％は３７５ｎｍまでの励起波長で得られる。下のトレースは発色団（４２１
ｎｍでの）の蛍光消失およびＥｕ蛍光（６１４ｎｍ）を示す。
【００２９】 膨大な数の蛍光化合物と同様に、感光性基その物は極めて短い蛍光寿命しかな
い。事実、発色団の蛍光寿命（４２１ｎｍでの）は短すぎて、正確に検出するこ
とができない。しかしながら、消滅トレースによって明らかに示されるように、
キレート（６１４ｎｍで）中に組み込まれているＥｕ3+の蛍光は特徴的な長い寿
命を有しており、それでＥｕ−含有キレートと他の蛍光化合物の間の時間分解を
区別することができる。Ｅｕの蛍光寿命を６３３μｓの寿命を付与するシングル
指数適合操作（single exponential fit）と適合させた。これらのデータから、
シノキサシン−ＤＴＰＡキレートはＨＴＲＦベースのアッセイにてドナー標識と
して利用するのに必要な分光学的特性を示すことが確かめられる。
【００３０】 図２は、Ｅｕ3+の存在下のシノキサシン−ＤＴＰＡ−シノキサシンキレートに
ついて、図１に記載のデータに対応するデータを示す。再び、発色団の消失（４
３０ｎｍでの消失）は検出するには速すぎる。 図３は、Ｅｕ3+の存在下のシノキサシン−ＤＴＰＡ−ＡＰＡ−クロロトリアジ
ンキレートについて、図１に記載のデータに対応するデータを示す。 本発明のキレートの「明度」を評価するために、その蛍光度を、同様の実験条
件を用い、ＷＯ９６／００９０１に記載のカルボスチリルキレート（ＤＴＰＡ−
ＣＳ１２４）と比較した。シノキサシン（Cinoxacin）含有キレートは従来のカ
ルボスチリルキレートに相当する蛍光度を示す。
【００３１】 シノキサシン−ＤＴＰＡ−ＡＰＡ−Ｅｕ3+・ストレプトアビジン（Ｃｉｎ−ＤＴ
ＰＡ−ＳＡ）の調製 ３３％ｖ／ｖＤＭＳＯに新たに溶かしたシノキサシン−ＤＴＰＡ−ＡＰＡ−ク
ロロトリアゼン（Ｄ５）（４ｍｇ）を１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７.０）緩衝
液中３３μＭストレプトアビジンと一緒にインキュベートし、１：１０および１
：２０のストレプトアビジンのキレートに対するモル比を得た。反応混合物を（
５００μＬ）を室温で６０分間インキュベートし、ついで２５μＬのトリス／Ｈ
Ｃｌでクエンチし、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（最終ｐＨ８.０）を得た。このク
エンチした反応物（５２５μＬ）に、３ｘ８μＬの水中２５ｍＭ ＥｕＣｌ3（１
.１ｍＭ Ｅｕ3+）を加え、室温で３０分間インキュベートした。 ついで、反応混合物（５４９μＬ）を０.０５％ツィーン２０含有のリン酸緩
衝化セイライン（ＰＢＳ／ツィーン、Sigma）中に脱塩し、５００μＬのフラク
ションを集め、蛋白含量について検定する（クマシーブルー試薬、Biorad）。標
体としてストレプトアビジンを用いてクマシー染色により、プールしたフラクシ
ョン（２ｍＬ、１４μＭ）の濃度を測定した。蛋白と共に溶出する固有の蛍光ラ
ンタニドの存在を、マイクロ秒ゲート（４００μｓ遅延、４００μｓ読み、サイ
クル時間１０００μｓ、Wallac Victor）での時間分解性蛍光シグナルを観察す
ることで明らかにした。５０ｍＭ Ｃｉｎ−ＤＴＰＡ−ＳＡでは、これらの条件
を用いて、１００μＬ中に１秒当たり１００００回を得た。Ｃｉｎ−ＤＴＰＡ−
ＡＰＡ−クロロトリアジンを１００％ＤＭＳＯに新たに溶かし、二炭酸塩緩衝液
中の反応混合物のｐＨを９.０に上げ、反応時間を４℃で約１６時間に伸ばすこ
とにより、さらに明るい結合物質を付与する改良された標識条件を得た。
【００３２】 時間分解蛍光共鳴エネルギーのＣｉｎ−ＤＴＰＡ−ＳＡからＣｙ５−標識化ペプ
チドへの移動の測定 ＰＢＳ／ツィーン中のＣｉｎ−ＤＴＰＡ−ＳＡ（１００ｎＭ）を、対応する非
標識ペプチドをビオチンおよびＣｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（Amersham）と反応させることで調製した、増加する濃度（０.１−１０００ｎ
Ｍ）のＮ−Ｓｕｃｃ−(Ｃｙ５−ＮＨ−Ｋ)ＡＥＲＡＱＡＧＶＶＮＡＳＳＲＬＡＥ (Ｋ −ＮＨ−Biotin)−ＣＯ2Ｈ（下線を付した文字は一文字アミノ酸コードをい
う）と混合した。室温で３０分間インキュベートした後、試料の蛍光度（λex＝
３４０ｎｍ、λem＝６１５ｎｍまたは６６４ｎｍ）を、ユーロピウム（６１５ｎ
ｍ）蛍光の場合、４００μｓの時間ゲート、４００μｓの読取時間、１０００μ
ｓのサイクル時間を用いて測定し、Ｃｙ５（６６４ｎｍ）蛍光の場合、７０μｓ
の時間ゲート、２００μｓの読取時間、１０００μｓのサイクル時間を用いて測
定した。６１５ｎｍの蛍光はペプチド濃度依存性操作にてＣｙ５−ペプチド飽和
濃度が６２−６７％減少し、それに対して６６４ｎｍ蛍光はペプチド飽和濃度が
１０００個／秒から８０００個／秒に飽和操作にて増加した。これらの特徴は共
にＣｉｎ−ＤＴＰＡ−ＳＡ錯体から蛍光アクセプターへの効果的なエネルギー移
動を示す。加えて、１０ｎＭ Ｃｉｎ−ＤＴＰＡ−ＳＡのＰＢＳ／ツィーン中の
ビオチニル化アロフィコシアニン（Ｂｔ−ＡＰＣ、０.５−５００ｎＭ、Sigma）
を用いる滴定は、５００ｎＭ Ｂｔ−ＡＰＣで１０００個／秒から３５００個／
秒への６６４ｎｍでの蛍光シグナルの増加と関連しており、それもまたキレート
からアクセプターへのエネルギー移動を示す。
【００３３】 図４はエネルギー移動によるドナー（Ｅｕ−キレート）およびアクセプター（
Ｃｙ５）蛍光の変化を示す。Ｅｕ3+蛍光は減少し、Ｃｙ５蛍光はＣｙ５−標識ペ
プチドを滴下するにつれて増加する。エネルギー移動はＥｕおよびＣｙ５をスト
レプトアビジン−ビオチン相互作用により近接させるようにした場合に生じる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｅｕ3+とキレート結合したシノキサシン−ＤＴＰＡの励起および
発光スペクトル、ならびに発色団およびＥｕ蛍光の蛍光消失を示す。
【図２】 シノキサシン−ＤＴＰＡ−シノキサシン−Ｅｕ3+キレートの励起
および発光スペクトル、ならびに発色団およびＥｕ蛍光の蛍光消失を示す。
【図３】 シノキサシン−ＤＴＰＡ−ＡＰＡ−クロロトリアジン−Ｅｕ3+キ
レートの励起および発光スペクトル、ならびに発色団およびＥｕ蛍光の蛍光消失
を示す。
【図４】 エネルギー移動によるドナー（Ｅｕ−キレート）およびアクセプ
ター（Ｃｙ５）蛍光の変化を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コリン・アンドリュー・リーチ イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ (72)発明者 キース・ジェイムズ・ミラン・ムーア イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ (72)発明者 スティーブン・ジェイムズ・スタンウェイ イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ Ｆターム(参考） 2G045 DA12 DA13 DA36 DA60 DA80 FB07 FB12 4C050 AA01 AA08 BB08 CC17 EE02 FF03 GG03 HH01

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 １のランタニドキレート形成基に共有結合した１またはそれ
    以上の感光性基を含むランタニドキレートであって、感光性基が式（Ｉ）： 【化１】 （Ｉ） ［式中、Ｘは当該感光性基を上記キレート形成基にカップリングさせる基を意味
    する］ で示される基であることを特徴とするランタニドキレート。
  2. 【請求項２】 Ｘが基−ＮＨ(ＣＨ2)pＮＨ−であって、ここにｐが２、３ま
    たは４であり、キレート形成基とアミド結合を形成する、請求項１記載のランタ
    ニドキレート。
  3. 【請求項３】 キレート形成基が、式（ＩＩ）： 【化２】 （ＩＩ） ［式中、ｎは１（ＤＴＰＡ）または２（ＴＴＨＡ）を意味する］ で示される基であるか、または式（ＩＩＩ）： 【化３】 （ＩＩＩ） で示される化合物である、請求項１記載のランタニドキレート。
  4. 【請求項４】 また、キレート形成基に共有結合する、リンカー基をさらに
    含むランタニドキレートであって、そのリンカー基が、式（Ｖ）： 【化４】 （Ｖ） ［式中、ＹはＣＨ2、ＣＨ2ＣＨ2または−ＣＨ2ＣＨ（ＣＯＯＨ）−であり、Ｒ2
    は巨大分子の誘導化に適当な反応基を意味する］ で示される基であるか、またはリンカー基が式（ＶＩ）： Ｒ2−(ＣＨ2)n−Ｚ−ＮＨ− （ＶＩ） ［式中、ｎは１ないし５、Ｚは結合または−ＣＨ2ＣＨ(ＣＯＯＨ)−基であり、
    Ｒ2は式（Ｖ）に記載と同意義である］ で示される基である、ランタニドキレート。
  5. 【請求項５】 基Ｒ2がアミン反応基、チオール反応基または光活性可能な
    反応基である、請求項４記載のランタニドキレート。
  6. 【請求項６】 生体分子プローブとして請求項１−５のいずれか１つに記載
    のランタニドキレートの使用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107954893A (zh) * 2017-11-28 2018-04-24 兰州纬寰生物科技有限公司 邻氨基苯甲酰胺衍生物及制备方法和用途

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000001663A1 (en) * 1998-07-07 2000-01-13 Smithkline Beecham Corporation Novel fluorescent lanthanide chelates
US6740756B1 (en) 1998-07-07 2004-05-25 Smithkline Beecham Corporation Fluorescent lanthanide chelates
AUPP856399A0 (en) * 1999-02-08 1999-03-04 Australian Membrane And Biotechnology Research Institute Improved compounds for protein binding
JP2006022123A (ja) * 2002-06-27 2006-01-26 Ajinomoto Co Inc キレート剤

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE207098C (de) 1908-03-06 1909-02-16 Koppers Gmbh Heinrich Verfahren zur Leuchtgasherstellung durch Destillation von Steinkohlen und Beimengung eines billigeren Gases zu dem Steinkohlengas.
NL147145B (nl) 1969-02-04 1975-09-15 Lilly Co Eli Werkwijze ter bereiding van preparaten met antimicrobiele werking.
US4379929A (en) * 1981-03-19 1983-04-12 Eli Lilly And Company 4(1H)-Oxocinnoline-3-carboxylic acid derivatives
DD207098A3 (de) * 1981-12-22 1984-02-15 Schmidt Hans Joerg Verfahren zur herstellung von 1-alkyl-6,7-methylendioxy-4(1h)-oxo-cinnolin-3-carbonsaeuren
EP0626068B1 (en) * 1991-12-05 1999-05-06 Wallac Oy Luminescent lanthanide chelates
US5622821A (en) 1994-06-29 1997-04-22 The Regents Of The University Of California Luminescent lanthanide chelates and methods of use

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107954893A (zh) * 2017-11-28 2018-04-24 兰州纬寰生物科技有限公司 邻氨基苯甲酰胺衍生物及制备方法和用途

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