JPH02291299A - 化学発光増強法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明は化学発光における増強法に関する。

特に本発明は化学発光物質の検出法、特に化学発光物質
の定量、並びに化学発光の計測を基とする免疫定量、酵
素定量等の感度向上に好適な化学発光の増強法に関する
ものである。

（σ）従来の技術及び発明が解決しようとする課題 化学発光反応に基づく分析方法は、極めて高感Ｉ１：ナ
測定方法となり得ろ可能性があるため、活発な研究が展
開されている。この分析方法は特に、免疫学的測定の分
野で注目されており、種々の技術の導入が試みられてい
ろ。

即ち、免疫学的測定においては、先ず初めに、放射性同
位元素をラベルとして用いる方法が開発されｒ二が、放
射性同位元素を用いることの欠点として、半減期の短い
ことやバイオハザードの問題、ざらに感度が不十分とさ
れる場合があるなど改善が求．められでいた。次に酵素
をラベルとするいわゆる酵素免疫測定など比色や蛍光で
検出する方法が開発され、ＲｔＡの有する欠点を克服す
る研究が進められた。しかしながら、なお、感度向上が
望まれ、新たな技術の展開が計られた。これらの中で化
学発光を検出手段として利用する方法は、最ら高感度が
期待できるものとして研究が進められている。

化学発光反応を利用した免疫化学的測定法は大きく分け
て次の４ｌ］！に分類される（辻　章夫等、蛋白質　核
酸　酵素、別冊第３１巻（　１９１Ｈｌ）　２５２〜２
６３頁）。

（１）標識化合物としてルミノールやイソルミノール、
アクリジニウム誘導体などの化学発光性物質を抗体や抗
原などに標識する方法、 （２）酵素を抗体や抗原などに標識した酵素免疫１１定
法（Ｅ　Ｉ　Ａ）において、酵素活性の測定に化学発光
反応を利用する方法、 （３）補酵素であるＮＡＤやＡＴＰを標識し、抗原抗体
反応によりその補酵素活性が不活化する現象を利用した
ホモジニアスな免疫測定方法、（４）生物発光反応を用
いる酵素免疫測定方法。

これらのうち、（１）においては、発光性物質を化学的
に結合させることによって、発光量子収率が低下し、結
果として期待した程に感度が向上しないこと、化学発光
の生じている時間が極めて短時間であるので計測の面で
無理があることなど若干の問題を内蔵している。（３）
については感度の向上は望めないこと、（４）について
は酵素が特殊な場合が多く、方法として一般化し難いと
いう欠点を有す。一方、（２）においては、化学発光性
物質は溶液中においてｔｆ離の状態で存在し、標識酵素
により発光反応が触媒さ／−ろので感変の上昇が期待で
きる。しかしながら、この場合においてら、発光持続時
間が題めて短時間であろことが多く、実質的には測定感
変上昇に結びついてはいなかった。

このようなことから、最近、化学発光反応の系において
、第３の化合物を共存させ、これにより化学発光反応の
最終的な発光量を大幅に増大さけることが可能であるこ
とが分かった。即ち、スオープ等（Ｇ．Ｈ．Ｇ．Ｔｈｏ
ｒｐｅル．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ）は“メソッドイン　エン
ザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ）”、第１３３巻、第３３１〜３５３頁（１９８
６年、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ社、Ｎｅｗ　Ｙｏ
ｒｋ）に総説を記載しており、ベル才キシダーゼを触媒
に用いるルミノールの発光反応において、発光反応を増
強する化合物群の記載が見られる。上述の論文の第３３
５頁に述べられているように、６−ハイドロキシベンゾ
チアゾールやフェノール誘導体にエンハンサ−（　ｅｎ
ｈａｎｃｅｒ）としての強力な作用が認められていろ。

これらのエンハンサーの利用により、化学発光反応を遅
延ざ仕ると共に、化学発光量を増太さ仕ることができる
ので、測定条件が容易なものになり、敗秒間以内の反応
を見ろというような困難性が解決できろことになる。

これまで見出されたエンハンサーを列記すると、（ｌ）
６−ハイドロキンベンゾチアゾール、（２）ｐ−ヨード
フェノールなどフェノール誘導体らしくはナフトール誘
導体（特開昭５９−１７１８３９号）、（３）アンモニ
アおよび水溶性有機アミン（特開昭６２−１２４４４６
号）、 （４）芳香族アミン類（特開昭６１−５４４５３号）、
（５）環状基を有するアミノ酸、 （６）蛍光性物質。

これらの中で（１）並びに（２）のｐ−ヨードフェノー
ルが優れたものとして選択された。

しかしながら、さらに優れたエンハンサーを見出すこと
が、測定方法の感度向上のために必要とされていた。即
ち、感度向上が可能となれば、生体内の＠量の活性成分
等が容易に測定できるようにｔり、したがって、これま
であまりにも＠量すぎて測定できなかった成分が測定で
きるので極微量成分の正常値を知ることができることか
ら、疾病時における濃度増加を早期に検出できるように
なり、疾病の早期診断が可能となる。さらに、疾病の出
現により、正常時より乙さらに小さくなるよ′うな成分
が測定でさることから、新たな疾病診断法が提供される
ことになる。また、疾病の予後管理にら睡めて有力な手
段を提供するものである。

これらの方法は単に疾病の診断に利用できるだけではな
く、微量分叶が必要な分野、たとえば環境分叶等にら利
用でき、さらに生理活性物質の検出や生木内動態を知る
几めにも有用であることは申すまでもない。

（ハ）課題を解決するための手段 本発明者は上記目的のため鋭意研究の結果、才キサゾー
ル誘導体、チアゾール誘導体、イミダゾール誘導体等に
強力な化学発光増強作用を見出した。即ち、本発明は、 １，　化学発光性物質を酸化剤とべルオキノダーゼとで
発光さける系において、 一般式（Ｉ）： ［式中、Ｒ１は酸素原子．硫黄原子または４−ヒドロキ
シフェニルで置換されていてもよいイミノ基を、Ｒ．，
Ｒ３およびＲＡはそれぞれ水素原子．ハロゲン原子，置
換されていてもよい炭化水素残基または複素環基を、ま
たはＲ，とＲ４とが相合わさって式： （式中、Ｒ，は水素原子またはヒドロキシル基を示す）
で表わされろ２価の基を示す。ただし、Ｒ．が酸素原子
、硫黄原子またはイミノ基の場合、Ｒ４は４−ヒドロキ
シフエニル基を示し、Ｒｌが４一ヒド口キシフェニルイ
ミノ基の場合、Ｒ，は水素原子を示す］で表わされる化
合物を共存させることを持徴とする化学発光増強法に関
する。

上記一般式（［）において、ハロゲン原子としては、例
えばフッ素．塩素，臭素．ヨウ素等か用いられ、置換さ
れていてもよい炭化水素桟基における炭化水素残基とし
ては、アルキル基（好ましくは炭素数１〜ｌＯのアルキ
ル基）．アルケニル基（好ましくは炭素数２〜１０のア
ルケニル基），アリール基（好ましくは炭素数６〜＋４
のアリール基），アラルキル基（好ましくは炭素数７〜
１９のアラルキル）基等が用いられ、複素環基としては
、好ましくは５〜７員複素環基、たとえば１個の硫黄原
子，窒素原子または酸素原子を含む５〜７員曳素環基．
２〜４個の窒素原子を含む５〜６員ｉ夏素環基．１〜２
個の窒素原子およびｌｇ！の硫黄原子または酸素原子を
含０５〜６員複素環基が用いられ、これらの撲素環基は
２個以下の窒素原子を含む６員環，ベンゼン環または１
四の硫黄原子を含む５貝環と縮合していてらよい。

炭素数１〜ＩＯのアルキル居としては例えばメチル．エ
チル．プロビル．イソブロビル，ブチル．イソブチル，
　ｓｅｅ−ブチル．　ｔｅｒｔ−ブチル，ペンチル．イ
ソペンヂル．不才ペンチル，ヘキノル．ヘブチル，オク
チル，ノニルまたはデシル等、炭素数２〜ＩＯのアルケ
ニル基としては例えばアリル，クロチル．２−ペンテニ
ル．３−へキセニル，２−ンクロペンテニルまたは２−
シクロへキセニルなど、アリール基としては、好ましく
は炭素数６〜１４のアリール基、例えばフェニル，アン
スリルまたはビフエニリルなどが用いられ、炭素数６〜
ｌ９のアラルキル基、さらに好ましくは炭素数６〜１４
のアリールー炭素数１〜４のアルキル基、例えばベンジ
ルまたはフエネチルなどが用いられる。

上記の５〜７員｝夏素環基の好ましい例としては、例え
ば２−ビリジル，ビリミジル．ビラジニルビリダジニル
．ビラゾリル　イミダゾリル，チアゾリル，才キサゾリ
ル．ピリド［２．３−　ｄ　］ピリミジル。ペンゾピラ
ニル．１．８−ナフチリジニル．キノリル．チエノ［２
．３−　ｂ　］ピリンル、テトラゾリル．チアジアゾリ
ル．オキサジアゾリル．トリアノニル．トリアゾリル．
チェニル　ビロリルピロリニル．フリル．ビロリジニル
　ベンゾチェニル．インドリル．イミダゾリノニル，ピ
ベリジル，ビベリノノ．ピベラジニル．モルホυニル，
モルホリノなどが用いられる。

Ｒ，、Ｒ，およびＲ．で示される炭化水素残基は、適当
な置換基たとえばハロゲン（例、フッ素．塩素，臭素．
ヨウ素等）．水酸基，炭素数１〜６のアルコキシ基，炭
素数１〜６のアルキル基で置換されていてもよいアミノ
基（例、ジメチルアミノ．ジエチルアミノ，ジブロピル
アミノ等）．有機カルボン酸，アシル基（例、炭素数！
〜ｌＯのアルカノイル基等）で置換されたアミノ基（例
アセチルアミノ，プロピ才二ルアミノ．ペンゾイルアミ
ノ等），炭素数１〜６のアルキル基で置換されていても
よいカルバモイル基（例、ジメチルカルバモイル．ジエ
チルカルバモイル．ジプロビルカルバモイル等），モノ
ーまたはジーアルコキンホスホリル基，エステル化され
たカルボキシル基、例えば、アルコキシカルボニル基、
好ましくは炭素数１〜ｌＯのアルコキンーカルボニル基
（例、メトキンカルボニル，エトキシカルボニル．プロ
ボキシカルボニル．ブトキシカルボニル等），アリール
オキシ基．好ましくは炭素数６〜１４のアリール才キシ
ー力ルボニル基（フェノキシアセチル等），アラルキル
オキシ力ルポニル基、好ましくは炭素敗７〜ｌ９のアラ
ルキルオキソ一カルボニル基（例、ペンジル才キシカル
ポニル等）等で１〜３例置換されていてもよい。

Ｒ２　，　Ｒ３゜およびＲ４で示される置換されていて
もよい炭化水素残基として例示した置換されていてもよ
い複素環基における置換基としては、例えばハロゲン（
例、フッ素，塩素．臭素，ヨウ素など）、炭素数１〜Ｂ
のアルキル、上記したハロゲンで置換された炭素数１〜
６のハロアルキル、水酸基、炭素数１〜６のアルコキシ
、炭素数１〜１０のアシル、炭素数１〜６のアルキルら
しくは炭素Ｂｔ〜１０のアシルで置換されていてもよい
アミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジブロ
ピルアミノ、アセチルアミノ、プロビオニルアミノ、ペ
ンゾイルアミノなど）、炭素数１〜６のアルキルで置換
されていて乙よいカルバモイル（例、ジメチル力ルバモ
イル、ジエチルカルバモイル、ジプロピルカルバモイル
なと”）　、炭ｊｌＩ〜６のアルコキシカルボニル（例
、メトキシカルボニル、エトキノカルボニル、プロボキ
シカルボニルなど）、上記した曳素環などが挙げられる
。

一般式（Ｉ）で表わされろ化合物としては、Ｒ，が酸素
原子であるオキサゾール誘導体、イオウ原子であるチア
ゾール誘導体らしくはイミノ基であるイミダゾール誘導
体が挙げられる。

これらのうち、好ましくはＲ４が４−ヒドロキシフェニ
ル基て、Ｒ，およびＲ，かそれぞれ水素原子、ハロゲン
原子、置換されていてもよい炭化水素残基、好ましくは
アルキル基、アルケニル基または芳香族基又は複素環基
などから選ばれた化合物が挙げられる。とりわけＲ，及
びＲ３が共に水素原子てある化合物、Ｒ，が水素原子て
Ｒ，か低級アルキル基とくにメチル基らしくはエチル基
である化合物、Ｒ，が水素原子でＲ２がハロゲン原子で
ある化合物、Ｒ．３が低級アルキル堪とくにメチル基ら
しく１よエチル基てあり、Ｒ，がハロゲン原子てある化
合物、Ｒ３がハロゲン原子でＲ，か水素原子てある化合
物、Ｒ，がハロゲン原子でＲ，が低扱アルキル基とくに
メチル基らしくはエチル基である化合物、Ｒ３かピリジ
ル基てＲ２が水素原子である化合物、Ｒ３がピリジル基
でＲ，が低扱アルキル基とくにメチル基らしくはエチル
基である化合物、Ｒ３が水素原子でＲ，がピリノル基で
ある化合物、Ｒ３か低級アルキル基（炭素数１から４の
アルキル基）、とくにメチル基らしくはエチル基であり
Ｒ２がビリジル基である化合物、Ｒ３が水素原子でＲ，
がアルコキシカルボニルアルキル基たとえばエトキン力
ルポニルエチル基である化合物などが挙げられる。

また、好ましくはＲ．が４−ヒドロキシフエニルで置換
されたイミノ基で、Ｒ，が水素原子、Ｒ，およびＲ．が
それぞれ水素原子、ハロゲン原子らしくは置換されてい
てもよいアルキル基、アルケニル基、芳香族基、複素環
基などから選ばれた化合物が挙げられるが、とりわｌナ
Ｒ，およびＲ４が共に水素京子てある化合物、Ｒ，が水
素原子てＲ４が低吸アルキル基とくにメチル基らしくは
エチル基である化合物、Ｒ２が水素原子でＲ４かハロゲ
ン原子である化合物、Ｒ，か低級アルキル基とくにメチ
ル基らしくはエチル基であり、Ｒ４がハロゲン原子てあ
る化合物、Ｒ２がハロゲン原子でＲ４が水素原子である
化合物、Ｒ，がハロゲン原子でＲ４が低扱アルキル基と
くにメチル堪らしくはエチル基であるｆヒ合物、Ｒ，が
ピリジル基でＲ４が水素原子である化合物、Ｒ，がピリ
ジル基でＲ４が低級アルキル基とくにメチル基らしくは
エチル基である化合物、Ｒ２が水素原子でＲ４がピリジ
ル基である化合物、Ｒｔが低扱アルキル基とくにメチル
基もしくはエチル基でありＲ，がピリジル基である化合
物、Ｒｔが水素原子でＲ４がアルコキシカルポニルアル
キル基たとえばエトキシカルボニルエチル基である化合
物などが挙げられる。

また、好ましくはＲ３とＲ４とが組合わされて式 饗 〈ン で表わされる２画の基で、Ｒ２が水素原子、ハロゲン原
子、置換されていてらよいアルキル基、アルケニル基、
芳香族基、複素環基などから進ばれ、とりわけ水素原子
、ハロゲン原子、低級アルキル基とくにメチル基もしく
はエチル基、ピリジル基、アルコキシカルボニルアルキ
ル基たとえばエトキシ力ルポニルエチル基などが挙げら
れる。

本発明で用いられるペルオキシダーゼとしては、種々の
起源のものを用いることができるが、その例としてはた
とえば西洋わさび．パイナップルイチジク．甘藷．ソラ
マメおよびトウモロコシなどから得られるベル才キンダ
ーゼが挙げられ、特に西洋わさびから抽出されたホース
ラデイツンユペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓ
ｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が好ましい。

ペルオキシダーゼは、測定系によってはａ雛型（非漂識
型）として用いるられるが、本発明を用いて免疫化学的
測定を１１なう場合、ベルオキノダーゼを抗原、ハプテ
ン、抗体等の免疫化学的活性物質に結合させる必要かあ
る。

ベルオキンダーゼを免疫化学的活性物質に結合させる方
，去としては、自体公知の方，去を用いることができる
。例えば、グルタルアルデヒド架橋法［イムノケミスト
リー（　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第６巻（
　１９６９年）、第４３頁、同誌Ｊ第８巻（　１９７１
年）、第１１７５頁］、過ヨウ素酸架橋法［ジャーナル
・オプ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミスト
リー（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．
）、第２２巻（　１９７４年）、第１０８４頁］、とり
わけ特開昭５８−１４９７００号公報記載の一般式： ［式中、ｎは０ないし５の整敗を、Ｒ：：ｉ化学結合ま
ｆ二は６員環状炭化水素残梧をそれぞれ示す。

で表わされる拮合剤が有利に用いられる。

化学発光物質としては、ルミノール（　ｌｕｍｉｎｏｌ
）又はその誘導体、ロフイン（ｌｏｐｈｉｎ）、ルノゲ
ニン（ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ）など各種知られている。

好ましくはルミノールまたはその誘導体であり、これら
は“メソッド　イン　エンザイモロノ−（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｃｙｍｏｌｏｇｙ）’　、第５７巻、第
４０９〜４２３頁（　１９８７年）記載のルミノール類
が用いられる。とりわけルミノール、イソルミノールさ
らにＮ　−　（　４−アミノブチル）−Ｎ一エチルイソ
ルミノールへミサクシミド、Ｎ−（６−アミノヘキシル
）−Ｎ一エチルイソルミノール、Ｎ一エチルイソルミノ
ール等が用いられる。これらのうち、ルミノールあるい
はイソルミノールが好都合に用いられる。

本発明で用いられる酸化剤は、化学発光反応により、光
を生じさせることのできる酸化剤でよく、例えば過酸化
水素、過硼酸塩等の酸化剤が宵１１１に用いることがで
きる。さらに、酸化剤が間接的に生成される系でらよく
、例えばグルコースオキシダーゼのような酸素を用いて
グルコースから過酸化水素を生成させるようなシステム
が利用できる。

本発明において、次のような測定システムが用いられる
。

１．ペルオキシダーゼらしくはペルオキシダーゼで標識
した免疫化学的活性物質 ２．酸化剤（過酸化水素らしくはその類似体）３，ルミ
ノールらしくはその誘導体 ４．化合物（Ｉ）（エンハンサー） 多くの場合、ベル才キシダーゼはハプテン、抗原、抗体
等と化学的に結合して用いられる場合が多い。２．３お
よび４の試薬はそれぞれ一定量か用いられ、化学発光量
が微量領域のベル才キシダーゼの変化量に応じて敏感に
変化する条件が還ばれる。化学発光反応は、エンハンサ
ーの採用により、発光反応の遅延が生じ、まｆこ、発光
量においてら極めて増大が認められる。これらの現象に
より、従来の技術に増して、微量の物質か測定できろよ
うになった。

エンハンサーとして化合物（＋）を用いる本発明の化学
発光反応において、通常、下記の条件で実施されること
が望ましい。

反応温度としては０〜６０℃の範囲の温変、特に、５〜
３０℃が望ましい。用いる緩衝液のｐＨとしては、中性
附近からアルカリ性の領域たとえばｐＨ７〜！０、望ま
しくはｐＨ８〜９で実施することができる。用いる緩衝
液としては、斉種援衝液を用いることができるが、硼酸
緩衝液リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液等が有
利に用いることができる。

試薬濃度としては、用いるエンハンサーの種類によって
異なるが、一般的に下記の濃度が好ましい。

（１）ペルオキシダーゼ　　　　　Ｏ〜１０００μ９Ｉ
Ｑ（２）酸化剤（過酸化水素）　　　１μ＼１〜３０．
ｘＭ（３）エンハンサ−　　　　　　　０．１μ■〜Ｉ
Ｏ．ｘＭ（４）発光性物質（ルミノール）ｌμＭ〜ｌｏ
ｚＭとりわけ、（１）としては、θ〜１μ９／１２．　
（２）としては２０μＩｌｌ〜２ｍＭ，（３）としては
４ｇＭ〜ｌｘ〜１、（４）としては１０μＭ〜２ｉＭが
望ましい。

（【）〜（４）を共存さ仕て、化学発光反応を行わせる
わけであるが、通常（１）〜（４）の１つを欠いた系に
、最後の１つの溶液を入れ、化学発光反応を起こさせろ
。反応溶液から生した光を、市販らしくは、自作の測定
装置（例えば、高感変な光電子増倍管を備えたフォトカ
ウンターなど）で測定することができろ。即ち、最後の
液を加えてから、数秒ないし数十分後゛の敗秒ないし数
分間における発光量を測定することで定量に供すること
ができる。

即ち、計測された発光量と、例えばペルオキシダーゼ量
との間に、良好な相関性が認められることになり、この
関係から分析が可能となる。通常、ベル才キシダーゼは
免疫化学的活性物質と共有結合されている場合が多い。

分叶に用いる試料としては、血清、血漿、尿、ｆｆｉ＆
．＆等の生体液や、組織からの抽出液等が挙げられる。

また、化学発光量の計測の方法としては、自体公知の例
えば充電増倍管を装着した市販らしくは自作のルミノメ
ータで測定することができる。これらの装置を利用する
場合、上述の試薬を混合後数秒から数百秒間の待機時間
の後、数秒から数十秒間に発生する発光量か計測される
。

一般式（＋）で表わされる化合物は公知または自体公知
の好適な方法によって製造することができる。チアゾー
ル、オキサゾールおよびイミダゾール製造のための方法
は、この技術分野においてよく知られており、そして例
えば丸善株式会社によって発行された“新実験化学講座
”第１４巻、有機化合物の合成と反応［ＩＶ］　　（１
９７，！ｌ年）による標準方法を参考とすることができ
る。以下に一般式（Ｉ）で表わされる化合物の製造法を
詳述する。

（以下余白） Ａ法 工毘ｌ （■） （■） （式中、Ｒ．は低級アルコキシまたはアラルキルオキシ
を示す）で表わされる基を示す。またはＲ８と４−ヒド
ロキシフエニルとが相合わさって式：工程２ ［上記式中、Ｒ，およびＲ，はそれぞれ水素原子、置換
されていてもよい炭化水素残基または摸素環基を、Ｒ？
は４位に保護されたヒドロキシル基を有するフエニル基
を、またはＲ７とＲ．とが相合わさって式・ で表わされる基を示す。Ｘは酸素原子またはイオウ原子
を、Ｙは脱離基を示す。コ Ｒ６およびＲ８で示される置換されていてもよい炭化水
素残基または複素環基としてはＲ，およびＲ，で例示さ
たものと同様のものがあげられる。

Ｒ７で示される４位に保護されたヒドロキシル基を有す
るフェニル基としては４−メトキシフェニル、４−エト
キシフェニル、４−イソプロボキシフエニル等の４一低
級アルコキシフエニルに加えて４一ベンジルオキンフエ
ニル、ｌｌ−（４−クロロペンジルオキシ）フエニル等
の４−アラルキルオキンフエニルかあげられる。Ｒ，で
示される低級アルコキシとしてはメトキシ、エトキシ、
プロボキシ、イソプロボキシ、プトキシ等が、アラルキ
ルオキシとしてはペンジルオキシ、フェネチルオキシ、
４−クロロペンジルオキシ等があげられる。Ｙで示され
る脱離基としてはハロゲン（例、塩素、臭素、ヨウ素等
）、メタンスルホニルオキシ、ベンゼンスルホニルオキ
シ、ｐ一トルエンスルホニル才キシ基等があげられる。

（工程１） 本法では、まず化合物（ｎ）と一般式（Ｉ［Ｉ）で表わ
されるチオアミドまたはアミド誘導体を反応さ仕チアゾ
ールまたはオキサゾール誘導体（ＩＶ）を製造する。本
反応（工程！）は適宜の溶媒中（例、トルエン、キシレ
ン、ピリジン、１．２−ジクロ口エタン、ｌ．ｌ．２．
２−テトラク口口エタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド、エタノールなど）あるいは
溶媒なしで５０〜２００℃に加熱することにより行われ
る。（［）の便用量は（■）１モルに対して１〜１０モ
ル、好ましくは１５〜４モルである。反応時間は０．５
〜３０時間、このましくは１〜５時間である。

（工程２） 工程ｌで得られた化合物（■）の保護基を除去すること
により化合物（Ｉ−１）を製造する。本脱保護基反応は
臭化水素酸、塩酸、硫酸などの無機酸、塩化アルミニウ
ム等のルイス酸、またはピリジン塩酸塩等を用いる方法
に加えて、Ｒ７がペンジルオキシ誘導体の場合には接触
水素添加による除去によっても有利に行われる。無機酸
類を用いる場合、溶媒としてはアルコール類（例、エタ
ノール、プロパノール、エチレングリコール、２一メト
キシエタノール等）、水あるいはこれらの混合溶媒が用
いられる。無機酸の使用量は化合物（ｆＶ）に対して通
常大過剰（５〜１００当量）、好ましくはｌＯ〜５０当
量、反応温度は５０〜１５０℃で０．５〜２０時間で行
われる。ルイス酸類を用いる脱保護基反応はルイス酸に
対して不活性な適宜の溶媒（例、クロロホルム、ジクロ
口メタン、ベンゼン、二硫化炭素等）中、−１０〜＋１
００℃で行われ、ルイス酸の使用量は（■）１モルに対
して１〜５モル、好ましくは１〜３モルである。反応時
間は０．５〜ｌＯ時間である。ピリジン塩酸塩を用いる
場合、化合物（［１／）とピリジン塩酸塩を５０〜２０
０℃に加熱することにより行われ、ピリジン塩酸塩の使
用量は（ＩＶ）１モルに対してｌ〜５モル、好ましくは
１〜３モルである。反応時間は０．５〜１０時間である
。

Ｂ法 工程！ （Ｖ） （■） 工程２ （■） 工睨３ ［上記式中、Ｒｅ，Ｒ７およびＲ，はそれぞれ前記と同
意義を有する。］ （工程１） 本法ではまず化合物（Ｖ）をアシル化して化合物（■）
を製造する。本アシル化反応はそれ自体公知の方法で行
なうことができ、例えば適宜の溶媒（例、クロロホルム
、ジクロ口メタン、酢酸エチル、テトラヒド口フラン、
水あるいはこれら混合物など）中、塩基（例、トリエチ
ルアミン、Ｎーメチルモルホリン、炭酸水素ナトリウム
、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムな
ど）の存在下に−１０〜＋５０℃で、０．１〜５時間か
けて行われ、（Ｖｌ）の使用量は（Ｖ）１モルに対して
ｔ　−１．２モルである。

（工程２） 次いで化合物（■）を窒素含有環化剤、例えば、尿素ま
たはアンモニアと反応させ才キサゾール誘導体（■〕を
製造する。アンモニアを使用する場合には、アンモニウ
ム塩、例えば酢酸中アセテートの形のものであることが
好ましい。本反応は、例えば化合物（■）を酢酸中、１
〜５当量の酢酸アンモニウムと共に０．５〜ｌＯ時間、
５０〜１１０℃に加熱することにより行われる。

（工程３） 化合物（■）は脱保護基反応の付すことにより（１−２
）が製造される。本脱保護基反応はＡ法、工程２と全く
同様にして行なうことができる。

（以下余白） Ｃ法 工哩！ ＣＩＣＯＯＣｓｆｌｓ １１ｔ−ＣＯＣＩ１−１１．　　−−ラ　Ｒ？　−　Ｃ
ＯＣＨ　−　Ｒａ０Ｈ （Ｖ） ＯＣＯＣ．Ｈ． （ＩＸ） 工程２ （Ｘ） 工程３ 工程４ （Ｘ［） ［上記式中、Ｒ８およびＲ７はそれぞれ前記と同意義を
宵する。］ （工程ｌ） 本法ではまず化合物（Ｖ）をクロロ炭酸フェニルでアシ
ル化して化合物（ＩＸ）を製造する。本アシル化反応は
それ自体公知の方法で行なうことができ、例えば適宜の
溶媒（例、クロロホルム、ジクロ口メタン、酢酸エチル
、テトラヒド口フラン、水あるいはこれら混合物など）
中、塩基（例、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリ
ン、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナト
リウム、炭酸カリウムなど）の存在下にーｌＯ〜＋５０
℃で、０．１〜５時間かけて行なわれ、クロロ炭酸フエ
ニルの使用量は（Ｖ）１モルに対して１〜１．２モルで
ある。

（工程２） 次いで化合物（ＩＸ）を窒素含有環化剤、例えば、尿素
またはアンモニアと反応させオキサゾロン誘導体（Ｘ）
を製造する。アンモニアを使用する場合には、アンモニ
ウム塩、例えば酢酸中アセテートの形のものであること
が好ましい。本反応は、例えば化合物（ＩＸ）を酢酸中
、１〜５当量の酢酸アンモニウムとと乙に０．５〜１０
時間、５０〜１１０°Ｃに加熱することにより行われる
。

（工程３） ついで化合物（Ｘ）をオキシ塩化リンーＮ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド（　Ｖｉｌｓｍｅｙｅｒ試薬）、五酸化
リン等を用いる公知反応により２−クロ口才キサゾール
誘導体（ＸＩ）を製造する。

（工程４） 化合物（ＸＩ）は脱保護基反応に付すことにより（Ｉ−
３）が製造される。本脱保護基反応はＡ法、工程２と全
く同様にして行なうことができる。

（以下余白） Ｄ法 ［式中、Ｒ，、Ｒ４およびＸは前記と同意義を有し、Ｚ
はハロゲン原子を示す。コ 本法では一般式（１）で表わされる化合物のうち、Ｒ，
が水素である化合物（＋−４）をハロゲン化して、Ｒ３
がハロゲン原子（例、塩素、臭素、ヨウ素）である化合
物（１−５）を製造する。本ハロゲン化反応はそれ自体
公知の方法で行なうことができ、例えば当ハロゲン化反
応条件下で不活性な適宜の溶媒（例、クロロホルム、ジ
クロ口メタン、四塩化炭素、テトラヒド口フランあるい
はこれら混合物など）中、塩素、臭素あるいはヨウ素の
存在下に０〜１００℃で、０．１〜５時間かけて行なわ
れ、塩素、臭素あるいはヨウ素の使用量は（■）１モル
に対して１〜５モル、好ましくは１．２〜３モルである
。

一般式（［）て表わさシｔる化合物のづらＲ１が４−ヒ
ドロキンフェニルで置換されたイミノ基である場合、こ
れらの化合物はジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカ
ル・ソサエティー（　Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ　．
　）　，第７１巻、第３８３頁（１９４９年）に記載さ
れた方法に従って合成することができる。

（ト）発明の効果 化合物（＋）を単独もしくは混合して用いることにより
、化学発光性物質を、酸化剤とペルオキシダーゼとで発
光させる系において、発光反応を遅延させるとともに、
発光量を極めて増大させることができる。

以下に参考例、実施例を挙げ本発明をさらに具体的に説
明するが、これらが本発明の範囲を制限するものでない
ことはいうまでもない。

（参考例） ４゜−ヒドロキンアセトフエノン４０９と炭酸カリウム
６０．９９をジメチルホルムアミド２５０ｚＱ中で撹拌
？、これにベンジルブロマイド３６．７ｘＱを滴下し、
室温で１時間反応させ、さらに５０〜６０゜Ｃに加温し
て１時間反応させｆ二、反応液、を水水中に注ぎ升出し
た結晶を濾取しｆこ。メタノールから再結晶し、５５．
４９　（８３．３％）の４゜−ベンジルオキシアセトフ
ェノンを得た。ｍ．ｐ．９３−９４℃ ＮＭＲ　（　ＣＤＣｌ３　）δ：　２．５　（３Ｈ．ｓ
）　，　５．１　（２Ｈ，ｓ），６．９７　（２Ｂ，ｄ
，Ｊ＝９Ｈｚ）　．　７．３６　（５Ｈ，ｍ）　．　７
．１７　（２Ｈ．ｄ．Ｊ＝９Ｈｚ）　． （２）４゜−ベンジルオキシ−２−プロモアセトフエノ
ン４′−ベンジルオキシアセトフエノン５５．０９をク
ロロホルム５００ｚｊ中で撹拌し、臭素１３．０ｉ（２
を室温で３０分間で滴下後、更に１０分間反応させた。

反応液を硫酸ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄
し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ａ！１し結晶を得た
。アセトンーイソプロビルエーテルから再結晶し２５．
７９　（３４．６％）の４゜−ベンジルオキシー２ープ
ロモアセトフェノンを得た。ｍ．ｐ．８１−８２℃．Ｎ
ＭＲ　（　ＣＤＣｌ３　）δ：　４．４　（２ｔＬｓ）
　．　５．１　（２｝１，ｓ），７．０　（２Ｈ．ｄｊ
■９Ｈｚ）　．　７．４　（５１｛，ｍ）　．γ．９５
　（　２１｛，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ） （３）チオホルムアミド 水冷下、撹拌したホルムアミド１０９に五硫化燐５９を
少量ずつ２０分間で加え、室温で１時間反応させた。こ
の後ジエチルエーテル１５ａＱを加えて２０時間撹拌し
た。エーテル層をＡｉｌオイル状生成物５．２９　（　
３Ｌ２％）を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー（溶出溶媒：酢酸エチルーヘキサン（１：１））で精
製しｌ．，６５ｇのチオホルムアミドを得た。

（４）４−　（４−ペンジルオキシフェニル）チアゾー
ル４゜−ベンジルオキシ−２−プロモアセトフェノン３
．０９とチオホルムアミド０．６３９をエタノール５０
２ｇ中で３０分間還流した。反応液を氷水中に注ぎ析出
した結晶を濾取した。ジエチルエーテルで抽出後、シリ
カゲルカラムクロマトグラフィ−（溶出溶媒：塩化メチ
レンーヘキサン（１：９））で精製し７２０ｒｔｔ９　
（２７．７％）の４−（４−ペンジルオキシフェニル）
チアゾールを得た。ジエチルエーテルーヘキサンから再
結晶した。ｍ．ｐ．ｌ０９　−　１１０’Ｃ　．Ｎ〜Ｉ
Ｒ　（ＣＤＣｌ３）δ：　５．１　（２Ｈ，ｓ）　．　
７．０　（２Ｈ．ｄ．Ｊ＝９Ｈｚ）．　７．４　（　Ｉ
Ｈ，ｄ．Ｊ＝２１１ｚ）　，　７．４　（３１１．ｍ）
　．　７．８５　（２Ｈ．ｄｊ＝９Ｈｚ）　．　８．３
　（ｌＨ．ｄｊ・２Ｈｚ）ｆＲ（ＫＢｒ）ν：　１６１
０ｃｍ−’元素分叶＝ＣＩＩＩＨ１３ＳＯＳとして理論
値：　Ｃ，７１．８８　：Ｈ．４．９０　；　Ｎ．５．
２４実測値：　Ｃ，７１．９５　；　ｔｌ，４．８５　
；　Ｎ．５．０１（５）４−　（４−ヒドロキシフェニ
ル）チアゾール４−（４−ペンジルオキシフェニル）チ
アゾール１．１ｇニ４７％臭化水素水１０Ｒ（を加え、
１０　０　’Ｃ、３０分間反応させた。反応液に氷水を
加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩
水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、＃縮した。結
晶をヘキサンを用いて濾取し、４６６ｕ　（６３．８％
）の４−（４ベンジルオキシフェニル）チアゾールを得
た。

塩化メチレンーヘキサンから再結晶した。ｍ．ｐ．１６
１．５−　１６２℃ ＮＭＲ　（　ＣＤＣｌ３　）δ：　５．４　（　ＩＨ．
ｓ）　．　６．８５　（２Ｈ．ｄ．Ｊ・９Ｈｚ），　７
．３５　（　ｌＨ．ｄ．Ｊ＝２１｛ｚ）　．　７．８　
（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）　，８．８　（　Ｉｆ｛，ｄ
．Ｊ＝２Ｈｚ）．ＩＲ（Ｋ［３ｒ）ν：　１６１０，　
　３１００ｃｍ−’元素分肝：　Ｃ，Ｈ，ＮＯＳとして 理論＠　：　Ｃ．６０．９９　．　Ｈ，３．９８　．　
Ｎ，７．９０実測＠　：　Ｃ，６１．００　．　Ｈ．３
．８５　．　Ｎ，７．７８４゜−ベンジルオキシ−２−
プロモアセトフエノン３．０ｇにホルムアミドｌ．ｏａ
（を加え、乾熱で１３０１３５℃、１時間反応さ什た。

反応物に水を加え、炭酸水素ナトリウム溶液でアルカリ
性とし酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩
水で洗浄後、活性炭で処理し、無水硫酸ナトリウムで乾
燥、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィ−（溶出溶媒：酢酸エチルーヘキサン（［：９））で
精製し、４１ｏｙｒ’ｉ　（　１６．６％）の４−（４
−ペンジルオキシフエニル）オキサゾールを得た。ジエ
チルエーテルーヘキサンから再結晶した。ｍｐ　１０１
１０２℃， ＮＭＲ　（ＣＤＣＩ３）δ：　５．１　（２ｆ｛，ｓ）
　，　７．０　（２｝１．ｄ．Ｊ：９Ｈｚ）．　　７．
４　（５１１，ｍ）　，　　７．７　（２Ｈ．ｄ．Ｊ＝
９１１ｚ）　．　　７．８　（ＩＨ．ｓ）．　　７．９
　（　ＬＨ．ｓ） （２）４−　（４−ヒドロキシフエニル）オキサゾール
４−（４−ペンジルオキシフエニル）オキサゾール３６
（Ｌｙ９をメタノール（（ＬｔＱに溶かし、５％パラジ
ウム炭素（５０％含水）　３００ｒ９を加え、８０分間
接触還元した。反応液を濾過により触媒を除き、ａ縮し
た。残渣をシリカゲルカラムクａマトグラフィー（溶出
溶媒：酢酸エチルーヘキサン（１：２））で精製し、１
０５ｉｙ　（　４５．５％）の４−（４−ヒドロキンフ
エニル）オキサゾールを得た。ジエチルエーテルーヘキ
サンから再結晶した。ｍｐ　１４７．５　−　１４８’
Ｃ　．ＮＭＲ　（　ＣＤＣＩ３）δ：　５．７　（ＩＨ
，ｓ）　，　６．９　（２Ｈ．ｄ．Ｊ＝９Ｈｚ）．　７
．７　（２Ｈ．ｄ，Ｊ＝９１１ｚ）　．　７．９　（Ｉ
Ｈ．ｓ）　．　８．０　（ＩＨ，ｓ） ＩＲ（ＫＢｒ）ν：　３３５０，　３ＨＯｃｍ元素分叶
二Ｃ，Ｈ，Ｎｏ，として 理論直：　Ｃ，６７．０８　．　Ｈ，４．３ｇ　．　Ｎ
，８．６９実測値：　Ｃ．６７．０６　．　ｌ｛．４．
４２　．　Ｎ．８．５７（実施例） 実施例１ 試薬 ルミノールナトリウムは水酸化ナトリウムから再結晶し
て用いた、西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｉ｛ＲＰ．）
はＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製ＴｙｐｅＶＩを用
いた。

分針装置 化学発光反応は１２ｘｘＸ　７５ｘｚのガラス製使い捨
てカルチャーチューブ（　Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）中で行
なった。発光はルミノメータ（アロカ社製．　ＢＬＲ−
２０１）を用いて測定した。

！．エンハンサーのスクリーニング ルミノール溶液は、ルミノールナトリウム（ｌ２．５ズ
９）及び過酸化水素水（１５μｃ，　３１％）をほう酸
緩衝液（０．２モル濃度、ｐＨ８．５）　５０ｔｔｒσ
に加えて調製した。｝ＩＲＰ溶液は、ＨＲＰをほう酸緩
衝液（０．２モル濃度、ｐＨ８．５）で希釈して調製し
た。いずれの溶液ら使用の約２時間前に調製し、水冷し
た。

ルミノール溶液９９０μｅに使用直前に、増感剤となる
サンプルのジメチルスルホキンド溶液ｌＯμＱを加え混
合しｆ為　このルミノール／過酸化水素／増感印１の１
昆合１夜１００μｃとＨＲＰ溶ｉ＆　（ｌｎｇ＃＋（！
　）　ｌＯｈｌ２をカルチャーチューブ中で混合し、５
分後の信号／バックグラウンドの比の改善を測定した。

結果を第１表に示す。

（以下余白） 第１表 ２．用量作用曲線の測定 ルミノール溶液はルミノールナトリウム（５２９）及び
過酸化水素水（１２μ１．３１％）をほう酸援衝液（０
．２モル濃度、ｐＨ８．５）　５０肩Ｑに加え、調製し
た。

ＨＲＰ溶液は、ＨＲＰをほう酸緩衝液（０．２モル濃度
、ｐＨ８．５）で希釈して調製した。いずれの溶液ら使
用の約２時間前に調製し、水冷した。

ルミノール溶液９９０μｅに使用直訂に、増感剤となる
サンプルのジメチルスルホキシド溶液ｌＯμＱを加え混
合した（ｐ−ヨードフェノール４０ｍＭ，４−（４−ハ
イドロキシフェニル）オキサゾール４ｓ＋Ｍ，４−（４
−ハイドロキシフエニル）チアゾール４ｘＭ，２−エチ
ル−４−　（４−ハイトロキシフェニル）−５−（３−
ピリジル）チアゾール４０！Ｍを用いた）。このルミノ
ール／過酸化水素／増感剤の混合液１００ｕｆ２と｝Ｉ
ＲＰＩＯ倍段階希釈溶液（０　〜ｌＯｒ＋９／ｘｌ２）
１００μＱをカルチャーチューブ中で混合し、５分後の
信号を測定した。結果を第２表に示す。

（以下余白） 第２表 ■剤号ンブル （１）：ｐ−コードフェノール （２）：４−（４−八イドｌ］キン７エニル）オキ号ゾ
ール（３）：４−（４−八イドＩ］キンフェニル）チア
ゾール（４）：２−エチル−４−（４−八イド［＋キノ
７エニル）−５−（３−ビリジル）チアゾール第１図に
ＨＲＰ！Ｉｆと信号との関係を示した。

第１図より各々の化合物を用いた場合の｝｛ＲＰの検出
限界を求めたところ、以下のようになった。

（１）ｐ−：ｌ−Ｆフェノール （２）４−（４−ハイド［＋Ａノフェニル）オ唇ゾール
（３）４−（４−ハイドａキゾフ１ニル）チアゾール（
４）２−エチル−４−（４−ハイドロキシフェニル）−
５−（３−ビリノル）チ７ゾール５０１’ｇ／πＱ １０　ｐｇ／λク ３ｐｇ／頭 １０ｐｇ／ｒ；＋（ 実施例２　　ｈＣＧの測定 ｌ．抗ｈＣＧ−β−ＣＴＰの精製 （１）Ｐｉベプタイド［　ｈＣＧ一βＣ端ベプチド（１
２３−１４５）］により免疫したウサギ抗血清５ｉｆ２
に飽和硫安溶液３．３ｍ（ｌを加え３０分間、室温で撹
拌した。

１０．０００回転で１０分間遠心後、沈殿を生理食塩水
５ｊ！Ｃに溶かした。

（２）飽和硫安溶液２．１ｘ（ｌを加え３０分間、室温
で撹拌した。１０，０００回転で１０分間遠心後、沈殿
を生理食塩水！５ｍＱに溶かした。

（３）０．０２Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．０）で一夜透
析した後、１０．０００回転でｌＯ分間４℃で遠心し沈
殿を除いた。

（４）Ｐｌベプタイド固相化ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ
アフイニティカラムに付した。透析物をカラムにのせた
後、０．０２Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．０）、続いてＯ
．１７Ｍグリンン緩衝液（ｐｆ｛３．０）で洗浄した後
、３八１チ才シアンナトリウム緩衝液（ｐｌ｛７．４）
により溶出した。

（５）溶出画分を集め、生理食塩水（含０．０１％ナト
リウムアジド）で一夜透析し、抗ｈＣＧ−β一ＣＴＰＩ
Ｓ液とした。２８０ｎｍの吸収を測定し、蛋白濃度２１
９．２μ９／ｍ（！，全ｆｌｌ．６４ｕと決定した。

２，抗ｈＣＧ一β一ＣＴＰ固相化ポリスチレンビーズの
作製 （１）ポリスチレンビース（径４．４＊ｚ）を２Ｎ水酸
化ナトリウム中で２時間撹拌後、蒸留水で洗浄した後乾
燥した。ついで２Ｎ塩酸中で２時間撹拌後、蒸留水で洗
浄した後乾燥した。

（２）抗ｈＣＧ一β一ＣＴＰを０，１λ１炭酸緩衝液（
ｐＨ９．５）に溶解し、ポリスチレンビーズを加え、３
日間、４℃で放置した（抗ｈｃｃ−β−ＣＴＰ−１μ９
／ボリスチレンビーズ１個）。

（３）生理食塩水で洗浄後、ｌ％ＢＳＡ溶液を加え、１
日、４℃で放置した。

（４）生理食塩水で洗浄後、０．１％ＢＳＡ溶液を加え
、４℃で保存した。

３．測定 （１）種々の量のｈＣＧを含有する試料１００μＱを０
．０２Ｍリン酸緩衝液（含１０％仔牛血清）１００μ夕
と混合し、抗ｈＣＧ一β−ＣＴＰ固相化ポリスチレンビ
ーズを加え、室温で一夜放置した。

（２）蒸留水で洗浄後、抗ｈＣＧ／ＨＲＰ複合体希釈液
２００μＱを加え、室温で２時間放置した。

（３）蒸留水で洗浄後、ビーズを発光測定用の試験管に
移し、１００μＭルミノール、３００μ■過酸化水素、
増感剤４０μＭ　４−　（４−ハイドロキシフエニル）
チアゾールを含む溶液を加え、発光を開始させた。■分
後の発光量を測定した。ｈＣＧの検出限界はＯ．ＱＯ５
ｍｌｔｌ／ｘＱであった。

実施例３　エンドセリンの測定 操作方法 ９６ウエルのマイクロタイタープレート（ＤＹＮＡ−Ｔ
ＥＣＨ　ｍｉｃｒｏＦＬＵＯＲ’，　Ｄｙｎａｔｅｃｈ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，米国）の各ウエルに、
鈴木ら［ジャーナル　オブイムノロジカル　メソッド（
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ’　Ｉｍｍｕｎ−ｏ１ｏｇｉｃａ
ｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）　．第１１８巻＜　１９８９年）
　，　２４５頁］の方法によりモノクロナール抗エンド
セリン抗体（ＡｗＥＴＮ４０）を加えて、抗体結合マイ
クロプレートを作製した。次に．１０％Ｂｌｏｃｋ　Ａ
ｃｅ’　（雪印乳業製）　，　０．４Ｍ　ＮａＣ！，　
　ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７）に溶解したエンドセリンの０．０．２．　０．
５およびｌｐｇｈＱの溶液１００ｕｆ２をぞれぞれのウ
エルに加えて、６°Ｃで１６時間インキユベートした。

０．８％ＮａＣｌを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液で洗浄
後、上記の鈴木らの文献記載のポリクローナル抗エンド
セリン抗体−ＨＲＰ複合体溶液１００μｅを各ウエルに
加えて同様に６℃で２４時間インキユベートした。リン
酸緩衝液で洗浄後、プレートに結合したＨＲＰ活性を本
発明の化学発光増強法により測定した。

即ち、２ｍＭルミノール，　５００ｕＮＩ過酸化水素．
増感剤２０μＭ４−（４−ハイドロキシフエニル）チア
ゾール、０．２５％エタノール、０．０２ｍＭ　ＥＤＴ
Ａを含む、０．１Ｍトリス援衝液（ｐＨ８．７）　１０
０ｇＣを加えて発光を開始させ、マイクロプレート用化
学発光自動測定装装置Ｓｌｏｄｅｌ　ＭＬＩＯＯＯ　（
Ｄｙｎａｊｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，米国
）で測定した（０．２５秒計測）。

結果を第２図に示したように、ウエルあたりｏ．ｏ３ｐ
ｇのエンドセリンが測定可能であり、極めて高感度であ
った。

第 図

【図面の簡単な説明】

第１図は発光量とＨＲＰｉ：１１度の関係を示す図であ
る。 ＨＲＰ遮＆　Ｐ９／ｍｌ 手続補■｛

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、化学発光性物質を酸化剤とペルオキシダーゼとで発
   光させる系において、 一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＿１は酸素原子、硫黄原子または４−ヒドロ
   キシフェニルで置換されていてもよいイミノ基を、Ｒ＿
   ２、Ｒ＿３およびＲ＿４はそれぞれ水素原子、ハロゲン
   原子、置換されていてもよい炭化水素残基または置換さ
   れていてもよい複素環基を、またはＲ＿３とＲ＿４とが
   相合わさって式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿５は水素原子またはヒドロキシル基を示す
   ）で表わされる２価の基を示す。ただし、Ｒ＿１が酸素
   原子、硫黄原子またはイミノ基の場合、Ｒ＿４は４−ヒ
   ドロキシフェニル基を示し、Ｒ＿１が４−ヒドロキシフ
   ェニルイミノ基の場合、Ｒ＿３は水素原子を示す］で表
   わされる化合物を共存させることを特徴とする化学発光
   増強法。 ２、化合物（ I ）が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２およびＲ＿３は請求項１記載と
   同意義］で表わされる化合物である請求項１記載の増強
   法。 ３、化合物（ I ）が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＿２およびＲ＿４は請求項１記載と同意義］
   で表わされる化合物である請求項１記載の増強法。 ４、化合物（ I ）が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２およびＲ＿５は請求項１記載と
   同意義］で表わされる化合物である請求項１記載の増強
   法。 ５、化学発光性物質がルミノールである請求項１記載の
   増強法。 ６、ペルオキシダーゼが免疫化学的活性物質との化学的
   結合体である請求項１記載の増強法。 ７、化合物（ I ）か４−（４−ハイドロキシフェニル
   ）チアゾールである請求項１記載の増強法。 ８、化合物（ I ）が４−（４−ハイドロキシフェニル
   ）−２−メチル−チアゾールである請求項１記載の増強
   法。 ９、化合物（ I ）が４−（４−ハイドロキシフェニル
   ）−２−（３−ピリジル）チアゾールである請求項１記
   載の増強法。