JPH02231564A - バルビツール酸塩の検出方法、それに用いるトレーサー化合物およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、流体、とりわけ血清、血漿または尿などの生
物学的流体中のパルビッール酸塩の量を決定するための
蛍光偏光イムノアッセイ法、それに用いる試薬および該
試薬の調製法に関する。さらに詳しくは、本発明は（１
）試料中のバルビツール酸塩の量を決定するための試薬
（トレーサーおよび抗体）、（２）抗体を産生させるの
に用いる免疫原化合物、（３）該トレーサーおよび該免
疫原化合物の合成法、および（４）アッセイ分析法に関
する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）バル
ビツール酸塩（ｂａｒｂｉｔｕｒａｔｅｓ）は、中枢神
経系抑制薬である。治療学的には、バルビツール酸塩は
鎮静薬、催眠薬および抗痙学薬として用いられる。バル
ビツール酸塩を合法的に入手することは難しくなったと
はいえ、しばしば乱用される鎮静薬または催眠薬であり
、一般に自殺をするのに用いられる。

バルビッール酸塩の生理学的吸収、活性および毒性は幅
広く変化し、５一置換基およびイミノ水素原子の性質に
依存する。血中の約３５％のバルビツール酸塩は血漿タ
ンパク質に結合している。

バルビツール酸塩は種々の組織および器官に分布してい
る。バルビツール酸塩は主として肝臓中で代謝され、若
干の例外を除いて一般に主として非活性代謝物として尿
中に排泄される。

最も一般に乱用されるバルビツール酸塩は、作用時間の
短いものから中間位のセコバルビクール、ベントバルビ
タール、アモバルビタールなどである。これらは、興奮
薬の使用による興奮状態をなだめるために広く用いられ
る。慢性的な使用によりこれらの薬に対する耐性が生じ
ることがあり、また過量摂取かまたは突然の投与中止に
より死を招くことがある。

過去においては、尿中のバルビツール酸塩レベルは高速
液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグ
ラフィー（ＧＣ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、基
質結合蛍光イムノアッセイ（ＳＬ，ＦＩＡ）およびラジ
オイムノアッセイ（Ｒ　Ｉ　Ａ）により一般に測定され
てきている。これらの方法は薬物レベルを検出するのに
適度に特異的であるが、欠点がないわけではない。ＨＰ
ＬＣおよびＧＣは試料抽出法を必要とし、またアッセイ
時間も長い。

ＥｒＡおよびＳｔ，Ｆ［Ａの両者はともに酵素反応を含
み、以下のような欠点を有する。

（１）試薬が比較的に不安定である。

（２）Ｅ　Ｉ　ＡまたはＳＬＦ’ＩＡ中の酵素反応に影
響を与える生物学的試料中のいかなる成分（酵素阻害剤
や同様の反応を触媒する酵素など）もアッセイ結果に影
響する。

（３）ＥＩＡおよびＳＬＦＩＡでは吸光度かまたは蛍光
を測定するが、吸光度または蛍光に影響を与える生物学
的試料中のいかなる成分（脂質、ヘモグロビン、ビリル
ビンまたは他の発色団または蛍光団など）もこれらのア
ッセイから得られる結果の正確さに影響する。

ＲＩＡ試薬は、以下のような欠点を有する。

（１）貯蔵寿命が短い。

（２）放射能の危険性がある。

（３）放射活性物質の貯蔵および廃棄に付随した問題が
ある。

薬物および他の物質のアッセイにおいては、蛍光偏光競
合結合イムノアッセイより一層満足のいく代替手段を提
供される。一般に、競合結合イムノアッセイは試験試料
中のリガンドを測定するために用いられる（本明細書に
おいて「リガンド」とは競合結合イムノアッセイにより
定量しようとする生物学的に興味ある物質をいう）。リ
ガンドは、標識試薬、すなわち「リガンド類似体」また
は「トレーサー」と、該リガンドおよびリガンド類似体
に特異的な抗体上の限られた数の結合部位について競合
する。試料中のリガンドの濃度は、抗体に結合するリガ
ンド類似体の量を決定する。リガンドおよびリガンド類
似体はそれぞれの濃度に比例して抗体に結合するので、
抗体に結合するリガンド類似体の量は試料中のリガンド
の濃度に反比例する。

蛍光偏光により、競合結合イムノアッセイ中に生成した
トレーサ一一抗体結合体の量を測定する定量手段が得ら
れる。蛍光偏光法は、蛍光標識化合物を平面偏光で励起
させたときにその化合物の分子回転の速度と反比例した
度合の偏光を有する蛍光を放出するという原理に基づい
ている。従って、蛍光標識を有するトレーサ一一抗体結
合体を平面偏光で励起したときは、光の吸収と放出との
間に蛍光団は抗体により回転が束縛されているので、放
出された光は偏光が大きいままである。これとは対照的
に、未結合トレーサーを平面偏光で励起したときは、そ
の回転は対応するトレーサ一一抗体結合体よりもはるか
に速い。その結果、未結合トレーサー分子から放出され
る光は脱偏光している。

尿中のバルビツール酸塩および他の「乱用薬物」の正確
な決定をこれまで妨げてきた問題は、リボフラビンの妨
害によるものである。リボフラビンすなわちビタミンＢ
，は、多くの食品および市販のビタミン補給剤の一般的
な成分である。リボフラビンは主として尿中に排泄され
、フルオレセインと極めて類似した蛍光スペクトルを有
する。その結果、尿試料中にリボフラビンが並の量で存
在しているだけで誤った結果を引き起こし得るような妨
害を生じさせる。リボフラビンの通常の摂取では尿中の
りボフラビン量は痕跡量以上になることはないが、バル
ビッール酸塩使用の検出を妨害せんとする人によりビタ
ミン補給剤が過剰量で摂取された場合には試験結果は容
易に間違ったものとなり得る． 本発明は、感度の高いトレーサー、該トレーサーの製造
法、および該トレーサーを用いたアッセイがリボフラビ
ンの妨害なくバルビッール酸塩を決定するために特に提
供されるという点で当該技術分野において進歩をもたら
すものである。

（課題を解決するための手段） 本発明は、バルビツール酸塩の蛍光偏光アッセイ法、該
アッセイに用いるトレーサー、免疫原および抗体、およ
び該トレーサー、免疫原および抗体の製造法に関する。

本発明は、一般式（Ｉ）： Ｏ ［式中、Ｗは酸素原子または硫黄原子：Ｒ．は炭素数の
合計が１〜ｌ２で直鎖もしくは分枝鎖状に配列し２個ま
での脂環もしくは芳香環構造を含むアルキル基、アルケ
ニル基またはアルキニル基； Ｒ，は式：ＣＨａ−Ｒ−Ｚ−Ｑ（式中、Ｑはポリ（アミ
酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または他の免疫学的に活
性な担体、またはフルオレセインまたはフルオレセイン
誘導体： ＺはＱがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体で
あるときにＮＨ，ＧＯ％ＯＳ．ＳＯ．＊たはＣ＝ＮＨ，
Ｑがポリ（アミノ酸）またはポリ（アミノ酸）誘導体ま
たは他の免疫学的に活性な担体であるときにＣＯ、Ｏ−
ＣＯＮＨ．Ｎ％ＮＨ，Ｎ＝ＮまたはＣＨ．． Ｒは炭素数とヘテロ原子数の合計がθ〜２ｏで直鎖また
は分枝鎖状に配列しており２個までの環構造を含む連結
基であり、Ｑがポリ（アミノ酸）またはポリ（アミノｗ
ｔ）誘導体または他の免疫学的に活性な担体であるとき
に７個までのヘテロ原子を含んでおり、Ｑがフルオレセ
インまたはフルオレセイン誘導体で連結基が環構造を含
んでいないときに１０個までのヘテロ原子を含んでおり
、またＱがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体
であり連結基が１個または２ｆｌの環構造を含んでいる
ときに１２６１までのヘテロ原子を含んでいるものであ
る）］で示される化合物； 一般式（１“）： ［式中、Ｗは酸素原子または硫黄原子；ＲＩは炭素数の
合計が１〜ｌ２で直鎖もしくは分枝鎖状に配列し２個ま
での脂環もしくは芳香環構造を含むアルキル基、アルケ
ニル基またはアルキニル基： Ｒ１は式：ＣＨ＊−Ｒ“−Ｙ（式中、ＹはＮＨＩ、Ｃ０
０Ｈ，ＧＯＣＩ，ＳＯｓＨ，ＳＯ＊Ｃｌ、ＳＨ，ＣＨＯ
％ＣＮ，ＯＨまたは■； Ｒ゜は１０個までのヘテロ原子を有し炭素数とヘテロ原
子数の合計が０〜２０で直鎖または分枝鎖状に配列して
おり２個までの脂環もしくは芳香環構造を含む連結基で
ある）で示される基］で示される前駆体をフルオレセイ
ンまたはフル才レセイン誘導体と結合させる ことを特徴とするトレーサーの製造方法：および生物学
的流体中のバルビツール酸塩の存在を検出ずる方法であ
って、 （ａ）試料をバルビツール酸塩抗血清、および該バルビ
ツール酸塩抗血清の存在に対して検出可能な蛍光偏光応
答を生じさせ得る請求項（１）記載のトレーザー化合物
と接触させ、 （ｂ）上記工程（ａ）で得られた溶液に平面偏光を通し
て蛍光偏光応答を得、ついで （ｃ）上記工程（ｂ）の溶液の蛍光偏光応答を検出して
試料中のバルビツール酸塩の存在を測定することを特徴
とする方法 を提供するものである。

本発明の第一の態様は、新規な構造を有する新規なトレ
ーサーおよび免疫原に関する。本発明の第一の態様によ
れば、本発明のトレーサーおよび免疫原はともに一般式
（■）： ［式中、Ｗは酸素原子または硫黄原子；Ｒ１は炭素数の
合計が１〜Ｉ２で直鎖もしくは分枝鎖状に配列し２個ま
での指環もしくは芳香環構造を含むアルキル基、アルケ
ニル基またはアルギニル基： Ｒ，は式：ＣＨ！−Ｒ−Ｚ−Ｑ（式中、Ｑはポリ（アミ
ノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または他の免疫学的に
活性な担体、またはフルオレセインまたはフルオレセイ
ン誘導体； ＺはＱがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体で
あるときにＮＨ，Ｇｏ、ｃｓ，ｓｏ．またはＣ＝ＮＨ，
Ｑがポリ（アミノ酸）またはポリ（アミノ酸）誘導体ま
たは他の免疫学的に活性な担体であるときにＣＯ、Ｏ−
ＣＯＮＨ，Ｎ，ＮＨ，Ｎ；ＮまたはＣＨ．； Ｒは炭素数とヘテロ原子数の合計が０〜２０で直鎖また
は分枝鎖状に配列しており２個までの環構造を含む連結
基であり、Ｑがポリ（アミノ酸）またはポリ（アミノ酸
）誘導体または他の免疫学的に活性な担体であるときに
７個までのヘテロ原子を含んでおり、Ｑがフルオレセイ
ンまたはフルオレセイン誘導体で連結基が環構造を含ん
でいないときにｌＯ個までのヘテロ原子を含んでおり、
またＱかフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体で
あり連結基が１個または２個の環構造を含んでいるとき
に１２個までのヘテロ原子を含んでいるものである）］
で示される構造を有する。

一般式（Ｉ）においてＱがポリ（アミノ酸）、その誘導
体または他の免疫学的に活性な担体であるときは、該化
合物は免疫原として用いることができる。また一般式（
Ｉ）においてＱがフル才レセインまたはその誘導体であ
るときは、該化合物はトレーサーとして用いることがで
きる。

好ましい態様においては，トレーサーおよび免疫原は、
一般弐〇）においてＷＳＲ．およびＱが前記と同じであ
り、 Ｒ．が直鎖または分枝鎖状に配列しＬ個までの指環また
は芳香環構造を含む炭素数の合計が２〜７のアルキル基
であり、 ＺがＱがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体で
あるときにＮＨまたはＣＯ、Ｑがポリ（アミノ酸）また
はポリ（アミノ酸）誘導体または他の免疫学的に活性な
担体であるときにＣＨ，であり、Ｒが炭素数とヘテロ原
子数の合計が０〜ＩＯで直鎖または分枝鎖状に配列して
おり１個までの環構造を含む連結基であり、Ｑがポリ（
アミノ酸）またはポリ（アミノ酸）誘導体または他の免
疫学的に活性な担体であるときに４個までのヘテロ原子
を含んでおり、Ｑがフルオレセインまたはフルオレセイ
ン誘導体で連結基が環構造を含んでいないときに６個ま
でのヘテロ原子を含んでおり、またＱがフルオレセイン
またはフルオレセイン誘導体であり連結基が１個または
２個の環構造を含んでいるときに６個までのヘテロ原子
を含んでいるものである構造を有する。

本発明の第二の態様は、上記新規な免疫原により産生じ
た抗体に関する。本発明の第二の聾様によれば、抗体は
一般式（１）においてＱがポリ（アミノ酸）またはその
誘導体または他の免疫学的に活性な担体である化合物に
対する応答により産生される。

本発明の第三の態様によれば、免疫原は、一般式（Ｉ’
）： ［式中、Ｗは酸素原子または硫黄原子；ＲＩは炭素数が
１−１２で直鎖もしくは分枝鎖状に配列し２個までの指
環もしくは芳香環構造を含むアルキル基、アルケニル基
またはアルキニル基；Ｒ．’は式：ＣＨ＊−Ｒ’−Ｘ（
式中、ＸはＮＨ，、Ｃｔ，Ｂｒ１　１，ＯＨ，ＣＯｔＨ
，Ｏ−Ｃ−ＣＩ，Ｒ゛は７個までのヘテロ原子を有し炭
素数とヘテロ原子数の合計がＯ〜２０で直鎖または分枝
鎖状に配列しており２個までの環構造を含む連結基であ
る）で示される基］で示される化合物をポリ（アミノ酸
）、ポリ（アミノ酸）誘導体または他の免疫学的に活性
な担体と結合させる ことを特徴とする方法により製造される。

本発明の第四の態様によれば、一般式（ビ）：［式中、
Ｗは酸素原子または硫黄原子；Ｒ１は炭素数が１−１２
で直鎖もしくは分枝鎖歌に配列し２個までの脂環もしく
は芳香環構造を含むアルキル基、アルケニル基またはア
ルキニル基；Ｒ，′は式：ＣＨ．−Ｒ”一Ｙ（式中、Ｙ
はＮＨ．、Ｃ００Ｈ，ＣＯＣＩＳＳＯ．Ｈ％ＳＯ＊Ｃｌ
，ＳＨ，ＣＨＯ、ＣＮ，ＯＨまたはｒ： Ｒ”はＩＯ個までのヘテロ原子を有し炭素数とヘテロ原
子数の合計が０〜２０で直鎖または分枝鎖状に配列して
おり２個までの指環もしくは芳香環構造を含む連結基で
ある）で示される基］で示される化合物をフルオレセイ
ンまたはフルオレセイン誘導体と結合させる ことを特徴とするトレーサーの製造法が提供される。

好ましくは、トレーサーは、一般式（ビ）において、Ｗ
およびＲ．′は前記と同じであり、Ｒ，が環構造を含ま
ない分枝鎖状に配列した炭素数４〜５のアルキル基であ
り、ＹがＮＨ．またはＣＯｏ１］であり、Ｒ”が３ｍま
でのヘテロ原子を有し炭素数とヘテロ原子数の合計が３
〜５で直鎖または分枝鎖状に配列しており環構造を含ま
ない連結基である構造を有する前駆体を結合させること
により製造する。

フルオレセインの好ましい誘導体としては、アミノ、ア
ミド、アミジノ、一尿素、チオ尿素、カルバミド、チオ
カルバミドまたはトリアジニルアミノ誘導体が挙げられ
る。現在の時点で最も好ましいのはアミノ誘導体であり
、特にアミノメチルフル才レセインが最も好ましい。

本発明の第五の態様は、リボフラビンによる潜在的な蛍
光妨害の除去に関する。リボフラビン結合タンパク質（
ＲＢＰ）を各試料に直接加えるかまたはアッセイに用い
るｌまたは２以上の試薬に加えると、該リボフラビン結
合タンパク質（ＲＢＰ）はすべてのりボフラピンと結合
してＲＢＰ−リボフラビン複合体を生成し、かくして蛍
光妨害を除去する●他の蛍光停止（ｆ　ｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｃｅ　−　ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）物質もまたこの目
的のために利用することができる。

本発明の第六の態様によれば、バルビツール酸塩の濃度
の検出もしくは測定方法が提供される。

試料をバルビッール酸塩抗血清、および該バルビツール
酸塩抗血清の存在に対して検出可能な蛍光偏光応答を生
じさせ得るフルオレセイン含有バルビツール酸塩誘導体
と接触させる。ついで、この溶液に平面偏光を通して蛍
光偏光応答を得、この応答を検出して試料中のバルビッ
ール酸塩の量を測定する。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

本発明は、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体
を使用することを含む。特に、本発明のトレーサー化合
物として有用であるために必要なフル才レセインおよび
その誘導体の性質は、フルオレセインの蛍光である。フ
ル才レセインは、環境の酸濃度（ｐｉ−｛）に依存して
２種の互変異性体として存在する。

開環（酸）形では、幾つかの共役二重結合が存在し、こ
れら結合のためにこの形のフル才レセイン（およびフル
オレセイン残基を含有する化合物）が青色の光を吸収し
、約４ナノ秒の励起状態寿命の後に緑色の蛍光を放出す
ることが可能となる。開環形と閉環形とが共存するとき
は、開環形および閉環形で存在する分子の相対濃度は、
ｐｉ｛レベルを調節することにより容易に変化する。一
般に、本発明のトレーサー化合物は溶液中ではナトリウ
ム、カリウム、アンモニウムなどの生物学的に許容し得
る塩として存在するため、本発明の分析法に用いたとき
には該化合物は開環した蛍光形で存在することか可能と
なる。存在する特定の塩は、ｐＨレベルの調節に用いた
バッファーに依存する。

たとえば、リン酸ナトリウムバッファーの存在下では、
本発明の化合物は一般にナトリウム塩として開環形で存
在するであろう。

本明細書において個々の化合物としてかまたは一ａ大き
な化合物の成分として用いられている「フルオレセイン
」なる語は、蛍光を問題とするとき以外は、特定の分子
として存在する限り開環形および閉環形の両方を含む。

蛍光を生じるためには開環形であることが必要である。

フルオレセイン分子の炭素原子の番号付けは、該分子の
開環形または閉環形のいずれを考慮するかによって異な
る。従って、フルオレセインおよびその化合物に関する
文献は、炭素原子の番号付けに関しては統一されていな
い。閉環形においては、フェニル環上のラクトンのカル
ボニルのバラ位の炭素原子は番号が６である。開環形で
は、フエニル環上のカルボン酸基のパラ位の炭素原子は
番号が５である。本明細書では閉環形の番号付けを採用
することにする。というのは、合成に用いる原料物質は
この系列で番号付けをしていることが最も一般的である
からである。それゆえ、フル才レセインおよびその化合
物のカルボキシル基の反対側にある炭素原子は、本明細
書の目的からいうと番号が「６」である。

抗体と複合体を生成していない溶液中のトレーサーは、
吸収および蛍光の再放出に必要な時間よりも短い間自由
に回転することができる。その結果、再放出された光は
比較的でたらめに配向しており、抗体と複合体を生成し
てないトレーサーの蛍光偏光は小さく、Ｏに近付く。特
異的な抗体と複合体を生成すると、このようにして生成
したトレーサ一一抗体複合体は抗体分子の回転を担うが
、該回転は比較的小さなトレーサー分子のものよりも遅
く、それゆえ観察される偏光は増大している。

それゆえ、抗体部位への結合についてリガンドがトレー
サーと競合するときには、遊離トレーサーとトレーサ一
一抗体複合体との混合物の蛍光の偏光を観察すると、ト
レーサーのものとトレーサー−抗体複合体のものとの中
間の値となる。試料が高濃度のリガンドを含んでいると
、観察される偏光値は遊離のトレーサーの値に近付く、
すなわち低くなる。試験試料が低濃度のリガンドを含有
している場合には、偏光値は結合トレーサーの値に近付
く、すなわち高くなる。イムノアッセイの反応混合物を
垂直偏光および水平偏光で連続的に励起させ、放出され
た光の垂直成分のみを分析することにより、反応混合物
における蛍光偏光を正確に決定することができる。決定
しようとするリガンドの濃度と偏光との間の正確な相関
関係は、既知農度のりガンドを有するカリブレーターの
偏光値を測定することにより確立される。試料中のリガ
ンド濃度は、このような方法により作成した標準曲線か
ら外挿することができる。

以下に詳述するように、本発明に従って調製した特別の
抗体およびトレーサーにより、極めて良好なアッセイが
提供されることがわかった。

Ｕ 上述したように、本発明の免疫原およびトレーサーは、
ともに一般式（　ｔ　’）で示すことができる。

目的は、抗体の認識部位に対してバルビッール酸塩とト
レーサーとの間で競合を起こさせることにある。この目
的を達成するために、ハブテンおよびトレーサーの構造
を広範囲に変えることが可能である。本発明の目的にと
って「ハブテン」とは免疫原の前駆体であって、一般に
免疫学的に活性な担体と結合するのに適した基を有する
置換パルビツール酸塩誘導体からなる。

免疫原の構造 使用可能な抗体は、種々のバルビツール酸塩誘導体から
調製することができる。環上の５位において官能化した
化合物から調製した免疫原は、動物において抗体を産生
ずることができる。そのような抗体は、適当なトレーサ
ーと組み合わせて用いると本発明のバルビツール酸塩ア
ッセイにおいて有用である。

本発明の免疫原は一般式（Ｉ）で示される一般構造を有
しており、また本発明の好ましい態様においては一般式
（１）で示した一般構造から由来させて免疫原を調製す
ることもできる。免疫原は、下記合成法および実施例で
も説明するように、一般式（１）で示される化合物をポ
リ（アミノ酸）またはポリ（アミノ酸）誘導体または他
の免疫学的に活性な担体と結合させることにより調製す
ることができる。

ウシ血清アルブミンはこの好ましい形のポリ（アミノ酸
）であるが、アルブミン、血清タンパク質（たとえばグ
ロプリンなど）、眼の水晶体タンパク質、リボタンパク
質などを含む種々のタンパク質担体を用いることができ
ることが理解されなければならない。そのようなタンパ
ク質担体の例示としては、ウシ血清アルブミンの他に、
アオガイヘモシアニン、卵白アルブミン、ウシγ−グロ
プリン、チロキシン結合性グロプリンなどが挙げられる
。

さらに、アスパラギン酸塩のような利用できるカルボキ
シレート基を充分な数有する合成ポリ（アミノ酸）もま
た、反応性官能基を有する多くの他の合成または天然の
ボリマー性物質と同様に用いることができる。加えて、
炭水化物、酵母、多糖類または免疫学的担体として用い
ることのできる他の物質をハブテンに結合させて免疫原
を製造することができる。

トレーサーの構造 本発明のトレーサーの構造は、トレーサーのハプテンの
構造におけるよりもはるかに大きく変化させることが可
能である。本発明のトレーサーは、一般式（Ｉ）に示す
一般構造式を有する。本発明の好ましい態様においては
、トレーサーは下記式（ａ）で示される構造を有する。

チオカルバミド、カルバモイル、チオカルバモイルまた
はスルホニルカルバモイル基によりフルオレセイン誘導
体に結合したパルビツール酸塩誘導体である。

トレーサーは、たとえば下記に示すようなアミド、アミ
ジノ、トリアジニルアミノ、カルバミド、−ＮＨ−Ｃｏ
−Ｆｌ −Ｃｏ−ＮＨ−Ｆｌ −Ｏ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｆｌ −ＮＨ−Ｃｏ−ＮＨ−ＰＩ −ＮＨ−ＯＳ−ＮＨ−Ｐｉ −Ｏ−Ｃｏ−ＮＨ−Ｆｌ ０−　Ｃ　Ｓ−ＮＨ−　Ｆ　１ −ＳＱ．一ＮＨ−ＦＩ Ｏ　　ＣＯ−ＮＨ　　Ｓ　Ｏｔ　　ＮＨＰｌ（上記式中
、Ｆ１はフルオレセイン残基を表す）トレーサーは、下
記合成法および実施例において詳述するように、適当な
フルオレセイン誘導体をアミノ基、カルボン酸基、スル
ホン酸基、メルカブト基、水酸基、イミデート基、ヒド
ラジド基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、
クロロホルメート基、クロロチオホルメート基、カルボ
ン酸クロライド基、クａロスルホニルカルバモイル基な
どの基を含有するバルビツール酸塩誘導体に結合するこ
とにより調製する。

フルオレセイン誘導体の例としては、下記のフル才レセ
イン誘導体のいずれをも用いることができる。

Ｆｌ−ＣＩ１２−ＮＨｔ　　　　　　　　　７ミノメチ
ルフルオレセインＰＩ−Ｎｉ１，　　　　　　　　　　
　　　　７ルｔレセインγミンＦｌ−Ｃｏ，Ｈ　　　　
　　　　　　　　　カルネ１シフルオレセインＦｌ−Ｎ
｝ＩｃＯｃＨ，ｌ　　　　　　　　　α−ヨート゛アセ
ト７ミどフルオレセインＦｌ−ＮＨＣＯＣＩＩ，Ｂｒ α−フ゛Ｕモ７セト１ミト゛フルオレセインＦｌ−ＮＣ
８　　　　　　　　　　　．フルオレセインチオイソシ
アネート抗体 本発明の抗体は、上記免疫原に対してヒツジにおいて応
答を引き起こすことにより調製する。上記免疫原を当業
者によく知られた仕方で、一連の接種により動物または
免疫適格細胞のインビト口培養液に投与する。本明細書
に記載する実験においてはバルビツール酸塩免疫原に対
する免疫宿主としてヒツジが好ましいが、本明細書に記
載の構造の免疫原に対して抗体を産生じ得るいかなるイ
ンビボまたはインビトロ宿主をも用いることができるこ
とを理解する必要がある。

免疫原の合成 本発明の免疫原は、上記一般式（Ｉ’Ｘ式中、Ｘがクロ
口ホルメート基、アルデヒド基、カルボキシル基、アミ
ノ基、クロライド基、ブロマイド基・ヨーダイド基また
は水酸基である）で示されるようなハプテンをポリ（ア
ミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または他の免疫学的
に活性な担体に結合させることにより調製する。ポリ（
アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または他の免疫学
的に活性な担体は、カルバメート、アミド、チオエーテ
ル、エーテル、ジアゾまたはアミノの各結合によりノ＼
ブテンに結合することができる。好ましい聾様において
は、ポリ（アミノ酸）はウソ血清アルブミン（ＢＳＡ）
であり、ハブテンは式（ｐ）で示す構造を有するもので
ある。これらの反応物は、カルバメート結合を生成させ
るのに通常用いる条件下で結合させるのが好ましく、そ
のような条件は当業者にはよく知られている。本発明の
免疫源の合成に使用可能なハブテンとしては、上記式（
ｐ）の構造を有する化合物の他に下記式（ｑ）〜（ｖ）
で示される化合物が挙げられる。

式（ｐ） 式（ｑ） （ｐ） （ｑ） 式工ａ 式ふΩ （ｒ） （ｓ） （ｕ） 式（ｖ） （ν） 免疫原は、アルデヒド基、カルボキシル基、アミノ基、
塩素基、臭素基、ヨウ素基、水酸基またはヨードアセト
ニル基を含有するハプテンをポリ（アミノ酸）、ポリ（
アミノ酸）誘導体または他の免疫学的に活性な担体に結
合させることにより調製する。アルデヒドは、ポリ（ア
ミノ酸）または他の免疫学的に活性な担体のアミノ基と
シッフの塩基を生成することにより結合させることがで
きる。

シッフの塩基は水素化シアノホウ素ナトリウムにより即
座に還元されて安定なアミノメチル結合を生成する。ポ
リ（アミノ酸）上のカルボキシル基の活性化は、該ハプ
テンおよびポリ（アミノ酸）を１一エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロビル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、
Ｎ，Ｎ″−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）
、ｌ−シクロへキシル−　３−（２一モルホリノエチル
）カルボジイミド、ｐ−｝ルエンスルホン酸メチルなど
とともに混合することにより行うことができる。ヒドラ
ジドの場合は、非芳香族アミノの場合と同様の仕方で結
合させる。アルキル、クロロ、ブロモ、およびヨード誘
導体およびスルホン酸エステルは、担体タンパク質中の
チロシン残基のフェノール性水酸基を強アルカリ条件下
でアルキル化してアルカリアリールエーテルを生成し、
システインの遊離スルフヒドリル基の硫黄原子をアルキ
ル化してチオエーテルを生成する。これらの反応のため
に好ましい誘導体は、ヨードアセトニルおよびヨーダイ
ドである。

上記ハプテン（免疫原前駆体）の合成は、２つの一般的
な方法のうちの１つにより行う。一般式（！゜）は、本
発明の方法の好ましい態様に従った免疫原前駆体を示し
ている。この調製は、適当な置換マロン酸エステルまた
はシアノ酢酸エステルを、保護されたアルコール官能基
、好ましくはテトラヒド口ビラニルエーテルを有するプ
ロモアルキルアルコールでアルキル化することから始め
る。

そのような中間体を尿素で閉環することは、溶液中の反
応物の混合物をマグネシウムメトキシド、マグネシウム
エトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキ
ンドまたはカリウムｔ−ブトキシドなどの塩基で処理す
ることにより行うことができる。保護官能基をはずし、
得られた化合物をポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）
ｙＪ導体または他の免疫学的に活性な担体に結合させる
。

（以下余白） 免疫原の５−ヨードアセトニルバルビツール酸塩前駆体
は、末端二重結合を有する５−アルケン基を有する５．
５一二置換バルビツール酸塩（一般式（■゜）に示すよ
うなもの）から出発して水中のヨウ化物と反応させるこ
とにより調製する。３−ヒドロキショードバルビツール
酸塩はこのようにして調製する。対応するα−ヨードア
セトニルｌ《ルビツール酸塩は、これらをジジーンズ試
薬などのクロム含有酸化剤で酸化することにより得られ
る。

アルデヒドは、末端二重結合を有する適当な５一アルケ
ニルバルビツール酸塩（一般式（■゜）に示すようなも
の）を−７８℃にてメタノール中でオゾン分解すること
により調製することができる。

アルデヒド（一般式（■゛）に示すようなもの）を得る
ための他の好ましい方法は、適当な置換マロン酸エステ
ルまたはシアノ酢酸エステルを、アルデヒド官能基を好
ましくはアセタールとして保護したプロモアルキルアル
デヒドと反応させることによるものである。そのような
中間体を尿素で閉環することは、溶液中の反応物の混合
物をナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カ
リウムメトキソドまたはカリウムＬ−ブトギシドなどの
塩基で処理することにより行うごとができる。保護官能
基をはずし、得られた化合物をポリ（アミノ酸）、ポリ
（アミノ酸）誘導体または他の免疫学的に活性な担体に
結合させる。

カルボン酸は、適当なアルデヒドをジジーンズ試薬など
のクロム含有酸化剤で酸化することにより得られる。

カルボキシアルキルバルビツール酸塩またはカルボキシ
アルケンバルビツール酸塩を合成する好ましい方法は、
適当な５一置換バルビツール酸塩（一般式（Ｉ゜）で示
されるようなもの）を塩基（たとえばトリエチルアミン
、水酸化ナトリウム、カリウムｔ−ブトキシドなど）の
存在下でハロゲンアルキルエステルまたはハロゲンアル
ケニルエステルと反応させ、ついで適当なバルビツール
酸エステルを無機酸（たとえば濃塩酸、４０％硫酸など
）で加水分解することによるものである。

ハロゲン化アルキルは、アルコールを塩化水素、臭化水
素またはヨウ化水素などで処理するか、または塩化チオ
ニルなどのハロゲン化試薬で処理することにより調製す
ることができる。これらのハロゲン化物は、比較的中性
の条件で遊離のスルフヒドリル基または担体に、または
強塩基性条件下でポリ（アミノ酸）中のチロシン残基に
おけるようなフェノールに直接結合する。

トレーサーの合成 本発明のトレーサーは、フルオレセイン残基またはフル
オレセイン誘導体を一般式（■“）（式中、Ｗは酸素原
子または硫黄原子；Ｒ，は炭素数が１〜ｌ２で直鎖もし
くは分枝鎖状に配列し２個までの脂環もしくは芳香環構
造を含むアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基
：Ｒ，”は式：ＣＨｔ−Ｒ’−Ｙ（式中、Ｒ”は１０個
までのヘテロ原子を有し炭素数とヘテロ原子数の合計が
０〜２０で直鎖または分枝鎖状に配列しており２個まで
の指環もしくは芳香環構造を含む連結基であり、該連結
基が環構造を含まないときには１０個までのヘテロ原子
を含み、該連結基が１個または２個の環構造を含むとき
には１２個までのヘテロ原子を含む：Ｙは−Ｃ　Ｏ　ｔ
Ｈ，　　Ｃ　Ｈ　Ｏ，　　Ｓ　Ｏ　ｓＩ４，　Ｃ　Ｎ，
０ＨまたはＮＨ！である）で示される基）で示される一
般構造に結合させることにより調製する。

フルオレセイン残基は、アミド、アミン、尿素、チオ尿
素、カルバメート、チオカルバメート、トリアジニルア
ミノまたはスルホニルカルバメートの各結合によりアミ
ノ、カルボキシル、アルデヒド、酸クロライド、イミデ
ートまたはアルコキシの各官能基に結合させることがで
きる。現在のところ好ましい態様においては、フルオレ
セイン誘導体はアミノメチルフル才レセインであり、こ
れを一般式（ビ）においてＲ１がメチルブチル基または
１−メヂルプ口ピル基であり、Ｒｌ″がーＣＨ，、−Ｃ
ＯＯＨまたは−Ｃ　Ｈ　ｔ　　Ｃ　Ｈ　＝　Ｃ　Ｈ　　
Ｃ　Ｏ　ｔ　Ｈである前駆体に結合させる。適当なカル
ボキシアルケニルバルビツール酸塩のアミノメチルフル
才レセインへの結合は、まずバルビツール酸塩のカルボ
ン酸において活性エステルを生成することにより行う。

好ましい活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド活性エステルであり、好ましい方法は溶媒として無水
Ｎ．Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いたＮ．Ｎ’−ジシ
クロへギンルカルボノイミド活性化によるものである。

他の活性化基、たとえば酸クロライド、１−ヒド口ギシ
ベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロフェノールまたは２−
エチル−５−フエニルイソキサゾリウム−３゜−スルホ
ネートなどを用いることもでき、他の溶媒、たとえばテ
トラヒド口フラン、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチ
レンホスホールアミドなどを用いることもできる。これ
らの反応物はアミド結合生成のための条件下で結合させ
るのが好ましく、活性エステル法を用いるのが最も好ま
しい。使用可能なトレーサーは、種々のバルビツール酸
塩から調製することができる。

末端アミノ基（たとえばアミノ基、ヒトラジニル基また
はヒドラノド基など）を有するすべてのバルビツール酸
塩は、活性エステル法または混合酸無水物法によりカル
ボキシフルオレセインに結合させ、また溶液中で単に混
合するだけでフルオレセインイソチオシアネート、ＤＴ
ＡＦまたはアルコキシＤＴＡＦに結合させることができ
る。アミノ基は、ホスゲンまたはチ才ホスゲンと反応さ
せることにより、それぞれイソシアネートまたはチオイ
ソシアネート基に変換することができる。

ついで、これらをアミノメチルフルオレセインと縮合さ
せてトレーサーを生成させる。

末端アルデヒド基を有するすべてのバルビツール酸塩は
、水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元的アミノ化によ
りアミノメチルフルオレセインに結合させることができ
る。

末端水酸基を有するすべてのバルビッール酸塩は、溶液
中でＤＴＡＦ，α−ヨードアセトアミドフルオレセイン
、α−プロモアセトアミドフルオレセインまたはフルオ
レセインイソチオシアネートと反応させることによりフ
ルオレセインに結合させることができる。５−ヨードア
セトニル基を有するすべてのバルビツール酸塩は、アミ
ノメチルフルオレセインに結合させてトレーサーを生成
させることができる。

本発明はまた、フルオレセイン残基とバルビツール酸塩
環との間に存在する炭素一炭素二重結合により、抗体と
の相互反応が最適になるようにトレーサーが有利に配向
されるという発見をも含んでいるということを理解する
必要がある。

本発明の好ましいトレーサーとしては、上記式（ａ）で
示される化合物の他に下記式（ｂ）〜（ｏ）で示される
化合物が挙げられる。

式迫σ　　　　　　　　　式工Ｑ （ｂ） （ｅ） 式（ｄ） 式（ｅ） （ｄ） （ｅ） （ｈ） （ｉ） （『） （ｇ） （Ｄ （ｋ） アッセイ 本発明の特別のトレーザーおよび抗体は、バルビツール
酸塩の蛍光偏光アッセイにおいて驚くほど素晴しい結果
が得られることがわかった。下記一般式（ｉ）〜（ｖｉ
）は、本発明に従って定量的または定性的に決定しよう
とするバルビッール酸塩の一般的構造を示すものである
。

（ｍ） （ｉ） （ｉｉ） Ｃ．ｎ） （ｉｉｉ） （ｉｖ） 式（ｖ） 式（ｖｉ） （ｖ）　　　　　　　　　　　　　（ｖｉ）本発明のア
ッセイは、分析前に試料を処理する必要がないこと、お
よびアッセイによって広スペクトルパルビツール酸塩特
異性が示されるということから、従来のほとんどの方法
に比べてより迅速かつ正確なバルビツール酸塩アッセイ
法を提供するものである。本発明のアッセイソステムで
は、バルビツール酸塩様化合物以外の実質的にすべての
化合物が抗体特異性によって排除されるので、試料中の
バルビツール酸塩の存在を正確に決定することができる
。

本発明の分析法、すなわち本発明のトレーザー化合物お
よび免疫原を用いた蛍光イムノアッセイ法によりバルビ
ツール酸塩を決定する方法によれば、バルビッール酸塩
を含付しているかまたは含存していると思われる試料を
、トレーサーの生物学的に許容し得る塩およびバルビツ
ール酸塩に特異的な抗体と混合する。該抗体は、上記免
疫原を用いて産生さ仕る。バルビツール酸塩とトレーサ
ーとは限られた抗体結合部位に対して競合し、その結果
、複合体が生成する。トレーサーと抗体の濃度を一定に
保つことにより、生成したトレーサ一一抗体複合体に対
するバルビツール酸塩一抗体複合体の比は、試料中のバ
ルビツール酸塩の量に正比例する。それゆえ、該混合物
を平面偏光で励起させ、トレーサーおよびトレーサ一一
抗体複合体により放出される蛍光の偏光を測定すること
により試料中のバルビツール酸塩の存在を決定すること
ができる。

結果の定量は、正味のミリ偏光単位（ｎｅｔ　ｍｉｌｌ
ｉｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　ｕｎｉｔｓ）およびスパ
ン（ｓｐａｎ）（ミリ偏光単位にて）を用いて行うこと
ができる。正味のミリ偏光単位の測定値は、バルビツー
ル酸塩の不在下で最大量のトレーサーが抗体に結合した
ときの最大偏光を示す。正味のミリ偏光単位が大きくな
ればなるほど、トレーサーの抗体への結合は良好になる
。スパンとは、バルビツール酸塩不在下でトレーサーが
抗体に最大限に結合したときの正味のミリ偏光単位と、
特定濃度のバルビッール酸塩の存在下でトレーサーが抗
体に結合したときの正味のミリ偏光単位との差異である
。最大スパンは、アッセイが検出することのできるリガ
ンド濃度の範囲を定める。スパンが大きくなるほどデー
タの数値分析は良くなる。好ましい抗体一トレーサーの
組合わせは、少なくとも８０ミリ偏光単位のスパンを存
する。場合により、より小さなスパンも許容し得る。

本発明の方法を行う際のｐＨは、トレーサーのフル才レ
セイン残基が開環形で存在するのに充分なものでなけれ
ばならない。ｐＨは約３〜ｌ２の範囲、より好ましくは
約５〜ｌＯの範囲、最も好ましくは約６〜９の範囲であ
る。アッセイ中にｐＨを達成し維持するために、種々の
バッファーを用いることができる。代表的なバッファー
としては、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バル
ビタールなどが挙げられる。本発明において特定のバッ
ファーを用いることは重要ではないが、トリスおよびリ
ン酸塩バッファーを用いるのが好ましい。バッファーの
カチ才ン部分は、一般に溶液中のトレーザー塩のカチオ
ン部分を決定する。

リボフラビン結合タンパク質（ＲＢＰ）を試料またはＩ
または２以上のアッセイ試薬に加え、試料中に存在する
りボフラピンと結合させてＲＢＰ−リボフラビン複合体
を生成させ、リボフラビンによる潜在的な蛍光妨害を除
くことができる。ＲＢＰは、分子量約３　２．０　０　
０のタンパク質であり、一般に卵白から単離される。卵
から単離するとＲＢＰの各分子はりボフラビンを１分子
含んでいる。

このＲＢＰのホロタンパク質体は、酸性条件下で透析を
行うことにより結合リボフラビンを除去してアボタンパ
ク質体に変換しなければならない。

本発明に用いるＲＢＰアボタンパク質は、シグマ・ケミ
カル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ
ｏｗｐａｎｙ）　（セントルイス、ミズーリ）から市販
されている。使用量は重要ではないが、試料中の実質的
にすべての遊離リボフラビンを結合させるために充分な
量を用いる。

つぎに、本発明の改良アッセイを行う好ましい方法を以
下に詳述する。本アッセイは「均一アッセイ」であり、
均一アッセイとは未結合トレーサーから結合トレーサー
を分離していない溶液から最終的な読み取りを行うこと
を意味する。これは、読み取りを行う前に未結合トレー
サーから結合トレーサーを分離しなければならない不均
一イムノアッセイ法に比べて明らかな利点である。

本発明の蛍光偏光アッセイの試薬は、バルビツール酸塩
に対する抗体およびバルビツール酸塩トレーサーからな
る。加えて、前処理溶液、希釈バッファ一、バルビツー
ル酸塩カリブレーターおよびパルビツール酸塩コントロ
ールを含む主として従来の溶液も調製するのが望ましい
。これら試薬の代表的な溶液（このうち幾つかは以下に
記載する）は、アボット・ラボラトリーズ（アボットパ
ーク、イリノイ）からアッセイ「キット」として市販さ
れている。

本明細書においては、特に断らない限り％はすべてｖ／
ｖ％である。現在のところ好ましいトレーサー調製物は
、０．１モルのリン酸塩バッファ一（ｐｒ｛６．２）、
５％の５−スルホサリヂル酸ナトリウム、０．１％のア
ジ化ナトリウムおよび０．０１％のウシγグロプリン中
にトレーサーを１６４ナノモル含むものである。抗血清
調製物は、ヒツジ血清を０．１モルのトリスバッファ−
（ｐＨ　７　．　５　）、０．１％のアジ化ナトリウム
、０．１％のウシγグロプリンおよび２％のエチレング
リコール（Ｖ／Ｖ）で希釈したものである。希釈バッフ
ァ−は、０．１モルのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）
、０．１％のアジ化ナトリウムおよび０．Ｏｌ％のウシ
γグロプリンからなる。前処理溶液は、０．０１％のウ
シγグロプリン、０，１モルのトリスバッファ一（ｐＨ
７．５）、０．１％のアジ化ナトリウムおよび３ｘｇ７
ｘｙのりボフラビン結合タンパク質からなる。バルビツ
ール酸塩カリブレーターとしては、保存剤として０．１
％のアジ化ナトリウムを添加した正常ヒト尿中のセコバ
ルビタールを０．０，０．２０、０．４０、０，７０、
１．２０および２００μｇ／１ｔＱの濃度で用いるのが
有用である。ノくルビツール酸塩コントロールとしては
、保存剤として０．１％のアジ化ナトリウムを添加した
正常ヒト尿中のセコバルビタールを０．３０および１０
０μｇ／Ｉ（！の濃度で用いるのが有用である。

好ましい手順は、アボットＴＤｘ偏光アナライザー（ア
ボット・ラボラトリーズ、アービング、テキサスから入
手可）とともに用いるべく特に設計する。最小５０μＱ
の尿が必要である。カリブレーター、コントロールまた
は未知試料をＴＤＫ試料カートリッジの試料ウエル中に
ピペットにて直接注入する。この方法の利点の一つは、
試料に特別な調製を施す必要がないことである。この点
ではアッセイ手順を完全に自動化することができる。

アッセイを手動により行うときは、試料を希釈バッファ
一中で前処理溶液と混合し、バックグラウンドの読み取
りを行う。ついで、トレーサーおよび抗体を試験溶液中
に混合する。インキュベートした後、蛍光偏光の続み取
りを行う。

各カリブレーター、コントロールまたは試料の正味の蛍
光偏光値を決定し、アボット’［’　ｌ）　！アリ゛ラ
イザーのような装置の出力テープ上にプリントする。標
準曲線は、各カリブレークーの偏光をその濃度に対しｔ
非線型回帰分折を用し）てプロ・ソトすることにより装
置中に前以て作成されてシ喝。

この用意されたカリブレーク一曲線から各コントロール
または試料の濃度を読み取り、出力テープ上にプリント
する。

上記好ましい手順に関しては、トレーサー、抗体、前処
理溶液、カリブレークーおよびコントロールは約２℃〜
約８℃の間で保存すべきであり、希釈バッファーは周囲
温度で保存すべきであることに注意すべきである。標準
曲線およびコントロールは各２週間毎に行うべきであり
、各カリブレーターおよびコントロールは２つずつ用し
）るべきである。すべての試料は、２つずつで行うこと
力くできる。

つぎに、実施例に基づき本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるものではない。

実施例１〜２３は、本発明の概念に従って行った実験を
記載したものである。実施例１〜３は、抗体を産生ずる
のに有用な免疫原の調製に関する。

実施例４〜８は、免疫原およびトレーサーの前駆体の合
成に関する。実施例９〜２３は、トレーサーの合成に関
する。

実施例ｌ ？（１８０ｘｌ２）中の５−（ｌ−メチルブチル）−５
−アリルバルビツール酸（５９、０．０２２モル）を還
流条件下で７５〜８５℃に加熱した。ヨー化物（６９）
を反応混合物に２時間かけて少しずつ加えた。この反応
混合物を７時間加熱撹拌した。この反応混合物を冷却し
沈澱させた。ブフナー漏斗上で結晶を濾取し、水で洗浄
した。この生成物をエタノール（５０ｚ■から結晶化さ
せて所望の物質（５５７ｇ）を得た。

５−（１−メチルブチル）ご５−ヨードアセトニルバル
ビツール酸 ５−（１−メチルブチル）−５−（β−ヒドロキシーγ
−ヨードブ口ピル）バルビツール酸（１ｇ）をアセトン
（７５ｘＱ）中に溶解した。１０％硫酸中のニクロム酸
カリウムの０．３３モル溶液（３０ｚｆ２）を加えた。

この反応混合物を室温で２時間撹拌し、引き続き酢酸エ
チル（２００３１７！）で抽出し、食塩水、水で洗浄し
、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。酢酸エチル
を真空下に除去し、粗製の固体物質を７０％エタノール
から結晶化させた。所望の生成物の無色結晶（５１９ｕ
）が得られた。

ＢＳＡ（２２６１９）をリン酸塩バツファ一（０，ＩＭ
ＳｐＨ　８　）（４　．　７　ｚ（１）およびＮ，Ｎ’
−ジメチルホルムアミド（５２０μ＋２）中に溶解した
。この溶液にＤＭＦ（５　３　０μＱ）中の５−（１−
メチルブチル）−５−ヨードアセトニルバルビツール酸
（１５２ｍ９）を加えた。この反応混合物を室温にて３
６時間撹拌した。得られた溶液を水に対して充分に透析
し、凍結乾燥して所望の生成物（２０８１９）を得た。

実施例２ １−プロモエチルテトラヒド口ビラニルエーテル水浴中
に冷却した２−ブロモエタノール（１２５ｇ、１．０当
ｆｆｉ）にｐ−トルエンスルホン酸一塩酸塩（触媒ｊｌ
）を加えた。アルゴン雰囲気下に撹拌しながらジヒドロ
ビラン（９３ｇ、１．１当量）を滴下した。添加完了後
、この反応混合物を室温にて１時間撹拌した。残渣を短
管（ｓｈｏｒｔ　ｐａｔｈ）蒸留により精製して生成物
（約ｔ２５ｇ）を得た。

フェニルテトラヒド口ビラニルオキシエチルマロン酸ジ
エチル ＤＭＦ中のフェニルマロン酸ジエチル（７６ｍ９，１．
０当量）にＮａＨ（１３．１ｇ、１．０当量、６４．１
４％無機油分散）を加えた。この反応混合物を５０℃に
て１７２時間撹拌し、ついでｌ−ブロモ−２−テトラヒ
ド口ビラニルエタノール（８０ｉＱ，１．５当１ｉ）を
加え、反応混合物を６０℃で１８時間撹拌した。この反
応混合物を中性にし、溶媒を減圧下に除去した。残渣を
短管蒸留により精製して生成物（４６ｙ）を得た。

ＴＨＰ−ヒドロキシエチルフェノバルビタールマグネシ
ウムの削りくず（３．７９、１．２当量）をアルゴン雰
囲気下に乾燥メタノール中に溶解した。ＴＨＰ−マロン
酸エステル（４６９、１．０当量）および尿素（９．９
ｇ、１．３当量）を一緒に乾燥メタノール中に溶解し、
ついで上記マグネシウム溶液を加えた。４８時間還流し
た後、尿素（９．９９、１．３当ｆｆｉ）およびマグネ
シウムメトキシド（マグネシウム３．７ｇ、１．２当ｍ
）をさらに加えた。

さらに２４時間還流した後、溶媒を減圧下に除去し、残
渣を５％Ｈ　Ｃ　ｌ水溶液中に取り、ついでエーテルで
抽出した。生成物をエーテル層から除き、エーテル／ヘ
キサンから結晶化させて目的物質（約１３９）を得た。

５−フェニル−５−ヒドロキシエチルバルビツール酸 ＴＨＰ−ヒドロキシエチルフェノバルビタール（１９ｙ
）を酢酸／水（５　０／５　０）中に加熱溶解した。こ
の溶液を還流し、脱保護をＴＬＣ（シリカゲル、メタノ
ール／塩化メチレン（１０：９０））によりモニターし
た。反応が完了したときに溶媒を減圧下に除去し、残渣
をエタノール／水から結晶化させた。所望の生成物（８
．７ｙ）を白色粉末として得た。

ヒドロキシエチルフェノバルビタール（５　０　０ｙｔ
９）を、乾燥し新たに蒸留したＴＨＦ（１　０ｘの中に
懸副した。この溶液中に撹拌しながらホスゲンを１５分
間吹き込み、ついでこの溶液中にアルゴンを吹き込んで
過剰のホスゲンを除いた。１５分後にＴＨＦを減圧下に
除去し、残渣をエチルエーテルでトリチュレートした。

乾燥後、所望の生成物（約５　２　０　１１９＞を白色
粉末として得た。

０　．　Ｉ　Ｎ　’）　７酸塩バッフｙ−（７ｘｌ２，
ｐＨ８）中のＢＳＡ（５００朽、１．０当ｆｆｉ）の溶
液にまずＤＭＦ　（３　ｘＱ）を加え、ついでＴＨＦ（
１ｍｌ２）中に溶解したヒドロキシエチルフェノバルビ
クールのクロロギ酸エステル（５０ｆｆｇ）を加えた。

このクロロギ酸エステルを激しく撹拌しながら加え、こ
の反応混合物をさらに３時間撹拌した。

上記溶液をＰＩＤカラムを用い、蒸留水で溶出して精製
した。２つのピークを回収したところ、第一のピークは
生成物を１００３１９、第二のピークは生成物を４００
ｍｇ含んでいた。紫外線により調べたところ、両方の試
料ともタンパク質およびフェノバルビタールを含有して
いることが示された。

実施例３ ２−（１−メチルプチル）マロン酸ジエチルナトリウム
金属＜５．２４９、０．２　３９原子）を無水エタノー
ル（２５１１２）と反応させた。この溶液に撹拌しなが
らマロン酸ジエチル（３６．０＊ｆｆ，０．２４モル）
を滴下した。この溶液を加熱還流し、２−プロモペンタ
ン（２９．ＯｘＱ，０．２３モル）を滴下した。一夜還
流した後、反応混合物を冷却し、エタノールを回転蒸発
器（ｒｏｔｏｖａｐ）上で除去した。

得られた生成物を水で洗浄し、ＭｇＳＯｉで乾燥し、分
別蒸留して所望の生成物（３５．７９）を得た。

２−（１−メヂルブチル）−２−（５−ベンテニル）カ
リウム金属（１．７１ｙ、０．０４ｇ原子）を無水ｔ−
ブチルアルコール（３０７１１２）と反応さＵ−た。つ
いで、この反応混合物を７５℃に加熱し、２−（１メヂ
ルブチル）マロン酸ジエチル（１０．０３９、０．０４
モル）を滴下した。４時間還流した後、■−ブロモー５
−ベンテンＣ６．４９、０．０４モル）を撹拌しながら
滴下した。この反応混合物を一夜還流し、ついで水中に
注ぎ、エーテルで抽出した。

エチル抽出物をＭｇＳＯ＋で乾燥させ、エーテルを回転
蒸発器上で蒸発させて所望の物質を得た。

５−（ｌ−メチルブチル）−５−（ペンテニル）バルビ
ツール酸 ナトリウム金属（０．９８ｇ、０．０４ｙ原子）をメタ
ノール（＋５１１２）と反応させ、ついで尿素（５．１
４ｇ、０．０９モル）を加えた。ついで２−（１−メチ
ルブチル）−２−（５−ペンテニル）マロン酸ジエチノ
レ（６．０８９、０．０２モノレ）を加えた。２日間還
流した後、メタノールを留去した。残渣をｌＮ水酸化ナ
トリウム溶液中に溶解し、エーテルで抽出し、ついで塩
酸で酸性にして所望のバルビツール酸の白色沈澱を得た
。

５−（４−ブタナール）−　５−（１−メヂルブヂル）
バルビツール酸 メタノール中の上記バルビツール酸エステルの溶液に−
７８℃でオゾンを通した。この溶液が青色になった後、
室素ガスを通して過剰のオゾンを除いた。ついで硫化ジ
メチルを加え、この溶液を室温にて一夜撹拌した。つい
で溶媒を真空下に除去して所望のアルデヒド（０．６２
９）を得た。

上記アルデヒドのＢＳＡへの結合 水（２５１１２）、ジメヂルホルムアミド（ＥＭ！）お
よびエタノールＣ５１９）からなる溶液に１３ＳＡ（１
　８８　ｘｇ）を加えた。この溶液のＩ）Ｈを６．２に
調節し、上記アルデヒド（＋８．６ｉ９、０．０７ミリ
モル）を加えた。１時間撹拌した後、水素化シアノホウ
素ナトリウム（４７２ｘｇ、７．５ミリモル）を加え、
反応混合物を一夜撹拌した。ついでこの物質をｐＨ９の
水に対して透析し、ついでｐＨ７の水に対して透折した
。ついでこの物質を凍結乾燥してバルビツール酸−ＵＳ
Ａ結合体（１１３１９）を得た。

実施例４ ５−（１−メヂルブヂル）−５−ホルミルメチルバルビ
ツール酸 メタノール中のセコバルビタールナトリウム（５．３０
９、２　２．２　ミリモル）の溶液に、溶液が青色に変
化するまでオゾン流を通した。この反応混合物中に窒素
ガスを通して過剰のオゾンを除いた後、硫化ジメチル（
１０１２）を加えた。この反応混合物を室温にて一夜撹
拌し、溶媒を回転蒸発器上で除去した。ついでこのアル
デヒドを酢酸エチル／ヘキサン（ＩＩＩ）を用いてシリ
カブレブ（ｐｒｅｐ）プレート上で精製した。

実施例５ ２−（３−メチルシクロヘキンル）マロン酸ノメチル ナトリウム金属（７．０２ｇ、０．３　０ｇ原子）を無
水メタノール（２５０ｆｆＱ）と反応させた。ついで、
これにマロン酸ジメチル（７０３１σ）を滴下し、その
間、反応混合物の温度を５０℃に保持した。ついで、こ
の溶液に３−メチルソクロヘキシルブロマイド（５４．
Ｏｆ、０．３０モル）を滴下し、反応混合物を一夜還流
した。メタノールを回転蒸発器上で除き、残留物質をエ
ーテルと水との間に分配した。エーテル層を分離し、Ｍ
ｇＳＯ４で乾燥し、蒸発させて黄色の油を得た。この物
質を９５〜１０６℃および！　．　２　ｘｉ圧で蒸留し
て透明な油を得た。

無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５０！１ク）中の
水素化ナトリウム（２．５３１Ｆ、０．０６モル）のス
ラリーに２−（３−メチルシクロヘキシル）マロン酸ジ
メチル（１　４．４　６９、０．０６モル）を滴下した
。添加完了後、もはや水素ガスが発生しなくなるまで反
応混合物を撹拌した。ついでこの反応混合物に１−ブロ
モー６−ヘキセン（１　０．３　３９、０．０６モル）
を滴下し、ついで撹拌した。反応の進行は、シリカプレ
ートおよび酢酸エチル／ヘキザン（４０：６０）を用い
た分析クロマトグラフィ一により追跡した。反応完了後
、水（２０１Ｃ）を加え、ほとんどの溶媒を高真空下に
除去した。残留する物質を水とエーテルとの間に分配し
、エーテル層を水で２回洗浄した。このエーテル溶液を
ＭｇｓＯａで乾燥し、蒸発させて濃厚な黄色の油を得た
。ついで生成物を１２７〜１３４℃および０．４龍圧で
蒸留して透明な油を得た。

ナトリウム金属（１．２４９、０．０５９原子）を無水
エタノール（７５Ｎ９）と反応させた。反応完了後、尿
素（５．Ｉ６ｇ、０．０８モル）を加え、ついで上記マ
ロン酸エステル（６．６７ｙ，０．０２モル）を加えた
。６時間還流した後、エタノールを蒸発させ、得られた
物質を水（ｐｉ｛　４　）と酢酸エチルとの間に分配し
た。この酢酸エチルをＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させ
て白色のゴム状物質を得た。ついでこの物質を酢酸エチ
ル／ヘキサン（４　０／６　０）を用いシリカプレブプ
レート上で精製して精製バルビッール酸、５−（３−メ
チルシクロヘキシル）ー５−（ホルミルブヂル）バルビ
ッール酸を得た。

メタノール（２０ｉＣ）中に溶解した上記バルビッール
酸（４０ｍｇ、０．１３ミリモル）の溶液中に、溶液が
青色に変化するまでオゾンを通した。溶液に窒素ガスを
通して過剰のオゾンを除き、硫化ジメチル（２１ｅ）を
加えた。一夜撹拌した後、溶媒を除去して所望のアルデ
ヒドを白色のゴム状物質として得た。

実施例６ ｓｅｃ−プチルマロン酸ジメチル ナトリウム金属（６．９ｙ）を無水メタノール（１２０
ｍｌ２）と反応させた。この溶液にマロン酸ジメチル（
３９．６ｙ、０．３モル）を加えた。この反応混合物を
還流し、２−プロモブタン（４１，ｌｇ、０．３モル）
を加えた。１６時間還流した後、反応混合物を冷却し、
メタノールを真空下に除去した。

生成物をエチルエーテルで抽出し、ついで水および半飽
和食塩水で洗浄した。有機物を硫酸マグネシウムで乾燥
させた。真空蒸発によりエチルエーテルを除去した後、
得られた粗製の油を分別蒸留して所望の生成物（２４９
）（沸点９５〜１０５℃／ｌ５肩ｘＨｇ）を得た。

５−ｓｅｃ−プチルバルビツール酸 無水エタノール（ＩＩＯＩＣ）を→・トリウＪ１金居（
７．７２９）と反応させた。引き続き、ｓｅｃ−ブチル
マロン酸ジメチル（１　７．６９，０．１モル）を加え
、ついで（約５分後）、尿素（６．７２ｇ）を加えた。

この反応混合物を！５時間還流し、エタノール（６０　
ｘＱ）を留去した。この残渣に水（２００ｉ１！）を加
え、ついで濃硫酸（２０１１２）を加えた。沈澱した結
晶を濾取した。ついで生成物を水から再結晶させて無色
の結晶（８ｇ）を得た。

１００ｘ（２容の２首フラスコ中に水素化ナトリウム（
２６５３１ｇ、６．６２５ミリモル）（６０％油懸ｉｌ
ｌ）を入れた。この水酸化ナトリウムをヘキサンで洗浄
し、ついでＴ　Ｈ　Ｐ　（５　ｘｌＤ中の５−ｓｅｃ−
プチルバルビツール酸（Ｊ　２　１　９ｘ９）を加え、
ついでジメチルホルムアミド（５０ｚＩ２）を加えた。

この反応混合物を室温で１．５時間撹拌し、プロモクロ
トン酸エヂル（９１２μｅ）を加え、ついで無水ヨウ化
カリウムＣ９００ｍ？）を加えた。反応Δへ合物を４８
時間還流し、引き続き回転蒸発乾固した。残渣を酢酸エ
チルで抽出し、水、５％亜硫酸水素ナトリウム、食塩水
で洗浄し、ついで硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒
を除去し、得られた粗製の物質を溶出液として酢酸エチ
ルを用いたシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーに
より精製した。

所望の生成物の収率は７８％であった。

濃塩酸（１５ＪＩ１２）中の５−ｓｅｃ−ブチルー５−
（カルブエトキシーｌ−プロピレン）バルビツール酸（
１５２Ｎ９）を４５分間還流した。この反応混合物を蒸
発乾固して所望の生成物を無色結晶として得た（収率９
５％、融点１６８〜＋７１’Ｃ）。

実施例７ 濃塩ＭＣ２５ｘρ）中の５−０−メチルブチル）−５−
カルブエトキシメチルバルビツール酸（２５０　ｏ）を
４５分間還流した。この反応混合物を冷却し、沈澱した
結晶を濾取した。水から再結晶して無色の結晶（１９０
！９）を得た（融点２３８〜２４０°Ｃ）。

実施例８ ５−（１−メチルブヂル）−５−カルブエトキシブロビ
ルバルビツール酸（２００ｏ）を濃塩酸（２５＋Ｑ）と
とらに１時間還流した。この反応混合物を真空蒸発させ
、得られた固体残渣を水から結晶化させた。無色結晶（
＋２０ｙ）を得た（融点１８９〜１９２℃）。

実施例９ ンへの結合 ５−ｓｅｃ−ブチルー５−カルポキン−１−プロピレン
バルビツール酸（２６．８ｏ、０．１ミリモル）を無水
ＤＭＦ（０．３ｚ（！）中に溶解し、この溶液にＤＭＦ
（０．３ｘσ）に溶解したジシクロへキシルカルボジイ
ミド（２０３１ｇ）を加え、ついでＤＭＦ（０．３ｌρ
）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１ｌ．５ス９）
を加えた。この反応混合物を室温にて撹拌した。３０分
後、アミノメヂルフル才レセイン（４２１Ｎ９）を加え
た。２０時間後、この反応混合物を回転蒸発乾固し、溶
出液として酢酸エチル／酢酸（１００：０．２）を用い
たシリカゲル上のカラムク【１マトグラフィーにより精
製した。

実施例１０ この結合体は、実施例９の手順に従い、５−（１メチル
ブチル）−５−カルボキシーｌ−プロピレンバルビツー
ル酸（２８．２友９、０．１ミリモル）、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド（１　１．５３ｌ９）、ジシクロへキ
シルカルボジイミド（２０Ｂ）およびアミノメチルフル
才レセイン（４２ｙ）を用いて調製した。溶出液として
酢酸エチル／酢酸（１００：０．２）を用いたシリカゲ
ル上のプレパラティブ薄層クロマトグラフィーにより生
成物を精製した。

実施例１ｌ セインへの結合 この結合体は、実施例９の手順に従い、５−イソプロビ
ル−５−（カルボキシーｌ−プロピレン）バルビッール
酸（２　１．４１ｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
（ＩＩ．５ｉｙ）、ジシクロへキシルヵルボジイミド（
２０１１ｇ）およびアミノメチルフル才レセイン（４２
ｏ）を用いて調製した。溶出液として酢酸エチル／酢酸
（Ｉ　Ｏ　Ｏ：０．２）を用いたシリカゲル上のプレパ
ラティブ薄層クロマトグラフィーにより生成物を精製し
た。

実施例ｌ２ この結合体は、実施例９の手順に従い、５−エチル−５
−カルポキンメチルバルビッール酸（２１　．　４　ｘ
９）、Ｎ−ヒドロキンスクシンイミド（ＩＩ５ｙｇ）、
ジシクロへキシルカルボノイミド（２０ｘｇ）およびア
ミノメチルフル才レセイン（４２＋ｙ）を用いて調製し
た。溶出液として酢酸エチル／酢酸（Ｉ００：０．２）
を用いたシリカゲル上のクロマトグラフィーにより生成
物を精製した。

実施例ｌ３ この結合体は、実施例９の手順に従い、５　−ｓｅＣ−
ブチルー５−カルボキシメチルバルビッール酸（２　４
　ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｌ１　．　
５　ｘｇ）、ジシクロへキシル力ルポジイミド（２０　
ｘｇ）およびアミノメチルフルオレセイン（４２ｚ９）
を用いて調製した。溶出液として酢酸エチル／酢酸（１
００：０．２）を用いたシリカゲル上のプレパラティブ
薄層クロマトグラフィ−（Ｐ　Ｔ　Ｌ　Ｃ）により生成
物を精製した。

実施例ｌ４ この結合体は、実施例９の手順に従い、５　−ｓｅＣ−
ブチルー５−カルボキシエチルバルビッール酸（２６３
＋１？）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１１　．　
５　ｍｇ）、ジシクロへキシルカルボジイミド（２０　
ｘｇ）およびアミノメチルフルオレセイン（４２ｆｆｇ
）を用いて調製した。溶出液として酢酸エチル／酢酸（
１　００：０．２）を用いたシリカゲル上のＰ　Ｔ　Ｌ
Ｃにより生成物を精製した。

合 この結合体は、実施例９の手順に従い、５　−ｓｅＣ−
ブチルー５−カルボキシプロビルバルビツール酸（２８
ｍｙ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１１　．　５
　ｍｙ）、ジシクロへキシルカルボジイミド（２０１９
）およびアミノメチルフルオレセイン（４２ｊｌ９）を
用いて調製した。溶出液として酢酸エチル／酢酸（２０
０：０．２）を用いたシリカゲル上のＰＴＬＣにより生
成物を精製した。

実施例ｌ６ ｓ−ｓｅｅ−ブチルー５−カルボキシブチルバルビこの
結合体は、実施例９の手順に従い、５　−ｓｅＣ−ブチ
ルー５−カルボキシブチルバルビツール酸（２９１９）
、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１１　．　５　１９
）、ジシクロへキシル力ルポジイミド（２０Ｍｇ）およ
びアミノメチルフルオレセイン（４２ｍｇ）を用いて調
製した。溶出液として酢酸エチル／酢酸（１００：０．
２）を用いたシリカゲル上のＰ　’ｒ　ＬＣにより生成
物を精製した。

の結合 この結合体は、実施例９の手順に従い、５−（１−メチ
ルブチル）−５−カルボキシメチルバルビツール酸（２
４１９）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｚ．５ｚｙ
）、ジシクロへキシル力ルポジイミド（２０ｏ）および
アミノメチルフルオレセイン（４２１９）を用いて調製
した。溶出液として酢酸エチル／酢酸（１００：０．２
）を用いたシリカゲル上のＰＴＬＣにより生成物を精製
した。

実施例ｌ８ の結合 この結合体は、実施例９の手順に従い、５−（１一メチ
ルブチル）−５−カルボキシエチルバルビツール酸（２
５ｉｙ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１１．５ｉ
ｙ）、ジシクロへキシルカルボジイミド（２０Ｎ９）お
よびアミノメチルフルオレセイン（４２１９）を用いて
調製した。溶出液として酢酸エチル／酢酸（１００：０
．２）を用いたシリカゲル上のＰＴＬＣにより生成物を
精製した。

実施例１９ ヘの結合 この結合体は、実施例９の手順に従い、５−（１−メチ
ルブチル）−５−カルボキシブロビルバルビツール酸（
２ｓ．５ｏ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｌｌ．
５ｏ）、ジシクロへキシルカルボジイミド（２０ｍｙ）
お上びアミノメチルフルオレセイン（４２１ｇ）を用い
て調製した。溶出液として酢酸エチル／酢酸（１　００
：０．２）を用いたシリカゲル上のＰＴＬＣにより生成
物を精製した。

の結合 この結合体は、実施例９の手順に従い、５〜（１−メチ
ルブチル）−５−カルボキシブチルバルビツール酸（２
　８１９）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｌｌ．５
ｍｇ）、ジシクロへキシルカルボジイミド（２０１９）
およびアミノメチルフルオレセイン（４２幻）を用いて
調製した。溶出液として酢酸エチル／酢酸（１　００：
０．２）を用いたシリカゲル上のＰＴＬＣにより生成物
を精製した。

実施例２１ ５−（ｌ−メチルブチル）−５−カルボキシメチルバル
ビッール酸のフルオレセインアミド（異性体）への結合 ５−（！−メヂルブチル）一５−カルボキシメチルバル
ビツール酸（５８．３３１９）に塩化チ才ニル（２ａＣ
ｔ）を加え、この溶液を１．５時間還流した。過剰の塩
化チオニルを真空下で除き、得られた油を冷却した。こ
れに乾燥ビリジン（　ｌ　ｚｉ２）中のフルオレセイン
アミド（異性体！）の溶液を加えた。この物質を酢酸エ
チル／酢酸（＋００：０．２）を用いたシリカプレブプ
レート上のクロマトグラフィーにかけて所望のトレーサ
ーを得た。

実施例２２ セインへの結合 この結合体は、実施例９の手順に従い、５−（３ーメチ
ルシクロヘキシル）−５−カルポキシブチルバルビツー
ルＲＣ２　１ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（
６．９ｚｙ）、ジシクロへキシルカルボジイミド（１９
．９Ｊ１９）およびアミノメチルフルオレセイン（２１
９）を用いて調製した。

実施例２３ 駿魚 ｐＨ６の水（２ｇのおよびメタノール（２　ｘＱ）から
なる溶液に５−（！−メチルブチル）−５−ホルミルメ
チルバルビツール酸（１４１３１１ｇ、０．５８ミリモ
ル）およびアミノメチルフル才レセイン（２１０ｌ９、
０．５８ミリモル）を加えた。この溶液にさらにＮ，Ｎ
−ジメチルホルムアミドを滴下した。１時間撹拌した後
、水素化シアノホウ素ナトリウム（３８．８１１９）を
一度に加えた。一夜撹拌した後、溶媒を蒸発させ、得ら
れた物質を、溶出液としてメタノール／水／トリフル才
口酢酸を用いた逆相プレパラティブプレート（シリカゲ
ル）上で精製した。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ［式中、Ｗは酸素原子または硫黄原子； Ｒ＿１は炭素数の合計が１〜１２で直鎖もしくは分枝鎖
   状に配列し２個までの脂環もしくは芳香環構造を含むア
   ルキル基、アルケニル基またはアルキニル基； Ｒ＿２は式；ＣＨ＿２−Ｒ−Ｚ−Ｑ（式中、Ｑはポリ（
   アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または他の免疫学
   的に活性な担体、またはフルオレセインまたはフルオレ
   セイン誘導体； ＺはＱがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体で
   あるときにＮＨ、ＣＯ、ＣＳ、ＳＯ＿２またはＣ＝ＮＨ
   、Ｑがポリ（アミノ酸）またはポリ（アミノ酸）誘導体
   または他の免疫学的に活性な担体であるときにＣＯ、Ｏ
   −ＣＯＮＨ、Ｎ、ＮＨ、Ｎ＝ＮまたはＣＨ＿２； Ｒは炭素数とヘテロ原子数の合計が０〜２０で直鎖また
   は分枝鎖状に配列しており２個までの環構造を含む連結
   基であり、Ｑがポリ（アミノ酸）またはポリ（アミノ酸
   ）誘導体または他の免疫学的に活性な担体であるときに
   ７個までのヘテロ原子を含んでおり、Ｑがフルオレセイ
   ンまたはフルオレセイン誘導体で連結基が環構造を含ん
   でいないときに１０個までのヘテロ原子を含んでおり、
   またＱがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体で
   あり連結基が１個または２個の環構造を含んでいるとき
   に１２個までのヘテロ原子を含んでいるものである）］
   で示される化合物。
2. （２）一般式（ I ）において、 Ｒ＿１が直鎖または分枝鎖状に配列し１個までの脂環ま
   たは芳香環構造を含む炭素数の合計が２〜７のアルキル
   基であり、 ＺがＱがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体で
   あるときにＮＨまたはＣＯ、Ｑがポリ（アミノ酸）また
   はポリ（アミノ酸）誘導体または他の免疫学的に活性な
   担体であるときにＣＨ＿２であり、Ｒが炭素数とヘテロ
   原子数の合計が０〜１０で直鎖または分枝鎖状に配列し
   ており２個までの環構造を含む連結基であり、Ｑがポリ
   （アミノ酸）またはポリ（アミノ酸）誘導体または他の
   免疫学的に活性な担体であるときに４個までのヘテロ原
   子を含んでおり、Ｑがフルオレセインまたはフルオレセ
   イン誘導体であり連結基が環構造を含んでいないときに
   ６個までのヘテロ原子を含んでおり、またＱがフルオレ
   セインまたはフルオレセイン誘導体であり連結基が１個
   または２個の環構造を含んでいるときに６個までのヘテ
   ロ原子を含んでいるものである請求項（１）記載の化合
   物。
3. （３）一般式（ I ）においてＱがウシ血清アルブミン
   である請求項（１）記載の化合物。
4. （４）一般式（ I ）においてＱがフルオレセインのア
   ミノ誘導体である請求項（２）記載の化合物。
5. （５）一般式（ I ）においてＱがポリ（アミノ酸）ま
   たはポリ（アミノ酸）誘導体であるときの請求項（１）
   記載の化合物に対する抗体。
6. （６）一般式（ I ”）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ”） ［式中、Ｗは酸素原子または硫黄原子； Ｒ＿１は炭素数の合計が１〜１２で直鎖もしくは分枝鎖
   状に配列し２個までの脂環もしくは芳香環構造を含むア
   ルキル基、アルケニル基またはアルキニル基； Ｒ＿２”は式：ＣＨ＿２−Ｒ”−Ｙ（式中、ＹはＮＨ＿
   ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＣｌ、ＳＯ＿３Ｈ、ＳＯ＿２Ｃｌ、
   ＳＨ、ＣＨＯ、ＣＮ、ＯＨまたはＩ； Ｒ”は１０個までのヘテロ原子を有し炭素数とヘテロ原
   子数の合計が０〜２０で直鎖または分枝鎖状に配列して
   おり２個までの脂環もしくは芳香環構造を含む連結基で
   ある）で示される基］で示される前駆体をフルオレセイ
   ンまたはフルオレセイン誘導体と結合させる ことを特徴とするトレーサーの製造方法。
7. （７）一般式（ I ”）において、Ｒ＿１が環構造を含
   まない分枝鎖状に配列した炭素数４〜５のアルキル基で
   あり、ＹがＮＨ＿２またはＣＯＯＨであり、Ｒ”が３個
   までのヘテロ原子を有し炭素数とヘテロ原子数の合計が
   ３〜５で直鎖または分枝鎖状に記載しており環構造を含
   まない連結基である請求項（６）記載の方法。
8. （８）フルオレセイン誘導体がアミノメチルフルオレセ
   インである請求項（７）記載の方法。
9. （９）生物学的流体中のバルビツール酸塩の存在を検出
   する方法であって、 （ａ）試料をバルビツール酸塩抗血清、および該バルビ
   ツール酸塩抗血清の存在に対して検出可能な蛍光偏光応
   答を生じさせ得る請求項（１）記載のトレーサー化合物
   と接触させ、 （ｂ）上記工程（ａ）で得られた溶液に平面偏光を通し
   て蛍光偏光応答を得、ついで （ｃ）上記工程（ｂ）の溶液の蛍光偏光応答を検出して
   試料中のバルビツール酸塩の存在を測定することを特徴
   とする方法。
10. （１０）工程（ａ）において試料をさらにリボフラビン
    結合タンパク質と接触させる請求項（９）記載の方法。