JP3325370B2 - 化学発光性化合物およびこれを用いるアッセイ法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、化学発光分析法におけ
る標識物質として有用な新規化学発光性化合物、該化学
発光性化合物が結合された発光性複合体、および該化学
発光性化合物を用いるアッセイ法に関する。

【０００２】

【従来の技術】化学発光性化合物の分析技術への応用
は、その高感度性から近年ますます拡大しつつある。ル
ミノール、アクリジニウム、安定化ジオキセタン、過シ
ュウ酸エステル等は発光収率が高いため、高感度分析用
試薬として種々の分野で実用化されつつある。なかでも
アクリジニウム化合物は、検出感度が１０^-18 モルレベ
ルあり、さらに容易に種々のリガンド分子に結合できる
ため、ラジオアイソトープに代わる安全な標識物質とし
て注目されてきた。

【０００３】特に臨床検査の分野では抗原・抗体反応あ
るいは核酸の相補的結合等を利用したリガンドアッセイ
の需要が増し、自動分析装置による高精度且つ迅速な測
定が望まれている。それに対し、アクリジニウム化合物
は秒単位のフラッシュ型発光であるため、臨床検査分野
のこのような要求にも十分応えうる試薬である。

【０００４】Ｎ−メチルアクリジニウム−９−カルボン
酸アリールエステルが、アルカリ性下で過酸化水素によ
り、励起状態のＮ−メチルアクリドンに化学変化し、発
光することは１９６４年マックカプラ等により見出され
た（Prog. Org. Chem., 8, 231-277, 1973) 。その後、
ウッドヘッド等により初めて免疫測定用の標識物として
応用された(Clin. Chem., 29, 1474-1479, 1983)。ウッ
ドヘッド等が標識用に合成したアクリジニウムエステル
は、下記式で表される化合物であり、通常免疫測定に用
いる溶媒系（ｐＨ中性の水溶液）では不安定なものであ
った。

【０００５】

【化２】

【０００６】このアクリジニウム−９−カルボン酸アリ
ールエステルの不安定性の問題を解決する手段として、
エステル成分の一部を構成するフェノキシ環の２つのオ
ルト位にメチル基を導入することがセイーヨン等により
開示された（特開昭 63-101368号公報) 。同様の効果は
マッカプラ等によっても示されている（特表平3-501772
号公報）。このフェノキシ環にオルトジメチル基を導入
した標識用化合物を用いることにより、安定性の改善が
なされた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、装置を
含めた分析法の高精度化あるいは迅速化に伴い、より安
定化された高性能な標識化合物の開発が望まれている。

【０００８】本発明の目的は、安定性の高い新規な化学
発光性化合物を提供することである。また本発明の目的
は、新規な化学発光性化合物から調製される安定性の高
い発光性複合体を提供することである。さらに本発明の
目的は、新規な化学発光性化合物を用いたアッセイ法を
提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、アクリジニウム−
９−カルボン酸フェニルエステルのフェノキシ環のオル
ト位にフッ素化アルキル基を導入することにより、発光
性を損なうことなく、安定性が顕著に改善されることを
見出し本発明を完成した。

【００１０】本発明は、一般式（Ｉ）

【００１１】

【化３】

【００１２】（式中、Ｒ₁ は１またはそれ以上の水素原
子が任意に置換基により置換されていてもよく、また、
１またはそれ以上の炭素原子が任意にヘテロ原子または
カルボニルで置換されていてもよいアルキル、アルケニ
ル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、あるいは
標識をするための反応性官能基から選択される化学発光
を妨げない基、Ｒ₂ はフッ素化アルキル、Ｒ₃ はアルキ
ル、フッ素化アルキルまたはアルコキシ、ＸおよびＹは
それぞれ独立してＯまたはＳを示し、Ａ^- はスルフェー
ト、ハロスルホネート、アルキルスルホネート、ハロア
ルキルスルホネート、アリールスルホネート、ハロボレ
ート、ハロアセテート、ハロホスフェート、ホスフェー
トまたはハライドから選択される化学発光を妨げない陰
イオンを示す。）で表され、そのアクリジン環またはフ
ェニル環の任意の位置に、１またはそれ以上の水素原子
が任意に置換基により置換されていてもよく、また、１
またはそれ以上の炭素原子が任意にヘテロ原子またはカ
ルボニルで置換されていてもよいアルキル、アルケニ
ル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、あるいは
標識をするための反応性官能基、ニトロ、ハロゲン、ア
ルコキシ、カルボキシ、保護カルボキシ、アルコキシカ
ルボニル、アミノ、保護アミノ、ヒドロキシまたは保護
ヒドロキシから選択される化学発光を妨げない基を有し
ていてもよいアクリジニウム化合物またはその異性体
〔以下、化学発光性化合物（Ｉ）という〕に関する。な
お、本明細書において「フェニル環」とは特にことわり
のない限りＹに結合するフェニル環を指す。

【００１３】また本発明は、生物学的活性物質およびこ
れに結合した化学発光性化合物（Ｉ）からなる発光性複
合体に関する。

【００１４】また本発明は、（ａ）試料を、化学発光性
化合物（Ｉ）で標識された、試料中の被検物質に対して
特異的に結合する結合物質と混合して被検物質と結合物
質との複合体を形成させ、（ｂ）該複合体と遊離の標識
結合物質とを分離し、（ｃ）該複合体に結合している化
学発光性化合物（Ｉ）の化学発光を検出し、（ｄ）検出
された発光量から試料中の被検物質の量を決定すること
からなる試料中の被検物質のアッセイ法（以下、アッセ
イ法１という）に関する。

【００１５】さらに本発明は、（ａ）試料を、(i) 試料
中の被検物質に対して特異的に結合する結合物質および
(ii) 化学発光性化合物（Ｉ）で標識された被検物質と
混合して被検物質と結合物質との複合体を形成させ、
（ｂ）該複合体と遊離の標識被検物質とを分離し、
（ｃ）該複合体に結合している化学発光性化合物（Ｉ）
の化学発光を検出し、（ｄ）検出された発光量から試料
中の被検物質の量を決定することからなる試料中の被検
物質のアッセイ法（以下、アッセイ法２という）に関す
る。

【００１６】本明細書において「生物学的活性物質」と
は、抗原（ハプテンを含む）、抗体、蛋白、ペプチド、
核酸、ホルモン、医薬、医薬代謝物などを包含して意味
する。

【００１７】本明細書において「化学発光を妨げない
基」とは化学発光分析法において有効な化学発光の発生
を妨害しない基を意味する。詳細には、Ｒ₁ で表される
化学発光を妨げない基は、アルキル、アルケニル、アル
キニル、アリールまたはアラルキル、あるいは標識をす
るための反応性官能基から選択される。当該アルキル、
アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルに
おける１またはそれ以上の水素原子は任意に適当な置換
基によって置換されていてもよい。ここで適当な置換基
とは、ニトロ、ハロゲン、アミノ、保護アミノ、アルコ
キシ、アリールオキシ、ヒドロキシまたは保護ヒドロキ
シから選択されるものである。また当該アルキル、アル
ケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルにおけ
る１またはそれ以上の炭素原子は任意にヘテロ原子また
はカルボニルで置換されていてもよい。ここでヘテロ原
子とは、窒素、リン、硫黄および酸素から選ばれるもの
である。

【００１８】前記アルキル、アルケニルおよびアルキニ
ルは、炭素数が１〜２０、好ましくは１〜１０、さらに
好ましくは１〜４であり、前記アリールおよびアラルキ
ルは、炭素数が６〜２０、好ましくは６〜１２である。
当該アリールの例としてはフェニル、ナフチルが挙げら
れ、アラルキルの例としてはベンジルが挙げられる。好
ましくはＲ₁ は炭素数１〜４のアルキルである。

【００１９】前記「標識をするための反応性官能基」と
は、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、または
生物学的活性物質が通常含有するその他の官能基と結合
可能な反応性基を意味し、具体的な例として −Ｑ−Ｒ−Ｗ、−Ｒ−Ｗ または −Ｗ 〔式中、ＱはＯまたはＳを表わし、Ｒはアルキレンまた
はアリーレンを表わし、Ｗは

【００２０】

【化４】

【００２１】（式中、Ｒ₄ はアルキル、アリールまたは
アラルキル、Ｒ₅ はアルキレンまたはアリーレン、Ｘ₁
はハロゲン、Ｚは臭素またはヨウ素である）から選ばれ
る基を表わす〕で表される基が示される。ここでアルキ
ル、アリールおよびアラルキルは前記Ｒ ₁ における定義
と同意義である。またアルキレンおよびアリーレンは炭
素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ま
しくは炭素数１〜６である。好ましくはＲはメチレン、
エチレン、プロピレン、またはオルト−、メタ−または
パラ−フェニレンである。ハロゲンは塩素、臭素、ヨウ
素またはフッ素であり、好ましくは塩素または臭素であ
る。

【００２２】Ｒ₂ はフッ素化アルキルであり、好適には
炭素数１〜４のフッ素化アルキルである。当該フッ素化
アルキルは、アルキルのすべての水素原子がフッ素置換
されたパーフルオロアルキルでもよいし、水素原子のう
ち一部がフッ素置換されたものでもよく、好ましくはパ
ーフルオロアルキルである。好ましくは、Ｒ₂ はトリフ
ルオロメチルである。

【００２３】Ｒ₃ はアルキル、フッ素化アルキルまたは
アルコキシであり、好適には炭素数１〜４のアルキル、
炭素数１〜４のフッ素化アルキルまたは炭素数１〜４の
アルコキシである。当該フッ素化アルキルは、アルキル
のすべての水素原子がフッ素置換されたパーフルオロア
ルキルでもよいし、水素原子のうち一部がフッ素置換さ
れたものでもよく、好ましくはパーフルオロアルキルで
ある。好ましくは、Ｒ ₃ はメチル、トリフルオロメチ
ル、メトキシである。

【００２４】ＸおよびＹは、それぞれ独立してＯまたは
Ｓであり、好ましくはＸおよびＹは共にＯである。本発
明の化学発光性化合物（Ｉ）はそのアクリジン環または
フェニル環の任意の位置に化学発光を妨げない基を有し
ていてもよい。ここで「化学発光を妨げない基」は、前
記Ｒ₁ で表される基として定義したアルキル、アルケニ
ル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、あるいは
標識をするための反応性官能基、ニトロ、ハロゲン（例
えば塩素、臭素、ヨウ素、フッ素）、アルコキシ、カル
ボキシ、保護カルボキシ、アルコキシカルボニル、アミ
ノ、保護アミノ、ヒドロキシまたは保護ヒドロキシから
選択される置換基である。好ましくは、炭素数１〜４の
アルキルもしくはハロアルキル、ニトロ、ハロゲンまた
は炭素数１〜４のアルコキシであり、さらに好ましく
は、メチル、トリフルオロメチル、ニトロ、ハロゲン、
メトキシである。

【００２５】Ａ^- で表される「化学発光を妨げない陰イ
オン」は、スルフェート、ハロスルホネート（例えばフ
ルオロスルホネートなど）、アルキルスルホネート、ハ
ロアルキルスルホネート（例えばフルオロアルキルスル
ホネートなど）、アリールスルホネート、ハロボレー
ト、ハロアセテート、ハロホスフェート、ホスフェート
またはハライドから選択される。

【００２６】化学発光性化合物（Ｉ）において「標識を
するための反応性官能基」は、Ｒ₁、またはアクリジン
環もしくはフェニル環の任意の位置に導入される。好ま
しくは当該反応性官能基は、Ｒ₁ またはフェニル環上の
Ｙに対してメタ位またはパラ位に導入される。

【００２７】本発明において一般式（Ｉ）の異性体には
アクリジン環部分がフェナントリジン環である一般式
（II)

【００２８】

【化５】

【００２９】（式中、各記号は前記と同意義である）で
表される化合物が含まれる。

【００３０】本発明の化学発光性化合物として好適なも
のは上記式（Ｉ）において、Ｒ₁ が炭素数１〜４のアル
キル、Ｒ₂ が炭素数１〜４のフッ素化アルキル、Ｒ₃ が
炭素数１〜４のアルキル、炭素数１〜４のフッ素化アル
キルまたは炭素数１〜４のアルコキシ、ＸおよびＹがと
もにＯであり、フェニル環のＹに対してメタ位またはパ
ラ位が反応性官能基で置換されている化合物であり、さ
らに好ましくは、Ｒ₁がメチル、Ｒ₂ がトリフルオロメ
チル、Ｒ₃ がメチル、トリフルオロメチルまたはメトキ
シであり、フェニル環のＹに対してメタ位またはパラ位
がＮ−スクシンイミジルオキシカルボニルアルキレンオ
キシ基で置換された化合物である。

【００３１】本発明の発光性複合体は、化学発光性化合
物（Ｉ）を標識をするための反応性官能基を介して抗原
（ハプテンを含む）、抗体、蛋白、ペプチド、核酸、ホ
ルモン、医薬、医薬代謝物など各種生物学的活性物質に
共有結合させることにより形成される。

【００３２】本発明のアクリジニウム化合物は下記の合
成経路に従って製造することができる。

【００３３】

【化６】

【００３４】（式中、Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ₃ およびＡ^- は前
記と同意義である） アクリジン−９−カルボン酸 (III)またはその反応性誘
導体を２，６−ジ置換フェノール(IV)と公知のエステル
合成法によりエステル化してアクリジン−９−カルボン
酸フェニルエステル化合物(V) が得られる。当該エステ
ル化合物(V) を常法に従って４級塩化することにより、
アクリジニウム化合物（Ｉ）が製造される。

【００３５】また、標識用アクリジニウム化合物は、ア
クリジン−９−カルボン酸(III) またはその反応性誘導
体を、次式

【００３６】

【化７】

【００３７】（式中、Ｒ₂ およびＲ₃ は前記と同意義で
あり、Ｒ₆ は標識するための反応性官能基を表す）で表
される置換フェノールとエステル結合させることにより
得られる。

【００３８】または、アクリジン−９−カルボン酸(II
I) またはその反応性誘導体を、次式

【００３９】

【化８】

【００４０】〔式中、Ｒ₂ およびＲ₃ は前記と同意義で
あり、Ｒ₇ は−Ｑ−Ｒ−ＣＯＯＲ₈ 、−Ｒ−ＣＯＯＲ₈
または−ＣＯＯＲ₈ （ここでＱおよびＲは前記と同意義
であり、Ｒ₈ はカルボキシ保護基を表す）〕で表される
置換フェノールとエステル結合させた後、カルボシキ保
護基を除去し、適当な化合物、例えばＮ−ヒドロキシス
クシンイミドなどを用いて反応性官能基をフェニル環上
に導入してもよい。Ｒ₁の位置に反応性官能基を導入す
るには、特開昭63-112564 号公報に開示の方法を用いれ
ばよい。

【００４１】化学発光性化合物（Ｉ）が生物学的活性物
質に結合された発光性複合体の調製は、反応性官能基の
種類により適宜選択される常法に従って行えばよい。例
えば、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基を有す
る本発明の発光性化合物を、標識すべき生物学的活性物
質と緩衝液中で混合し、室温にて数分〜数十分間（通常
１５〜３０分）放置することにより調製される。

【００４２】本発明のアッセイ法は、トレーサーとして
化学発光性化合物（Ｉ）で標識された発光性複合体を使
用することを特徴とする。本発明のアッセイ法は、生物
学的特異的結合反応を利用するアッセイ法であれば、公
知のアッセイ法のいずれにも適用できる。ここで生物学
的特異的結合反応とは、抗原・抗体反応、核酸の相補的
結合、ホルモンとその結合蛋白、薬物とその結合蛋白、
酵素とその基質などの結合反応を包含する。

【００４３】本発明のアッセイ法で測定可能な被検物質
としては、抗原（ハプテンを含む）、抗体、蛋白、ペプ
チド、核酸、ホルモン、医薬、医薬代謝物などの各種生
物学的活性物質が挙げられる。被検物質と結合物質との
組合せとしては、抗原と抗体、核酸と相補的ポリヌクレ
オチド、酵素とその基質、ホルモンとその結合蛋白、医
薬とその結合蛋白、腫瘍マーカーとその抗体などがあ
る。かかる被検物質の例としては、ＴＳＨ（甲状腺刺激
ホルモン）、ｈＣＧ（胎盤性性腺刺激ホルモン）、ＣＲ
Ｐ（Ｃ反応性蛋白）、ＡＳＯ（抗ストレプトリジン
Ｏ）、ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）、ＩｇＧ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＣＥＡ（癌胎児性抗
原）、トランスフェリン、フェリチン、フィブリン、フ
ィブリノーゲン分解産物、ハプトグロビン、α₁ −アン
チトリプシン、α₁ −アシドグリコプロテイン、α₂ −
マクログロブリン、β₂ −ミクログロブリンなどを挙げ
ることができる。

【００４４】本発明のアッセイ法において、複合体と遊
離体との分離（Ｂ／Ｆ分離）はイムノアッセイの分野に
おいて通常用いられる手法にて行えばよい。ポリスチレ
ン製の試験管またはウェル、ガラスビーズ、ポリスチレ
ンラテックスビーズ、セファロース、ポリアクリルなど
の不溶性担体上に結合物質を固定化する固相法が簡便性
の点で有利である。

【００４５】化学発光の検出も公知の手段にて行えばよ
い。アルカリ性条件下、例えば過酸化水素などの酸化剤
を添加することにより発光が生じる。その発光量をルミ
ノメーターなどの適当な測定器で測定すればよい。な
お、複合体に結合している標識化合物の化学発光を測定
する代わりに、分離した遊離体に結合している標識化合
物の方を測定してもよいことはいうまでもない。

【００４６】以下、本発明の好ましい態様を抗原・抗体
反応を利用したイムノアッセイ法を例に挙げて説明す
る。被検物質は抗原と抗体のいずれでもよいが便宜的に
抗原を測定する方法で説明する。

【００４７】アッセイ法１（非競合法）の好ましい態様
はサンドイッチ法である。すなわち、次の工程からなる
試料中の抗原のアッセイ法である。（ａ）試料を、固定
化された、試料中の抗原に対する抗体（以下、固定化抗
体という）とインキュベートして固定化抗体と抗原との
複合体を形成させ、（ｂ）次いで化学発光性化合物
（Ｉ）で標識された、抗原に対する抗体（以下、標識抗
体という）を加えてインキュベートして固定化抗体、抗
原および標識抗体からなるサンドイッチを形成させ、
（ｃ）該サンドイッチと遊離の標識抗体とを分離し、
（ｄ）該サンドイッチに結合している化学発光性化合物
（Ｉ）の化学発光を検出し、（ｅ）検出された発光量か
ら試料中の抗原の量を決定する。 この方法は、２以上の抗体結合部位を有する抗原の測定
に適用することができる。

【００４８】アッセイ法２（競合法）の好適な態様は、
次の工程からなる試料中の抗原のアッセイ法である。 （ａ）試料を、(i) 固定化抗体および (ii) 化学発光性
化合物（Ｉ）で標識された抗原（以下、標識抗原とい
う）とインキュベートして抗原と抗体との複合体を形成
させ、 （ｂ）該複合体と遊離の標識抗原とを分離し、 （ｃ）該複合体に結合している化学発光性化合物（Ｉ）
の化学発光を検出し、 （ｄ）検出された発光量から試料中の抗原の量を決定す
る。

【００４９】

【実施例】本発明を以下の実施例、試験例によってさら
に詳細に説明する。 実施例１ （１）ベンジル−４−ブロモ酪酸（化合物１）の合成 ４−ブロモ塩化酪酸（１３．８ｇ）を酢酸エチル（５０
ｍｌ）に加え、−２０℃下で攪拌しながら、Ｎ−メチル
ホルホリン（７．６ｇ）を滴下した。さらにベンジルア
ルコール（７ｇ）を滴下後、室温で２時間攪拌を続け
た。酢酸エチル（５０ｍｌ）と１０％−炭酸ナトリウム
（４００ｍｌ）を加え、有機層を分離した。有機層を精
製水（４００ｍｌ）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾
燥した。溶媒を減圧下で留去し、粗生成物（油）を得
た。減圧下で蒸留（１４０℃／１ｍｍＨｇ）して精製
し、標記化合物を得た。（油 １３ｇ、収率７７％）

【００５０】（２）３，５−ビス（トリフルオロメチ
ル）−４−ニトロフェノール（化合物２）の合成 ３，５−ビス（トリフルオロメチル）−フェノール（４
０ｇ）を酢酸（５００ｍｌ）に溶解し、氷冷下で攪拌し
ながら、１３Ｎ−硝酸（５００ｍｌ）を滴下し加えた。
８０℃で５０分間加温後、反応混合物を冷水（６リット
ル）に加え、酢酸エチル（４００ｍｌ、４回）で抽出
し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで有機層
を乾燥した。減圧下で溶媒を留去した後、シリカゲルク
ロマトグラフィー（溶出液、ジクロロメタン／酢酸エチ
ル、３０：１）により精製し、標記化合物を得た。（１
７ｇ、収率３５％） 融点：１５４〜１５５℃¹ H-NMR(DMSO-d₆ ):δ 11.6 (broad, 1H), 7.50 (s, 2H)

【００５１】（３）２，６−ビス（トリフルオロメチ
ル）−４−（３−ベンジルオキシカルボニルプロピルオ
キシ）−ニトロベンゼン（化合物３）の合成 ３，５−ビス（トリフルオロメチル）−４−ニトロフェ
ノール（４．６ｇ）、炭酸カリウム（４．６ｇ）をアセ
トン（８０ｍｌ）に加え、攪拌しながらベンジル−４−
ブロモ酪酸（１４．７ｇ）を滴下して加えた。２４時間
還流後、溶媒を減圧下で留去した。生成物をシリカゲル
クロマトグラフィー（溶出液、ｎ−ヘキサン／酢酸エチ
ル、６：１）で精製し、標記化合物を得た。（油 ６．
０ｇ、収率８０％）

【００５２】（４）２，６−ビス（トリフルオロメチ
ル）−４−（３−ベンジルオキシカルボニルプロピルオ
キシ）−アニリン（化合物４）の合成 ２，６−ビス（トリフルオロメチル）−４−（３−ベン
ジルオキシカルボニルプロピルオキシ）−ニトロベンゼ
ン（６．０ｇ）と１０％−パラジウム／炭素（２．５
ｇ）をメタノール（２００ｍｌ）に加え、攪拌しながら
水素ガスを２時間通じた。触媒を濾別した後、溶媒を減
圧下で留去し、標記化合物を結晶として得た。（４．８
ｇ、収率８８％） 融点：９５〜９９℃

【００５３】（５）２，６−ビス（トリフルオロメチ
ル）−４−（３−ベンジルオキシカルボニルプロピルオ
キシ）−フェノール（化合物５）の合成 ２，６−ビス（トリフルオロメチル）−４−（３−ベン
ジルオキシカルボニルプロピルオキシ）−アニリン
（４．３ｇ）を酢酸（１５０ｍｌ）に溶解後、０．１Ｎ
−硫酸（７４０ｍｌ）を加え、氷冷下で攪拌しながら亜
硝酸ナトリウム水溶液（１．５ｇ／水８０ｍｌ）を３時
間かけて滴下して加えた。硝酸銅（II）（３００ｇ）と
酸化銅（Ｉ）（１５ｇ）を加え、室温で１時間攪拌した
（ガス発生）。濾過後、濾液中の生成物を酢酸エチル
（３００ｍｌ、３回）で抽出した。有機層を無水硫酸ナ
トリウムで乾燥後、溶媒を減圧下で留去した。得られた
粗結晶をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出液、ｎ−
ヘキサン／酢酸エチル、１：１）により精製し、標記化
合物を得た。（４．１ｇ、収率９５％） 融点：８１〜８２℃

【００５４】（６）２，６−ビス（トリフルオロメチ
ル）−４−（３−ベンジルオキシカルボニルプロピルオ
キシ）−フェニル アクリジン−９−カルボキシレート
（化合物６）の合成 アクリジン−９−カルボン酸クロリド塩酸塩（２．８
ｇ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．２ｇ）、
２，６−ビス（トリフルオロメチル）−４−（３−ベン
ジルオキシカルボニルプロピルオキシ）−フェノール
（２．１ｇ）を無水ピリジン（６０ｍｌ）に加え、２０
時間還流した。溶媒を減圧下で留去した後、残渣をシリ
カゲルクロマトグラフィー（溶出液、ｎ−ヘキサン／酢
酸エチル、３：１）により精製し、標記化合物を得た。
（１９０ｍｇ、収率６％） IR (KBr): 3399, 2934, 1786, 1709, 1613, 1489, 137
5, 1281, 1177, 1132 cm ^{-1 1} H-NMR(CDCl₃ ):δ 7.60 (m, 15H), 5.39 (s, 2H), 3.9
1 (m, 4H), 2.55 (t, 2H)

【００５５】（７）２，６−ビス（トリフルオロメチ
ル）−４−（３−Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニ
ルプロピルオキシ）−フェニル アクリジン−９−カル
ボキシレート（化合物７）の合成 ２，６−ビス（トリフルオロメチル）−４−（３−ベン
ジルオキシカルボニルプロピルオキシ）−フェニル ア
クリジン−９−カルボキシレート（７０ｍｇ）を１０％
−臭化水素／酢酸（１ｍｌ）で１００℃、５時間処理し
て得られた結晶に、無水ジメチルホルムアミド（３ｍ
ｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（６０ｍｇ）、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（１０ｍｇ）、Ｎ−ヒ
ドロキシコハク酸イミド（３０ｍｇ）を加え、室温で６
９時間攪拌した。減圧下で溶媒を留去した後、残渣を塩
化メチレンに溶解し、析出したジシクロヘキシルウレア
を濾過により除去した。生成物をシリカゲルクロマトグ
ラフィー（溶出液、クロロホルム／酢酸エチル、６：
１）により精製し、標記化合物を得た。（２４ｍｇ、収
率３４％）

【００５６】（８）２，６−ビス（トリフルオロメチ
ル）−４−（３−Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニ
ルプロピルオキシ）−フェニル Ｎ−メチル−アクリジ
ニウム−９−カルボキシレート フルオロスルホネート
（化合物８）の合成 ２，６−ビス（トリフルオロメチル）−４−（３−Ｎ−
スクシンイミジルオキシカルボニルプロピルオキシ）−
フェニル アクリジン−９−カルボキシレート（１０ｍ
ｇ）を無水塩化メチレン（１ｍｌ）に溶解し、メチルフ
ルオロスルホネート（０．０３ｍｌ）を加え、室温で１
７時間攪拌した。無水エーテル（２ｍｌ）を加え、粗結
晶を得る。粗結晶をアセトニトリルとエーテルの混合物
から再結晶化して標記化合物を得た。（５ｍｇ、収率４
２％） 融点：１６９〜１７５℃（分解） ＦＡＢ−ＭＳ：Ｍ⁺ ６４９

【００５７】比較例 ４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）
−フェニル Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボ
キシレート フルオロスルホネート（化合物９）の合成 本化合物はウッドヘッド等の方法（メソッズ イン エ
ンザイモロジー、１３３巻、３７２〜３７４頁）に従っ
て合成した。

【００５８】実施例２ アクリジニウムエステルによる
抗体蛋白の標識 抗アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）マウスモノク
ローナル抗体（ＩｇＧ、２００μｇ）を含む０．１Ｍ−
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、標識用アクリジニウム
エステル（化合物８）をジメチルホルムアミドに５ｍＭ
となるように溶解したものを５μｌ加えた。室温下で３
０分間放置した後、１Ｍ−グリシン緩衝液（ｐＨ８．
０）を５０μｌ加え、さらに３０分間放置した。あらか
じめＰＢＳ（０．１５Ｍ−塩化ナトリウムを含むｐＨ
７．０の２０ｍＭ−リン酸緩衝液）で平衡化しておいた
セファデックスＧ−２５カラムに通し、標識体８を得
た。分光学的方法からＩｇＧ１分子あたり約３分子のア
クリジニウムが標識されていることが明らかとなった。

【００５９】化合物９による標識はウッドヘッド等の方
法に従って行なった（メソッズ イン エンザイモロジ
ー、１３３巻、３７４〜３７８頁）。この場合、ＩｇＧ
に結合しているアクリジニウムはＩｇＧ１分子あたり約
３分子であった（標識体９）。

【００６０】試験例１ 標識体の安定性 標識体８（本発明）、標識体９（比較例）をそれぞれ同
濃度となるように０．１％−牛血清アルブミンを含むＰ
ＢＳで希釈し、３７℃保存した場合の発光量の経日変化
を調べた。化学発光量は、試料（２０μｌ）に０．３％
−過酸化水素を含む０．１Ｎ−硝酸（１５０μｌ）を加
え、１分後に０．２５Ｎ−水酸化ナトリウム（１５０μ
ｌ）をショットすることにより測定した（日音株式会社
製、ルミカウンター２５００、積算時間５秒）。結果を
表１に示す。

【００６１】

【表１】

【００６２】標識体９（比較例）は保存中における発光
量の低下が著しい。これに対して標識体８（本発明）は
安定性に優れることが明らかである。

【００６３】実施例３ 化学発光免疫測定 （１）感作試験管の作製 抗ＡＦＰヤギＩｇＧを０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で１０μｇ／ｍｌとなるように希釈し、ポリス
チレン製試験管（１２×７５ｍｍ、ヌンク社製マキシソ
ープチューブ）に３００μｌ加え、５℃で一夜放置し
た。０．１％−ツイーン２０を含むＰＢＳで２回洗浄
し、０．５％−牛血清アルブミンを含むＰＢＳを１ｍｌ
加え、さらに５℃で一夜放置した。 （２）標識体８、標識体９の希釈 標識体８及び９を２０％−牛血清を含むＰＢＳで希釈
し、２０μｌ当たりの発光量が２×１０⁶ カウントとな
るように希釈した。 （３）測定 感作試験管内の液を吸引除去した後、１％−牛血清アル
ブミンを含むＰＢＳを０．３ｍｌ、ＡＦＰ標準液希釈系
列を２０μｌ加え、室温で１時間放置した。０．１％−
ツイーン２０を含むＰＢＳで２回洗浄した後、希釈した
標識体８又は９を０．３ｍｌ加え、さらに１時間室温で
放置した。０．１％−ツイーン２０を含むＰＢＳで４回
洗浄後、０．３％−過酸化水素を含む０．１Ｎ−硝酸３
００μｌを加え、１分後に０．２５Ｎ−水酸化ナトリウ
ム３００μｌをショットし、化学発光量を測定した。Ａ
ＦＰ標準液各希釈系列を用いた場合の検量線を図１に示
す。

【００６４】

【発明の効果】本発明の化学発光性化合物は、フェニル
環のオルト位にフッ素化アルキルが導入されたことによ
り、従来の発光性アクリジニウム化合物と比べて、安定
性、特に中性水溶液中における安定性が極めて高く、か
つ化学発光性も従来の化合物に匹敵するかもしくはそれ
以上である。化学発光分析法における標識化合物として
有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３におけるＡＦＰ標準液各希釈系列を用
いた場合の検量線を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−101368（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−133469（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−61969（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−9566（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/532 C07D 219/04 C09K 11/07 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒ₁ は１またはそれ以上の水素原子が任意に置
   換基により置換されていてもよく、また、１またはそれ
   以上の炭素原子が任意にヘテロ原子またはカルボニルで
   置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニ
   ル、アリールまたはアラルキル、あるいは標識をするた
   めの反応性官能基から選択される化学発光を妨げない
   基、Ｒ₂ はフッ素化アルキル、Ｒ₃ はアルキル、フッ素
   化アルキルまたはアルコキシ、ＸおよびＹはそれぞれ独
   立してＯまたはＳを示し、Ａ^- はスルフェート、ハロス
   ルホネート、アルキルスルホネート、ハロアルキルスル
   ホネート、アリールスルホネート、ハロボレート、ハロ
   アセテート、ハロホスフェート、ホスフェートまたはハ
   ライドから選択される化学発光を妨げない陰イオンを示
   す。）で表され、そのアクリジン環またはフェニル環の
   任意の位置に、１またはそれ以上の水素原子が任意に置
   換基により置換されていてもよく、また、１またはそれ
   以上の炭素原子が任意にヘテロ原子またはカルボニルで
   置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニ
   ル、アリールまたはアラルキル、あるいは標識をするた
   めの反応性官能基、ニトロ、ハロゲン、アルコキシ、カ
   ルボキシ、保護カルボキシ、アルコキシカルボニル、ア
   ミノ、保護アミノ、ヒドロキシまたは保護ヒドロキシか
   ら選択される化学発光を妨げない基を有していてもよい
   アクリジニウム化合物またはその異性体。
2. 【請求項２】 置換基が、ニトロ、ハロゲン、アミノ、
   保護アミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシ
   または保護ヒドロキシから選択される基である請求項１
   記載のアクリジニウム化合物またはその異性体。
3. 【請求項３】 ヘテロ原子が窒素、リン、硫黄または酸
   素から選ばれる請求項１または２記載のアクリジニウム
   化合物またはその異性体。
4. 【請求項４】 生物学的活性物質およびこれに結合した
   請求項１記載の化合物からなる発光性複合体。
5. 【請求項５】 （ａ）試料を、請求項１記載の化合物で
   標識された、試料中の被検物質に対して特異的に結合す
   る結合物質と混合して被検物質と結合物質との複合体を
   形成させ、 （ｂ）該複合体と遊離の標識結合物質とを分離し、 （ｃ）該複合体に結合している請求項１記載の化合物の
   化学発光を検出し、 （ｄ）検出された発光量から試料中の被検物質の量を決
   定することからなる試料中の被検物質のアッセイ法。
6. 【請求項６】 （ａ）試料を、(i)試料中の被検物質に
   対して特異的に結合する結合物質および(ii)請求項１記
   載の化合物で標識された被検物質と混合して被検物質と
   結合物質との複合体を形成させ、 （ｂ）該複合体と遊離の標識被検物質とを分離し、 （ｃ）該複合体に結合している請求項１記載の化合物の
   化学発光を検出し、 （ｄ）検出された発光量から試料中の被検物質の量を決
   定することからなる試料中の被検物質のアッセイ法。