JP5130540B2 - 蛍光誘導体化試薬ならびに蛍光誘導体化方法 - Google Patents
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Description
ー蛍光誘導体化法は、従来の誘導体化法では困難であった対象物質1分子当たり1個の発光団が導入された誘導体と複数個導入された誘導体とを分光的に識別することができる(非特許文献4)。
Ohkura, Y., et al., J. Chromatogr. B, 659,85-107 (1994) Yamaguchi, M., et al., "Reagentsfor FluorescenceDetection", ed. by Toyooka, T/,John Wiley and Sons Ltd., New York, 1999,pp. 99-166 Fukushima, K., et al., J. Pharm. Biomed. Anal.,30,1655-1687 (2003) 吉田秀幸、YAKUGAKU ZASSHI 123(8) 691-696 (2003)
という新しい概念に基づく蛍光誘導体化法を見出して、この発明を完成した。
さらに、本発明者らは、このF−trap という新概念に基づいてアミン用の誘導体化試薬としてF−trap 誘導体を合成して、このF−trap 誘導体が HPLC を妨害しないことを確認した。
なお、ここで使用する用語「フルオラス (fluorous)」とは、「親フルオロカーボン性の」という意味の造語であって、「フルオラスタグ」は、分子中にフッ素結合を豊富に含む領域を持つ標識部分を意味している。
または一般式 [II]:
で表される多環化合物である蛍光誘導体化試薬を提供することを目的としている。
または一般式[II]:
で表される多環化合物である蛍光誘導体化試薬を提供する。
一般式 [I]:
または一般式[II]:
で表される多環化合物である。
または下記化学反応式 [IIb]:
に従って、試料中のアミン類またはアミノ酸関連物質のアミノ基と反応して、試料中のアミン類またはアミノ酸関連物質が誘導体化され疎フッ素性の蛍光性アミン誘導体を生成すると同時に、フルオラスタグであるフッ素性部位が脱離して親フッ素性のフルオラスタグ含有反応副生成物が生成する。
F-trap ピレンの合成スキームを下記化学反応式 [Ic]の通りである。1-ピレン酪酸(288
mg、1 mmol)および4-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-ヘプタデカフルオロデシルチオ)フェノール(286 mg、0.5 mmol)を7 mLの脱水テトラヒドロフラン(THF)に溶解し、N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド(155 μL、1 mmol)、およびN,N-ジメチルアミノピリジン(DMAP)(61 mg、0.5 mmol)を加え、20時間室温で撹拌した。反応液に100 mLの酢酸エチルを加えた後、30mLの0.1 M塩酸および水でそれぞれ3回ずつ洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥して減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒;ヘキサン:酢酸エチル=4:1)で精製し、白色粉末のF-trapピレン[4-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-ヘプタデカフルオロデシルチオ)フェニル4-(ピレン-1-イル)ブタノエート]を得た(236 mg、収率56.1 %)。
1H-NMR(600
MHz、CDCl3) δ 2.32
(2H, m), 2.69 (2H, t, J=7.0 Hz), 3.08 (2H, t, J=8.2 Hz), 3.49 (2H, t, J=7.6
Hz), 7.03 (2H, d, J=4.6 Hz), 7.36(2H, d, J=4.6 Hz), 7.88 (1H, d, J=7.6 Hz),
7.99 (1H, t, J=7.6 Hz), 8.03 (4H,s), 8.12 (1H, d, J=4.6 Hz), 8.16 (1H, d, J=6.7
Hz), 8.31 (1H, d, J=9.2 Hz)。
F-trapクマリンの合成スキームは下記化学反応式 [IIc] の通りである。7-メトキシクマリン-4-酢酸(117 mg、0.5 mmol)および4-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-ヘプタデカフルオロデシルチオ)フェノール(286 mg、0.5 mmol)を7 mLの脱水テトラヒドロフラン(THF)に溶解し、N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド(93 μL、0.6 mmol)、およびDMAP(61 mg、0.5 mmol)、を加え、3時間室温で撹拌した。反応液に100 mLの酢酸エチルを加えた後、30mLの0.1 M塩酸および水でそれぞれ3回ずつ洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥して減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒;ヘキサン: 酢酸エチル=2:1)で精製し、白色粉末のF-trapクマリン[4-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-ヘプタデカフルオロデシルチオ)フェニル2-(7-メトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)アセテート]を得た(99 mg、収率25.1 %)。
1H-NMR(600
MHz、CDCl3) δ 2.39
(2H, m), 3.08 (2H, t, J=7.9 Hz), 3.10 (2H,s), 3.95 (3H, s), 6.33 (1H, s), 6.87
(1H, s), 6.88 (1H, d, J=8.9 Hz), 7.02 (2H,d, J=8.9 Hz), 7.35 (2H, d, J=8.9 Hz),
7.56 (1H, d, J=8.9 Hz)。
被検体試料であるアミン溶液200 μLにピリジン1.4 mLおよび5 mM F-trapピレンのTHF溶液400 μLを加えて90℃、1時間加熱する。反応液100 μLをフルオラス固相抽出カートリッジ(F-SPE)(2 g、フルオラステクノロジーズ社製)に添加する。カートリッジを水4 mL で洗浄後、80%(v/v)メタノール4 mLで溶出し、その20 μLをHPLCに注入した。HPLC分析条件は次の通り。カラム:COSMOSIL 5C18-AR-II (内径4.6
mm×長さ15 cm、ナカライテスク社製)、移動相:80%(v/v)アセトニトリル(0-10 min)、アセトニトリル-水-THF(8:1:1、v/v)(10-40 min)のグラジエント溶出、流速1.0mL/min、蛍光検出:励起波長 345 nm、蛍光波長 375 nm。
。以上の結果より、フルオラス固相抽出操作により未反応試薬のみが選択的に除去できることが示された。図3と図4のクロマトグラムのピーク面積の比からフルオラス固相抽出操作により未反応試薬の除去率を算出した。このとき、未反応試薬は少なくとも99.95%以上が除去された。
被検体試料であるアミン溶液200 μLに20 %ピリジンのアセトニトリル溶液1.4mLおよび5 mM F-trapクマリンのTHF溶液400 μLを加えて90℃、10分間加熱する。反応液100 μLをフルオラス固相抽出カートリッジ(F-SPE)(2 g、フルオラステクノロジーズ社製)に添加する。カートリッジを水4 mL で洗浄後、70 %(v/v)アセトニトリル4 mLで溶出し、その20 μLをHPLCに注入した。HPLC分析条件は次の通り。カラム:COSMOSIL 5C18-AR-II
(内径4.6 mm×長さ15 cm、ナカライテスク社製)、移動相:アセトニトリル水溶液のグラ
ジエント溶出(0 - 30 min)(40 - 90%(v/v))、流速1.0 mL/min、蛍光検出:励起波長345 nm、蛍光波長 375 nm。
Claims (6)
- 蛍光部位と、アミン類反応部位と、フッ素性部位とを有する蛍光誘導体化試薬において、前記蛍光誘導体化試薬が一般式 [I]:
または一般式 [II]:
で表される多環化合物であることを特徴とする蛍光誘導体化試薬。 - 請求項1に記載する蛍光誘導体化試薬において、前記蛍光誘導体化試薬が、
化学構造式[Ia]:
化学構造式[IIa]:
- 一般式 [I]:
- 請求項3に記載の蛍光誘導体化方法において、前記蛍光誘導体化試薬が、一般式[IIa]:
- 請求項1もしくは2のいずれか1項に記載の蛍光誘導体化試薬または請求項3もしくは4に記載の誘導体化方法を用いて、試料中のアミン類やアミノ酸関連物質を誘導体化して分離測定することを特徴とする試料中のアミン類やアミノ酸関連物質の測定方法。
- 請求項1もしくは2のいずれか1項に記載の蛍光誘導体化試薬または請求項3もしくは4に記載の誘導体化方法を用いて、試料中のアミン類やアミノ酸関連物質を誘導体化したときに過剰に残存する未反応試薬を親フッ素性吸着剤により選択的に除去することを特徴とする除去方法。
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