JPH09241233A - 免疫測定用標識試薬及びそれに用いる蛍光性化合物及び錯体、及びそれらを用いる生物物質の免疫測定法 - Google Patents

免疫測定用標識試薬及びそれに用いる蛍光性化合物及び錯体、及びそれらを用いる生物物質の免疫測定法

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JPH09241233A
JPH09241233A JP8051185A JP5118596A JPH09241233A JP H09241233 A JPH09241233 A JP H09241233A JP 8051185 A JP8051185 A JP 8051185A JP 5118596 A JP5118596 A JP 5118596A JP H09241233 A JPH09241233 A JP H09241233A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 蛍光発光強度が強く、合成収率が良く、免疫
測定法において固相測定と液相測定の両方が可能であ
り、測定手順も少ない標識試薬及びそれに用いる蛍光性
化合物及び錯体を提供する。 【解決手段】 一般式（３） 【化１】 及び一般式（４） 【化２】 及び一般式（５） 【化３】 （一般式（３）〜（５）中、Ｒはタンパク質に結合可能
な基であり、Ａｒは共役二重結合系であり、ｎは整数で
ある。）で表される蛍光性化合物、及び該蛍光性化合物
とランタノイド金属イオンからなる錯体、及び該蛍光性
化合物または該錯体部分を有する免疫測定用標識試薬。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査分野にお
いて用いられる時間分解蛍光免疫測定法等の標識試薬、
及びそれに用いる蛍光性化合物及びその錯体に関する。
なお、本明細書中において、「蛍光性化合物」とは、金
属イオンに配位して錯体となったときに、錯体由来の蛍
光を発することのできる化合物をいう。
【０００２】
【従来の技術】従来の測定用試薬としては、ＬＫＢシス
テムで用いられるβ−ジケトン型標識試薬、芳香アミン
型標識試薬（ＢＣＰＤＡ系標識試薬）がある。ＬＫＢシ
ステムとは、標識試薬（Ｅｕキレート標識抗体）を単体
として用いても、標識試薬と抗原等のタンパク質が結合
した状態で用いても、蛍光を発光することができないた
め、抗原の濃度を測定するために、増強剤として２−ナ
フトイルトリフルオロアセトンとトリ−ｎ−オクチルホ
スフィンオキサイドとトリトンＸ−１００溶液を加え
て、水溶液中にＥｕ（III)を遊離させた後、Ｅｕ（III)
キレート−ミセルの状態にして蛍光を測定するものであ
る。
【０００３】しかし、これには次のような問題点があ
る。第一に、環境（血清、試薬、空気中等）からの汚染
を受けやすいという欠点がある。すなわち、水溶液中に
遊離したＥｕ（III)と十分に反応させるために、過剰の
増強剤を加える必要があり、この過剰の増強剤が環境
（空気、血清等）中のユウロピウムと反応し、抗原の濃
度が実際より高く測定されてしまう。第二に、抗原、抗
体等のタンパク質と蛍光性化合物が結合した状態では、
蛍光を発することができないため、測定操作手順中に増
強試薬を加える操作が必要であること、および、水溶液
中でないと蛍光発光の可能な物質とならず、固相測定が
できないという欠点がある。
【０００４】上記芳香アミン型標識試薬（ＢＣＰＤＡ系
標識試薬）に用いる蛍光性化合物としては、４，７−ビ
ス（クロロスルフォフェニル）−１，１０−フェナント
ロリン−２，９−ジカルボン酸（ＢＣＰＤＡ）、ビスク
ロロスルフォフェニルフェナントロリンジカルボン酸等
が挙げられる。しかし、芳香アミン型標識試薬を用いた
場合、上記β−ジケトン型標識試薬を用いたＬＫＢシス
テムと比較して、蛍光強度が１／１００〜１／２００と
弱い。蛍光強度が弱いと、測定対象の高感度な定量がで
きない。すなわち、検出限界が高く、低濃度域までの測
定ができない。蛍光強度を高めるために、特開平２−８
８９６８号公報には多重標識型に改良した標識試薬が開
示されているが、十分な蛍光強度を得るには至っていな
い。
【０００５】さらに、近年開発されたβ−ジケトン型標
識試薬が、特開平４−２４４０８５号公報及び特開平７
−１０８１９号公報に記載されている。しかし、これら
の標識試薬についても、上記ＢＣＰＤＡを用いた芳香ア
ミン型標識試薬と比較して、蛍光強度が１．４倍程と弱
い。また、合成における工程数が多く、目標とする化合
物の収率も良くない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、（１）蛍光強度が強く、（２）芳香アミン型標
識試薬（ＢＣＰＤＡ系標識試薬）と比較して安価であ
り、（３）合成収率が高く、（４）固相測定と液相測定
の両方が可能であり、（５）測定手順が少なく、迅速に
結果を得ることができ、（６）合成した標識試薬が安定
な物質であり、長期保存が可能である標識試薬と、それ
に用いる蛍光性化合物及びその錯体を提供することにあ
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記目的を解決するため
に、本発明は、一般式（１）
【化６】 （式中、Ｒはタンパク質に結合可能な基であり、Ａｒは
共役二重結合系であり、Ｘはフッ素原子または一般式
（２）
【化７】 で表される基であり、ｎは整数である。）で表される蛍
光性化合物、及び該蛍光性化合物とランタノイド金属イ
オンからなる錯体、及び該蛍光性化合物または該錯体を
有する免疫測定用標識試薬を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】上記一般式（１）において、Ｒは
タンパク質に結合可能な基であり、具体的には、次に示
す基を挙げることができる。
【化８】 この中で特に塩化スルホニル基（−ＳＯ2 Ｃｌ）が、タ
ンパク質等のアミノ基と反応性に富み、比較的簡単な方
法で蛍光性化合物に導入できるため、好ましい。
【０００９】上記一般式（１）中のＲと結合するタンパ
ク質としては、具体的には抗体類、ビオチン標識抗体
類、抗原類、アビジン、ストレプトアビジン、ウシ血清
アルブミン、ハプテン、ホルモン、ポリペプチド、核
酸、ポリヌクレオチド等が挙げられる。
【００１０】上記一般式（１）において、Ａｒは共役二
重結合系であり、例えば、アリール基や次に示すものが
挙げられる。
【化９】 上記一般式（１）において、ｎは整数であり、通常、１
〜６である。
【００１１】本発明で用いられるランタノイド金属イオ
ンとしては、例えば、ユウロピウム（Ｅｕ）、サマリウ
ム（Ｓｍ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄ
ｙ）等のイオンを挙げることができる。
【００１２】蛍光性化合物の合成は、二つの工程からな
る。以下、第一工程と第二工程に分けて説明する。第一工程 アセチル化芳香環化合物類とエチルパーフルオロカルボ
キシレート類またはジエチルパーフルオロジカルボキシ
レート類とのクライゼン縮合反応によって、β−ジケト
ン類化合物を合成する。アセチル化芳香環状化合物類の
具体例としては、４’−フェニルアセトフェノン、２−
アセチルジベンゾチオフェン（ジベンゾチオフェンと塩
化アセチルとの反応によって合成される。）、メチルー
４，４’，４”−テルフェニルケトン（４，４’，
４’’−テルフェニルケトンと塩化アセチルとの反応に
よって合成される。）、２−アセチルチオフェン、２−
アセチルベンゾチオフェン（ベンゾチオフェンと塩化ア
セチルとの反応によって合成される。）、４，４’−ジ
アセチル−ｏ−テルフェニル（ｏ−テルフェニルと塩化
アセチルとの反応によって合成される。）等が挙げられ
る。
【００１３】エチルパーフルオロカルボキシレート類の
具体例としては、トリフルオロ酢酸エチル、ペンタフル
オロプロピオン酸エチルエステル、エチルヘプタフルオ
ロブチレート、エチルパーフルオロペンタノエート等が
挙げられる。ジエチルパーフルオロジカルボキシレート
類の具体例としては、ジエチルジフルオロマロネート、
ジエチルテトラフルオロサクシネート、ジエチルヘキサ
フルオログルタレート、ジエチルパーフルオロアジペー
ト、ジエチルデカフルオロピメレート、ジエチルドデフ
ルオロスベレート等が挙げられる。第一工程の合成経路
図を図１に示す。図中、ＮａＯＣＨ3 は触媒であり、乾
燥エーテルは溶媒である。得られた生成物は、再結晶に
よって精製される。再結晶溶媒としてはエタノール、
１，４−ジオキサンまたはそれらの混合溶媒を用いる。
【００１４】第二工程 合成したβ−ジケトン類化合物とクロロ硫酸とのクロロ
スルホニル化反応によって、β−ジケトン分子の芳香環
にクロロスルホニル基（ＣｌＳＯ2 −）を導入する。ク
ロロ硫酸とβ−ジケトンとの反応が終了した後、冷水中
で未反応のクロロ硫酸を加水分解させると、クロロスル
ホニル化β−ジケトンは冷水中に溶解せず、沈澱として
得られる。第二工程の合成経路図を図２に示す。
【００１５】二つの塩化スルフォニル基を有する蛍光性
化合物の場合、該化合物をタンパク質の標識反応に直接
使用すると、ポリマー標識タンパク質を生成する可能性
がある。標識する前にどちらか一つの塩化スルフォニル
基の保護を行うと、これを防ぐことができる。保護反応
は、Ｎ（Ｃ2 Ｈ5 ）3 の存在下でＮＨ2 ＣＨ（ＣＨ3）
2 、Ｃ6 Ｈ5 ＮＨ2 、Ｃ2 Ｈ5 ＮＨ2 等を用い、ＤＭＦ
またはアセトニトリル中で行う。この保護反応を行うこ
とによって、ポリマーの生成を防ぐことができ、Ｅｕと
の錯体の蛍光強度を増大することができるという効果が
得られる。しかし、この保護反応を行わなくてもポリマ
ーの生成が起こらないことが、同じような構造を有する
蛍光性化合物について報告されているので、保護反応を
必ずしも行う必要はない。
【００１６】以上の工程によって、蛍光性化合物を合成
することができる。タンパク質の標識反応は、クロロス
ルホニル基とアミノ基とのアミド形成反応によって行わ
れる。室温で炭酸緩衝溶液（ｐＨ＝９．０〜９．５）中
で反応が容易に進行する。標識タンパク質の合成経路図
を図３に示す。本発明の標識試薬を用いる免疫測定法と
しては、例えば、時間分解蛍光免疫測定法や特異的結合
アッセイを挙げることができる。時間分解蛍光免疫測定
法とは、長寿命の蛍光標識体（Ｅｕ−キレート等）を用
い、短時間の蛍光寿命のバックグラウンドの蛍光が消失
した後に、標識体の蛍光シグナルのみを時間分解蛍光測
定する高感度な蛍光免疫測定法を指す。特異的結合アッ
セイとは、抗原抗体反応を利用した免疫測定、レセプタ
ー・アクセプターの結合反応を利用したアッセイ、核酸
のハイブリダイゼーションを利用したアッセイ等を指
す。
【００１７】
【実施例】蛍光性化合物（ａ）〜（ｄ）の製造 次の化学式（ａ）〜（ｄ）に示す蛍光性化合物の製造方
法について説明する。
【化１０】
【００１８】４０ｇの乾燥エーテル中に、２．５ｇのＮ
ａＯＣＨ3 、１０ｍｍｏｌのＡｒＣＯＣＨ3 （４’−フ
ェニルアセトフェノン、２−アセチルジベンゾチオフェ
ン、メチル−４，４’，４”−テルフェニルケトン、２
−アセチルベンゾチオフェンから選択されたもの）及び
１０ｍｍｏｌのＣ3 Ｆ7 ＣＯＯＣ2 Ｈ5 を加え、室温に
おいて密封し、２４時間攪拌した。蒸留（または揮発）
によってエーテルを除去し、固体を３０分間真空乾燥し
た。１００ｍｌの１５％硫酸を加え、室温で３０分間十
分攪拌し、生成したβ−ジケトンのナトリウム塩を中和
した。生成したβ−ジケトンの沈澱を吸引濾別し、水で
よく洗浄した。これを２４時間真空乾燥した後、エタノ
ールでβ−ジケトンを再結晶化させた。すなわち、還流
によってβ−ジケトンを溶解させ、熱濾過した後、濾液
を−２０℃で２４時間放置して結晶化させた。生成した
β−ジケトンの結晶を濾別し、室温で４８時間以上真空
乾燥した。その結果、次に示す中間体（ａ’）〜
（ｄ’）が得られた。
【００１９】
【化１１】
【００２０】収率は、（ａ’）が７６％、（ｂ’）が６
５％、（ｃ’）が８２％、（ｄ’）が７０％であった。
（ａ’）〜（ｄ’）の元素分析の結果を次の表１に示
す。
【表１】
【００２１】次に、０℃において、攪拌下の３ｍｌのク
ロロ硫酸中に２ｍｍｏｌのβ−ジケトン（上記（ａ’）
〜（ｄ’）の化合物）を徐々に加えた。０〜１０℃で４
〜１０時間攪拌した後、注意深く反応溶液を攪拌下の８
０ｍｌの水−氷中（外部を氷−水で冷却する。）に徐々
に滴下した。生成した沈澱を早く遠心分離し、冷たい水
（約５℃）で沈澱を洗い、２回遠心分離した。少量の冷
たい水で沈澱をガラスフィルターに移し、吸引濾過によ
って水を除去した。生成したクロロスルフィニル化β−
ジケトンを室温で４８時間以上、真空乾燥した。収率
は、（ａ）が８５％、（ｂ）が８９％、（ｃ）が９１
％、（ｄ）が８４％であった。元素分析の結果を表２に
示す。
【００２２】
【表２】
【００２３】蛍光性化合物（ｂ）を用いたタンパク質の
標識 上記（ｂ）の蛍光性化合物を用いたウシ血清アルブミン
の標識について説明する。まず、５０ｍｇのウシ血清ア
ルブミン（以下、「ＢＳＡ」とも略す。）を８ｍｌの
０．１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝溶液（ｐＨ＝９．３）中に溶
解し、室温下、ウシ血清アルブミンのアミノ基（５９個
−ＮＨ2 ／分子）と等モル数の上記（ｂ）の蛍光性化合
物を含有する２ｍｌのＤＭＦ溶液を、攪拌下のＢＳＡ溶
液に徐々に滴下した。室温で１時間攪拌した後、ゲル濾
過によって、標識ＢＳＡと未反応の蛍光性化合物の加水
分解物を分離した。この分離の際、展開溶媒としては、
（ゲルＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０，１．０×２９．１
ｃｍ），ｐＨ＝８．０の０．０５ｍｏｌ／Ｌの炭酸水素
アンモニウム水溶液を用いた。流速は１ｍｌ／９０秒と
し、１ｍｌずつ流出液を収集した。このカラムの条件で
１０ｍｌの溶液の分離を１回行うと分離効果が良くない
ので、２つのカラムで５ｍｌずつの溶液の分離を行っ
た。標識ＢＳＡの画分を集め、４℃において、水に対し
て一晩透析することによって無機塩を除去した。ゲル濾
過前の溶液を用いて、３３０ｎｍにおける溶液の吸光度
を測定した。用いた蛍光性化合物のモル濃度と３３０ｎ
ｍの吸光度から、３３０ｎｍにおける蛍光性化合物のモ
ル吸光係数を計算した。結果は、吸光係数が１．８×１
０4 ｍｏｌ-1・ｃｍ-1・Ｌであり、３３０ｎｍにおける
ウシ血清アルブミンの吸収はなかった。モル吸光係数は
標識反応の過程中に変化しないとの仮定を用い、標識Ｂ
ＳＡ溶液中のラベルの濃度及びラベルとＢＳＡとの結合
比を計算した。以上の方法で得られた標識ＢＳＡ画分中
のＢＳＡと蛍光性化合物の結合比は約２０であった。こ
れを「ＢＳＡ（ラベル）20」と表す。
【００２４】蛍光強度の測定方法と結果 蛍光の測定には、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｆ−４５００蛍光分
光光度計（日立製作所製）を用い、１５０Ｗのキセノン
ランプを励起光源とした。測定前にローダミンＢを光量
子計として用い、励起側分光器（２００〜６００ｎｍ）
の波長特性等を補正し、拡散素子を用い、蛍光側分光器
（２００〜６００ｎｍ）の波長特性、検知器の波長特性
等を補正した。蛍光寿命の測定には、ＬＰＸ１００Ｅｘ
ｃｉｍｅｒ Ｌａｓｅｒパルス光源（パルス半値幅＜１
０ｎｓ，１０Ｈｚ，ＬａｍｂｄａＰｈｙｓｉｋ社製）と
ＨＲ３２０分光器（ＳＰＥＸ社製）を組み合わせた装置
を用い、遅延時間（ｄｅｌａｙ ｔｉｍｅ）の変化に伴
う蛍光強度の変化を測定し、ｌｎＩ（ｔ）＝ｌｎＩ
（０）−ｔ／τ式により、蛍光寿命τを計算した。時間
分解蛍光測定にはＣｙｂｅｒ Ｆｌｕｏｒ ６１５ 時
間分解蛍光光度計を用い、３３７．１ｍｍの窒素レーザ
で励起させ、６１５ｎｍの蛍光強度を測定した。測定条
件は、遅延時間（ｄｅｌａｙ ｔｉｍｅ）が２００μ
ｓ、測定時間（ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｔｉｍｅ）が２００
〜６００μｓであった。測定用ウェルとしては、白色不
透明のポリスチレン製のもの（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いた。
【００２５】各蛍光性化合物をアセトン、メタノール、
エタノール等の有機溶剤に溶解し、ＥｕＣｌ3 溶液を用
い、蛍光性化合物−Ｅｕ3+の標準溶液を調製し、蛍光強
度を測定した。結果を表３に示す。
【表３】
【００２６】ユウロピウム（III)存在下の標識ＢＳＡ溶
液の蛍光特性 β−ジケトン標識ＢＳＡ溶液にＥｕＣｌ3 溶液を加える
と、強い蛍光性溶液になる。この溶液を用いて、ＢＳＡ
（ｂ）21−Ｅｕ3+溶液の蛍光スペクトル、蛍光強度に対
するｐＨ及び緩衝溶液の影響と蛍光寿命を測定した。Ｂ
ＳＡ（ｂ）21−Ｅｕ3+溶液の蛍光スペクトルは次の通り
であった。 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中：λex.max＝２５３ｎｍ、３３１ｎｍ λem.max＝６１２ｎｍ ｔｏｐｏ−ＳＤＳ :λex.max＝２５３ｎｍ、３３９ｎｍ −ＮａＨＣＯ3 中 λem.max＝６１４ｎｍ ＢＳＡ（ｂ）21−Ｅｕ3+溶液の蛍光強度に対するｐＨ及
び緩衝溶液の影響、蛍光寿命を測定した結果を表４に示
す。
【００２７】
【表４】 表４から、蛍光強度は溶液のｐＨ及び緩衝溶液の組成に
依存することがわかった。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液中で
は、強い蛍光を有する。相対的に炭酸緩衝溶液中では蛍
光が弱くなり、リン酸緩衝溶液中では蛍光が著しく弱く
なる。さらに、Ｅｕ3+と強い配位能力のあるｔｏｐｏの
溶液を用いると、ｔｏｐｏの強力な「ｓｙｎｅｒｇｉｃ
効果」によって蛍光が著しく強くなる。同時に蛍光寿命
も少し増大する。なお、溶液中に溶解した酸素が溶液の
蛍光に影響しないことを実験で確認した。
【００２８】標識ＢＳＡ溶液の時間分解蛍光測定 得られたＢＳＡ（ｂ）21溶液、１．０×１０-5ｍｏｌ／
Ｌのｔｏｐｏ−０．０５％のＳＤＳ−０．１ｍｏｌ／Ｌ
のＮａＨＣＯ3 溶液、及び１．０×１０-5ｍｏｌ／Ｌの
ＥｕＣｌ3 溶液を用い、ＢＳＡ（ｂ）21−Ｅｕ3+の標準
溶液（４．２４×１０-14 ｍｏｌ／Ｌ）を調整した。各
溶液には、Ｅｕ3+の濃度を１．０×１０ -6ｍｏｌ／Ｌに
固定し、ＢＳＡ（ｂ）21の濃度を変化させた。調整した
溶液は、室温で２時間放置した後、時間分解蛍光測定を
行った。測定時は、同じ濃度の溶液を４つのウェルに分
注し（３００μｌ／ウェル）、測定結果の平均値を測定
結果（Ｉ）とした。同様に、溶媒も４つのウェルに分注
し、測定結果の平均値をバックグラウンド（Ｉ0 ）とし
た。検量線を引く際に、（Ｉ−Ｉ0 ）値をフルオレセン
ス・カウント（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｕｎ
ｔ）として使用した。結果を図４に示す。図４から求め
た蛍光性化合物（ｂ）の検出限界は、８．９×１０-12
ｍｏｌ／Ｌであった。
【００２９】時間分解蛍光測定装置（「Ｃｙｂｅｒ Ｆ
ｌｕｅｒ ６１５」）を用いて、本発明の標識試薬（標
識ＢＳＡ−Ｅｕ3+）と従来法（ＬＫＢシステム、芳香ア
ミン型標識試薬）の検出感度を比較した。表５から、本
発明の蛍光性化合物は、ＬＫＢシステムの５倍、ＢＣＰ
ＤＡ（芳香型標識試薬）の約１０００倍感度が良いこと
がわかる。
【表５】
【００３０】蛍光性化合物（ｅ）〜（ｈ）の製造 次の化学式（ｅ）〜（ｈ）に示す蛍光性化合物の製造方
法について説明する。
【化１２】
【００３１】５０ｇの乾燥エーテル中に、３．０ｇのＮ
ａＯＣＨ3 、２０ｍｍｏｌのＡｒＣＯＣＨ3 （４’−フ
ェニルアセトフェノン、２−アセチルジベンゾチオフェ
ン、メチル−４，４’，４”−テルフェニルケトン、２
−アセチルチオフェン、２−アセチルベンゾチオフェン
から選択されたもの）及び１０ｍｍｏｌのＣ2 Ｈ5 ＯＯ
ＣＣ4 Ｆ8 ＣＯＯＣ2 Ｈ5 を加え、室温において密封
し、２４時間攪拌した。蒸留（または揮発）によってエ
ーテルを除去し、固体を３０分間真空乾燥した。１００
ｍｌの１５％硫酸を加え、室温で３０分間充分攪拌し、
生成したβ−ジケトンのナトリウム塩を中和した。生成
したβ−ジケトンの沈澱を吸引濾別し、水でよく洗浄し
た。これを２４時間真空乾燥した後、５：１の混合比の
エタノールと１，４−ジオキサン（４’−フェニルアセ
トフェノン、メチル−４，４’，４”−ターフェニルケ
トンを用いた場合）または１，４−ジオキサン（２−ア
セチルジベンゾチオフェンを用いた場合）またはエタノ
ール（２−アセチルチオフェン、２−アセチルベンゾチ
オフェンを用いた場合）でβ−ジケトンを再結晶化させ
た。生成したβ−ジケトンの結晶を濾別し、室温で４８
時間以上真空乾燥した。その結果、次に示す中間体
（ｅ’）〜（ｉ’）が得られた。
【００３２】
【化１３】
【００３３】収率は、（ｅ’）が６５％、（ｆ’）が５
０％、（ｇ’）が７１％、（ｈ’）が７９％、（ｉ’）
が６９％であった。（ｅ’）〜（ｉ’）の元素分析の結
果を次の表６に示す。
【表６】
【００３４】次に、０℃において、攪拌下の５ｍｌのク
ロロ硫酸中に２ｍｍｏｌのβ−ジケトン（上記（ｅ’）
〜（ｉ’）の化合物の中から選択されたもの）を徐々に
加えた。０〜１０℃で４〜１０時間攪拌した後、注意深
く反応溶液を攪拌下の１２０ｍｌの水−氷中（外部を氷
−水で冷却する。）に徐々に滴下した。生成した沈澱を
早く遠心分離し、冷たい水（約５℃）で沈澱を洗い、２
回遠心分離した。少量の冷たい水で沈澱をガラスフィル
ターに移し、吸引濾過によって水を除去した。ただし、
（ｈ）の沈澱は非常に小さいので、２回の遠心分離後、
上澄みを捨てるに止めた。生成したクロロスルフィニル
化β−ジケトンを室温で４８時間以上、真空乾燥した。
収率は、（ｅ）が８５％、（ｆ）が８６％、（ｇ）が８
９％、（ｈ）が３０％、（ｉ）が８０％であった。元素
分析の結果は次の表７の通りである。
【００３５】
【表７】
【００３６】蛍光性化合物（ｅ）を用いたタンパク質の
標識 上記（ｅ）の蛍光性化合物を用いたウシ血清アルブミン
の標識について説明する。攪拌下の７５．３ｍｇ（０．
０８５６ｍｍｏｌ）の上記（ｅ）化合物と１．００ｍｌ
の乾燥ＤＭＦ溶液に、０．１２８ｍｏｌ／ＬのＮＨ2 Ｃ
Ｈ（ＣＨ3 ）2 −０．１５０ｍｏｌ／ＬのＮ（Ｃ
2 Ｈ5 ）3 のＤＭＦ溶液を１．００ｍｌ滴下した。室温
で２０〜３０分間攪拌した後、このＤＭＦ溶液を、攪拌
下の５０ｍｇのＢＳＡ−１０ｍｌの０．１ｍｏｌ／Ｌ炭
酸緩衝溶液（ｐＨ＝９．３０）の溶液に徐々に滴下し、
室温で１時間攪拌した。ゲル濾過によって、標識ＢＳＡ
と未反応の蛍光性化合物とを分離した。この分離の際、
展開溶媒としては、（ゲル Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５
０，１．０×２９．１ｃｍ），ｐＨ＝８．０の０．０５
ｍｏｌ／Ｌの炭酸水素アンモニウム水溶液を用いた。流
速は１ｍｌ／９０秒とし、１ｍｌずつ流出液を収集し
た。このカラムの条件で１０ｍｌの溶液の分離を１回行
うと分離効果が良くないので、３ｍｌずつの溶液の分離
を行った。標識ＢＳＡの画分を集め、４℃において、水
に対して一晩透析することによって無機塩を除去した。
ゲル濾過前の溶液を用いて、３３０ｎｍにおける溶液の
吸光度を測定した。用いたＢＳＡのモル濃度と３３０ｎ
ｍの吸光度から、３３０ｎｍにおけるＢＳＡのモル吸光
係数を計算した。結果は、吸光係数が３．６５×１０4
ｍｏｌ-1・ｃｍ-1・Ｌであった。標識ＢＳＡ画分中のＢ
ＳＡと蛍光性化合物の結合比は約２６であった。
【００３７】以上の反応において、蛍光性化合物の量を
増加させ、ＮＨ2 ＣＨ（ＣＨ3 ）2−Ｎ（Ｃ2 Ｈ5 ）3
のＤＭＦ溶液の濃度を増加させることによって、さらに
高い結合比をもつＢＳＡ（蛍光性化合物）n の溶液が得
られた。蛍光性化合物の量を２６３．９ｍｇとし、０．
３４２ｍｏｌ／ＬのＮＨ2 ＣＨ（ＣＨ3 ）2 −０．５０
ｍｏｌ／ＬのＮ（Ｃ2 Ｈ5 ）3 のＤＭＦ溶液を用いるこ
とによって、最高４７の結合比の溶液が得られた。
【００３８】蛍光性化合物（ｅ）を用いたアビジン及び
ストレプトアビジンの標識 上記（ｅ）の蛍光性化合物を用いたアビジン（ＡＤ）及
びストレプトアビジン（ＳＡ）の標識について説明す
る。攪拌下の１１．８ｍｇ（０．０１３ｍｍｏｌ）の上
記蛍光性化合物（ｅ）−２５０μＬのアセトニトリル溶
液の溶液に、２５０μＬの０．０７２ｍｏｌ／ＬのＮＨ
2 ＣＨ（ＣＨ3 ）2 −０．１０ｍｏｌ／ＬのＮ（Ｃ2 Ｈ
5 ）3 のアセトニトリル溶液を滴下した。室温で３０分
間攪拌した後、乾燥窒素ガスの流れでアセトニトリル溶
媒を飛ばさせた。その後、５ｍｇのアビジン（またはス
トレプトアビジン）−１．１ｍｌの炭酸緩衝溶液（０．
１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ＝９．１）−２５μＬのＤＭＦの溶
液を加え、室温で２時間攪拌した。遠心分離によって不
溶物を分離し、２．０ｍｌの０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ＝７．７）で沈澱を洗い、
遠心分離後、２回の上澄みを合わせて、０．１ｍｏｌ／
ＬのＮａＨＣＯ3 −０．２５ｇのＮａＮ3 溶液４Ｌに対
して、４℃で２回（１回目は１６時間、２回目は６時
間）透析した。この方法で得られた標識タンパク質溶液
中のタンパク質−蛍光性化合物の結合比は約８であっ
た。
【００３９】以上に示した方法は、抗体等のタンパク質
の標識にも応用することができる。標識アビジンまたは
標識ストレプトアビジンを用いて、ビオチンで標識した
抗体、抗原、ＤＮＡ等とのアビジン−ビオチン反応によ
って、イムノアッセイに直接応用することができる。
【００４０】蛍光強度の測定方法と結果 蛍光強度の測定方法は、上記蛍光性化合物（ｂ）を用い
た場合と同様である。結果を表８に示す。
【表８】
【００４１】ユウロピウム（III)存在下の標識ＢＳＡ溶
液の蛍光特性 β−ジケトン標識ＢＳＡ溶液にＥｕＣｌ3 溶液を加える
と、強い蛍光性溶液になる。蛍光性化合物として上記
（ｅ）化合物を用いて、ＢＳＡ（ｅ）n −Ｅｕ3+溶液の
蛍光スペクトル、蛍光強度に対するｐＨ及び緩衝溶液の
影響と蛍光寿命を測定した。ＢＳＡ（ｅ）n −Ｅｕ3+溶
液の蛍光スペクトルは次の通りであった。 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中：λex.max＝３３６ｎｍ、 λem.max＝６１１．６ｎｍ（半値幅＝約９ｎｍ） 炭酸緩衝溶液中 ：λex.max＝３３０ｎｍ、 λem.max＝６１１．２ｎｍ（半値幅＝約９ｎｍ） ｔｏｐｏ−ＳＤＳ :λex.max＝３４１ｎｍ −ＮａＨＣＯ3 * 中 λem.max＝６１３．６ｎｍ（半値幅＝約９ｎｍ） （＊ １．０×１０-5ｍｏｌ／Ｌのｔｏｐｏ−０．０５％のＳＤＳ−０． １ｍｏｌ／ＬのＮａＨＣＯ3 溶液） 結合比ｎが変化しても、蛍光スペクトルの形は変化しな
い。
【００４２】ＢＳＡ（ｅ）n −Ｅｕ3+溶液の蛍光強度に
対するｐＨ及び緩衝溶液の影響、蛍光寿命を測定した結
果を表９に示す。表９において、ｐＨ９．１の０．１ｍ
ｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液の蛍光強度（カウン
ト）を１００とし、他の溶液の相対蛍光強度を計算し
た。結合比ｎが変化しても、相対蛍光強度は変化しな
い。
【表９】
【００４３】次に、蛍光性化合物として上記（ｆ）化合
物を用いて、ＢＳＡ（ｆ）n −Ｅｕ 3+溶液の蛍光スペク
トル、蛍光強度に対するｐＨ及び緩衝溶液の影響と蛍光
寿命を測定した。ＢＳＡ（ｆ）n −Ｅｕ3+溶液の蛍光ス
ペクトルは次の通りであった。 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中：λex.max＝２５３ｎｍ、３３９ｎｍ λem.max＝６１２ｎｍ（半値幅＝約９ｎｍ） 炭酸緩衝溶液中 ：λex.max＝２５３ｎｍ、３３０ｎｍ λem.max＝６１１．６ｎｍ（半値幅＝約９ｎｍ） リン酸緩衝溶液中 ：λex.max＝２５３ｎｍ、３３２ｎｍ λem.max＝６１１．６ｎｍ（半値幅＝約９ｎｍ） ｔｏｐｏ−ＳＤＳ :λex.max＝２５３ｎｍ、３４１ｎｍ −ＮａＨＣＯ3 2)中 λem.max＝６１３．５ｎｍ（半値幅＝約９ｎｍ） ２）１．０×１０-5ｍｏｌ／Ｌのｔｏｐｏ−０．０５％のＳＤＳ−０．１ｍｏ ｌ／ＬのＮａＨＣＯ3 溶液 結合比ｎが変化しても、蛍光スペクトルの形は変化しな
い。
【００４４】ＢＳＡ（ｆ）n −Ｅｕ3+溶液の蛍光強度に
対するｐＨ及び緩衝溶液の影響、蛍光寿命を測定した結
果を表１０に示す。表１０において、ｐＨ９．１の０．
１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液の蛍光強度（カウ
ント）を１００とし、他の溶液の相対蛍光強度を計算し
た。結合比ｎが変化しても、相対蛍光強度は変化しな
い。
【表１０】
【００４５】表９と表１０の結果から、蛍光強度は溶液
のｐＨ及び緩衝溶液の組成に依存することがわかった。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液中では、強い蛍光を有する。相対
的に炭酸緩衝溶液中では蛍光が弱くなり、リン酸緩衝溶
液中では蛍光が著しく弱くなる。さらに、Ｅｕ3+と強い
配位能力のあるｔｏｐｏの溶液を用いると、ｔｏｐｏの
強力な「ｓｙｎｅｒｇｉｃ効果」によって蛍光が著しく
強くなる。同時に蛍光寿命も少し増大する。なお、溶液
中に溶解した酸素が溶液の蛍光に影響しないことを実験
で確認した。
【００４６】標識ＢＳＡ溶液の時間分解蛍光測定 得られたＢＳＡ（ｅ）47溶液またはＢＳＡ（ｆ）40溶
液、１．０×１０-5ｍｏｌ／Ｌのｔｏｐｏ−０．０５％
のＳＤＳ−０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＨＣＯ3 溶液、及び
１．０×１０-5ｍｏｌ／ＬのＥｕＣｌ3 溶液を用い、Ｂ
ＳＡ（蛍光性化合物）n −Ｅｕ3+の標準溶液（ＢＳＡ
（ｅ）47溶液は１．６×１０-14 ｍｏｌ／Ｌ、ＢＳＡ
（ｆ）40溶液は９．３×１０-14 ｍｏｌ／Ｌ）を調整し
た。各溶液には、Ｅｕ3+の濃度を１．０×１０-6ｍｏｌ
／Ｌに固定し、ＢＳＡ（蛍光性化合物） n の濃度を変化
させた。調整した溶液は、室温で２時間放置した後、時
間分解蛍光測定を行った。測定時は、同じ濃度の溶液を
４つのウェルに分注し（３００μｌ／ウェル）、測定結
果の平均値を測定結果（Ｉ）とした。同様に、溶媒も４
つのウェルに分注し、測定結果の平均値をバックグラウ
ンド（Ｉ0 ）とした。検量線を引く際に、（Ｉ−Ｉ0 ）
値をフルオレセンス・カウント（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｃｅ ｃｏｕｎｔ）として使用した。結果を図５に示
す。図５から求めた蛍光性化合物の検出限界は、化合物
（ｅ）で７．５×１０-13 ｍｏｌ／Ｌ、化合物（ｆ）で
３．７×１０-12 であった。
【００４７】時間分解蛍光測定装置（「Ｃｙｂｅｒ Ｆ
ｌｕｏｒ ６１５」）を用いて、本発明の標識試薬（標
識ＢＳＡ−Ｅｕ3+）と従来法（ＬＫＢシステム、芳香ア
ミン型標識試薬）の検出感度を比較した。表１１から、
本発明のラベル化剤はＬＫＢシステムの数１０倍、蛍光
性化合物としてＢＣＰＤＡを用いた芳香型標識試薬の約
２０００倍以上感度が良いことがわかる。
【表１１】
【００４８】４，４’−ジアセチル−ｏ−テルフェニル
の合成 アセチル化芳香環状化合物類として、４，４’−ジアセ
チル−ｏ−テルフェニルを用いた実施例について、以下
に述べる。まず、４，４’−ジアセチル−ｏ−テルフェ
ニルの合成方法を説明する。０℃において、攪拌下の２
００ｍｌのＣＨ2 Ｃｌ2 と、２１０ｍｍｏｌのＡｌＣｌ
3 と、２０５ｍｍｏｌのＣＨ3 ＣＯＣｌの溶液に、１０
０ｍｌのＣＨ2 Ｃｌ 2 と１００ｍｍｏｌのｏ−テルフェ
ニルの溶液を徐々に滴下した。０℃で３０分間攪拌した
後、室温で２４時間攪拌した。さらに２時間還流した
後、反応溶液を氷＋塩酸（濃）中に注ぎ、充分攪拌した
後、減圧蒸留によってＣＨ2 Ｃｌ2 を除去した。沈澱を
濾別し、水でよく洗浄した。約２５０ｍｌの２−ブタノ
ンで生成物を再結晶し、生成した針状結晶を濾別し、真
空乾燥した。収量は２２．１ｇであり、収率は７０．３
％であった。元素分析の結果は次の通りであった。 元素分析結果： 理論値：Ｃ％＝８４．０５、Ｈ％＝５．７７ 測定値：Ｃ％＝８４．０６、Ｈ％＝５．８７1 Ｈ−ＮＭＲで生成物が目標化合物であることを確認し
た。
【００４９】蛍光性化合物（ｊ）の中間体（ｊ’）の合
成
【化１４】 で表される蛍光性化合物（ｊ）の中間体（ｊ’）
【化１５】 の合成方法を以下に述べる。
【００５０】３０ｇの乾燥エーテル（Ｅｔ2 Ｏ）中に
３．０ｇのＮａＯＣＨ3 、１０ｍｍｏｌの４，４’−ジ
アセチル−ｏ−テルフェニル及び２０ｍｍｏｌのＣ3 Ｆ
7 ＣＯＯＣ2 Ｈ5 を加え、室温において密封し、２４時
間攪拌した。蒸留によって乾燥エーテルを除去し、３０
分間真空乾燥した。１００ｍｌの１５％硫酸で生成物を
中和し、沈澱を濾別し、水でよく洗浄した。沈澱を２０
０ｍｌエタノールに加熱しながら溶解し、濾過によって
不溶物を除去した。減圧で溶液を約２０ｍｌまで濃縮
し、この溶液を攪拌下の２００ｍｌの石油エーテル中に
徐々に滴下した。充分攪拌した後、析出した少量の沈澱
を濾過によって除去し、濾液を減圧濃縮して全ての有機
溶媒を除去した。得られた油状物を真空乾燥した後、黄
色の粉末が得られた。さらに石油エーテルで黄色粉末を
充分洗浄した後、２４時間真空乾燥した。収量は４，６
０ｇであり、収率は６５．０％であった。 元素分析結果： 理論値：Ｃ％＝５１．００、Ｈ％＝２．２８ 測定値：Ｃ％＝５１．２２、Ｈ％＝２．６１1 Ｈ−ＮＭＲで生成物は目標化合物であることを確認し
た。
【００５１】蛍光性化合物（ｊ）の合成 室温において、攪拌下の３．５ｍｌのクロロ硫酸中に２
ｍｍｏｌのβ−ジケトン（ｊ’）を徐々に加えた。室温
で７時間攪拌した後、注意深く反応溶液を攪拌下の１５
０ｍｌの水−氷中（外部は氷−水で冷却する。）に徐々
に滴下した。生成した沈澱を早く遠心分離し、冷たい水
（約５℃）で沈澱を洗浄し、２回の遠心分離を行った。
少量の冷たい水で沈澱をガラスフィルターに移し、吸引
濾過によって水を除去した。室温で４８時間以上、生成
したクロロスルホニル化β−ジケトンを真空乾燥した。
収率は７７％であった。 元素分析結果： 理論値：Ｃ％＝４４．７６、Ｈ％＝１．８８ 測定値：Ｃ％＝４４．５０、Ｈ％＝１．９２1 Ｈ−ＮＭＲで生成物は目標化合物であることを確認し
た。
【００５２】蛍光性化合物（ｊ）を用いたタンパク質の
標識 蛍光性化合物（ｊ）を用いたウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）の標識について、以下に述べる。５０ｍｇのＢＳＡ
を１０．００ｍｌの０．１ｍｏｌ／Ｌの炭酸緩衝溶液
（ｐＨ＝９．３）に溶かし、室温下でＢＳＡのアミノ基
（５９個−ＮＨ2 ／分子）と等モル数の蛍光性化合物
（ｊ）を含有する２ｍｌのＤＭＦ溶液を攪拌下のＢＳＡ
溶液に徐々に滴下した。室温で１時間攪拌した後、ゲル
濾過によって標識ＢＳＡと未反応の蛍光性化合物の加水
分解物を分離した。この分離の際、展開溶媒としては、
（ゲル Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０，１．０×２９．
１ｃｍ），ｐＨ＝８．０の０．０５ｍｏｌ／Ｌの炭酸水
素アンモニウム水溶液を用いた。流速は１ｍｌ／９０秒
とし、１ｍｌずつ流出液を収集した。このカラムの条件
で１０ｍｌの溶液の分離を１回行うと分離効果が良くな
いので、２つのカラムで５ｍｌずつの溶液の分離を行っ
た。標識ＢＳＡの画分を集め、４℃において、水に対し
て一晩透析することによって無機塩を除去した。ゲル濾
過前の溶液を用いて、３３０ｎｍにおける溶液の吸光度
を測定した。用いた蛍光性化合物のモル濃度と３３０ｎ
ｍの吸光度から、３３０ｎｍにおける蛍光性化合物のモ
ル吸光係数を計算した。結果は、吸光係数が３．４１ｍ
ｏｌ-1・ｃｍ-1・Ｌであり、３３０ｎｍにおけるウシ血
清アルブミンの吸収はなかった。モル吸光係数は標識反
応の過程中に変化しないとの仮定を用い、標識ＢＳＡ溶
液中のラベルの濃度及びラベルとＢＳＡとの結合比を計
算した。以上の方法で得られた標識ＢＳＡ画分中のＢＳ
Ａと蛍光性化合物の結合比は約３５であった。
【００５３】蛍光性化合物（ｊ）を用いたストレプトア
ビジン及びアビジンの標識 上記蛍光性化合物（ｊ）を用いたストレプトアビジン
（ＳＡ）及びアビジン（ＡＤ）の標識について説明す
る。１．５ｍｇの上記蛍光性化合物（ｊ）に、５ｍｇの
ストレプトアビジン（またはアビジン）−１．１ｍｌの
炭酸緩衝溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ＝９．１）−２
５μＬのＤＭＦの溶液を加え、室温で２時間攪拌した。
遠心分離により不溶物を分離し、２．０ｍｌの０．０５
ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ＝７．
７）で沈澱を洗い、遠心分離後、２回の上澄みを合わせ
て、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＨＣＯ3 −０．２５ｇのＮ
ａＮ3 の溶液４Ｌに対して、４℃で２回（１回目は１６
時間、２回目は６時間）透析した。この方法で得られた
標識タンパク質溶液中のタンパク質−蛍光性化合物の結
合比は約１０であった。
【００５４】蛍光性化合物（ｊ）を用いたヒツジ抗マウ
スＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体の標識 ２ｍｇ／ｍｌのヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体２
ｍｌを４℃で、３Ｌの生理食塩水に対して、２４時間の
透析を２回行った後、０．５ｍｏｌ／ＬのＮａ 2 ＣＯ3
溶液で抗体溶液のｐＨを９．２に調製した。抗体溶液に
２．０ｍｇの上記蛍光性化合物（ｊ）を加え、攪拌下に
１２５μＬのＤＭＦを加えた。室温で１時間攪拌した
後、更に５０μＬのＤＭＦを加え、再び室温で１時間攪
拌した。遠心分離によって不溶物を除去し、上澄みを
０．１ＭのＮａＨＣＯ3 −０．２５ｇのＮａＮ3 溶液４
Ｌに対して、４℃で２４時間の透析を２回行った。この
方法で得られた標識タンパク質溶液中のタンパク質−蛍
光性化合物の結合比は約１１であった。以上の方法で得
られた標識タンパク質が生理活性を保つことを実際のイ
ムノアッセイへの応用によって確認した。
【００５５】蛍光強度の測定の実験方法と結果 蛍光強度の測定方法は、上記蛍光性化合物（ｂ）を用い
た場合と同様である。結果を表１２に示す。
【表１２】
【００５６】ユウロピウム（III)存在下の標識ＢＳＡ溶
液の蛍光特性 ＢＳＡ（ｊ）n −Ｅｕ3+溶液の蛍光スペクトルは次の通
りであった。 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中： λex.max＝３２６ｎｍ λem.max＝６１１．６ｎｍ（半値幅＝約９ｎｍ） 炭酸緩衝溶液中 ： λex.max＝３２４ｎｍ λem.max＝６１１．６ｎｍ（半値幅＝約９ｎｍ） リン酸緩衝溶液中 ： λex.max＝３２４ｎｍ λem.max＝６１１．６ｎｍ（半値幅＝約９ｎｍ） ｔｏｐｏ−ＳＤＳ ： λex.max＝３３４ｎｍ −ＮａＨＣＯ3 * 溶 λem.max＝６１３．４ｎｍ（半値幅＝約９ｎｍ） 液中 （＊１．０×１０-5ｍｏｌ／Ｌのｔｏｐｏ−０．０５％のＳＤＳ−０．１ ｍｏｌ／ＬのＮａＨＣＯ3 溶液）
【００５７】ＢＳＡ（ｊ）n −Ｅｕ3+溶液の蛍光強度に
対するｐＨ及び緩衝溶液の影響、蛍光寿命を測定した結
果を表１３に示す。
【表１３】
【００５８】標識ＢＳＡ溶液の時間分解蛍光測定 得られたＢＳＡ（ｊ）35溶液、１．０×１０-5ｍｏｌ／
Ｌのｔｏｐｏ−０．０５％のＳＤＳ−０．１ｍｏｌ／Ｌ
のＮａＨＣＯ3 溶液、及び１．０×１０-5ｍｏｌ／Ｌの
ＥｕＣｌ3 溶液を用い、ＢＳＡ（蛍光性化合物）35−Ｅ
ｕ3+の標準溶液（２．８×１０-14 ｍｏｌ／Ｌ）を調整
した。各溶液には、Ｅｕ3+の濃度を１．０×１０-6ｍｏ
ｌ／Ｌに固定し、ＢＳＡ（蛍光性化合物）35の濃度を変
化させた。調整した溶液は、室温で２時間放置した後、
時間分解蛍光測定を行った。測定時は、同じ濃度の溶液
を４つのウェルに分注し（３００μｌ／ウェル）、測定
結果の平均値を測定結果（Ｉ）とした。同様に、溶媒も
４つのウェルに分注し、測定結果の平均値をバックグラ
ウンド（Ｉ0 ）とした。検量線を引く際に、（Ｉ−
Ｉ0 ）値をフルオレセンス・カウント（ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｃｅ ｃｏｕｎｔ）として使用した。結果を図６
に示す。図６から求めた蛍光性化合物（ｊ）の検出限界
は、１．３×１０-12 であった。
【００５９】時間分解蛍光測定装置（「Ｃｙｂｅｒ Ｆ
ｌｕｏｒ ６１５」）を用いて、本発明の標識試薬（標
識ＢＳＡ−Ｅｕ3+）と従来法（ＬＫＢシステム、芳香ア
ミン型標識試薬）の検出感度を比較した。表１３から、
本発明の標識試薬はＬＫＢシステムの数１０倍、蛍光性
化合物としてＢＣＰＤＡを用いた芳香型標識試薬の数千
倍感度が良いことがわかる。
【表１４】
【００６０】
【発明の効果】本発明の標識試薬は、測定の対象となる
抗原、抗体等のタンパク質と直接結合することが可能で
あり、標識試薬単体でもタンパク質と結合した状態でも
どちらでも蛍光発光が可能である。また、本発明の標識
試薬は、β−ジケトンをベースに電子供与基（芳香環置
換基）、電子吸引基（フッ素置換アルキル基）を結合し
た構造をもつため、強い蛍光発光と長い蛍光寿命を有す
る。蛍光発光の強さは、ＬＫＢシステムにおける標識試
薬の約１０倍以上であり、芳香アミン型標識試薬の約１
０００倍以上である。また、本発明の標識試薬は、合成
が容易であり、収率も高い。特に、従来のＬＫＢシステ
ムで必要な増強試薬の分注や第三インキュベーション工
程が不要である。従来の芳香アミン型標識試薬を用いた
測定で必要なウェルの乾燥工程も不要である。
【００６１】また、ＬＫＢシステムのように水溶液中に
Ｅｕ（III)を遊離させなくても蛍光発光が可能であるた
め、環境からの汚染を受けない。また、免疫複合体の固
相測定、液相測定のいずれも可能である。さらに、本発
明の標識試薬は、安定な物質であり、長期保存が可能な
上、従来の芳香アミン型標識試薬の合成と比べて安価に
合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】蛍光性化合物の合成の第一工程を表す合成経路
図である。
【図２】蛍光性化合物の合成の第二工程を表す合成経路
図である。
【図３】標識タンパク質の合成経路図である。
【図４】横軸にウシ血清アルブミン（ｂ）21溶液の濃度
（Ｍ）の対数を、縦軸にフルオレセンス・カウントの対
数を表す図である。
【図５】横軸にウシ血清アルブミン（ｅ）47溶液および
ウシ血清アルブミン（ｆ）40溶液の濃度（Ｍ）の対数
を、縦軸にフルオレセンス・カウントの対数を表す図で
ある。
【図６】横軸にウシ血清アルブミン（ｊ）35溶液の濃度
（Ｍ）の対数を、縦軸にフルオレセンス・カウントの対
数を表す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年４月１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記目的を解決するため
に、本発明は、一般式（１）
【化６】 （式中、Ｒはタンパク質に結合可能な基であり、Ａｒは
共役二重結合系であり、Ｘはフッ素原子または一般式
（２）
【化７】 で表される基であり、ｎは整数である。）で表される蛍
光性化合物、及び該蛍光性化合物とランタノイド金属イ
オンからなる錯体、及び該蛍光性化合物または該錯体を
有する免疫測定用標識試薬を提供する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】蛍光性化合物の合成は、二つの工程からな
る。以下、第一工程と第二工程に分けて説明する。第一工程 アセチル化芳香環化合物類とエチルパーフルオロカルボ
キシレート類またはジエチルパーフルオロジカルボキシ
レート類とのクライゼン縮合反応によって、β−ジケト
ン類化合物を合成する。アセチル化芳香環状化合物類の
具体例としては、４’−フェニルアセトフェノン、２−
アセチルジベンゾチオフェン（ジベンゾチオフェンと塩
化アセチルとの反応によって合成される。）、メチルー
４，４’，４”−テルフェニルケトン（４，４’，
４’’−テルフェニルと塩化アセチルとの反応によって
合成される。）、２−アセチルチオフェン、２−アセチ
ルベンゾチオフェン（ベンゾチオフェンと塩化アセチル
との反応によって合成される。）、４，４’−ジアセチ
ル−ｏ−テルフェニル（ｏ−テルフェニルと塩化アセチ
ルとの反応によって合成される。）等が挙げられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】
【表４】 表４から、蛍光強度は溶液のｐＨ及び緩衝溶液の組成に
依存することがわかった。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液中で
は、強い蛍光を有する。相対的に炭酸緩衝溶液中では蛍
光が弱くなり、リン酸緩衝溶液中では蛍光が著しく弱く
なる。さらに、Ｅｕ3+と強い配位能力のあるｔｏｐｏの
溶液を用いると、ｔｏｐｏの強力な「ｓｙｎｅｒｇｉｃ
効果」によって蛍光が著しく強くなる。同時に蛍光寿命
も少し増大する。なお、溶液中に溶解した酸素が溶液の
蛍光に影響しないことを実験で確認した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５２】蛍光性化合物（ｊ）を用いたタンパク質の
標識 蛍光性化合物（ｊ）を用いたウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）の標識について、以下に述べる。５０ｍｇのＢＳＡ
を１０．００ｍｌの０．１ｍｏｌ／Ｌの炭酸緩衝溶液
（ｐＨ＝９．３）に溶かし、室温下でＢＳＡのアミノ基
（５９個−ＮＨ2 ／分子）と等モル数の蛍光性化合物
（ｊ）を含有する２ｍｌのＤＭＦ溶液を攪拌下のＢＳＡ
溶液に徐々に滴下した。室温で１時間攪拌した後、ゲル
濾過によって標識ＢＳＡと未反応の蛍光性化合物の加水
分解物を分離した。この分離の際、展開溶媒としては、
（ゲル Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０，１．０×２９．
１ｃｍ），ｐＨ＝８．０の０．０５ｍｏｌ／Ｌの炭酸水
素アンモニウム水溶液を用いた。流速は１ｍｌ／９０秒
とし、１ｍｌずつ流出液を収集した。このカラムの条件
で１０ｍｌの溶液の分離を１回行うと分離効果が良くな
いので、２つのカラムで５ｍｌずつの溶液の分離を行っ
た。標識ＢＳＡの画分を集め、４℃において、水に対し
て一晩透析することによって無機塩を除去した。ゲル濾
過前の溶液を用いて、３３０ｎｍにおける溶液の吸光度
を測定した。用いた蛍光性化合物のモル濃度と３３０ｎ
ｍの吸光度から、３３０ｎｍにおける蛍光性化合物のモ
ル吸光係数を計算した。結果は、吸光係数が３．４１×
１０4 ｍｏｌ-1・ｃｍ-1・Ｌであり、３３０ｎｍにおけ
るウシ血清アルブミンの吸収はなかった。モル吸光係数
は標識反応の過程中に変化しないとの仮定を用い、標識
ＢＳＡ溶液中のラベルの濃度及びラベルとＢＳＡとの結
合比を計算した。以上の方法で得られた標識ＢＳＡ画分
中のＢＳＡと蛍光性化合物の結合比は約３５であった。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年７月３０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 免疫測定用標識試薬及びそれに用い
る蛍光性化合物及び錯体、及びそれらを用いる生物物質
の免疫測定法
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】追加
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 （式中、Ｒはタンパク質に結合可能な基であり、Ａｒは
共役二重結合系であり、Ｘはフッ素原子または一般式
（２）
【化２】 で表される基であり、ｎは整数である。）で表される蛍
光性化合物。
【化３】 で表される請求項１に記載の蛍光性化合物。
【化４】 で表される請求項１に記載の蛍光性化合物。
【化５】 で表される請求項１に記載の蛍光性化合物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】上記一般式（１）中のＲと結合するタンパ
ク質等の生物物質としては、具体的には抗体類、ビオチ
ン標識抗体類、抗原類、アビジン、ストレプトアビジ
ン、ウシ血清アルブミン、ハプテン、ホルモン、ポリペ
プチド、核酸、ポリヌクレオチド等が挙げられる。
【手続補正書】
【提出日】平成８年９月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】追加
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 （式中、Ｒはタンパク質に結合可能な基であり、Ａｒは
共役二重結合系であり、Ｘはフッ素原子または一般式
（２）
【化２】 で表される基であり、ｎは整数である。）で表される蛍
光性化合物。
【化３】 で表される請求項１に記載の蛍光性化合物。
【化４】 で表される請求項１に記載の蛍光性化合物。
【化５】 で表される請求項１に記載の蛍光性化合物。
【化６】 （式中、Ａｒは共役二重結合系であり、ｎは整数であ
る。）で表される蛍光性化合物。
【化７】 （式中、Ａｒは共役二重結合系であり、ｎは整数であ
る。）で表される蛍光性化合物。
【化８】 （式中、Ａｒは共役二重結合系であり、ｎは整数であ
る。）で表される蛍光性化合物。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 一般式（１） 【化１】 （式中、Ｒはタンパク質に結合可能な基であり、Ａｒは
    共役二重結合系であり、Ｘはフッ素原子または一般式
    （２） 【化２】 で表される基であり、ｎは整数である。）で表される蛍
    光性化合物。
  2. 【請求項２】 上記一般式（１）が一般式（３） 【化３】 で表される請求項１に記載の蛍光性化合物。
  3. 【請求項３】 上記一般式（１）が一般式（４） 【化４】 で表される請求項１に記載の蛍光性化合物。
  4. 【請求項４】 上記一般式（１）が一般式（５） 【化５】 で表される請求項１に記載の蛍光性化合物。
  5. 【請求項５】 請求項１〜請求項４のいずれかに記載の
    蛍光性化合物とランタノイド金属イオンからなる錯体。
  6. 【請求項６】 請求項１〜請求項４のいずれかに記載の
    蛍光性化合物または請求項５に記載の錯体部分を有する
    免疫測定用標識試薬。
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