JPH05255263A - アクリジウム化合物を用いた物質の測定法 - Google Patents
アクリジウム化合物を用いた物質の測定法Info
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- JPH05255263A JPH05255263A JP5161792A JP5161792A JPH05255263A JP H05255263 A JPH05255263 A JP H05255263A JP 5161792 A JP5161792 A JP 5161792A JP 5161792 A JP5161792 A JP 5161792A JP H05255263 A JPH05255263 A JP H05255263A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】抗原、抗体、核酸等の物質を高感度に分析でき
る方法を提供する。 【構成】 被測定物質である抗原、抗体または核酸と、
被測定物質と結合する抗体、抗原または核酸と結合させ
た下記式 で表されるアクリジウム誘導体とを反応させ、反応液中
の発光を測定することにより、物質を測定する。
る方法を提供する。 【構成】 被測定物質である抗原、抗体または核酸と、
被測定物質と結合する抗体、抗原または核酸と結合させ
た下記式 で表されるアクリジウム誘導体とを反応させ、反応液中
の発光を測定することにより、物質を測定する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規アクリジウム化合物
およびアクリジウム化合物を用いた抗原、抗体、核酸等
の高感度分析方法に関する。
およびアクリジウム化合物を用いた抗原、抗体、核酸等
の高感度分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】化学発光物質のアクリジウム化合物をを
免疫診断法に用いた場合、ルシフェラーゼの様な酵素と
異なり器具への吸着がなく、簡単にラベル化でき発光効
率が良い点で優れている（特開昭６０ー１４６１５５号
公報、特開昭６３ー１０１３６８号公報）。
免疫診断法に用いた場合、ルシフェラーゼの様な酵素と
異なり器具への吸着がなく、簡単にラベル化でき発光効
率が良い点で優れている（特開昭６０ー１４６１５５号
公報、特開昭６３ー１０１３６８号公報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】公知のアクリジウム化
合物は発光強度のブランク値（測定対象物が含まれてい
ない精製水等を測定操作した場合に得られる発光強度）
が高く、発光強度の弱い領域での測定誤差が大きいの
で、測定限界が高かった。本発明により、簡単にラベル
化でき、発光強度のブランク値の低い新規アクリジウム
化合物およびこれを用いる抗原、抗体、核酸等の高感度
分析法が提供される。
合物は発光強度のブランク値（測定対象物が含まれてい
ない精製水等を測定操作した場合に得られる発光強度）
が高く、発光強度の弱い領域での測定誤差が大きいの
で、測定限界が高かった。本発明により、簡単にラベル
化でき、発光強度のブランク値の低い新規アクリジウム
化合物およびこれを用いる抗原、抗体、核酸等の高感度
分析法が提供される。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、被測定物質で
ある抗原、抗体または核酸と、被測定物質と結合する抗
体、抗原または核酸に結合させた下記式（Ｉ）
ある抗原、抗体または核酸と、被測定物質と結合する抗
体、抗原または核酸に結合させた下記式（Ｉ）
【０００５】
【化５】
【０００６】〔式中、Ｒ1 およびＲ3 は同一または異な
って水素、置換もしくは非置換の低級アルキル基または
置換もしくは非置換のアリール基を表し、Ｒ2 は水素、
低級アルキル基、低級アルキルスルホニル基またはアリ
ールスルホニル基を表し、Ｒ4は
って水素、置換もしくは非置換の低級アルキル基または
置換もしくは非置換のアリール基を表し、Ｒ2 は水素、
低級アルキル基、低級アルキルスルホニル基またはアリ
ールスルホニル基を表し、Ｒ4は
【０００７】
【化６】
【０００８】または−Ｒ5 −Ｎ＝Ｃ＝Ｓ（式中、Ｒ5 は
置換もしくは非置換のアルキレン基または置換もしくは
非置換のアルケニレン基を表す）を表す〕で表されるア
クリジウム誘導体またはその塩とを反応させ、反応液中
の発光強度を測定することを特徴とする物質の定量法に
関する。
置換もしくは非置換のアルキレン基または置換もしくは
非置換のアルケニレン基を表す）を表す〕で表されるア
クリジウム誘導体またはその塩とを反応させ、反応液中
の発光強度を測定することを特徴とする物質の定量法に
関する。
【０００９】また本発明は、一般式（Ｉ）
【００１０】
【化７】
【００１１】〔式中、Ｒ1 およびＲ3 は同一または異な
って水素、置換もしくは非置換の低級アルキル基または
置換もしくは非置換のアリール基を表し、Ｒ2 は水素、
低級アルキル基、低級アルキルスルホニル基またはアリ
ールスルホニル基を表し、Ｒ4は
って水素、置換もしくは非置換の低級アルキル基または
置換もしくは非置換のアリール基を表し、Ｒ2 は水素、
低級アルキル基、低級アルキルスルホニル基またはアリ
ールスルホニル基を表し、Ｒ4は
【００１２】
【化８】
【００１３】または−Ｒ5 −Ｎ＝Ｃ＝Ｓ（式中、Ｒ5 は
置換もしくは非置換のアルキレン基または置換もしくは
非置換のアルケニレン基を表す）を表す〕で表されるア
クリジウム誘導体またはその塩に関する。
置換もしくは非置換のアルキレン基または置換もしくは
非置換のアルケニレン基を表す）を表す〕で表されるア
クリジウム誘導体またはその塩に関する。
【００１４】本発明の式（Ｉ）における、置換もしくは
非置換の低級アルキル基および低級アルキルスルホニル
基におけるアルキル基としては炭素数１〜４の直鎖また
は分岐状のアルキル基、例えばメチル、エチル、プロピ
ル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブ
チル等があげられ、置換もしくは非置換のアリール基お
よびアリールスルホニル基におけるアリール基とは炭素
数６〜１０のフェニル、ナフチル等があげられ、置換も
しくは非置換のアルキレン基としては炭素数１〜６のメ
チレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンテン、
ヘキシレン等があげられ、置換もしくは非置換のアルケ
ニレン基とは炭素数２〜４の基を包含し、─ＣＨ＝ＣＨ
─、─ＣＨ＝ＣＨ─ＣＨ2 ─、─ＣＨ＝ＣＨ─ＣＨ＝Ｃ
Ｈ─等が挙げられる。
非置換の低級アルキル基および低級アルキルスルホニル
基におけるアルキル基としては炭素数１〜４の直鎖また
は分岐状のアルキル基、例えばメチル、エチル、プロピ
ル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブ
チル等があげられ、置換もしくは非置換のアリール基お
よびアリールスルホニル基におけるアリール基とは炭素
数６〜１０のフェニル、ナフチル等があげられ、置換も
しくは非置換のアルキレン基としては炭素数１〜６のメ
チレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンテン、
ヘキシレン等があげられ、置換もしくは非置換のアルケ
ニレン基とは炭素数２〜４の基を包含し、─ＣＨ＝ＣＨ
─、─ＣＨ＝ＣＨ─ＣＨ2 ─、─ＣＨ＝ＣＨ─ＣＨ＝Ｃ
Ｈ─等が挙げられる。
【００１５】置換低級アルキル基、置換アルキレン基、
置換アリール基および置換アルケニレン基における置換
基とは低級アルキル基、ヒドロキシ基、ハロゲン基、低
級アルコキシ基、スルホン基またはカルボキシル基を表
す。ハロゲン基とは塩素、臭素、ヨウ素または塩素を表
し、低級アルキル基および低級アルコキシ基におけるア
ルキル基は前記と同義である。
置換アリール基および置換アルケニレン基における置換
基とは低級アルキル基、ヒドロキシ基、ハロゲン基、低
級アルコキシ基、スルホン基またはカルボキシル基を表
す。ハロゲン基とは塩素、臭素、ヨウ素または塩素を表
し、低級アルキル基および低級アルコキシ基におけるア
ルキル基は前記と同義である。
【００１６】本発明化合物の塩としては、例えば塩酸
塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩およびマレイン酸
塩、フマル酸塩、クエン酸塩等からなる酸付加塩または
アンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム
塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の塩基付加塩が挙
げられる。
塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩およびマレイン酸
塩、フマル酸塩、クエン酸塩等からなる酸付加塩または
アンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム
塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の塩基付加塩が挙
げられる。
【００１７】以下に式（Ｉ）で示される化合物を化合物
（Ｉ）という。
（Ｉ）という。
【００１８】本発明の測定法における抗原とは免疫応答
を誘起しうる物質の総称を示し、抗体とは抗原と特異的
に結合する蛋白質の総称を示し、核酸とは例えばＤＮ
Ａ、ＲＮＡ等を示す。
を誘起しうる物質の総称を示し、抗体とは抗原と特異的
に結合する蛋白質の総称を示し、核酸とは例えばＤＮ
Ａ、ＲＮＡ等を示す。
【００１９】本発明方法を用いた好ましい被測定物質の
測定方法としては、例えば担体に結合させた被測定物質
と結合する抗原、抗体または核酸（固定化層）と試料中
の被測定物質とを結合させた後、更に該被測定物質と結
合する抗原、抗体または核酸に結合させた化合物（Ｉ）
またはその塩（標識化合物）を結合させ、固定化層中の
被測定物質と結合した標識化合物の発光強度を測定する
サンドウイッチ法等があげられる。サンドウイッチ法に
おける担体とは、例えば、ビーズ、９６穴プレートまた
は磁性粒子等の免疫学的測定法で常用される担体があげ
られる。
測定方法としては、例えば担体に結合させた被測定物質
と結合する抗原、抗体または核酸（固定化層）と試料中
の被測定物質とを結合させた後、更に該被測定物質と結
合する抗原、抗体または核酸に結合させた化合物（Ｉ）
またはその塩（標識化合物）を結合させ、固定化層中の
被測定物質と結合した標識化合物の発光強度を測定する
サンドウイッチ法等があげられる。サンドウイッチ法に
おける担体とは、例えば、ビーズ、９６穴プレートまた
は磁性粒子等の免疫学的測定法で常用される担体があげ
られる。
【００２０】以下に化合物（Ｉ）〔化合物Ｉａおよび化
合物Ｉｂ〕の合成法を説明する。
合物Ｉｂ〕の合成法を説明する。
【００２１】
【化９】
【００２２】（式中、Ｒ1 およびＲ5 は前記と同義であ
り、Ｒ3aは前記Ｒ3 の定義のうちＲ1と同一である場合
を示す）化合物（II) に塩化チオニル、ＤＣＣ等脱水縮
合剤の存在下、ヒドラジン等塩基と反応させることによ
り化合物(III) を得ることができる。溶媒としては、ベ
ンゼン、トルエン、キシレン、ジオキサン、テトラヒド
ロフラン、イソプロピルエーテル等を用い、反応は３０
℃〜１１０℃で１０分間から７２時間で行う。化合物
（II) は公知の方法により得ることができる〔ジャーナ
ル オブ バイオルミネッセンス アンド ケミルミネ
ッセンス（Journal of Bioluminescence and Chemilumi
nescence) 、４巻、１３６頁、１９８９年；アナリーチ
カ ケミカアクタ（Analytica Chimica Acta) 、２２７
巻、１１頁、１９８９年〕。
り、Ｒ3aは前記Ｒ3 の定義のうちＲ1と同一である場合
を示す）化合物（II) に塩化チオニル、ＤＣＣ等脱水縮
合剤の存在下、ヒドラジン等塩基と反応させることによ
り化合物(III) を得ることができる。溶媒としては、ベ
ンゼン、トルエン、キシレン、ジオキサン、テトラヒド
ロフラン、イソプロピルエーテル等を用い、反応は３０
℃〜１１０℃で１０分間から７２時間で行う。化合物
（II) は公知の方法により得ることができる〔ジャーナ
ル オブ バイオルミネッセンス アンド ケミルミネ
ッセンス（Journal of Bioluminescence and Chemilumi
nescence) 、４巻、１３６頁、１９８９年；アナリーチ
カ ケミカアクタ（Analytica Chimica Acta) 、２２７
巻、１１頁、１９８９年〕。
【００２３】化合物(III) と下記式（Ａ）で表される化
合物Ａ
合物Ａ
【００２４】
【化１０】
【００２５】（式中、Ｒ5 は前記と同義でありＨａｌは
ハロゲン基を表す、ハロゲン基は前記と同義である）と
を反応させることにより化合物(IV)を得ることができ
る。溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジ
オキサン、テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル
等を用い、反応は３０℃〜１１０℃で１０分間から７２
時間で行う。
ハロゲン基を表す、ハロゲン基は前記と同義である）と
を反応させることにより化合物(IV)を得ることができ
る。溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジ
オキサン、テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル
等を用い、反応は３０℃〜１１０℃で１０分間から７２
時間で行う。
【００２６】化合物(IV)にＮ−ヒドロキシコハク酸イミ
ド、ジシクロヘキシルカルボキシジイミド等の縮合剤を
作用させることにより化合物（Ｖ）を得ることができ
る。溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジ
オキサン、テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル
等を用い、反応は３０℃〜１１０℃で１０分間から７２
時間で行う。
ド、ジシクロヘキシルカルボキシジイミド等の縮合剤を
作用させることにより化合物（Ｖ）を得ることができ
る。溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジ
オキサン、テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル
等を用い、反応は３０℃〜１１０℃で１０分間から７２
時間で行う。
【００２７】化合物（Ｖ）と下記式（Ｄ）で表される化
合物Ｄ
合物Ｄ
【００２８】
【化１１】
【００２９】（式中、Ｒ1 およびＨａｌは前記と同義で
ある）とを反応溶媒中、反応させることにより化合物
（Ｉ）のうちＲ4 が
ある）とを反応溶媒中、反応させることにより化合物
（Ｉ）のうちＲ4 が
【００３０】
【化１２】
【００３１】である化合物（Ia) を得ることができる。
溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジオキ
サン、テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル等を
用い、反応は３０℃〜１１０℃で１０分間から７２時間
で行う。
溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジオキ
サン、テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル等を
用い、反応は３０℃〜１１０℃で１０分間から７２時間
で行う。
【００３２】化合物（Ｉ）は次の方法によっても得るこ
とができる。
とができる。
【００３３】化合物（III)と式（Ｃ）Ｈａｌ−Ｒ5 −Ｎ
ＨＣＯＯＣ（ＣＨ3)3 （式中、Ｒ5およびＨａｌは前記
と同義である）とを反応させることにより、化合物（V
I) を得ることができる。溶媒としては、ベンゼン、ト
ルエン、キシレン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、
イソプロピルエーテル等を用い、反応は３０℃〜１１０
℃で１０分間から７２時間で行う。
ＨＣＯＯＣ（ＣＨ3)3 （式中、Ｒ5およびＨａｌは前記
と同義である）とを反応させることにより、化合物（V
I) を得ることができる。溶媒としては、ベンゼン、ト
ルエン、キシレン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、
イソプロピルエーテル等を用い、反応は３０℃〜１１０
℃で１０分間から７２時間で行う。
【００３４】化合物（VI) をトリクロロ酢酸等の酸で処
理することにより、化合物(VII) を得ることができる。
溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジオキ
サン、テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル等を
用い、反応は３０℃〜１１０℃で１０分間から７２時間
で行う。
理することにより、化合物(VII) を得ることができる。
溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジオキ
サン、テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル等を
用い、反応は３０℃〜１１０℃で１０分間から７２時間
で行う。
【００３５】化合物(VII) をチオホスゲン等と反応させ
ることにより化合物（VIII) を得ることができる。溶媒
としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジオキサ
ン、テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル等を用
い、反応は３０℃〜１１０℃で１０分間から７２時間で
行う。
ることにより化合物（VIII) を得ることができる。溶媒
としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジオキサ
ン、テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル等を用
い、反応は３０℃〜１１０℃で１０分間から７２時間で
行う。
【００３６】化合物（VIII) を前述の化合物Ｄと反応さ
せることにより化合物（Ｉ）のうちＲ4 が−Ｒ5 −Ｎ＝
Ｃ＝Ｓである化合物（Ib）を得ることができる。溶媒と
しては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジオキサン、
テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル等を用い、
反応は３０℃〜１１０℃で１０分間から７２時間で行
う。
せることにより化合物（Ｉ）のうちＲ4 が−Ｒ5 −Ｎ＝
Ｃ＝Ｓである化合物（Ib）を得ることができる。溶媒と
しては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジオキサン、
テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル等を用い、
反応は３０℃〜１１０℃で１０分間から７２時間で行
う。
【００３７】上述した製法における中間体および目的化
合物は、有機合成化学で常用される精製法、例えばろ
過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグ
ラフィー等に付して単離精製することができる。また中
間体は、とくに精製することなく次の反応に供すること
も可能である。
合物は、有機合成化学で常用される精製法、例えばろ
過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグ
ラフィー等に付して単離精製することができる。また中
間体は、とくに精製することなく次の反応に供すること
も可能である。
【００３８】化合物（Ｉ）の塩を取得したいとき、化合
物（Ｉ）が塩の形で得られる場合にはそのまま精製すれ
ばよく、また、遊離の形で得られる場合には、適当な有
機溶媒に溶解もしくは懸濁させ、酸または塩基を加えて
塩を形成させればよい。以下に本発明化合物（Ｉ）の具
体例を示す。
物（Ｉ）が塩の形で得られる場合にはそのまま精製すれ
ばよく、また、遊離の形で得られる場合には、適当な有
機溶媒に溶解もしくは懸濁させ、酸または塩基を加えて
塩を形成させればよい。以下に本発明化合物（Ｉ）の具
体例を示す。
【００３９】
【化１３】
【００４０】次に化合物(I) を用いた物質の測定法を説
明する。抗原および抗体のタンパク質のアミノ基または
核酸のアミノ基と化合物（Ｉ）で示される化合物の持つ
Ｎ−ヒドロキシサクシイミドエステル基またはイソチオ
シアナート基とは簡単に結合するので、被測定物質と結
合する抗体、抗原または核酸と結合する核酸と化合物
（Ｉ）とをリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等緩衝液
中、均一に混合させることにより該化合物の結合した抗
原、抗体または核酸を得ることができる（以下これを化
合物（Ｉ）標識体と言う）。反応は４〜５０℃で、１０
分間から７２時間で行う。なお、以下本測定方法に用い
る緩衝液はアルブミン、ＮａＮ3 、界面活性剤等通常免
疫測定法の補助剤として用いる化合物を含有することも
ある。
明する。抗原および抗体のタンパク質のアミノ基または
核酸のアミノ基と化合物（Ｉ）で示される化合物の持つ
Ｎ−ヒドロキシサクシイミドエステル基またはイソチオ
シアナート基とは簡単に結合するので、被測定物質と結
合する抗体、抗原または核酸と結合する核酸と化合物
（Ｉ）とをリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等緩衝液
中、均一に混合させることにより該化合物の結合した抗
原、抗体または核酸を得ることができる（以下これを化
合物（Ｉ）標識体と言う）。反応は４〜５０℃で、１０
分間から７２時間で行う。なお、以下本測定方法に用い
る緩衝液はアルブミン、ＮａＮ3 、界面活性剤等通常免
疫測定法の補助剤として用いる化合物を含有することも
ある。
【００４１】反応生成物である化合物（Ｉ）の標識体は
ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロ
マトグラフィー等の分離手法により単離することができ
る。
ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロ
マトグラフィー等の分離手法により単離することができ
る。
【００４２】公知の方法により被測定物質と結合する抗
体、抗原または核酸と結合させた免疫測定用ビーズ、９
６穴プレート、または磁性粒子等免疫学的測定法で常用
される担体に、被測定物質を含んだ試料液を、リン酸緩
衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液中、４〜４０℃で、
１分間〜７２時間接触させる。得られた反応混合物をリ
ン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液で洗浄する。
体、抗原または核酸と結合させた免疫測定用ビーズ、９
６穴プレート、または磁性粒子等免疫学的測定法で常用
される担体に、被測定物質を含んだ試料液を、リン酸緩
衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液中、４〜４０℃で、
１分間〜７２時間接触させる。得られた反応混合物をリ
ン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液で洗浄する。
【００４３】洗浄後の該反応混合物に前述の化合物
（Ｉ）の標識体を、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等
の緩衝液中、４〜４０℃で、１分間〜７２時間接触させ
る。得られた反応混合物をリン酸緩衝液、トリス塩酸緩
衝液等の緩衝液で洗浄する。
（Ｉ）の標識体を、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等
の緩衝液中、４〜４０℃で、１分間〜７２時間接触させ
る。得られた反応混合物をリン酸緩衝液、トリス塩酸緩
衝液等の緩衝液で洗浄する。
【００４４】過酸化水素を含む酢酸緩衝液、リン酸緩衝
液等ｐＨ９以下の緩衝液を該反応混合物に加え反応させ
た後、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基を加
え反応液をｐＨ７以上好ましくはｐＨ9.０〜１２にす
る。このとき生成する遊離の化合物（Ｉ）の１９０〜７
５０ｎｍ好ましくは４００〜６００ｎｍの波長における
発光強度を発光分析計により測定することにより、試料
中の被測定物質を測定することができる。
液等ｐＨ９以下の緩衝液を該反応混合物に加え反応させ
た後、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基を加
え反応液をｐＨ７以上好ましくはｐＨ9.０〜１２にす
る。このとき生成する遊離の化合物（Ｉ）の１９０〜７
５０ｎｍ好ましくは４００〜６００ｎｍの波長における
発光強度を発光分析計により測定することにより、試料
中の被測定物質を測定することができる。
【００４５】以下に本発明化合物および該化合物を用い
た本発明測定法の実施例および参考例を示す。
た本発明測定法の実施例および参考例を示す。
【００４６】
【００４７】実施例１ １０−Ｎ′−メチル−９−〔カルボキシエチル（Ｎ″，
Ｎ″−ジメチル）ヒドラジノカルボニル〕アクリジン−
Ｎ−ヒドロキシサクシイミドエステル（化合物１：ＣＥ
ＭＨＡ） 参考例３で得られる化合物ｃ 0.４ｇをテトラヒドロフ
ラン１０ｍｌで溶解しし、これにメチルトリフルオロメ
タンスルフォネ−ト（アルドリッチ社製）0.５ｇを除々
に滴下し１夜放置した。得られた溶液にエチルエーテル
を加え、化合物１を沈殿として得た。 融点９8.３〜９9.８℃．
Ｎ″−ジメチル）ヒドラジノカルボニル〕アクリジン−
Ｎ−ヒドロキシサクシイミドエステル（化合物１：ＣＥ
ＭＨＡ） 参考例３で得られる化合物ｃ 0.４ｇをテトラヒドロフ
ラン１０ｍｌで溶解しし、これにメチルトリフルオロメ
タンスルフォネ−ト（アルドリッチ社製）0.５ｇを除々
に滴下し１夜放置した。得られた溶液にエチルエーテル
を加え、化合物１を沈殿として得た。 融点９8.３〜９9.８℃．
【００４８】実施例２ １０−Ｎ′−メチル−９−〔イソチオシアノアミノエチ
ル（Ｎ″，Ｎ″−ジメチル）ヒドラジノカルボニル〕ア
クリジン（化合物２） 参考例６で得られた化合物ｆ 0.5 gをテトラヒドロフラ
ンに縣濁させ、これにメチレントリフルオロメタンスル
フォネート0.4 g を添加して室温で１昼夜反応させた。
該反応液にエチルエーテルを加え、化合物２を0.５８ｇ
得た。 融点 ７1.1 〜７3.７℃.
ル（Ｎ″，Ｎ″−ジメチル）ヒドラジノカルボニル〕ア
クリジン（化合物２） 参考例６で得られた化合物ｆ 0.5 gをテトラヒドロフラ
ンに縣濁させ、これにメチレントリフルオロメタンスル
フォネート0.4 g を添加して室温で１昼夜反応させた。
該反応液にエチルエーテルを加え、化合物２を0.５８ｇ
得た。 融点 ７1.1 〜７3.７℃.
【００４９】実施例３ 癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の測定
【００５０】（１）抗ＣＥＡ抗体の４−（２−サクシニ
ミジルオキシカルボニルエチル）フェニル-10-メチルア
クリジウム−９−カルボキシレート フルオロスルフォ
ネート（アクリジウム−Ｉ、以下Ａ−Ｉ）による標識化 Ａ−Ｉ（商品名：同仁化学研究所）を〔クリニカルケミ
ストリー（Clinical Chemistry）２９巻、８号、１４７
４頁、１９８３年〕により抗ＣＥＡマウスモノクローナ
ル抗体に標識した。すなわち、0.５ｍＭのＡ−Ｉのジメ
チルホルムアミド溶液１０μｌに５０μｇの抗ＣＥＡマ
ウスモノクローナル抗体が溶解された0.１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ8.０）３００μｌを添加し、１０分間標識化反
応したのち、１０g/l のリジン塩酸塩溶液１００μｌを
加えて反応を停止させた。 セファデックスＧ−５０
（８０×６ｍｍ、ファルマシア社）カラムクロマトグラ
フィーにより未反応のＡ−Ｉを除去し、Ａ−Ｉ標識化抗
ＣＥＡ抗体を得た。
ミジルオキシカルボニルエチル）フェニル-10-メチルア
クリジウム−９−カルボキシレート フルオロスルフォ
ネート（アクリジウム−Ｉ、以下Ａ−Ｉ）による標識化 Ａ−Ｉ（商品名：同仁化学研究所）を〔クリニカルケミ
ストリー（Clinical Chemistry）２９巻、８号、１４７
４頁、１９８３年〕により抗ＣＥＡマウスモノクローナ
ル抗体に標識した。すなわち、0.５ｍＭのＡ−Ｉのジメ
チルホルムアミド溶液１０μｌに５０μｇの抗ＣＥＡマ
ウスモノクローナル抗体が溶解された0.１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ8.０）３００μｌを添加し、１０分間標識化反
応したのち、１０g/l のリジン塩酸塩溶液１００μｌを
加えて反応を停止させた。 セファデックスＧ−５０
（８０×６ｍｍ、ファルマシア社）カラムクロマトグラ
フィーにより未反応のＡ−Ｉを除去し、Ａ−Ｉ標識化抗
ＣＥＡ抗体を得た。
【００５１】（２）抗ＣＥＡ抗体のＣＥＭＨＡによる標
識化 実施例１で得られた化合物１（ＣＥＭＨＡ）を前記のＡ
−Ｉと同様にして抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体に
標識した。
識化 実施例１で得られた化合物１（ＣＥＭＨＡ）を前記のＡ
−Ｉと同様にして抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体に
標識した。
【００５２】（３）抗ＣＥＡ抗体固定化ポリスチレンチ
ューブの調製 ポリスチレン製試験管（７５×１２ｍｍ）に標識に使用
した抗体とは反応性の異なる抗ＣＥＡモノクローナル抗
体を固相化した。 すなわち１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ8.０）に溶解した１０μｇ／ｍｌの抗ＣＥＡ抗体溶液
を試験管に２００μｌ添加し１晩放置した。吸引後、１
％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、0.１％ＮａＮ3 を含
む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ8.０）を５００μｌ加え
保存した。
ューブの調製 ポリスチレン製試験管（７５×１２ｍｍ）に標識に使用
した抗体とは反応性の異なる抗ＣＥＡモノクローナル抗
体を固相化した。 すなわち１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ8.０）に溶解した１０μｇ／ｍｌの抗ＣＥＡ抗体溶液
を試験管に２００μｌ添加し１晩放置した。吸引後、１
％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、0.１％ＮａＮ3 を含
む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ8.０）を５００μｌ加え
保存した。
【００５３】（４）ＣＥＡの測定 抗ＣＥＡ抗体固定化ポリスチレンチューブに0.２−２0.
０ｎｇ／ｍｌに調整した標準ＣＥＡ各５０μｌおよびＡ
−Ｉ標識化抗ＣＥＡ抗体またはＣＥＭＨＡ標識化抗ＣＥ
Ａ抗体を各１００μｌ添加し、室温で１時間インキュベ
ートした。反応液を吸引後、0.０５％のtween ２０（商
品名）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ8.０）を洗浄
液として１ｍｌ加え吸引した。この操作を３回繰り返し
た。測定はチュ−ブに0.１Ｍ水酸化ナトリウムと0.３％
過酸化水素を含む水溶液２００μｌを添加し、生ずる反
応液の発光をバイオルマット（Biolumat）ＬＢ９５００
Ｔ〔ベルト−ルド（Berthold）社製〕で測定した。得ら
れた結果を第１表に示した。
０ｎｇ／ｍｌに調整した標準ＣＥＡ各５０μｌおよびＡ
−Ｉ標識化抗ＣＥＡ抗体またはＣＥＭＨＡ標識化抗ＣＥ
Ａ抗体を各１００μｌ添加し、室温で１時間インキュベ
ートした。反応液を吸引後、0.０５％のtween ２０（商
品名）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ8.０）を洗浄
液として１ｍｌ加え吸引した。この操作を３回繰り返し
た。測定はチュ−ブに0.１Ｍ水酸化ナトリウムと0.３％
過酸化水素を含む水溶液２００μｌを添加し、生ずる反
応液の発光をバイオルマット（Biolumat）ＬＢ９５００
Ｔ〔ベルト−ルド（Berthold）社製〕で測定した。得ら
れた結果を第１表に示した。
【００５４】
【表１】
【００５５】実施例４ ヒト３人の血清を被験試料とし、実施例３と同様の方法
により血清中のＣＥＡ濃度を測定した。また参考例とし
て酵素免疫法〔ＣＥＡ−ＥＩＡワンステップキット（ア
ボット社製）〕を用いて同じ被験試料のＣＥＡ濃度を測
定した。結果を第２表に示す。
により血清中のＣＥＡ濃度を測定した。また参考例とし
て酵素免疫法〔ＣＥＡ−ＥＩＡワンステップキット（ア
ボット社製）〕を用いて同じ被験試料のＣＥＡ濃度を測
定した。結果を第２表に示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】実施例５ ＣＥＡを本発明方法またはＡ−Ｉを用いた方法により定
量した場合の、低濃度での測定限界を次のような方法で
測定した。ＣＥＡ濃度既知の健常人の血清を希釈液で２
倍希釈系列で段階希釈し、ＣＥＡを希釈した各試料およ
び希釈液のみの（対照）を実施例３に記載した方法によ
り５回測定した。希釈試料の発光強度のカウントと対照
の発光強度のカウントの間に有意差（危険率１％以下）
がある場合が検出可能であるとして、有意差がある最低
濃度を測定限界濃度とした。結果を第３表に示す。
量した場合の、低濃度での測定限界を次のような方法で
測定した。ＣＥＡ濃度既知の健常人の血清を希釈液で２
倍希釈系列で段階希釈し、ＣＥＡを希釈した各試料およ
び希釈液のみの（対照）を実施例３に記載した方法によ
り５回測定した。希釈試料の発光強度のカウントと対照
の発光強度のカウントの間に有意差（危険率１％以下）
がある場合が検出可能であるとして、有意差がある最低
濃度を測定限界濃度とした。結果を第３表に示す。
【００５８】
【表３】
【００５９】第３表によれば、ＣＥＡの測定検出限界は
本発明のＣＥＭＨＡでは0.１４ｎｇ／ｍｌとなり、Ａ−
Ｉを用いた場合の検出限界0.５５ｎｇ／ｍｌよりかなり
低い濃度を示した。
本発明のＣＥＭＨＡでは0.１４ｎｇ／ｍｌとなり、Ａ−
Ｉを用いた場合の検出限界0.５５ｎｇ／ｍｌよりかなり
低い濃度を示した。
【００６０】参考例１ ９ーヒドラジノカルボニルアクリジン（化合物ａ） ９ーアクリジンカルボン酸水和物（アルドリッチ社製）
4.４６ｇをジオキサン２００ｍｌに分散し、チオニルク
ロライドを4.７６ｇ添加した後、ジメチルホルムアミド
を１滴加えて６０〜７０℃で３時間反応させた。反応液
が透明になった後、室温まで冷却し、抱水ヒドラジン１
０ｍｌを徐々に滴下し、さらに１昼夜反応させた。反応
液を減圧濃縮して約６０ｍｌとし、氷冷すると化合物ａ
の結晶が沈澱した。得られた結晶をグラスフィルタ−で
濾別し化合物ａを3.４ｇ得た。
4.４６ｇをジオキサン２００ｍｌに分散し、チオニルク
ロライドを4.７６ｇ添加した後、ジメチルホルムアミド
を１滴加えて６０〜７０℃で３時間反応させた。反応液
が透明になった後、室温まで冷却し、抱水ヒドラジン１
０ｍｌを徐々に滴下し、さらに１昼夜反応させた。反応
液を減圧濃縮して約６０ｍｌとし、氷冷すると化合物ａ
の結晶が沈澱した。得られた結晶をグラスフィルタ−で
濾別し化合物ａを3.４ｇ得た。
【００６１】参考例２ ９ーカルボキシエチルヒドラジノカルボニルアクリジン
（化合物ｂ） 参考例１で得られた化合物ａ 2.３７ｇをテトラヒドロ
フラン５０ｍｌで溶解し、βープロピオラクトン（アル
ドリッチ社製）0.８ｇを加えて５０℃で３時間反応させ
た。反応液を室温に冷却した後、反応液をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィ−で精製して化合物ｂを1.３ｇ得
た。
（化合物ｂ） 参考例１で得られた化合物ａ 2.３７ｇをテトラヒドロ
フラン５０ｍｌで溶解し、βープロピオラクトン（アル
ドリッチ社製）0.８ｇを加えて５０℃で３時間反応させ
た。反応液を室温に冷却した後、反応液をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィ−で精製して化合物ｂを1.３ｇ得
た。
【００６２】参考例３ ９−カルボキシエチルヒドラジノカルボニルアクリジン
−Ｎ−ヒドロキシサクシイミドエステル（化合物ｃ） 参考例２で得られた化合物ｂ 1.０３ｇをテトラヒドロ
フラン５０ｍｌで溶解し、Ｎ−ヒドロキシサクシイミド
0.７７ｇ、ジシクロヘキシルカルボジイミド1.０ｇを加
えて室温で１昼夜反応させた。酢酸１ｍｌ、メタノ−ル
１ｍｌを加えてさらに１時間反応後沈澱を濾別し、濾液
をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−で精製し化合物
ｃを1.２ｇ得た。
−Ｎ−ヒドロキシサクシイミドエステル（化合物ｃ） 参考例２で得られた化合物ｂ 1.０３ｇをテトラヒドロ
フラン５０ｍｌで溶解し、Ｎ−ヒドロキシサクシイミド
0.７７ｇ、ジシクロヘキシルカルボジイミド1.０ｇを加
えて室温で１昼夜反応させた。酢酸１ｍｌ、メタノ−ル
１ｍｌを加えてさらに１時間反応後沈澱を濾別し、濾液
をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−で精製し化合物
ｃを1.２ｇ得た。
【００６３】参考例４ ９−（tert−ブトキシカルボニルアミノメチルヒドラジ
ドカルボニル）アクリジン（化合物ｄ） 参考例１で得られる化合物ａ ２ｇをジオキサン５００
mlに溶解した後、これに２−ヨード−１−tert−ブトキ
シカルボニルアミノエタン１０mlを加えて４０℃で１昼
夜反応させた。 反応液を濃縮して得られた沈殿物を濾
過乾燥し、化合物ｄを1.７ｇ得た。
ドカルボニル）アクリジン（化合物ｄ） 参考例１で得られる化合物ａ ２ｇをジオキサン５００
mlに溶解した後、これに２−ヨード−１−tert−ブトキ
シカルボニルアミノエタン１０mlを加えて４０℃で１昼
夜反応させた。 反応液を濃縮して得られた沈殿物を濾
過乾燥し、化合物ｄを1.７ｇ得た。
【００６４】参考例５ ９−（アミノエチルヒドラジノカルボニル）アクリジン
（化合物ｅ） 参考例４で得られた化合物ｄ １g に４Ｎ臭素酸−酢酸
溶液を５０ｍｌ加え反応させた。該反応液にエチルエー
テルを加え化合物ｅの臭素酸塩を析出させ、析出物を濾
過乾燥させて化合物ｅを0.６ｇ得た。
（化合物ｅ） 参考例４で得られた化合物ｄ １g に４Ｎ臭素酸−酢酸
溶液を５０ｍｌ加え反応させた。該反応液にエチルエー
テルを加え化合物ｅの臭素酸塩を析出させ、析出物を濾
過乾燥させて化合物ｅを0.６ｇ得た。
【００６５】参考例６ １０−Ｎ′−メチル−９−｛イソチオシアノアミノエチ
ル（Ｎ″Ｎ″−ジメチル）ヒドラジノカルボニル｝アク
リジン（化合物ｆ） 参考例５で得られた化合物ｅ 0.５g をベンゼン１００
mlに縣濁させ、ベンゼンの沸点まで加温した状態で透明
になるまでチオホスゲンを通じさせた。反応液を濃縮乾
固させ化合物ｆを0.６５ｇ得た。
ル（Ｎ″Ｎ″−ジメチル）ヒドラジノカルボニル｝アク
リジン（化合物ｆ） 参考例５で得られた化合物ｅ 0.５g をベンゼン１００
mlに縣濁させ、ベンゼンの沸点まで加温した状態で透明
になるまでチオホスゲンを通じさせた。反応液を濃縮乾
固させ化合物ｆを0.６５ｇ得た。
【００６６】
【発明の効果】本発明によれば、免疫学的定量法におい
て、高感度な抗原、抗体または核酸の定量が可能にな
る。
て、高感度な抗原、抗体または核酸の定量が可能にな
る。
Claims (2)
- 【請求項１】 被測定物質である抗原、抗体または核酸
と、被測定物質と結合する抗体、抗原または核酸に結合
させた下記式（Ｉ） 【化１】 〔式中、Ｒ1 およびＲ3 は同一または異なって水素、置
換もしくは非置換の低級アルキル基または置換もしくは
非置換のアリール基を表し、Ｒ2 は水素、低級アルキル
基、低級アルキルスルホニル基またはアリールスルホニ
ル基を表し、Ｒ4は 【化２】 または−Ｒ5 −Ｎ＝Ｃ＝Ｓ（式中、Ｒ5 は置換もしくは
非置換のアルキレン基または置換もしくは非置換のアル
ケニレン基を表す）を表す〕で表されるアクリジウム誘
導体またはその塩とを反応させ、反応液中の発光強度を
測定することを特徴とする物質の定量法。 - 【請求項２】 式（Ｉ） 【化３】 〔式中、Ｒ1 およびＲ3 は同一または異なって水素、置
換もしくは非置換の低級アルキル基または置換もしくは
非置換のアリール基を表し、Ｒ2 は水素、低級アルキル
基、低級アルキルスルホニル基またはアリールスルホニ
ル基を表し、Ｒ4は 【化４】 または−Ｒ5 −Ｎ＝Ｃ＝Ｓ（式中、Ｒ5 は置換もしくは
非置換のアルキレン基または置換もしくは非置換のアル
ケニレン基を表す）を表す〕で表されるアクリジウム誘
導体またはその塩。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5161792A JPH05255263A (ja) | 1992-03-10 | 1992-03-10 | アクリジウム化合物を用いた物質の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5161792A JPH05255263A (ja) | 1992-03-10 | 1992-03-10 | アクリジウム化合物を用いた物質の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05255263A true JPH05255263A (ja) | 1993-10-05 |
Family
ID=12891847
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5161792A Withdrawn JPH05255263A (ja) | 1992-03-10 | 1992-03-10 | アクリジウム化合物を用いた物質の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05255263A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997033884A1 (fr) * | 1996-03-15 | 1997-09-18 | Ss Pharmaceutical Co., Ltd. | Reactifs pour marquer les groupes sh, procede pour les preparer et procede pour les marquer |
| US6087502A (en) * | 1995-08-01 | 2000-07-11 | Mochida Pharmaceuticals Co., Ltd. | Acridinium compound having a plurality of luminescent groups and binding groups, and conjugate thereof |
| EP1783177A1 (en) * | 2004-07-14 | 2007-05-09 | National University Corporation Tokyo University of Agriculture and Technology | Novel isonitrile compound, process for producing the same, fluorescence labeling agent for marine attached organism larva containing the compound, and method of detecting marine attached organism larva therewith |
-
1992
- 1992-03-10 JP JP5161792A patent/JPH05255263A/ja not_active Withdrawn
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6087502A (en) * | 1995-08-01 | 2000-07-11 | Mochida Pharmaceuticals Co., Ltd. | Acridinium compound having a plurality of luminescent groups and binding groups, and conjugate thereof |
| WO1997033884A1 (fr) * | 1996-03-15 | 1997-09-18 | Ss Pharmaceutical Co., Ltd. | Reactifs pour marquer les groupes sh, procede pour les preparer et procede pour les marquer |
| US6171520B1 (en) | 1996-03-15 | 2001-01-09 | Ss Pharmaceutical Co., Ltd. | Reagents for labeling SH groups, process for the preparation of them and method for labeling with them |
| EP1783177A1 (en) * | 2004-07-14 | 2007-05-09 | National University Corporation Tokyo University of Agriculture and Technology | Novel isonitrile compound, process for producing the same, fluorescence labeling agent for marine attached organism larva containing the compound, and method of detecting marine attached organism larva therewith |
| EP1783177A4 (en) * | 2004-07-14 | 2009-09-02 | Univ Tokyo Nat Univ Corp | NEW ISONITRIL COMPOUND, THEIR MANUFACTURE, IT CONTAINS FLUORESCENT MARKING AGENT FOR LARVES OF MARINE ORGANISMS AND THEIR USE TO DETERMINE THE INGREDIENT OF LARVES OF MARINE ORGANISMS |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19990518 |