JPH05255263A - アクリジウム化合物を用いた物質の測定法 - Google Patents

アクリジウム化合物を用いた物質の測定法

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JPH05255263A
JPH05255263A JP5161792A JP5161792A JPH05255263A JP H05255263 A JPH05255263 A JP H05255263A JP 5161792 A JP5161792 A JP 5161792A JP 5161792 A JP5161792 A JP 5161792A JP H05255263 A JPH05255263 A JP H05255263A
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JP5161792A
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Akira Miike
彰 三池
Shigeru Matsumori
繁 松森
Seiji Sato
征二 佐藤
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Kyowa Medex Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【目的】抗原、抗体、核酸等の物質を高感度に分析でき
る方法を提供する。 【構成】 被測定物質である抗原、抗体または核酸と、
被測定物質と結合する抗体、抗原または核酸と結合させ
た下記式 で表されるアクリジウム誘導体とを反応させ、反応液中
の発光を測定することにより、物質を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は新規アクリジウム化合物
およびアクリジウム化合物を用いた抗原、抗体、核酸等
の高感度分析方法に関する。
【0002】
【従来の技術】化学発光物質のアクリジウム化合物をを
免疫診断法に用いた場合、ルシフェラーゼの様な酵素と
異なり器具への吸着がなく、簡単にラベル化でき発光効
率が良い点で優れている(特開昭60ー146155号
公報、特開昭63ー101368号公報)。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】公知のアクリジウム化
合物は発光強度のブランク値(測定対象物が含まれてい
ない精製水等を測定操作した場合に得られる発光強度)
が高く、発光強度の弱い領域での測定誤差が大きいの
で、測定限界が高かった。本発明により、簡単にラベル
化でき、発光強度のブランク値の低い新規アクリジウム
化合物およびこれを用いる抗原、抗体、核酸等の高感度
分析法が提供される。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明は、被測定物質で
ある抗原、抗体または核酸と、被測定物質と結合する抗
体、抗原または核酸に結合させた下記式(I)
【0005】
【化5】
【0006】〔式中、R1 およびR3 は同一または異な
って水素、置換もしくは非置換の低級アルキル基または
置換もしくは非置換のアリール基を表し、R2 は水素、
低級アルキル基、低級アルキルスルホニル基またはアリ
ールスルホニル基を表し、R4
【0007】
【化6】
【0008】または−R5 −N=C=S(式中、R5
置換もしくは非置換のアルキレン基または置換もしくは
非置換のアルケニレン基を表す)を表す〕で表されるア
クリジウム誘導体またはその塩とを反応させ、反応液中
の発光強度を測定することを特徴とする物質の定量法に
関する。
【0009】また本発明は、一般式(I)
【0010】
【化7】
【0011】〔式中、R1 およびR3 は同一または異な
って水素、置換もしくは非置換の低級アルキル基または
置換もしくは非置換のアリール基を表し、R2 は水素、
低級アルキル基、低級アルキルスルホニル基またはアリ
ールスルホニル基を表し、R4
【0012】
【化8】
【0013】または−R5 −N=C=S(式中、R5
置換もしくは非置換のアルキレン基または置換もしくは
非置換のアルケニレン基を表す)を表す〕で表されるア
クリジウム誘導体またはその塩に関する。
【0014】本発明の式(I)における、置換もしくは
非置換の低級アルキル基および低級アルキルスルホニル
基におけるアルキル基としては炭素数1〜4の直鎖また
は分岐状のアルキル基、例えばメチル、エチル、プロピ
ル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブ
チル等があげられ、置換もしくは非置換のアリール基お
よびアリールスルホニル基におけるアリール基とは炭素
数6〜10のフェニル、ナフチル等があげられ、置換も
しくは非置換のアルキレン基としては炭素数1〜6のメ
チレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンテン、
ヘキシレン等があげられ、置換もしくは非置換のアルケ
ニレン基とは炭素数2〜4の基を包含し、─CH=CH
─、─CH=CH─CH2 ─、─CH=CH─CH=C
H─等が挙げられる。
【0015】置換低級アルキル基、置換アルキレン基、
置換アリール基および置換アルケニレン基における置換
基とは低級アルキル基、ヒドロキシ基、ハロゲン基、低
級アルコキシ基、スルホン基またはカルボキシル基を表
す。ハロゲン基とは塩素、臭素、ヨウ素または塩素を表
し、低級アルキル基および低級アルコキシ基におけるア
ルキル基は前記と同義である。
【0016】本発明化合物の塩としては、例えば塩酸
塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩およびマレイン酸
塩、フマル酸塩、クエン酸塩等からなる酸付加塩または
アンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム
塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の塩基付加塩が挙
げられる。
【0017】以下に式(I)で示される化合物を化合物
(I)という。
【0018】本発明の測定法における抗原とは免疫応答
を誘起しうる物質の総称を示し、抗体とは抗原と特異的
に結合する蛋白質の総称を示し、核酸とは例えばDN
A、RNA等を示す。
【0019】本発明方法を用いた好ましい被測定物質の
測定方法としては、例えば担体に結合させた被測定物質
と結合する抗原、抗体または核酸(固定化層)と試料中
の被測定物質とを結合させた後、更に該被測定物質と結
合する抗原、抗体または核酸に結合させた化合物(I)
またはその塩(標識化合物)を結合させ、固定化層中の
被測定物質と結合した標識化合物の発光強度を測定する
サンドウイッチ法等があげられる。サンドウイッチ法に
おける担体とは、例えば、ビーズ、96穴プレートまた
は磁性粒子等の免疫学的測定法で常用される担体があげ
られる。
【0020】以下に化合物(I)〔化合物Iaおよび化
合物Ib〕の合成法を説明する。
【0021】
【化9】
【0022】(式中、R1 およびR5 は前記と同義であ
り、R3aは前記R3 の定義のうちR1と同一である場合
を示す)化合物(II) に塩化チオニル、DCC等脱水縮
合剤の存在下、ヒドラジン等塩基と反応させることによ
り化合物(III) を得ることができる。溶媒としては、ベ
ンゼン、トルエン、キシレン、ジオキサン、テトラヒド
ロフラン、イソプロピルエーテル等を用い、反応は30
℃〜110℃で10分間から72時間で行う。化合物
(II) は公知の方法により得ることができる〔ジャーナ
ル オブ バイオルミネッセンス アンド ケミルミネ
ッセンス(Journal of Bioluminescence and Chemilumi
nescence) 、4巻、136頁、1989年;アナリーチ
カ ケミカアクタ(Analytica Chimica Acta) 、227
巻、11頁、1989年〕。
【0023】化合物(III) と下記式(A)で表される化
合物A
【0024】
【化10】
【0025】(式中、R5 は前記と同義でありHalは
ハロゲン基を表す、ハロゲン基は前記と同義である)と
を反応させることにより化合物(IV)を得ることができ
る。溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジ
オキサン、テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル
等を用い、反応は30℃〜110℃で10分間から72
時間で行う。
【0026】化合物(IV)にN−ヒドロキシコハク酸イミ
ド、ジシクロヘキシルカルボキシジイミド等の縮合剤を
作用させることにより化合物(V)を得ることができ
る。溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジ
オキサン、テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル
等を用い、反応は30℃〜110℃で10分間から72
時間で行う。
【0027】化合物(V)と下記式(D)で表される化
合物D
【0028】
【化11】
【0029】(式中、R1 およびHalは前記と同義で
ある)とを反応溶媒中、反応させることにより化合物
(I)のうちR4
【0030】
【化12】
【0031】である化合物(Ia) を得ることができる。
溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジオキ
サン、テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル等を
用い、反応は30℃〜110℃で10分間から72時間
で行う。
【0032】化合物(I)は次の方法によっても得るこ
とができる。
【0033】化合物(III)と式(C)Hal−R5 −N
HCOOC(CH3)3 (式中、R5およびHalは前記
と同義である)とを反応させることにより、化合物(V
I) を得ることができる。溶媒としては、ベンゼン、ト
ルエン、キシレン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、
イソプロピルエーテル等を用い、反応は30℃〜110
℃で10分間から72時間で行う。
【0034】化合物(VI) をトリクロロ酢酸等の酸で処
理することにより、化合物(VII) を得ることができる。
溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジオキ
サン、テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル等を
用い、反応は30℃〜110℃で10分間から72時間
で行う。
【0035】化合物(VII) をチオホスゲン等と反応させ
ることにより化合物(VIII) を得ることができる。溶媒
としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジオキサ
ン、テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル等を用
い、反応は30℃〜110℃で10分間から72時間で
行う。
【0036】化合物(VIII) を前述の化合物Dと反応さ
せることにより化合物(I)のうちR4 が−R5 −N=
C=Sである化合物(Ib)を得ることができる。溶媒と
しては、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジオキサン、
テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル等を用い、
反応は30℃〜110℃で10分間から72時間で行
う。
【0037】上述した製法における中間体および目的化
合物は、有機合成化学で常用される精製法、例えばろ
過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグ
ラフィー等に付して単離精製することができる。また中
間体は、とくに精製することなく次の反応に供すること
も可能である。
【0038】化合物(I)の塩を取得したいとき、化合
物(I)が塩の形で得られる場合にはそのまま精製すれ
ばよく、また、遊離の形で得られる場合には、適当な有
機溶媒に溶解もしくは懸濁させ、酸または塩基を加えて
塩を形成させればよい。以下に本発明化合物(I)の具
体例を示す。
【0039】
【化13】
【0040】次に化合物(I) を用いた物質の測定法を説
明する。抗原および抗体のタンパク質のアミノ基または
核酸のアミノ基と化合物(I)で示される化合物の持つ
N−ヒドロキシサクシイミドエステル基またはイソチオ
シアナート基とは簡単に結合するので、被測定物質と結
合する抗体、抗原または核酸と結合する核酸と化合物
(I)とをリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等緩衝液
中、均一に混合させることにより該化合物の結合した抗
原、抗体または核酸を得ることができる(以下これを化
合物(I)標識体と言う)。反応は4〜50℃で、10
分間から72時間で行う。なお、以下本測定方法に用い
る緩衝液はアルブミン、NaN3 、界面活性剤等通常免
疫測定法の補助剤として用いる化合物を含有することも
ある。
【0041】反応生成物である化合物(I)の標識体は
ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロ
マトグラフィー等の分離手法により単離することができ
る。
【0042】公知の方法により被測定物質と結合する抗
体、抗原または核酸と結合させた免疫測定用ビーズ、9
6穴プレート、または磁性粒子等免疫学的測定法で常用
される担体に、被測定物質を含んだ試料液を、リン酸緩
衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液中、4〜40℃で、
1分間〜72時間接触させる。得られた反応混合物をリ
ン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液で洗浄する。
【0043】洗浄後の該反応混合物に前述の化合物
(I)の標識体を、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等
の緩衝液中、4〜40℃で、1分間〜72時間接触させ
る。得られた反応混合物をリン酸緩衝液、トリス塩酸緩
衝液等の緩衝液で洗浄する。
【0044】過酸化水素を含む酢酸緩衝液、リン酸緩衝
液等pH9以下の緩衝液を該反応混合物に加え反応させ
た後、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基を加
え反応液をpH7以上好ましくはpH9.0〜12にす
る。このとき生成する遊離の化合物(I)の190〜7
50nm好ましくは400〜600nmの波長における
発光強度を発光分析計により測定することにより、試料
中の被測定物質を測定することができる。
【0045】以下に本発明化合物および該化合物を用い
た本発明測定法の実施例および参考例を示す。
【0046】
【実施例】
【0047】実施例1 10−N′−メチル−9−〔カルボキシエチル(N″,
N″−ジメチル)ヒドラジノカルボニル〕アクリジン−
N−ヒドロキシサクシイミドエステル(化合物1:CE
MHA) 参考例3で得られる化合物c 0.4gをテトラヒドロフ
ラン10mlで溶解しし、これにメチルトリフルオロメ
タンスルフォネ−ト(アルドリッチ社製)0.5gを除々
に滴下し1夜放置した。得られた溶液にエチルエーテル
を加え、化合物1を沈殿として得た。 融点98.3〜99.8℃.
【0048】実施例2 10−N′−メチル−9−〔イソチオシアノアミノエチ
ル(N″,N″−ジメチル)ヒドラジノカルボニル〕ア
クリジン(化合物2) 参考例6で得られた化合物f 0.5 gをテトラヒドロフラ
ンに縣濁させ、これにメチレントリフルオロメタンスル
フォネート0.4 g を添加して室温で1昼夜反応させた。
該反応液にエチルエーテルを加え、化合物2を0.58g
得た。 融点 71.1 〜73.7℃.
【0049】実施例3 癌胎児性抗原(CEA)の測定
【0050】(1)抗CEA抗体の4−(2−サクシニ
ミジルオキシカルボニルエチル)フェニル-10-メチルア
クリジウム−9−カルボキシレート フルオロスルフォ
ネート(アクリジウム−I、以下A−I)による標識化 A−I(商品名:同仁化学研究所)を〔クリニカルケミ
ストリー(Clinical Chemistry)29巻、8号、147
4頁、1983年〕により抗CEAマウスモノクローナ
ル抗体に標識した。すなわち、0.5mMのA−Iのジメ
チルホルムアミド溶液10μlに50μgの抗CEAマ
ウスモノクローナル抗体が溶解された0.1Mリン酸緩衝
液(pH8.0)300μlを添加し、10分間標識化反
応したのち、10g/l のリジン塩酸塩溶液100μlを
加えて反応を停止させた。 セファデックスG−50
(80×6mm、ファルマシア社)カラムクロマトグラ
フィーにより未反応のA−Iを除去し、A−I標識化抗
CEA抗体を得た。
【0051】(2)抗CEA抗体のCEMHAによる標
識化 実施例1で得られた化合物1(CEMHA)を前記のA
−Iと同様にして抗CEAマウスモノクローナル抗体に
標識した。
【0052】(3)抗CEA抗体固定化ポリスチレンチ
ューブの調製 ポリスチレン製試験管(75×12mm)に標識に使用
した抗体とは反応性の異なる抗CEAモノクローナル抗
体を固相化した。 すなわち10mMリン酸緩衝液(p
H8.0)に溶解した10μg/mlの抗CEA抗体溶液
を試験管に200μl添加し1晩放置した。吸引後、1
%BSA(ウシ血清アルブミン)、0.1%NaN3 を含
む10mMリン酸緩衝液(pH8.0)を500μl加え
保存した。
【0053】(4)CEAの測定 抗CEA抗体固定化ポリスチレンチューブに0.2−20.
0ng/mlに調整した標準CEA各50μlおよびA
−I標識化抗CEA抗体またはCEMHA標識化抗CE
A抗体を各100μl添加し、室温で1時間インキュベ
ートした。反応液を吸引後、0.05%のtween 20(商
品名)を含む10mMリン酸緩衝液(pH8.0)を洗浄
液として1ml加え吸引した。この操作を3回繰り返し
た。測定はチュ−ブに0.1M水酸化ナトリウムと0.3%
過酸化水素を含む水溶液200μlを添加し、生ずる反
応液の発光をバイオルマット(Biolumat)LB9500
T〔ベルト−ルド(Berthold)社製〕で測定した。得ら
れた結果を第1表に示した。
【0054】
【表1】
【0055】実施例4 ヒト3人の血清を被験試料とし、実施例3と同様の方法
により血清中のCEA濃度を測定した。また参考例とし
て酵素免疫法〔CEA−EIAワンステップキット(ア
ボット社製)〕を用いて同じ被験試料のCEA濃度を測
定した。結果を第2表に示す。
【0056】
【表2】
【0057】実施例5 CEAを本発明方法またはA−Iを用いた方法により定
量した場合の、低濃度での測定限界を次のような方法で
測定した。CEA濃度既知の健常人の血清を希釈液で2
倍希釈系列で段階希釈し、CEAを希釈した各試料およ
び希釈液のみの(対照)を実施例3に記載した方法によ
り5回測定した。希釈試料の発光強度のカウントと対照
の発光強度のカウントの間に有意差(危険率1%以下)
がある場合が検出可能であるとして、有意差がある最低
濃度を測定限界濃度とした。結果を第3表に示す。
【0058】
【表3】
【0059】第3表によれば、CEAの測定検出限界は
本発明のCEMHAでは0.14ng/mlとなり、A−
Iを用いた場合の検出限界0.55ng/mlよりかなり
低い濃度を示した。
【0060】参考例1 9ーヒドラジノカルボニルアクリジン(化合物a) 9ーアクリジンカルボン酸水和物(アルドリッチ社製)
4.46gをジオキサン200mlに分散し、チオニルク
ロライドを4.76g添加した後、ジメチルホルムアミド
を1滴加えて60〜70℃で3時間反応させた。反応液
が透明になった後、室温まで冷却し、抱水ヒドラジン1
0mlを徐々に滴下し、さらに1昼夜反応させた。反応
液を減圧濃縮して約60mlとし、氷冷すると化合物a
の結晶が沈澱した。得られた結晶をグラスフィルタ−で
濾別し化合物aを3.4g得た。
【0061】参考例2 9ーカルボキシエチルヒドラジノカルボニルアクリジン
(化合物b) 参考例1で得られた化合物a 2.37gをテトラヒドロ
フラン50mlで溶解し、βープロピオラクトン(アル
ドリッチ社製)0.8gを加えて50℃で3時間反応させ
た。反応液を室温に冷却した後、反応液をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィ−で精製して化合物bを1.3g得
た。
【0062】参考例3 9−カルボキシエチルヒドラジノカルボニルアクリジン
−N−ヒドロキシサクシイミドエステル(化合物c) 参考例2で得られた化合物b 1.03gをテトラヒドロ
フラン50mlで溶解し、N−ヒドロキシサクシイミド
0.77g、ジシクロヘキシルカルボジイミド1.0gを加
えて室温で1昼夜反応させた。酢酸1ml、メタノ−ル
1mlを加えてさらに1時間反応後沈澱を濾別し、濾液
をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−で精製し化合物
cを1.2g得た。
【0063】参考例4 9−(tert−ブトキシカルボニルアミノメチルヒドラジ
ドカルボニル)アクリジン(化合物d) 参考例1で得られる化合物a 2gをジオキサン500
mlに溶解した後、これに2−ヨード−1−tert−ブトキ
シカルボニルアミノエタン10mlを加えて40℃で1昼
夜反応させた。 反応液を濃縮して得られた沈殿物を濾
過乾燥し、化合物dを1.7g得た。
【0064】参考例5 9−(アミノエチルヒドラジノカルボニル)アクリジン
(化合物e) 参考例4で得られた化合物d 1g に4N臭素酸−酢酸
溶液を50ml加え反応させた。該反応液にエチルエー
テルを加え化合物eの臭素酸塩を析出させ、析出物を濾
過乾燥させて化合物eを0.6g得た。
【0065】参考例6 10−N′−メチル−9−{イソチオシアノアミノエチ
ル(N″N″−ジメチル)ヒドラジノカルボニル}アク
リジン(化合物f) 参考例5で得られた化合物e 0.5g をベンゼン100
mlに縣濁させ、ベンゼンの沸点まで加温した状態で透明
になるまでチオホスゲンを通じさせた。反応液を濃縮乾
固させ化合物fを0.65g得た。
【0066】
【発明の効果】本発明によれば、免疫学的定量法におい
て、高感度な抗原、抗体または核酸の定量が可能にな
る。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 被測定物質である抗原、抗体または核酸
    と、被測定物質と結合する抗体、抗原または核酸に結合
    させた下記式(I) 【化1】 〔式中、R1 およびR3 は同一または異なって水素、置
    換もしくは非置換の低級アルキル基または置換もしくは
    非置換のアリール基を表し、R2 は水素、低級アルキル
    基、低級アルキルスルホニル基またはアリールスルホニ
    ル基を表し、R4は 【化2】 または−R5 −N=C=S(式中、R5 は置換もしくは
    非置換のアルキレン基または置換もしくは非置換のアル
    ケニレン基を表す)を表す〕で表されるアクリジウム誘
    導体またはその塩とを反応させ、反応液中の発光強度を
    測定することを特徴とする物質の定量法。
  2. 【請求項2】 式(I) 【化3】 〔式中、R1 およびR3 は同一または異なって水素、置
    換もしくは非置換の低級アルキル基または置換もしくは
    非置換のアリール基を表し、R2 は水素、低級アルキル
    基、低級アルキルスルホニル基またはアリールスルホニ
    ル基を表し、R4は 【化4】 または−R5 −N=C=S(式中、R5 は置換もしくは
    非置換のアルキレン基または置換もしくは非置換のアル
    ケニレン基を表す)を表す〕で表されるアクリジウム誘
    導体またはその塩。
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Cited By (3)

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