JPH07333224A - 物質の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 被測定物質である抗原、抗体または核酸１分
子に結合する標識用アクリジニウム化合物の量を増加さ
せることにより、発光強度が高く微量の被測定物質でも
定量が可能な定量方法を提供する。 【構成】 被測定物質である抗原、抗体または核酸と、
ポリアクリジニウム化合物を結合させた、被測定物質と
結合する抗体、抗原または核酸とを反応させ、発光処理
を行い、反応液中の発光強度を測定することを特徴とす
る物質の定量方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はポリアクリジニウを用い
た抗原、抗体、核酸等の高感度定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】化学発光物質のアクリジニウム化合物を
免疫診断法に用いた場合、ルシフェラーゼの様な酵素と
異なり器具への吸着がなく、簡単にラベル化でき発光効
率が良いことが知られている（特開昭６０−１４６１５
５号公報、特開昭６３−１０１３６８号公報、特開平５
−２５５２６３号公報）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】アクリジウム化合物を
免疫診断法の標識体として用いた場合、抗体あるいは抗
原の１つのアミノ基に１分子のアクリジニウム化合物し
か結合できないため、抗体あるいは抗原に結合できるア
クリジニウム化合物の数が少なく十分な発光量が得られ
ない。

【０００４】本発明はアクリジニウム化合物をポリマー
として抗体あるいは抗原と結合させ免疫測定法の標識体
として用いれば、抗体あるいは抗原１分子に対して多数
のアクリジニウム化合物を結合させることができ、抗体
あるいは抗原１分子が強力な発光量をもった標識体にな
るとの新規知見のもとに、簡単にラベル化でき、発光強
度の非常に強いポリアクリニジウム化合物を用いる抗
原、抗体、核酸等の超高感度分析法を提供する。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、被測定物質で
ある抗原、抗体または核酸と、ポリアクリジニウム化合
物を結合させた、被測定物質と結合する抗体、抗原また
は核酸とを反応させ、発光処理を行い、反応液中の発光
強度を測定することを特徴とする物質の定量方法に関す
る。

【０００６】本発明におけるポリアクリジニウム化合物
は、末端オレフィンを有するアクリジン誘導体単独ある
いは無水マレイン酸もしくはマレイン酸誘導体との共重
合体から得られるポリアクリジニウム化合物であればど
のようなものでもよいが、式（Ｉ）

【０００７】

【化４】

【０００８】〔式中、ｍは１〜１００００の任意に変わ
りえる正の整数を表し、ｎは０〜１００００の任意に変
わりえる正の整数を表し、ｑは１〜２００００整数を表
し、Ｘは水素または低級アルキルを表し、Ｙは水素、低
級アルキルまたは金属を表し、Ｒ₁ 、Ｒ₂ およびＲ_2aは
同一または異なって、水素、低級アルキル、低級アルカ
ノイル、置換もしくは非置換のアロイル、カルボキシま
たはシアノを表し、Ｒ₃ は式 −〔ＣＯＯ〕_s −Ｗ−〔ＯＣＯ〕_p −、−〔ＣＯＯ〕_s
−Ｗ−Ｎ（Ｒ₉ ）ＣＯ−、−ＣＯＯ−Ｗ−Ｗ_a −〔Ｎ
（Ｒ₉ ）ＣＯ〕_p −、または−ＣＯＮ（Ｒ₉ ）−Ｗ−
〔Ｎ（Ｒ_9a）ＣＯ〕_p − （式中、ＷおよびＷ_a は異なってメチレン、アルキレ
ン、置換もしくは非置換のフェニレンまたは置換もしく
は非置換のナフチレンを表し、Ｒ₉ およびＲ_9aは同一ま
たは異なって水素、低級アルキルスルホニルまたは置換
もしくは非置換のアリールスルホニルを表し、ｓおよび
ｐは同一または異なって０または１を表す）を表し、Ｒ
₄ およびＲ₅ は同一または異なって、水素、低級アルキ
ル、低級アルコキシ、カルボキシ、スルホを表し、Ｒ₆
は置換もしくは非置換の低級アルキルを表し、Ｒ₇ はカ
ルボキシ、低級アルコキシカルボニル

【０００９】

【化５】

【００１０】（式中、Ｒ₁₀はアルキレン、置換もしくは
非置換のフェニレンまたは置換もしくは非置換のナフチ
レンを表す）を表し、Ｒ₈ はカルボキシ、低級アルコキ
シカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルまたは置
換もしくは非置換のアリールを表すか、Ｒ₇ およびＲ₈
が一緒になって

【００１１】

【化６】

【００１２】を表し、Ｚはハロゲン、メタンスルホニル
オキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシを表す〕
で表される化合物を用いることが好ましい。

【００１３】式（Ｉ）の各基の定義において、ｍで表さ
れる任意の整数としては、１〜１００００、好ましくは
１〜１０００であり、ｎで表される任意の整数として
は、０〜１００００、好ましくは１〜１００００、とり
わけ好ましくは０〜１０００、より好ましくは１〜１０
００である。ｑは１〜２００００、好ましくは１〜２０
００である。低級アルキル、低級アルカノイル、低級ア
ルコキシおよび低級アルキルスルホニルにおけるアルキ
ル部分としては炭素数１〜６の直鎖または分岐状のアル
キル、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチ
ル、ヘキシル等があげられる。

【００１４】置換低級アルキルの置換基としては同一ま
たは異なって置換数１〜３のスルホ、カルボキシ、ヒド
ロキシ等があげられる。アルキレンとしては、炭素数１
〜１０の、例えばメチレン、エチレン、トリメチレン、
プロピレン、テトラメチレン、エチルエチレン、ペンタ
メチレン、ヘキサメチレン、オクタメチレン等があげら
れる。アリール、アリールスルホニルおよびアロイルに
おけるアリール部分としてはフェニル、ナフチルがあげ
られる。置換アリール、置換アリールスルホニル、置換
フェニレンおよび置換ナフチレンの芳香環における置換
基としては、同一または異なって置換数１〜３の低級ア
ルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、低級アルコキシ、スル
ホまたはカルボキシを表す。ハロゲンとは塩素、臭素、
ヨウ素またはフッ素を表し、低級アルキルおよび低級ア
ルコキシにおけるアルキル部分は前記と同義である。金
属としてはリチウム、ナトリウム、カリウム、アルミニ
ウム等があげられる。

【００１５】以下に式（Ｉ）で示される化合物を化合物
（Ｉ）という。他の式番号の化合物についても同様であ
る。

【００１６】以下に本発明に用いる化合物（Ｉ）の製法
について説明する。化合物（Ｉ）は第４版実験化学講
座，日本化学会編，Ｎｏ２２，有機合成IV，１２０頁，
平成４年丸善刊、同，Ｎｏ２２，高分子合成，１１６
頁，平成４年丸善刊等を参考にして以下の工程で得るこ
とができる。

【００１７】

【化７】

【００１８】

【化８】

【００１９】（式中、Ｗ₁ はＯ−Ｗ−ＯＨ、Ｏ−Ｗ−Ｎ
（Ｒ₉ ）Ｈ、Ｏ−Ｗ−Ｗ_a −Ｎ（Ｒ₉ ）Ｈ、またはＮ
（Ｒ₉ ）−Ｗ−Ｎ（Ｒ_9a）Ｈを表し、Ｗ₂ は、ＨＯ−
Ｗ、ＨＯ−Ｗ−Ｗ_a またはＨＮ（Ｒ₉ ）−Ｗを表し、
Ｗ、Ｗ_a 、ｍ、ｎ、ｓ、ｑ、Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ_2a、Ｒ₃ 、
Ｒ₄ 、Ｒ₅ 、Ｒ₆ 、Ｒ₇ 、Ｒ₈ 、Ｒ ₉ 、Ｘ、ＹおよびＺ
は前記と同義である） 化合物（Ｉ）は、アクリジン誘導体（Ｖ）と乳酸誘導体
（VI) とを共重合反応に付すことにより得ることができ
る。

【００２０】化合物（Ｖ）において、Ｒ₃ 中のｐが１で
ある化合物は以下の方法で得ることができる。

【００２１】化合物（II) と化合物（Ａ）とを、ジシク
ロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下に反応さ
せ化合物（IV）を得ることができる。反応は４〜１１０
℃で１〜１２時間である。溶媒としては、ジオキサン、
テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエン、アセトニト
リル、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、N,N ^, −ジ
メチルホルムアミド等があげられる。

【００２２】化合物（III ）は化合物（II）と塩化チオ
ニルとを、反応させることにより得ることができる。反
応は０〜１１０℃で１〜６時間である。溶媒としては、
ジオキサン、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエ
ン、アセトニトリル、クロロホルム、1,2-ジクロロエタ
ン等があげられる。

【００２３】化合物（III ）と化合物（Ａ）とを反応さ
せ化合物（IV）を得ることができる。反応は０〜１１０
℃で１〜６時間であり、用いる溶媒は前記と同様であ
る。なお、該反応は必要によりピリジン、トリエチルア
ミン、Ｎ−メチルモルホリン、ジメチルアミノピリジン
等の塩基の存在下に行ってもよい。

【００２４】化合物（IV）と化合物（Ｂ）とをＤＣＣの
存在下に反応させ化合物（Ｖ）を得ることができる。反
応は前記の反応条件と同様にして行うことができる。ま
た、化合物（Ｖ）において、ｐ＝０である化合物は、化
合物（II）と化合物（Ｃ）からＤＣＣの存在下に、ある
いは化合物（III ）と化合物（Ｃ）から、いずれも前記
の反応条件に準じて行うことができる。

【００２５】なお化合物（Ｖ）において、Ｒ₉ 、Ｒ_9aが
アルキルまたはアリールスルホニルである化合物を所望
の場合は、Ｒ₉ 、Ｒ_9aが水素である相当する化合物
（Ｖ）とアルキルハライドまたはアリールスルホニルハ
ライドとを反応させることにより得ることもできる。反
応は０〜１１０℃で１〜２４時間である。用いる溶媒と
しては、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ベンゼン、
トルエン、アセトニトリル、クロロホルム、1,2-ジクロ
ロエタン、N,N ^, −ジメチルホルムアミド等があげられ
る。なお、必要により前記と同様に塩基を添加しておこ
なってもよい。

【００２６】化合物（Ｖ）単独あるいは、化合物（Ｖ）
と化合物（VI）とを、化合物（Ｄ）またはアゾイソブチ
ルニトリル（ＡＩＢＮ）等の重合開始剤の存在下、溶媒
の存在下または非存在下に反応させ化合物（VII ）を得
ることができる。反応はイソプロパノール等の反応停止
剤を加え停止させる。溶媒としてはシクロヘキサン、ヘ
プタン、ヘキサン、トルエン、ベンゼン等があげられ、
これらを混合して用いてもよい。反応は−８０〜２０℃
で0.1 〜６時間である。

【００２７】なお、化合物(VI)として無水マレイン酸を
用いた場合、得られた化合物（VII）に下式

【００２８】

【化９】

【００２９】（式中、Ｒ₁₀は前記と同義である。） で示される化合物（Ｆ）または化合物（Ｇ）を反応させ
マレイン酸エステル体を得ることもできる。

【００３０】反応は、化合物（VII ）と化合物（Ｆ）ま
たは化合物（Ｇ）とを、溶媒の存在下または非存在下に
反応させる。反応は０〜６０℃で１〜２４時間である。
溶媒としては、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ベン
ゼン、トルエン、アセトニトリル、クロロホルム、1,2
- ジクロロエタン等があげられる。

【００３１】また、共重合反応は化合物(VI)に代わっ
て、無水マレイン酸と化合物（Ｆ）または化合物（Ｇ）
とから得られる以下の化合物（VIII) 〔化合物（VIIIa)
および化合物（VIIIb)〕を用いてもよい。

【００３２】

【化１０】

【００３３】（式中、Ｒ₁₀は前記と同義である。） 化合物（VIII) は、化合物（VII ）と化合物（Ｆ）また
は化合物（Ｇ）との反応条件に準じて得ることができ
る。

【００３４】化合物（VII)と化合物（Ｅ）とを、溶媒の
存在下または非存在下に反応させ化合物（Ｉ）を得るこ
とができる。反応は０〜６０℃で１〜２４時間である。
溶媒としてはジオキサン、テトラヒドロフラン、ベンゼ
ン、トルエン等があげられる。

【００３５】上述した製法における中間体および目的化
合物は、有機合成化学で常用される精製法、例えばろ
過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグ
ラフィー等に付して単離精製することができる。また中
間体は、とくに精製することなく次の反応に供すること
も可能である。本発明に用いられるポリアクリジウム化
合物の具体例を第１表に示す。

【００３６】

【表１】

【００３７】

【表２】

【００３８】

【表３】

【００３９】

【表４】

【００４０】

【表５】

【００４１】次に本発明の物質の定量方法について説明
する。

【００４２】本発明の測定法における抗原とは免疫応答
を誘起しうる物質の総称を示し、抗体とは抗原と特異的
に結合する蛋白質の総称を示し、核酸とは例えばＤＮ
Ａ、ＲＮＡ等を示す。

【００４３】本発明方法を用いた好ましい被測定物質の
測定方法としては、例えば担体に結合させた被測定物質
と結合する抗原、抗体または核酸（固定化層）と試料中
の被測定物質とを結合させた後、更にポリアクリジウム
化合物、好ましくは化合物（Ｉ）〔標識化合物〕を結合
した該被測定物質と結合する抗原、抗体または核酸と結
合させ固定化層中の被測定物質と結合した標識化合物
を、発光処理を行った後、発光強度を測定するサンドウ
イッチ法等があげられる。サンドウイッチ法における担
体とは、例えば、ビーズ、９６穴プレートまたは磁性粒
子等の免疫学的測定法で常用される担体があげられる。

【００４４】標識化合物を結合させた抗原、抗体または
核酸（以下、これを標識体と言う）は、被測定物質と結
合する抗体、抗原または核酸とポリアクリジウム化合
物、好ましくは化合物（Ｉ）とをリン酸緩衝液、トリス
塩酸緩衝液等の緩衝液（ｐＨ６〜１１）中、均一に混合
させることにより得ることができる。反応は４〜５０℃
で、１０分間から７２時間で行う。

【００４５】反応生成物である標識体はゲルクロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー
等の分離手法により単離することができる。

【００４６】公知の方法により被測定物質と結合する抗
体、抗原または核酸と結合させた免疫測定用ビーズ、９
６穴プレート、または磁性粒子等免疫学的測定法で常用
される担体に、被測定物質を含んだ試料液を、リン酸緩
衝液、グッド緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液（ｐ
Ｈ５〜９）中、４〜４０℃で、１分間〜７２時間接触さ
せる。得られた反応混合物をリン酸緩衝液、グッド緩衝
液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液で洗浄する。洗浄後の
該反応混合物に前述の標識体を、リン酸緩衝液、グッド
緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液中、４〜４０℃
で、１分間〜７２時間接触させる。得られた反応混合物
をリン酸緩衝液、グッド緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の
緩衝液で洗浄する。

【００４７】発光処理操作として、過酸化水素を含む酢
酸緩衝液、リン酸緩衝液等ｐＨ９以下の緩衝液を該反応
混合物に加え反応させた後、水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム等の塩基を加え反応液をｐＨ７以上好ましくは
ｐＨ９．０〜１２にする。このとき生成する遊離のアク
リジニウム化合物の１９０〜７５０ｎｍ好ましくは４０
０〜６００ｎｍの波長における発光強度を発光分析計に
より測定することにより、試料中の被測定物質を測定す
ることができる。なお、以下該測定方法に用いる緩衝液
はアルブミン、ＮａＮ₃ 、界面活性剤等通常免疫測定法
の補助剤として用いる化合物を含有してもよい。以下に
本発明を実施例で示す。

【００４８】

【実施例】

【００４９】実施例１ 癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の測定

【００５０】（１）抗体の標識 クリニカルケミストリー（Clinical Chemistry）２９
巻、８号、１４７４頁、（１９８３年）に記載の方法に
準じ抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体に標識した。す
なわち、参考例１で得られる化合物１の溶液３０μｌに
５０μｇの抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体を含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）３００μｌを添加
し、１０分間標識化反応したのち、１０ｇ／ｌのリジン
塩酸塩溶液１００μｌを加えて反応を停止させた。セフ
ァデックスＧ−５０（８０×６ｍｍ、ファルマシア社）
カラムクロマトグラフィーにより未反応の抗体およびポ
リアクリジニウム化合物を除去し、ポリアクリジニウム
化合物標識化抗ＣＥＡ抗体（以下、ポリ標識化抗体と略
記する）を得た。

【００５１】（２）抗ＣＥＡ抗体のアクリジニウムエス
テルによる標識化 比較のため、従来のアクリジニウム化合物の代表例とし
てアクリジニウム誘導体−１

【００５２】

【化１１】

【００５３】（同仁化学研究所製）を前記と同様にして
抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体に標識した（以下、
モノ標識化抗体と略記する）。

【００５４】（３）抗ＣＥＡ抗体固定化ポリスチレンチ
ューブの調製 ポリスチレン製試験管（７５×１２ｍｍ）に標識に使用
した抗体とは反応性の異なる抗ＣＥＡモノクローナル抗
体を固相化した。すなわち１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）に溶解した１０μｇ／ｍｌの抗ＣＥＡ抗体溶液
を試験管に２００μｌ添加し１晩放置した。吸引して上
清を除去した後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、
０．１％ＮａＮ₃ を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）を５００μｌ加え保存した。

【００５５】（４）ＣＥＡの測定 抗ＣＥＡ抗体固定化ポリスチレンチューブに０〜１０．
０ｎｇ／ｍｌに調製した標準ＣＥＡ各５０μｌおよびポ
リ標識化抗ＣＥＡ体またはモノ標識化抗ＣＥＡ抗体を各
１００μｌ添加し、室温で１時間インキュベートした。
反応液を吸引後、０．０５％のツイーン２０（和光純薬
工業社製）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
を洗浄液として１ｍｌ加え吸引した。この操作を３回繰
り返した。測定はチューブに０．３％の過酸化水素を含
むｐＨ３の１０ｍＭ酢酸緩衝液を添加し、次に０．１Ｍ
水酸化ナトリウムを含む水溶液２００μｌを添加し、生
ずる反応液の発光をバイオルマット（Biolumat）ＬＢ９
５００Ｔ〔ベルトールド（Berthold）社製〕で測定し
た。得られた結果を第２表に示した。

【００５６】また、化合物１と同様に参考例３で得られ
た化合物６、参考例４で得られた化合物７、参考例５で
得られた化合物８を用いて試料中のＣＥＡ濃度を測定し
たところ、モノ標識体で測定した値より各１２．５倍、
７．８倍、２４．６倍高い発光強度を得た。

【００５７】

【表６】

【００５８】実施例２ ヒト３人の血清を被験試料とし、実施例１と同様の方法
により血清中のＣＥＡ濃度を測定した。また参考例とし
て酵素免疫法〔ＣＥＡ−ＥＩＡワンステップキット（ア
ボット社製）〕を用いて同じ被験試料のＣＥＡ濃度を測
定した。結果を第３表に示す。

【００５９】

【表７】

【００６０】実施例３ ＣＥＡを本発明方法またはモノ標識抗体を用いた方法に
より定量した場合の、低濃度での測定限界を次のような
方法で測定した。ＣＥＡ濃度既知の健常人の血清を希釈
液で１０倍希釈系列で段階希釈し、ＣＥＡを希釈した各
試料および希釈液のみ（対照）を実施例１に記載した方
法により５回測定した。希釈試料の発光強度のカウント
と対照の発光強度のカウントの間に有意差（危険率１％
以下）がある場合が検出可能であるとして、有意差があ
る最低濃度を測定限界濃度とした。結果を第４表に示し
た。

【００６１】

【表８】

【００６２】第４表によれば、ＣＥＡの測定検出限界は
本発明のポリ標識体では０．０１７ｎｇ／ｍｌとなり、
モノ標識体を用いた場合の検出限界１．７ｎｇ／ｍｌよ
り非常に低い濃度までの限界を示した。

【００６３】実施例４ 癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の測定 （１）抗体の標識 化合物１の代わりに参考例２で得られる化合物２を使用
し、実施例１と同様の操作により標識化抗ＣＥＡ抗体を
得た。

【００６４】（２）抗ＣＥＡ抗体固定化磁性粒子の調製 １０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌにフェリス
フェアー１００Ａ（日本ペイント）１ｍｌ、グルタルア
ルデヒド１２５μｍｏｌを溶解し、さらに１ｍｇ／ｍｌ
の抗ＣＥＡ抗体溶液を１００μｌ添加し、よく攪拌後一
晩放置した。３０００ｒｐｍで遠心後、上清を吸引、１
０ｍＭリン酸緩衝液で３回洗浄した後、１％ＢＳＡ、
０．１％ＮａＮ₃ を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）を５００μｌ加え保存した。

【００６５】（３）ＣＥＡの測定 ポリスチレンチューブに（２）で作成した抗ＣＥＡ抗体
固定化磁性粒子溶液０．５ｍｌ添加し、さらに０〜２
０．０ｎｇ／ｍｌに調製した標準ＣＥＡ各５０μｌおよ
び（１）で作成した標識化抗ＣＥＡ抗体を各１００μｌ
添加し、室温で１時間インキュベートした。反応液を３
０００ｒｐｍで遠心し、上清を吸引後、０．０５％のツ
イーン２０（和光純薬工業社製）を含む１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ８．０）を洗浄液として１ｍｌ加え遠心し
た後上清を吸引除去した。この操作を３回繰り返した。
測定はチューブに０．３％の過酸化水素を含むｐＨ３の
１０ｍＭ酢酸緩衝液を添加し、次に０．１Ｍ水酸化ナト
リウムを含む水溶液２００μｌを添加し、生ずる反応液
の発光をバイオルマット（Biolumat）ＬＢ９５００Ｔ
〔ベルトールド（Berthold）社製〕で測定した。得られ
た結果を第５表に示した。

【００６６】

【表９】

【００６７】参考例１． （１）、アクリジン基を持つアクリル酸エステルの合成 アクリジンカルボン酸水和物（アルドリッチケミカルカ
ンパニー社製）４．６ｇをジオキサン（関東化学社製）
２００ｍｌに溶解し、塩化チオニル（関東化学社製）
２．４ｇを徐々に滴下し、６０℃で１時間反応させた。
これにさらにｐ−ハイドロキノン（和光純薬工業社製）
４．４ｇを添加して６０℃、５時間反応させた。反応液
を減圧濃縮乾固し、トルエン（関東化学社製）中で結晶
化、濾別乾燥してアクリジンカルボン酸のハイドロキノ
ンエステル５．６ｇを得た。このエステル３．１５ｇと
アクリル酸０．７２ｇをジオキサン２００ｍｌに溶解
し、ジシクロヘキシルカルボジイミド２．５ｇを添加溶
解し、５０℃で４時間反応させた。生じた沈澱を濾別
し、濾液を濃縮乾固した後トルエンから再結晶しアクリ
ル酸エステルを２．４ｇ得た。

【００６８】物性値；融点１１２．６〜１１３．９℃

【００６９】（２）、無水マレイン酸との共重合 （１）で得られたアクリル酸エステル１ｇ、無水マレイ
ン酸（アルドリッチケミカルカンパニー）０．２ｇをよ
く脱水されたテトラヒドロフラン１００ｍｌに溶解し、
窒素で約１時間ほど溶液をバブリングした。重合開始剤
としてsec-ブチルリチウムのシクロヘキサン／ヘプタン
溶液（アルドリッチケミカルカンパニー社製）を０．１
ｍｌ滴下し室温で重合を開始させた。粘度が２００セン
チポアズに上昇したところでイソプロパノールを０．０
５ｍｌ加えて重合を停止し、化合物ａを得た。

【００７０】（３）無水マレイン酸ブロックのＮ−ヒド
ロキシサクシイミドエステル化 （２）で得られた化合物ａの共重合溶液にＮ−ヒドロキ
シサクシイミド（関東化学社製）０．３ｇ添加してその
まま６０℃に５時間加温し化合物ｂを得た。

【００７１】（４）アクリジン基のアクリジニウム基へ
の変換 （３）で得られた化合物ｂの共重合溶液にメチルトリフ
ロロメタンスルフォナート（アルドリッチケミカルカン
パニー社製）を１．０ｍｌ添加し、攪拌後室温で１昼夜
放置し化合物１を得た。得られたポリマーは黄色であっ
た。 物性値；ＩＲ，ν，( cm^-1) ：２９９７，１７０３，１
５００

【００７２】参考例２ （１）アクリジン基を持つアクリル酸アミドの合成 アクリジンカルボン酸水和物（アルドリッチケミカルカ
ンパニー社製）４．６ｇをジオキサン（関東化学社製）
２００ｍｌに溶解し、ジシクロヘキシルカルボジイミド
（関東化学社製）４．２ｇを加え、５０℃で１時間反応
させた。これにさらにヘキサメチレンジアミン（和光純
薬工業社製）２．４ｇを添加して５０℃、３時間反応さ
せた。液が透明になったら、さらにアクリル酸０．７２
ｇとジシクロヘキシルカルボジイミド２．５ｇを追加溶
解し、５０℃で４時間反応させた。生じた沈澱を濾別
し、濾液を濃縮乾固した後トルエンから再結晶してアク
リル酸アミドを３．６ｇ得た。 物性値；融点１２７〜１３０℃。 得られたアクリル酸アミド２．１ｇを脱水したテトラヒ
ドロフラン１００ｍｌに溶解し、メチルスルホニルクロ
リド（東京化成社製）２ｍｌを添加し、２時間加熱還流
させた。反応液を減圧濃縮乾固し、トルエンで再結晶し
てメチルスルホニル化物１．５６ｇを得た。

【００７３】（２）無水マレイン酸との共重合 前記（１）で得られたメチルスルホニル化物１ｇ、無水
マレイン酸０．２ｇをよく脱水したテトラヒドロフラン
１００ｍｌに溶解し、窒素で１時間ほど溶液をバブリン
グした。重合開始剤としてsec-ブチルリチウムのシクロ
ヘキサン／ヘプタン溶液を０．１ｍｌ滴下し室温で重合
を開始させた。粘度が２５０センチポアズに上昇したと
ころでイソプロパノールを０．０５ｍｌ加えて重合を停
止し化合物ｃを得た。

【００７４】（３）アクリジン基のアクリジニウム基へ
の変換 前記（２）で得た化合物ｃにメチルトリフロロメタンス
ルフォナートを１．０ｍｌ添加し、攪拌後室温で１晩放
置し化合物２を得た。この得られたポリマーは黄色であ
り、希釈粘度法による分子量は５４００００であった。

【００７５】参考例３ アクリジンカルボン酸水和物４．６ｇをジオキサン２０
０ｍｌに溶解し、塩化チオニル２．４ｇを徐々に添加し
て６０℃で１時間反応させた。これに更に４─ヒドロキ
シベンジリデンマロノニトリル（ランカスター社）１．
７ｇを添加して６０℃で５時間反応させた。反応液を減
圧濃縮して約５０ｍｌとし、氷冷して結晶化、濾別し、
アクリジンカルボン酸のベンジリデンマロノニトリルエ
ステル１．２ｇを得た。このエステル１．７ｇを使用し
て参考例１（２）で記述したと同様に無水マレイン酸
０．２ｇとの共重合をおこなった。さらに参考例１
（４）の方法によりアクリジン基をアクリジウム塩へ変
換し、化合物６を得た。

【００７６】参考例４ ４−ヒドロキシベンジリデンマロノニトリルの代わりに
４−ヒドロキシベンジリデンアセトン（ランカスター
社）１．６ｇを使う以外は参考例３と同じ方法により化
合物７を得た。得られたポリマーの平均分子量は約２６
０００であった。

【００７７】参考例５ アクリジンカルボン酸水和物４．６ｇをジオキサン２０
０ｍｌに溶解し、塩化チオニル２．４ｇを徐々に添加し
て６０℃で１時間反応させた。これにさらにアリルアミ
ン１．１５ｇを滴下し６０℃で２時間加温を続けた。反
応液を減圧濃縮して約５０ｍｌとし、氷冷して結晶化
し、濾別してアクリジンカルボン酸のアリルアミンアミ
ド２．２ｇを得た。この１ｇをジオキサン２００ｍｌに
懸濁し、フェニルスルフォニルクロリド２ｍｌを液が透
明になるまで滴下し、スルホンアミド体を合成し、反応
液を減圧濃縮して５０ｍｌとし、氷冷して結晶化し、濾
別した。また、これについては無水マレイン酸と共重合
させた後、参考例１（３）の方法によりＮ−ヒドロキシ
サクシンイミド０．３ｇを添加してエステルとした。参
考例１（４）の方法によりアクリジウム塩へ変換し化合
物８を得た。得られたポリマーの平均分子量は３８００
０であった。

【００７８】

【発明の効果】本発明によれば、免疫学的定量法におい
て、高感度な抗原、抗体または核酸の定量が可能にな
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被測定物質である抗原、抗体または核酸
   と、ポリアクリジニウム化合物を結合させた、被測定物
   質と結合する抗体、抗原または核酸とを反応させ、発光
   処理を行い、反応液中の発光強度を測定することを特徴
   とする物質の定量方法。
2. 【請求項２】 ポリアクリジニウム化合物が式（Ｉ） 【化１】 〔式中、ｍは１〜１００００の任意に変わりえる正の整
   数を表し、ｎは０〜１００００の任意に変わりえる正の
   整数を表し、ｑは１〜２００００の正の整数を表し、Ｘ
   は水素または低級アルキルを表し、Ｙは水素、低級アル
   キルまたは金属を表し、Ｒ₁ 、Ｒ₂ およびＲ_2aは同一ま
   たは異なって、水素、低級アルキル、低級アルカノイ
   ル、置換もしくは非置換のアロイル、カルボキシまたは
   シアノを表し、Ｒ₃ は式 −〔ＣＯＯ〕_s −Ｗ−〔ＯＣＯ〕_p −、−〔ＣＯＯ〕_s
   −Ｗ−Ｎ（Ｒ₉ ）ＣＯ−、−ＣＯＯ−Ｗ−Ｗ_a −〔Ｎ
   （Ｒ₉ ）ＣＯ〕_p −、または−ＣＯＮ（Ｒ₉ ）−Ｗ−
   〔Ｎ（Ｒ_9a）ＣＯ〕_p − （式中、ＷおよびＷ_a は異なってメチレン、アルキレ
   ン、置換もしくは非置換のフェニレンまたは置換もしく
   は非置換のナフチレンを表し、Ｒ₉ およびＲ_9aは同一ま
   たは異なって水素、低級アルキルスルホニルまたは置換
   もしくは非置換のアリールスルホニルを表し、ｓおよび
   ｐは同一または異なって０または１を表す）を表し、Ｒ
   ₄ およびＲ₅ は同一または異なって、水素、低級アルキ
   ル、低級アルコキシ、カルボキシ、スルホを表し、Ｒ₆
   は置換もしくは非置換の低級アルキルを表し、Ｒ₇ はカ
   ルボキシ、低級アルコキシカルボニル 【化２】 （式中、Ｒ₁₀はアルキレン、置換もしくは非置換のフェ
   ニレンまたは置換もしくは非置換のナフチレンを表す）
   を表し、Ｒ₈ はカルボキシ、低級アルコキシカルボニ
   ル、置換もしくは非置換のアルキルまたは置換もしくは
   非置換のアリールを表すか、またはＲ₇および Ｒ₈が一
   緒になって 【化３】 を表し、Ｚはハロゲン、メタンスルホニルオキシ、トリ
   フルオロメタンスルホニルオキシを表す〕で表されるポ
   リアクリジニウム化合物である請求項１記載の定量方
   法。