FI93997C - Homogeenisia fluorimetrisiä määritysmenetelmiä, joissa käytetään fluoresoivan taustan poissulkemista ja fluoroforeina vesiliukoisia harvinaisten maametallien kelaatteja - Google Patents

Description

93997

Homogeenisia fluorimetrisiä määritysmenetelmiä, joissa käytetään fluoresoivan taustan poissulkemista ja fluoro-foreina vesiliukoisia harvinaisten maametallien kelaatte- ja 5

Keksinnön tausta 1. Keksinnön kenttä Tämä keksintö koskee fluoresenssimääritysmenetelmiä, joissa käytetään hyväksi spesifistä sitoutumista. Tarkem-10 min määriteltynä se koskee homogeenisia fluoresenssimääritysmenetelmiä, joihin liittyy spesifinen sitoutuminen ja joissa käytetään vesiliukoisia (harvinainen maametalli)ke-laattifluoroforeja yhdessä fluoresenssimittausten kanssa, jotka eliminoivat tai torjuvat häiritsevän taustafluore-15 senssin ja mahdollistavat vesiväliaineissa olevien analysoitavien aineiden suoran ja hyvin herkän määrittämisen.

Määritysmenetelmät, joissa käytetään hyväksi spesifistä sitoutumista, ovat käyttökelpoisia erilaisten aineiden, joilla on diagnostista, lääketieteellistä, ympä-20 ristötieteellistä ja teollista merkitystä ja joita esiintyy nestemäisissä väliaineissa hyvin pieninä pitoisuuksina, määrittämisessä. Spesifinen sitoutuminen -määritykset perustuvat määritettävän aineen ja sen sitoutumiskumppanin spesifiseen vuorovaikutukseen. Kun joko analysoitava aine 25 tai sen sitoutumiskumppani on vasta-aine ja toinen niistä on vastaava hapteeni tai antigeeni, määrityksestä käytetään nimitystä immuunimääritys.

Tällaisissa määrityksissä on välttämätöntä, että läsnä on merkkiainetta, joka antaa mitattavissa olevan 30 osoituksen siitä, missä laajuudessa spesifinen sitoutu-misreaktio tapahtuu. Fluoresoivia merkkiaineita voi esimerkiksi olla läsnä sitoutumiskumppanissa, ja tämän fluoresoivan merkkiaineen sisällyttämistä spesifisesti sitoutuneeseen pariin voidaan käyttää parin muodostumisen de-35 tektointiin.

•« 2 93997

Spesifinen sitoutumisreaktio voi vaihtoehtoisesti aiheuttaa muutoksen fluoroforin fluoresenssiominaisuuksis-sa. Kuten I. Wieder (US-patenttijulkaisu 4 058 732) esittää, voidaan tämän fluoresenssin detektoinnista tehdä her-5 kempi käyttämällä aikaohjattua detektointia lyhytikäisen taustafluoresenssin torjumiseksi ja pitkäikäisen fluoresenssin, kuten harvinaisten maametallien kelaattien emittoiman fluoresenssin, detektoimiseksi tarkemmin. Näitä taustantorjumismenetelmiä on käytetty tähän mennessä me-10 nestyksellisesti erilaisissa heterogeenisissä analyysimenetelmissä. Heterogeeninen määritys on määritys, jossa fluoresoivaksi leimattu pari erotetaan fysikaalisesti sitoutumattomista fluoroforeista.

Tämä keksintö tarjoaa käyttöön menetelmiä, joissa 15 taustantorjumismenetelmiä sovelletaan homogeenisiin mää rityksiin. Homogeeninen määritys on määritys, jossa fluoresoiviksi leimattuja pareja ei eroteta sitoutumattomista fluoroforeista, mutta sitoutuneet fluoroforit ja sitoutumattomat fluoroforit ovat erotettavissa toisistaan. Katso 20 J. Biol. Chem. 251 (1976) 4172 - 8.

2. Aiempien menetelmien kuvaus US-patenttijulkaisussa 4 058 732 (15. marraskuuta 1977, Irwin Wieder) kuvataan fluoresoivan taustan torjumisen käyttöä määritysmenetelmissä.

25 US-patenttijulkaisussa 4 341 957 (Irwin Wieder) kuva taan fluoresoiviin harvinaisten maametallien kelaatteihin kytkettyjä vasta-aineita.

US-patenttijulkaisussa 4 352 751 (5. lokakuuta 1982,

Wieder ja Wollenberg) julkistetaan joukko harvinaisten 30 maametallien kelaatteja ja niiden käyttö fluoresoivan taustan torjumismenetelmissä. Samoin EP-hakemuksessa 68 875 A2 (28. kesäkuuta 1982, Eastman Kodak Co.) julkistetaan fluoresoivien (harvinainen maametalli)kelaattimerkkinaineiden käyttö fluoresenssimääritysmenetelmissä.

35 EP-hakemuksessa 64 484 A2 (Wallac Oy) julkistetaan heterogeeninen määritysmenetelmä, jossa lantanidikelaatti 3 93997 kytketään spesifisesti sitoutuvaan aineeseen, saatetaan reagoimaan sitoutumisreaktiossa ja eristetään sitoutumis-reaktioseoksesta fysikaalisesti erottamalla. Lantanidi-ionimerkkiaine vapautetaan sitten kelaatista happokäsit-5 telyllä ja mitataan käyttämällä Wiederin fluoresoivan taustan torjumismenetelmää. Muihin kiintoisiin viitteisiin kuuluvat artikkelit, jotka ovat ilmestyneet julkaisuissa Clin. Chem., Winston Salem, N. C., 29(1) (1983) 65 - 8 ja Proc. Natl. Meet. Biophys. Med. Eng. Finl., 10 4 (1982 199 202, ja US-patenttijulkaisu 4 374 120, jotka kaikki ovat Wallac Oy:n ryhmän nimissä; ja Kodakin US-patentti julkaisu 4 283 328 (11. elokuuta 1981).

Eräs viimeaikainen kiintoisa julkaisu on EP-pa-tenttijulkaisu 103 558 (21. maaliskuuta 1984), jossa Wal-15 lac Oy:n ryhmä ehdottaa fluoresoivan taustan torjumisen käyttöä tietyissä homogeenisissa analyysijärjestelyissä. Mainitussa patenttihakemuksessa esitetyssä menetelmässä käytetään kuitenkin reagensseja, jotka ovat normaalisti veteeniiukenemattomia ja heikosti fluoresoivia vedessä ja 20 monimutkaisia misellien muodostusmenetelmiä näiden rea- genssien käytön mahdollistamiseksi veden ollessa testi-väliaineena. Tämä kyvyttömyys toimia suoraan vesiväliai-neissa on vakava puute, sillä käytännöllisesti katsoen jokainen tärkeä spesifinen sitoutumisreaktio identifioi-25 daan pääasiassa vesijärjestelmissä.

Muita mainitsemisen arvoisia, mutta todennäköisesti vähemmän tärkeitä, alan julkaisuja ovat artikkeli "A Review of Fluoroimmunoassay and Immunofluorometric Assay", D.S. Smith et ai., Ann. Clin. Biochem., 18 (1981) 30 253 - 274, jossa esitetään yhteenveto tähän mennessä eh- . dotetuista heterogeenisista ja homogeenisista fluoresens- simääritysmenetelmistä; US-patenttijulkaisut 3 998 943; 4 020 151; 3 939 350; 4 220 450 ja 3 901 654, joissa esitetään määritysmenetelmiä.

35 On olemassa kaksi yleistä tyyppiä homogeenisia fluo- resenssimäärityksiä. Tavallisemmassa niistä sitoutuneilla ί 4 93997 fluoroforeilla on alentunut eli "sammutettu" fluoresenssi verrattuna sitoutumattomiin fluoroforeihin, niin että sitoutumisen laajuus voidaan detektoida fluoresenssin vähenemisen kautta. On ehdotettu joukko erilaisia sammutus-5 määrityksiä. /Katso esimerkki Shaw et ai., J. Clin.

Pathol., 30 (1977) 526 - 31; Broughton et ai., Clin. Chem.

24 (1978) 1033; Shaw et ai., Clin. Chem. 25 (1979) 322 -5; Dandliker et ai., Immunochemistry 7 (1970) 799 - 828;

Nargessi et ai., J. Immunol. Meth. 26 (1979) 307 - 313; 10 Lopatin et ai., Biochemistry 10 (1971) 208 - 13; Portmann et ai., Immunochemistry 12 (1975) 461 - 6; Levison et ai., Biochemistry 9 (1979) 322 - 31; Voss et ai., Immunochemistry 13 (1976) 447-53; Nargessi et ai., Clin. Chem.

Acta 89 (1978) 461 - 7; Zuk et ai., Clin. Chem. 25 (1979) 15 1554 - 60 ja Brinkley et ai., Clin. Chem. 25 (1979) 1077.J7 SYVÄ Corporation on samoin ehdottanut homogeenista fluore-seiini-rodamiinimääritysjärjestelmää, jossa fluoreseiini liitetään antigeeniin ja rodamiini vasta-aineeseen. Kun nämä kaksi ryhmää saatetaan yhteen, on tuloksena sammutus.

20 Toisessa homogeenisessa fluoresenssimääritysmenetel- mässä sitoutuneella fluoroforilla on kohonnut eli "edistetty" fluoresenssi verrattuna sitoutumattomaan fluoro-foriin. Katso D. S. Smith, FEBS Lett. 77 (1977) 25-7, jossa on käytetty fluoreseiinilla leimattua T^:ää voimis-25 tuksen aikaansaantiin.

Edellä mainitut menetelmät ovat yleensä perustuneet etupäässä rodamiinien ja fluoreseiinin käyttöön eivätkä sellaisiin materiaaleihin kuin harvinaisten maametallien kelaatit, jotka ovat erityisen edullisia fluoresoivan 30 taustan torjunnan järjestämisessä. Huolimatta homogeenisten määritysten ja fluoresoivan taustan torjumisen tunnustetuista eduista analyysimenetelminä ei vielä ole esitetty menetelmää, jolla voitaisiin yhdistää nämä kaksi teknistä edistysaskelta yleisesti käytännöllisellä tavalla 35 vastaan tulevien monien erilaisten äärimmäisen laimeiden vesiliuosten analysoimiseksi tehokkaasti. Tämä puute on 5 93997 erityisen tärkeä, koska pääasiallisena kiinnostuksen kohteena ovat näytteet, joissa analysoitavan aineen pitoisuus 10"8 mol/1, erityisesti alueella 10~8 - 10"14 mol/1, ja sen alapuolella, mikä liittyy luonnontuotteiden, hormonien, 5 seerumin proteiinien tms. määrittämiseen. Tämän keksinnön tärkeimpänä päämääränä on tarjota käyttöön käytännöllisiä homogeenisia menetelmiä laimeissa vesiväliaineissa olevien analysoitavien aineiden määrittämiseksi käyttämällä fluoresoivan taustan torjumista detektointitapatumana.

10 Selostus keksinnöstä

Nyt on havaittu, että homogeenisia määrityksiä spesifisen sitoutumisreaktion laajuuden määrittämiseksi kvantitatiivisesti voidaan tehdä tehokkaasti hyvin laimeille liuoksille käyttämällä fluoresenssimittauksia, jos käyte-15 tään fluoresenssimittausjärjestelmää, jolla on kyky torjua lyhytikäinen taustafluoresenssi, ja jos mitattavalla fluoresoivalla ryhmällä on seuraavat ominaisuudet: a. mitattavan ryhmän tulee olla harvinaisen maame-tallin kelaattikompleksiyhdistelmä; 20 b. kelaatin tulee olla vesiliukoinen; c. kompleksiyhdistelmän tulee olla stabiili myös äärimmäisen laimeissa vesiliuoksissa, ts. mitatussa kelaa-tissa täytyy olla vähintään yksi ligandi, jolla metallin ja ligandin välinen sitoutumisvakio on vähintään noin 1013 M'1 25 tai suurempi, ja sen fluoresenssiemission tulee olla pitkäikäinen verrattuna ympäristössä olevien aineiden pisimpään vaimenemisaikaan, ja sen puoliintumisajan tulee olla 0,01 -50 ms. Tällaisen mittausjärjestelyn ja tällaisen fluoresoivan materiaalin käyttö mahdollistaa tämän keksinnön mukai-30 sen analyysimenetelmän, jossa a. sekoitetaan vesiliukoinen yhdiste, joka sisältää ensimmäistä merkkiainetta sisältävän, biologisesti spesifisen ryhmän, vesiliuokseen, joka sisältää ensimmäistä merkkiainetta sisältävän biologisesti spesifisen ryhmän sisäl-35 tävän yhdisteen biologisesti spesifisen vastinparin, jol loin muodostuu vesiliukoinen tuote, joka sisältää spesifisen sitoutumisparin, joka tällaisen spesifisen sitoutumisen seurauksena sisältää uuden merkkiaineen, joka fluoresens- 6 93997 siltaan on erilainen kuin ensimmäinen merkkiaine, jolloin ainakin toinen ensimmäisestä merkkiaineesta ja uudesta merkkiaineesta on harvinaista maametallia sisältävä fluoresoiva kelaatti, joka on vesiliukoinen vesiliuoksessa ja 5 jossa metallin ja ligandin välinen sitoutumisvakio on suurempi kuin noin 1013M_1 ja jonka vaimenemisaika on pitempi kuin ympäristön sisältämien aineiden pisin vaimenemisaika (ts. puoliintumisaika on alueella 0,01 - 50 ms); b. viritetään vaiheessa a. saatu vesiliukoinen tuo-10 te vähintään yhdellä elektromagneettisella säteilypulssil- la, jonka kesto on lyhyempi kuin pitkäikäisen fluoresens-siemission vaimenemisaika, jolloin muodostuu viritetty vesiliukoinen tuote; c. detektoidaan viritetyn vesiliukoisen tuotteen 15 emittoima fluoresenssi, sen jälkeen kun ympäristön sisäl tämien aineiden fluoresenssi on vaimentunut oleellisilta osiltaan, ja d. suhteutetaan kohdassa c. detektoitu fluoresenssi vesiliuoksessa tapahtuvan spesifisen sitoutumisreaktion 20 määrään.

Eräässä erityissuoritusmuodossa tämä keksintö tarjoaa käyttöön homogeenisen määrityksen, jossa käytetään fluoresoivan taustan torjuntaa yhdistettynä periaatteeseen, joka koskee energiansiirtoa kahden ligandin välillä, joista • 25 vähintään toinen on kelatoituva ligandi, jolla on kyky koordinoida harvinainen maametalli-ioni, jolloin muodostuu fluoresoiva kelaatti, jolla on pitkä vaimentumisaika ja muut edellä kuvatut ominaisuudet. Tällaisessa suoritusmuodossa energiansiirto on spesifisen sitoutumisen tapahtu-30 misasteen funktio, ja energiansiirto muuttaa fluoresenssia, ja fluoresenssin muuttumisaste on spesifiseen sitoutumis-reaktioon osallistuvan kohteen pitoisuuden funktio.

Eräässä toisessa suoritusmuodossa tämä keksintö tarjoaa käyttöön homogeenisen määrityksen, jossa käytetään 35 hyväksi harvinaisen maametalli-ionin ligandien välistä siirtoa, jolloin spesifisen sitoutumisreaktion seuraukse-• na muodostuu fluoresenssiltaan muuttunut kompleksi. Täs- 7 93997 sä suoritusmuodossa harvinainen maametalli esiintyy ke-laattina, joka on kiinnittynyt spesifisen sitoutumisparin toiseen jäseneen, edullisesti siihen joka on ominaisuuksiltaan kohteen kaltainen, ja parin toinen jäsen sisältää 5 ligandin, jolla on kyky muodostaa haluttu fluoresenssiltaan muuttunut kelaatti harvinaisen maametallin kanssa. Toisella ligandilla tulisi olla suurempi sitoutumisvakio harvinaisen maametallin suhteen kuin ensimmäisellä ligandilla, jolloin saadaan aikaan metallin siirtyminen toi-10 seen kelaattiin. Tällaisessa suoritusmuodossa metallin siirron määrä on spesifisen reaktion tapahtumisasteen funktio, ja metallin siirto muuttaa fluoresenssia, ja fluoresenssin muuttumisaste on spesifiseen sitoutumisreaktioon osallistuvan kohteen pitoisuuden funktio.

15 Keksinnön mukaisen homogeenisen määritysmenetelmän kolmannessa suoritusmuodossa käytetään harvinaisen maametallin kelaattia, joka sisältää useita koordinaatiokohtia, jotka kaikki eivät ole kelaatin muodostavan ligandin miehittämiä, ja spesifisen sitoutumisreaktion seurauksena yksi 20 tai useampi näistä miehittämättömistä paikoista täyttyy spesifisen sitoutumiskumppanin tuomalla ligandilla, jolloin saadaan fluoresenssiltaan erilainen uusin sekaligandike-laatti. Tässä suoritusmuodossa tuleva ligandi voi syrjäyttää alkuperäisen ligandin joistakin paikoista, jotka ovat 25 sen miehittämiä alkuperäisessä kelaatissa. Tällaisessa suoritusmuodossa sekakelaattien muodostumisen määrä on spesifisen sitoutumisen tapahtumisasteen funktio, ja sekakelaattien muodostuminen muuttaa fluoresenssia, ja fluoresenssin muuttumisaste on spesifiseen sitoutumisreaktioon osallis-30 tuvan kohteen pitoisuuden funktio.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Viittaus aiheeseen liittyviin hakemuksiin Muutamia ligandeista, joita voidaan käyttää tämän keksinnön yhteydessä, julkistetaan ja niiden suhteen esitetään 35 patenttivaatimuksia samanaikaisesti avoinna olevassa US-pa-tenttihakemuksessa nro 712 774 (Hale ja Solas, jätetty 18.

8 93997 maaliskuuta 1985), joka mainitaan kokonaisuudessaan tässä viitteenä.

Piirroksen lyhyt kuvaus Tässä kuvauksessa viitataan liittenä olevaan piirrok-5 seen, jossa olevat kaksi kuvaa valaisevat energiansiirtome-kanismeja, joita voi tapahtua tämän keksinnön yhteydessä, jolloin tapahtuu mitattavissa oleva muutos detektoitavissa olevassa fluoresenssissa.

Edullisten suoritusmuotojen kuvaus 10 Fluoresoivien kelaattien ominaispiirteet

Toteutettaessa tätä keksintöä tehdään homogeenisia määrityksiä parannetulla teholla käyttämällä fluoresoivan taustan torjuntaa yhdistettynä mitattuun fluoresoivaan spesiekseen, joka on harvinaisen maametallin fluoresoiva ke-15 laatti. Kelaatit ovat vesiliukoisia, mikä voidaan määritellä seuraavasti: kelaattien täytyy mennä vesiliuokseen ainakin pH-alueella 6-10 määrityksissä käytettyinä pitoisuuksina. Vaikka tämä pitoisuus voi joissakin tapauksissa olla suhteellisen alhainen, on käsittely- ja näyteyhteensopi- 20 vuusetujen kannalta edullista, että kelaattia liukenee vä--4 hintään 10 mol/1 tällä pH-alueella. Kelaattien tulisi myös olla stabiileja vesiväliaineissa pH-alueella 6-10, mitä heijastaa metallin ja ligandin välisen sitoutumis- 13 -1 vakion (K_,_) arvo yli noin 10 M (ts. log K_,^ vähintään .bC dl . 25 noin 13), ja niillä pitäisi olla pitkäikäinen fluoresenssi (ts. puoliintumisaika vähintään 0,01 ms) ja voimakas kvant- tituotto. Fluoresenssin eksitaatio tapahtuu edullisesti aallonpituudella, joka on 300 nm tai pitempi.

Tässä yhteydessä käytettävät kelaatit sisältävät har- 30 vinaista maametalli-, ts. lantanidi-ionia. Monia erilaisia harvinaisten maametallien ioneja voidaan käyttää mukaan luettuina Nd^+, Pm^+, Sm^+, Eu^t Gd^+, Tb^+, Dy^+, Er^+ 3+ 3 + tms. Terbiumioni (Tb ) ja europiumioni (Eu ) ovat edullisia harvinaisia maametalli-ioneja.

35 Ligandeille, jotka ovat käyttökelpoisia kelatoitavik- si harvinaisen maametalli-ionin kanssa, on luonteenomaista 9 93997 vesiliukoisuus, suuret sitoutumisvakiot ja sellaisten ke-laattien aikaansaanti, joiden kvanttihyötysuhde on yli 0,01. Eräs ryhmä tällaisia ligandeja ovat 2,6-bis/N,N-di-(karboksialkyyli)aminoalkyylijpyridiinit. Tarkemmin mää-5 riteltynä substituoidulla aryyliryhmällä substituoitu 2,6-/ft,N-bis(karboksialkyyli)aminoalkyylijpyridiiniryhmä, jolla on kaava,

Ar-(R)n,, ^CH2-COOM

10 \__HC

A-\ ^CH -COOM

/\ή £ “ ^CH2-COOM

R1 R" — 15 2 n \

1 3 ^CH -COOM

2 jossa n ja n' ovat riippumattomasti kokonaislukuja 1 tai 2, Ar on aryyliryhmä, n" on kokonaisluku, joka on yhtä suuri 20 kuin ryhmän Ar käytettävissä olevien sitoutumispaikkojen lukumäärä, M on vety- tai metalli-ioni ja kukin ryhmistä R, joita on n" kpl, R' ja R" on riippumattomasti vety; elektroneja luovuttava ryhmä mukaan luettuina alemmat al-koksi-, alemmat alkyyli-, amiini-, dialkyyliamiini-, aryy- 2 5 li- ja aryloksyyliryhmät; tai siltaryhmä mukaan luettuina kovalenttinen sidos ja siltaryhmä, jolla on kyky muodostaa silta loppuosaan molekyylistä sillä edellytyksellä, että vähintään yksi ryhmistä R, joita on n" kpl, on elektroneja luovuttava ryhmä ja vähintään yksi ryhmistä R', R" ja 30 R, joita on n” kpl, on melkyylin loppuosaan johtava silta-. ryhmä. Näitä materiaaleja kuvataan Halen ja Solasin patent- tihakemuksessa, johon viitattiin edellä.

Muihin ligandeihin, jotka voivat muodostaa fluoresoivia kelaatteja, jotka ovat asianmukaisesti stabiileja ja 35 vesiliukoisia, kuuluvat polyamiinipolykarboksyylihapot, kuten diamiinitrihapot, joilla on kaava, « • ·

1 O

93997

HOOC-CH CH-COOH

Z\ /2

„N-R-N

/ \

B-L-OC-CH- CH-COOH

2 2 5 jossa B on biologisesti spesifinen orgaaninen ryhmä, L on silta biospesifiseen ryhmään ja R on kaksi hiiltä sisältävä tai suurempi kovalenttinen orgaaninen siltaryhmä. Näitä materiaaleja kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 432 907 10 (Wieder ja Wollenberg), joka mainitaan tässä viitteenä.

Vielä eräs ryhmä ligandeja, jotka voivat ottaa osaa näihin homogeenisiin analyyseihin, ovat substitutoidut di-pikoliinihapot ja -suolat, joilla on kaava, 15 Ar-(R)n,,

Rl—CR”

MOOC N ' ^ COOM

20 jossa yksi ryhmistä R, joita on n kpl, R' ja R" on vasta-aineen tai kohteen kaltainen ryhmä, muut ryhmistä R, R' ja R" ovat edellä kuvattuja ryhmiä ja ryhmät M, jota on 2, ·; 2 5 ovat riippumattomasti vety- tai metalli-ioneja.

‘ Muihin ligandeihin kuuluvat triamiinitetrahapot, jotka vastaavat kaavoja, 30 <JH2-COOH CH2-COOH ^ch^cooh

B-L-COCH2 ^ XCH2-COOH

li 1 1 93997

CH2-COOH

( ^ CH^COOH

5 B-L-OCCH2-N

/ ^ CH -COOH

\ s' 2

^CHj-COOH

10 ja joita muodostetaan saattamalla dietyleenitriamiinipenta-etikkahappo reagoimaan dianhydridikseen /Hnatowich et al.# Int. J. Appl.Radiat. Isot. 33 (1982) 327_/, aktivoiduksi se-ka-anhydridiksi /Krejcarek ja Tucker, Biochem. Biophys.

15 Res. Commun. 77 (1977) 581/ tai aktiiviseksi esteriksi /Najafi et ai., Int. J. Radiat. Isot. 35 (1984) 554.7, joissa biospesifiset ryhmät (B) sisältävät sopivalla tavalla substituöituja siltaryhmiä (L).

Muihin soveltuviin ligandeihin kuuluvat tetrahapot, 20 joilla on kaava,

^,CH2-COOH

/-\ / ^ CH -COOH

25 b-l-(oK

\_J \ CH2-COOH

N

^CH2-COOH

30 joita valmistetaan parasubstituoiduista fenyylietyleenidi- « : amiinitetraetikkahapoista /Meares ja Wensel, Accounts of

Chemical Research 17 (1984) 202\J, ja imidaatiin kytketyt tetrahapot, joilla on kaava, 35 » 4 t 12 93997

^CH -COOH NH

VI ^CH2-COOH

νίρΠ

^n‘CH2-COOH

joita valmistetaan DTTA-atsoimidaatista /Paik et ai., J.

10 Radioanalytical Chemistry 57 (1980) 553/.

Edellä esitetyt materiaalit ovat edustavia esimerkkejä. On ymmärrettävä, että tämä keksintö ei ole riippuvainen minkään tietyn ligandin tai kelaatin käytöstä vaan enemminkin siitä, että käytetään harvinaisten maametallien 15 kelaatteja, joilla on edellä esitetyt liukoisuus- ja sta-biilisuusominaisuudet.

Kytkennät biologisesti spesifiseen materiaaliin Fluoresoiva kelaatti kytketään spesifisesti sitoutuvaan materiaaliin, ts. biologisesti spesifisen (esimerkiksi 20 immunologisen) parin toiseen puoliskoon biospesifisten määritysten tekemisen mahdollistamiseksi. Fluoroforin kytkentä biologisesti spesifiseen materiaaliin voi olla kovalent-tinen kemiallinen sidos tai "vasta-aine - antigeeni" -tyyppinen sidos kelaatin ja spesifisesti sitoutuvan materiaalin 25 välillä, jollaista kuvataan teoksessa A. Kawamura (toim.), Fluorescent Antibody Techniques and Their Application,

University Park Press, Baltimore, Md. 1969. Kelaatin muodostavat ligandiryhmät voivat olla biologisesti spesifisiin ryhmiin johtavien kytkentöjen sijaintikohtia. Tämä sitoutu-. 30 minen voidaan saada aikaan kovalenttisella sidoksella tai jollakin siltaryhmällä, jotka molemmat voivat muodostaa jonkin ryhmistä R', R" ja R, erityisesti jonkin ryhmistä R, edellä kuvatuissaligandirakenteissa.

Kun sitoutuminen saadaan aikaan siltaryhmällä, tuli-35 si tässä ryhmässä R olla aktiivinen eli sitoutuva kohta, .. kuten amiini-, hydroksyyli-, karboksyyli-, esteri- tms.

13 93997 ryhmä, biologisesti spesifisen ryhmä sitoutumisen helpottamiseksi. Esimerkkejä tällaisista sitoutuvista ryhmistä R ovat amiiniryhmä (-NH2), primaarisen ja sekundaarisen amii-nipääteryhmän sisältävät alkyyliryhmät, primaarisen ja se-5 kundaarisen amiinipääteryhmän sisältävät aryyli- ja ary-loksyyliryhmät, niiden isomeerit, tms.; hydroksyyliryhmän sisältävät alkyyliryhmät ja hydroksyyliryhmän sisältävät aryyli- ja aryloksyyliryhmät.

Muita funktionaalisia ryhmiä, jotka soveltuvat si-10 doksen muodostamiseen biospesifisen ryhmän kanssa, ovat amidi-, amidiini-, tioamidi-, urea-, tiourea-, guanidiini-, diatso-, tioeetteri-, karboksyyli- ja fosfaattiesteri- ja -tioesteriryhmät ja muut alalla tunnetut kovalenttiset sidokset. Eräs edullinen siltaryhmä on yksinkertainen amii-15 niryhmä. Siltaryhmät voivat kytkeytyä suoraan biologisesti aktiiviseen ryhmään, tai kytkentä voi tapahtua bifunktio-naalisen väliryhmän, kuten jonkin ryhmistä -CO(CH2)4-, -CS-, -CO(CH2)gNHCOCH2ON=f -COCH_ON=, -CO (CH„ ) ,-NHCO (CH0 ) ,CO- , Z Z D Z Ό 20 -CO(CH2)2SS(CH2)2CO-, -CSNH(CH2)3N(CH2CH2)2N(CH2)3NH-CO(CH2)6CO-, -CSNH(CH2)3N(CH2CH2)2N(CH2)3NHCO(CHOH)2CO--CSNH(CH2)3N(CH2CH2)2N(CH2)3NHCOCH2ON= 25 tms. kautta. Tällaiset siltaryhmät ja välivksiköt ovat tyy-* pillisiä esimerkkejä.

Biologisesti spesifinen ryhmä

Kuten edellä mainittiin, keksinnön mukaisissa määrityksissä kytketään biologisesti aktiivinen, ts. biologises-30 ti spesifinen ryhmä fluoresoivaan kelaattiin esimerkiksi kelaatin muodostavan ligandin kautta. Termejä "biospesifi-nen ryhmä (biologisesti spesifinen ryhmä)" ja "biologisesti aktiivinen ryhmä" käytetään laajassa merkityksessä kattamaan kaikki molekyylirakenteet, jotka "tunnistavat spe-35 sifisesti" toisen molekyylispesieksen tai "reagoivat spesifisesti" tai "ovat spesifisessä vuorovaikutuksessa" sen 14 93997 kanssa. Tällaisiin ryhmiin voivat kuulua immunologisesti spesifiset ryhmät, kuten vasta-aineet ja niitä vastaavat antigeenit tai hapteenit, hormonit ja niiden reseptorit, sitoutumisparit, kuten biotiini - avidiini-pari tms. Nii-5 hin voivat kuluva myös nukleiinihapposekvenssit, jotka hybridisoituvat spesifisesti komplementaaristen sekvenssien kanssa. Sitoutumiskumppaneista käytetään välillä yleisnimityksiä "vasta-aineen kaltaiset" ja "kohteen kaltaiset" molekyylit.

10 Voidaan valita biologisesti spesifisiä ryhmiä, jotka sitoutuvat tai muulla tavalla liittyvät kohdemolekyyliin tai jotka jäljittelevät kohdemolekyyliä tai sisältävät sen kilpaillakseen kohteen kanssa biospesifisessä reaktiossa. Ymmärrettäneen, että parhaiden herkkyyksien saavuttamiseksi 15 voi olla edullista puhdistaa sitoutumiskumppanit biologisen spesifisyytensä suhteen käyttämällä affiniteettikroma-tografiaa tms. menetelmiä.

Analysoitava molekyyli

Analysoitava eli kohdemolekyyli, joka vastaa biospe-20 sifistä ryhmää tai on vuorovaikutuksessa sen kanssa, voi olla monoepitooppinen tai polyepitooppinen materiaali. Kun otetaan huomioon fluoresoivien kelaattien, joita täytyy käyttää tämän keksinnön yhteydessä, vesiliukoisuusominai-suudet, on yleensä edullista, että kohde on materiaali, 25 joka esiintyy vesisysteemeissä. Se voi rajoittamattomasti olla sellainen materiaali kuin lääke, metaboliitti, luonnontuote, pestisidi, kemikaali tai ilman ja veden epäpuhtaus. Asian valaisemiseksi voidaan mainita lääkkeet mukaan luettuina digoksiini, digitoksiini, fenytoiini, teofyliini, 30 gentamisiini ja tobramysiini; alkaloidit, kuten morfiini, heroiini, kokaiini, torajyväalkaloidit tms.; steroidit, kuten steroidihormonit mukaan luettuina estrogeenit ja androgeenit, esimerkiksi estrioli, ja tulehdusten vastaiset steroidit, esimerkiksi kortisoli; laktaamit, kuten barbitu-35 raatit fenobarbitaali mukaan luettuna; aminoalkyylibentsee-nit, kuten amfetamiinit; vitamiinit, prostaglandiinit, ku- 15 93997 ten F2_alfa ja E, antibiootit tms., lyhyet peptidisekvens-sit tai aminohapot, kuten tyroksiini, trijodityroniini ja oksitosiini. Esimerkkeihin saasteista ja pestisideistä kuuluvat PCB, dioksiini, halogenoidut bifenyylit, karba-5 maatit, tiofosfiitit, fosfaattiesterit ja niiden metabo-liitit. Tällaisten materiaalien molekyylimassa voi olla suunnilleen alueella 50-2 000.

Kohdemolekyyli voi olla myös polymeerinen materiaali, kuten proteiini tai muu polyaminohappo, polynukleiinihappo 10 tai polysakkaridi. Tyypillisiä proteiinimateriaaleja voivat olla minkä tahansa proteiiniryhmän jäsenet mukaan luettuina ilman rajoituksia globuliinit, albumiinit, lipopro-teiinit, glykoproteiinit, histonit tms., yliherkkyysproteii-nit albumiini mukaan luettuna, immunoglobuliinit, kuten 15 IgE, fibrinogeeni, transferriini, erilaiset komplementtite-kijät, kasvainmarkkerit, kuten CEA (karsinoembryonaalinen antigeeni) ja PAP, erilaiset veren hyytymistekijät ja pro-teiinihormonit mukaan luettuina beeta-hCG, FSH, gastriini, LH ja prolaktiini; insuliini, tyrotropiini, gonadotropiini 20 tms. Esimerkkejä biospesifisistä polysakkarideista ovat mikro-organismeista peräisin olevat, kuten erilaisiin Salmonella-, Streptococcus- ja Klebsiella-lajeihin liittyvät polysakkaridit. Muihin kohteisiin kuuluvat seuraaviin rajoittumatta erilaisia infektiosairaustiloja, kuten hepa-25 tiitti- tai rubellainfektioita, aiheuttavat materiaalit.

Edellä oleva luettelo on tarkoitettu lyhyeksi yleiskatsaukseksi. On ymmärrettävä, että muita vastaavia materiaaleja, kuten materiaaleja, joita on lueteltu yksityiskohtaisemmin alan kirjallisuudessa (katso US-patenttijul-30 kaisu 4 193 983, palstat 7-11, joka mainitaan tässä viitteenä), voitaisiin käyttää tämän keksinnön tarjoamien homogeenisten fluoresenssimääritysmenetelmien yhteydessä.

Detektointimekanismit Käytettäessä edellä kuvattua tyyppiä olevaa vesiliu-35 koista harvinaisen maametallin kelaattia tämän keksinnön mukaisissa homogeenisissa määrityksissä, se kytketään spe- i 16 93997 sifisesti sitoutuvaan - joko vasta-aineen tai kohteen kaltaiseen - reagenssiin ja yhdistetään vesisubstraatissa spesifisen sitoutumisparin toiseen puoliskoon, jolla itsellään on kyky tai joka on kytketty ryhmään, jolla on kyky muut-5 taa harvinaisen maametallin kelaatin fluoresenssiemissiota, kun spesifinen sitoutumisreaktio on tapahtunut ja tuonut fluoresoivan kelaatin ja fluoresenssia muuttavan ryhmän lähelle toisiaan. Jäljempänä esitetään joukko edustavia ja uskoaksemme uusia analyysimekanismeja, jotka tämän keksinkö non soveltaminen mahdollistaa.

Energiansiirtovaimennus:

Eräässä suoritusmuodossa fluoresenssia muuttava ryhmä voi olla ryhmä, joka saa aikaan energiansiirron fluoresoivaan kelaattiin tai pois siitä, jolloin kelaatin fluoresens-15 si voimistuu tai vaimenee.

Energiaa siirtäviin fluoresenssia muuttaviin ryhmiin kuuluvat sellaiset materiaalit kuin fluoresenssia vaimentavat metalli-ionikompleksit, jotka vetävät energiaa pois harvinaisen maametallin kelaatista saatettuina hyvin lähel-20 le sitä ja heikentävät siten sen fluoresenssia. IV ryhmän siirtymämetallien kompleksit, esimerkiksi mangaani-, ko- 2 + boltti-, rauta- ja nikkelikompleksit, kuten Co -termoly-2 + siini- tai Fe -transferriinikompleksit, saavat aikaan tämän vaikutuksen joutuessaan fluoresoivan harvinaisen maa-25 metallin kompleksin, kuten terbiumkelaatin, lähelle. Muillakin yhdisteillä voi olla tämä sammutusominaisuus. Tyypillisiä esimerkkejä tällaisista aineista ovat rodamiinit, esimerkiksi rodamiini B (Rh.B); substituoidut fluoreseiinit, esimerkiksi symmetrisesti substituoitu dieetterifluorese-30 iini; fykobiliproteiinit ja muut sammuttavat ryhmät, jotka täyttävät yleisen vaatimuksen, joka koskee niiden absorptio-vyöhykkeiden hyvää päällekkäisyyttä fluoroforin emission kanssa. Nämä sammuttavat materiaalit voivat olla itse fluoresoivia, mutta aallonpituudella ja aikana, joka on erotet-35 tavissa aallonpituudesta ja ajasta, jolla harvinaisten maametallien kelaatit fluoresoivat.

. . * 17 93997 Tällaiset sammuttavat ryhmät voidaan kiinnittää vasta-aineen tai kohteen kaltaisiin ryhmiin, niin että ne ottavat osaa biospesifisiin reaktioihin kvantitatiivisesti määritettävän spesieksen kanssa ja tulevat biospesi-5 fisten reaktioiden kautta saatetuiksi sopivan lähelle fluoresoivaa kelaattia, jolloin saadaan aikaan sammutus.

Tämän sammutusmekanismin eräänä suoritusmuotona Rh.B voidaan saattaa vuorovaikutukseen vesiliukoisen fluoresoivan harvinaisen maametallin kelaatin, esimerkik-10 si terbiumkelaatin, kanssa. Kuten D. D. Thomas et ai.

[Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 75 (1978) 5746 - 50] huomauttavat, kun Rh.B on keskimäärin 6,57 nm:n etäisyydellä fluoresoivasta terbiumkelaatista aikana, jolloin kelaatti on virittyneessä tilassaan, 50 % kelaatin fluoresenssista 15 häviää. Etäisyydet suunnilleen 2,0 nm olisivat samoin tehokkaita, kun on kyseessä IV ryhmän metallin kompleksin aikaansaama harvinaisen maametallin kelaatin fluoresenssin sammutus.

Tämäntyyppisiä funktionaalisten ryhmien välisiä 20 etäisyyksiä saavutetaan spesifisissä sitoutumisvuorovai-kutuksissa. Vasta-aineiden mitat ovat tyypillisesti noin 3,5 x 6,5 nm (Fab-fragmentit) ja 4,0 x 4,0 nm (Fc-frag-mentit) (Day, E. D., Advanced Immunochemistry, Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md. 1972, 108). Tämä tarkoit-.· 25 taa sitä, että jos muutamia rodamiiniväriaineryhmiä lii tetään vasta-aineeseen, on ainakin yksi rodamiiniryhmä kyllin lähellä sammuttaakseen ainakin osittain biospesi-fisen parin toiseen jäseneen kytketyn fluoresoivan harvinaisen maametallin kelaatin fluoresenssin.

30 Energiansiirron kautta tapahtuva sammutus riippuu tekijästä (r/R0)'6, jossa r on luovuttajan ja vastaanottajan välinen todellinen etäisyys ja R0 on siirtohyöty-suhdetta 50 % vastaavat etäisyys. Niinpä sammutushyöty-suhteen suurentamiseksi 50 %:sta 99 %:iin sammuttaja tu-35 lee tuoda noin 3,06 nm:n etäisyydelle kelaatista. Tämä on kohtuullisesti saavutettavissa oleva etäisyys vasta-aine - antigeeni tai muun biospesifisen reaktion mittakaavassa.

18 93997 Tämä etäisyys määritellään seuraavasti:

Kt = K0 (r/R0)'6 5 jossa Kt on energiansiirron nopeusvakio ja KQ on virittyneen luovuttajan vaimenemisen nopeusvakioiden summa vastaanottajan poissa ollessa.

Siirtohyöty suhde = Kt/(Kt + Kc) 10 Kt/(Kt + KJ = 0,99 ja Kt = 100 K0. Tämän arvon Kt saamiseksi lasketaan r riippuvuussuhteesta (r/R0)-6, jolloin 15 Kt/K0 = 100 = (R/R0 )'6 (r/R0)_1 = (100)1/6 * 2,15, mikä tarkoittaa, että jos luovuttajan ja vastaanottajan välinen etäisyys on 6,57/0,215 nm, tapahtuu energian 20 99-%:inen siirtyminen luovuttajalta vastaanottajalle, ja luovuttaja sammuu 99-%:isesti. Tämäkin mitta on saavutettavissa biospesifisessä reaktiojärjestelyssä, niin että tällaiset suuret sammutushyötysuhteet ovat saavutettavissa. Kuten edellä mainittiin, on myös mahdollista, että 25 biospesifisesti reagoivassa ryhmässä on läsnä useampia kuin yksi sammuttava ryhmä. Tällaisessa tapauksessa sammutuksen saa käytännössä aikaan joukko sammutusryhmiä, ja sammutus on kaikkien yksittäisten ryhmien aikaansaamien sammutusvaikutusten summa. Tämä on hyvin merkittävä, 30 vaikka biospesifinen reaktio ei toisikaan yhtään yksittäistä ryhmää juuri 2,0 - 3,0 nm:n etäisyydelle, kunhan biospesifinen reaktio tuo sammuttajan suhteellisen lähelle.

Ymmärrettäneen myös, ettei edellä kuvattu 99-%:inen 35 sammutus ole millään tavoin tämän keksinnön menestyksellisen toteuttamisen edellytys ja että määritys olisi edelleen .. mahdollinen, kunhan tapahtuu mitattavissa ole fluoresens- ♦ sin väheneminen AbL- ja Tl-molekyylien sitoutuessa.

19 93997

Tulisi ymmärtää, että edellä esitetyt ovat vain esimerkkejä sammutusjärjestelmistä ja että muitakin järjestelmiä, joissa käytetään tässä kuvattuja kelaatin erityisominaisuuksia, voidaan käyttää yhtä hyvin. Eräänä esimerkkinä 5 homogeenisesta määrityksestä, jossa käytetään tätä sammu-tusperiaatetta, kohteen kaltainen molekyyli, TL, leimataan fluoresoivalla terbiumkelaatilla ja laitetaan vesiliuokseen, joka sisältää tuntemattoman määrän kohdemolekyylejä. Näiden annetaan kilpailla ennalta määrätystä määrästä Rh.B 10 leimattuja kohteen vasta-aineita. Fluoresenssi mitataan ennalta määrätyn inkubointiajan kuluttua. Kohdemateriaalin määrän tuntemattomassa näytteessä ollessa suuri sammutus on vähäistä ja päin vastoin. Sitoutumiskäyrä, jossa korrelaatio on käänteinen, voidaan muodostaa ja käyttää sitä 15 standardikäyränä tavanomaisella tavalla.

Eräänä suorana seurauksena stabiilin liukoisen harvinaisen maametallin kelaatin käytöstä parin fluoresoivana jäsenenä on mahdollisuus helposti soveltaa fluoresoivan taustan torjumista fluoresenssimittausvaiheeseen. Tähän 20 liittyy sykäyksittäisen virityksen käyttö ja harvinaisen maametallin pitkäikäisen fluoresenssin tarkkailun viivyttäminen, kunnes taustan fluoresenssi on vaimentunut. Tämä johtaa suurempaan herkkyyteen, kuin mitä on saavutettavissa aiemmilla homogeenisilla fluoresenssinsammutusmäärityk-25 sillä, koska pienetkin harvinaisen maametallin kelaatin emittoiman fluoresenssin vaihtelut voidaan mitata tarkasti, sillä oleellisia häiriötekijöitä ei taustan torjunnan ansiosta ole mukana.

Tulisi huomata, että koska vasta-aineella (tai vasta-30 aineen kaltaisella molekyylillä) voi olla useita ligandeja (sammuttavia tai fluoresoivia) siihen kiinnittyneinä, määritys toimii paremmin sammuttajien ollessa vasta-aineen kaltaisissa molekyyleissä, niin etteivät reaktion osallistumattomat sammuttajat lisää mitään taustaan. Jos fluoresoi-35 ja olisi vasta-aine- tai vasta-aineen kaltaisissa molekyyleissä, reaktioon osallistumattomat fluoresoijat aiheuttai- 20 9 3 9 9 7 sivat fluoresenssitausta, joka täytyisi vähentää. Vaikka tämä on periaatteessa mahdollista, on selvästi edullista, että vasta-aineen kaltaiset molekyylit sisältävät sammuttajia eivätkä fluoresoijia.

5 Eräs edellä mainittu fluoresoivan kelaatin ja sam muttajan yhdistelmä koostuu alla esitetyistä tetraetikka-haposta I ja rodamiinista II.

Θ 10 i Θ 0 * C°2” \ N......... Tb «Miilu M / J, N,/ 1 jL j.

i / % i (CH K

20 0 0 II

Eräs toinen fluoresoija-sammuttajayhdistelmä koostuu-substituoidun fenantroliinitetraetikkahapon terbiumkelaatis- 25 ta III ja rodamiini B:stä.

<O> 30 X™\—™ 0¾¾ x n · ; *··. n

V V

o o

II

III

21 93997

Kolmas esimerkki fluoresoija-sammuttajayhdistelmästä olisi tetrahappo I yhdistettynä vasta-aineeseen kytkettyyn sammuttajaan, jolla on kaava, 5 Γ®

NH

?°2

10 O

j©Vl (Et)2N^-^ ^^N+(Et)2 X- 15

Energiansiirtoaktivointi:

Keksinnön mukainen homogeeninen määritysmenetelmä voi toimia myös "kirkastumis"- eli "aktivointi"-mallilla, jossa käytetään harvinaisen maametallin kelaattia, jolla koh-20 teen tai vasta-aineen kaltaiseen ryhmäänsä kiinnitettynä on oleellisesti vähentynyt fluoresenssi käytettävällä eksi-taatioaallonpituusalueella. Harvinaisen maametallin sitou- tumisvakion ligandiin tulee tässä kelaatissa olla suurempi 13 -1 kuin noin 10 M , niin ettei metalli irtoa suurimmilla-25 kaan laimennussuhteilla eikä missään määritysolosuhteissa. Eräs esimerkiksi käyttökelpoisten kelatoituvien ligandien ryhmästä, jolla on nämä ominaisuudet, ovat pyridyylitetra-hapot, joita kuvataan edellä mainitussa Halen ja Solasin US-patenttihakemuksessa. Molekyyli, joka koostuu kohteen 30 kaltaisesta ryhmästä kytkettynä tällaiseen tetrahappoon ja joka sisältää harvinaisen maametalli-ionin, voidaan virittää vasta-aineen kaltaiseen sitoutumiskumppaniinsa sitoutumisen jälkeen itse vasta-aineen kaltaisesta ryhmästä tai siihen kiinnitetystä aktivointiryhmästä absorboituneel-35 la energialla. Tällainen kelaatti voidaan aktivoida eli saattaa "kirkastumaan" saattamalla se biospesifisen reak- 22 93997 avulla lähelle aktivaattoriryhmää, joka pystyy siirtämään siihen energiaa.

Tämä positiivinen energiansiirto voidaan saada aikaan kummalla tahansa kuvissa 1 ja 2 esitetyistä eksitaa-5 tiomekanismeista. Perinteisesti on katsottu, että energiansiirto eksitoivista ligandeista harvinaisiin maame-talleihin tapahtuu aktivoivassa ryhmässä olevan singletin (S) kautta, joka siirtää energiaa molekyylin sisäisesti aktivoidussa ryhmässä olevaan triplettiin (T), joka puo-10 lestaan siirtää energiaa molekyylien välisesti metalliin, joka sitten luovuttaa energiaa fluorenssin muodossa [Heller ja Wasserman, J. Phys. Chem. 42 (1965) 949]. Tämä singletti-tripletti-metalli- eli "S-T-M"-reitti esitetään kaavamaisesti kuviossa 1. S-T-M-menetelmällä, vaikka se 15 teoriassa on käyttökelpoinen, on keksinnön mukaisessa järjestelyssä se haittapuoli, että eksitoivan ryhmän ja eksitoitavan ryhmän välisen etäisyyden tulee olla hyvin pieni - suuruusluokkaa 0,5 nm. Tämä on suora seuraus siitä tosiasiasta, että energiansiirtohyötysuhdetta 50 % 20 vastaava etäisyys "R0" on verrannollinen lausekkeeseen (Q0)1/6 jossa Q0 on kvanttihyötysuhde ja triplettien ollessa kyseessä Q0 on 10*6 tai pienempi. Jotta tämä mekanismi olisi todella tehokas, tulee energiansiirtokumppa-neiden etäisyyden siten olla pienempi kuin tavanomaiset 25 etäisyydet, joita esiintyy vasta-aineiden ja antigeenien välisissä vuorovaikutuksissa ja muissa biospesifisissä reaktioissa.

Nyt on havaittu, että voidaan käyttää erästä toista aktivointi- eli "kirkastus"energiansiirtomekani-30 smia. Tässä mekanismissa energiaa siirretään luovuttajas- sa olevasta singletistä vastaanottajassa olevaan singlet- tiin, sitten vastaanottajassa olevan triplettiin ja lopuksi metalliin. Tämä S-S-T-M-mekanismi esitetään kuviossa 2, ja se on edullinen, koska molekyylien välinen siir-35 to on siirto, jossa Rc-arvot voivat olla suuruusluokkaa 5,0 nm, jollaisia etäisyyksiä esiintyy normaalisti bios-.·' pesifisissä reaktioissa.

23 93997

Taulukossa 1 esitetään esimerkkejä liukoisen ja stabiilin harvinaisen maametallin kelaatin ja energialuovutta-jan muodostamista pareista, joilla voidaan saada aikaan tämä aktivointi- eli kirkastusmekanismi.

5 Taulukko 1

Harvinaisen maametallin kelaatti_Aktivaattori_

Tetrahapon, jolla on kaava Antiteofylliinivasta- aine

Ar-(R) CH2-COOH

/-Λ-\ ^CH -COOH

/\-J CH2-COOH

R' R"

1 5 ^“-CH -COOH

2 jossa yksi ryhmistä R sisältää teofylliiniä, kelaatti harvinaisen maametallin kanssa 20 Edellä olevan kaavan mukainen Vasta-aine, joka sisäl- harvinaisen maametallin kelaatti tää rakenteessa sopivas ti sijaitsevan tyrosii-ni- tai tryptofaaniryh-män

25 L-T Ab-L-NH-CH -CH -CO-NH

JL 2 2 I

y φ ^ ώ.

N. OH .N

” r vn CV CV CV co2- 24 93997 Tällaisissa järjestelmissä kelaatin ja aktivaattorin ollessa vesiliuoksessa biospesifinen reaktio saattaa aktivaattorin ja kelaatin asinamukaiselle etäisyydelle aktivoitumisen eli "kirkastumisen" aikaansaamiseksi, ja fluo-5 renssin määrä on siten biospesifisen reaktion määrän mittana. Siten tässäkin tapauksessa analyysisekvenssit, joihin liittyy biospesifisen parin puoliskon ja tutkittavassa nesteessä olevan analysoitavan aineen välinen kilpailu pari toisesta puoliskosta, voivat tarjota keinon analy-10 soitavan aineen pitoisuuden mittaamiseksi.

Metallin siirto:

Vesiliukoiset harvinaisten maametallien kelaatit voidaan saattaa osallistumaan homogeenisiin määrityksiin myös käyttämällä ligandien välinen metallin siirto -mekanismia.

15 Keksinnön tämä puoli koskee menetelmää, jossa kohteen kaltaisen molekyylin ja vasta-aineen kaltaisen molekyylin välisen spesifisen sitoutumisreaktion tapahtuminen johtaa harvinaisen maametallin siirtymiseen suoraan spesifisen sitou-tumisparin jäsenestä toiseen. Tämä siirtyminen johtaa har-20 vinaisen maametallin ympäristön muuttumiseen, joka havaitaan muutoksena sen fluoresenssiominaisuuksissa, joka mitataan käyttämällä US-patenttijulkaisussa 4 058 732 esitettyä fluoresoivan taustan torjumismenetelmää.

Jotta saataisiin aikaan tämä metallin siirtyminen ja 25 siihen liittyvä fluoresenssin muutos, sitoutumisparin toinen jäsen kytketään ensimmäiseen kelatoituvaan ligandiin sopivan siltaryhmän tai funktionaalisen ryhmän kautta. Sitoutumisparin toinen jäsen kytketään vastaavasti toiseen kelatoituvaan ligandiin. Biospesifisen reaktion tapahtumi-30 nen saattaa nämä kaksi ligandia lähelle toisiaan, niin että voi tapahtua harvinaisen maametallin siirtyminen suoraan kelaattirakenteesta toiseen. On tunnettua, että metallit voivat siirtyä kelatoituvasta ryhmästä toiseen /Bates et ai., J. Biol. Chem. 242 (1967) 2810_7, erityisesti sellai-35 seen, jonka sitoutumisvakio on suurempi, ja tämän prosessin nopeusvakioita on mitattu. Eräissä muissa tutkimuksissa

II

93997 25 /Margerum et ai., J. Amer. Chem. Soc. 87 (1965) 4463_7 on havaittu, että EDTA-tyyppisten kelaattien metallin korvautuminen toisella metallilla, jonka sitoutumisvakio on suurempi, etenee vaiheittain, jolloin koordinoituvien ryhmien 5 irtoamista ensimmäisestä metallista seuraa niiden koordinoituminen toiseen metalliin. Tämä merkitsee, että korvautumisen aikana muodostuu tietyksi ajaksi ternaarinen kompleksi, joka sisältää molempia metalleja. Kahden ligandin kilpaillessa yhdestä metallista on vastaavasti odotettavis-10 sa, että muodostuu väliaikainen ternaarinen kompleksi, mikä edellyttää, että siltaryhmien tai funktionaalisten ryhmien, jotka kytkevät kunkin kelatoituvan ryhmän sitä vastaavaan sitoutumisparin jäseneen, tulee olla kyllin pitkiä ja taipuisia mahdollistaakseen näiden kahden ligandin välisen 15 kontaktin, kun sitoutumisreaktio on tapahtunut. Tämä mekanismi vaatii, että tapahtuu metallin todellinen siirtyminen kelaatista toiseen. Tämä on erotettavissa alalla käytettävistä menetelmistä, joissa metalli kompleksoidaan, vapautetaan kompleksista liuokseen muuttamalla pH:ta tms.

20 tavalla ja kompleksoidaan sitten uudelleen toisen ligandin kanssa.

Kummallakin näistä ligandeista on tässä tarvittava kyky muodostaa vesiliukoisia stabiileja komplekseja. On tärkeää korostaa tässä järjestelyssä käytettävien kahden 25 kelaatin stabiiliusominaisuutta. Kummankin kelaatin täytyy olla riittävän luja pitääkseen metallin kiinnittyneenä hyvin laimeissa liuoksissa ja seerumin komponenttien tms., jotka voisivat kilpailla metalli-ioneista, läsnä ollessa.

Tässä mekanismissa toisella ligandilla, ts. vastaan-30 ottavalla ligandilla, tulee olla kyky muodostaa harvinaisen maametallin kanssa kompleksi, joka on stabiilimpi kuin kompleksi ensimmäisen luovuttavan ligandin kanssa. Nämä stabiilisuudet eroavat toisistaan edullisesti vähintään noin yhden kertaluvun verran ja edullisemmin vähintään kah-35 den kertaluvun verran. Numeerisesti ilmaistuna • · 26 93997 logK^^T - log K = vähintään 1 ja edullisesti BC 2. BC1 vähintään 2, jolloin Κ_.0_ on metallin ja ligandin välinen stabiilisuus-BC Z.

vakio muodostuvc.ssa kelaatissa ja K . on vastaava vakio

BC I

5 metallin luovuttavassa kelaatissa.

Tämä mekanismi voi toimia sammutusanalyysissä tai voimistusanalyysissä ensimmäisen ja toisen kelaatin välisen fluoresenssimuutoksen detektoitavan mukaan. On yleensä edullista, että toinen kelaatti on voimakkaammin fluoresoi-10 va helpommin detektoitavissa olevan voimistusanalyysin aikaansaamiseksi. Kuten aiemmin mainittiin, voi myös olla edullista, että biospesifisten ryhmien ja vastaavien funktionaalisten ligandiryhmien välissä on väliryhmiä tai -ketjuja vastaanottavan ligandin ja luovuttavan kelaatin 15 saamiseksi lähelle toisiaan.

Yhteenvetona voidaan todeta, että ensimmäisen ligandin edullisia ominaisuuksia ovat kyky muodostaa kelaatte-ja, jotka ovat suhteellisen fluoresoimattomia viritettyinä kyseisellä aallonpituusalueella ja kyky sitoa harvinai-20 nen maametalli-ioni kyllin lujasti pitääkseen sen kiinnittyneenä analyysiolosuhteissa, joissa laimennusaste on suuri ja läsnä on seerumin komponentteja. Toisen ligandin tulisi edullisesti muodostaa metallikelaatteja, jotka ovat voimakkaasti fluoresoivia ja sitovat metallin sitoutumis-25 vakion ollessapaljon suurempi kuin ensimmäisellä ligandil-la. Funktionaalisten siltaryhmien, jotka kytkevät ligandin sitoutumisparin vastaaviin osiin, yhteispituuden tulee lisäksi olla riittävä hyvän kontaktin mahdollistamiseksi sitoutumisreaktion jälkeen.

30 Vaikka kumpi tahansa ligandi voidaan kytkeä kumpaan tahansa sitoutumisparin jäseneen, kytketään edullisissa suoritusmuodoissa ensimmäinen ligandi kohteen kaltaisiin molekyyleihin, ja se kelatoi merkkiaineena olevan harvinaisen maametalli-ionin, kun taas toinen ligandi kytketään 35 vasta-aineen kaltaisiin molekyyleihin. Pienet kohteen kaltaiset molekyylit kytketään yleensä yhteen ensimmäiseen 27 93997 ligandiin; suuremmat analysoitavat molekyylit voidaan leimata useammalla ryhmällä. Vasta-aineen kaltaiset molekyylit leimataan yleensä muutamalla toisella ligandilla. Im- muunimäärityksissä käytettävien pitoisuuksien (suuruus-_8 5 luokkaa 10 mol/1 tai pienempiä) vallitessa metallin siirtyminen ensimmäisestä ligandista toiseenligandiin olisi hyvin hidas prosessi sitoutumisparin jäsenten välisen spesifisen sitoutumisreaktion poissa ollessa. Kyseisen ensimmäisen ja toisen ligandin muodostaman parin, jossa ligan-10 dit eivät ole liittyneinä kohteen tai vasta-aineen kaltaisiin molekyyleihin, havaittiin itse asiassa vaativan useita tunteja, jotta tapahtuisi detektoivissa oleva me- -9 tallin siirtyminen pitoisuuden ollessa 10 mol/1, jolloin siirtyminen riippuu diffuusiosta ja sattumanvarai- —5 15 sista törmäyksistä, kun taas pitoisuudessa 10 mol/1 ja suuremmissa pitoisuuksissa metallin siirtymiset tapahtuivat nopeasti. Siten analysoitavan kohteen määrityksessä ensimmäisen kelaatilla leimatun kohteen kaltaisen molekyylin spesifinen sitoutuminen toiseen kelaatilla leimattuun 20 vasta-aineen kaltaiseen molekyyliin saa aikaan paikallisesti korkean tehokkaan pitoisuuden, joka johtaa metallin siirtymiseen toiseen kelaattiin ja siihen liittyvään fluo-resenssiemission voimistumiseen.

Analysoitavan kohdemolekyylin määrityksen perustana 25 on siten kohdemolekyylien, joiden pitoisuutta ei tunneta, ja leimattujen kohteen kaltaisten molekyylien välinen kilpailu sitoutumisesta leimattuihin vasta-aineen kaltaisiin molekyyleihin. Tämä kilpailu tapahtuu inkubointijakson aikana, ja fluoresenssi luetaan sitten suoraan, ilman mitään 30 erotusvaihetta käyttämällä US-patenttijulkaisussa 4 058 732 kuvattuja fluoresoivan taustan torjumista koskevia periaatteita.

Tyypillisinä erityisinä ligandisuoritusmuotoina, jotka voivat osallistua tähän metallinsiirtomekanismiin, voi-35 daan käyttää seuraavia: » 28 93997

Luovuttava harvinaisen Vastaanottava maametallin kelaatti ligandi_

Trihapon, jolla on kaava, Vasta-aineeseen kyt- 5 ketty fenantroliini- te trae tikkahappo

HOOC-CH^ CH2-COOH

N-R-N

T-L-OC-CH^ ^CH2~COOH

10 jossa T on kohteen kaltainen molekyyli ja L on US-patenttijulkaisun 4 352 751 mukainen siltaryhmä, kelaatti harvinaisen maametallin 15 kanssa.

Edellä olevan trihapon kelaatti Vasta-aineeseen kyt- harvinaisen maametallin kanssa fenyylipyridiini- tetraetikkahappo 20

Sekaligandimekanismit: Tämä mekanismi, jossa käytetään kahta kelatoituvaa li-gandia. Ensimmäinen ligandi muodostaa stabiilin vesiliukoisen kompleksin harvinaisen maametallin kanssa. Tämän en-25 simmäisen kelaatin tulisi olla suhteellisen epäherkkä kiinnostuksen kohteina olevilla aallonpituuksilla tehtävälle eksitaatiolle, niin että se on suhteellisen fluoresoimaton. Ensimmäisen ligandin tulisi myös olla ominaisuuksiltaan sellainen, ettei se käytä metallin kaikkia koordinaatipaikko-30 ja ja mahdollistaa siten myös toisen ligandin koordinoitu-inisen. /Katso F. R. Haddad, TALANTA 1 (1977) 1 - 13.7 Toi sella ligandilla tulisi olla kyky koordinoida nämä harvinaisen maametallin jäljellä olevat paikat, vaikka metalli onkin jo kiinni ensimmäisessä ligandissa, ja muodostaa si-35 ten kompleksi, jolla on voimistunut fluoresenssi halutul-aalonpituusalueella.

29 93997 Tämä metallin jakautuminen kahden ligandin kesken tapahtuu suuressa määrin vain silloin, kun vasta-aineen kaltaisten ja kohteen kaltaisten ryhmien, joihin ligandit ovat kiinnittyneinä, välinen biologisesti spesifinen reaktio 5 saattaa ligandit lähelle toisiaan. Detektoitu muutos fluo-resenssiominaisuuksissa on siten mitta biospesifisen reaktion määrästä. Samoin kuin metallinsiirron yhteydessä ligandit voidaan liittää biospesifisiin ryhmiin väliryhmien tms. kautta, jotta saadaan aikaan näiden kahden ligandin 10 sopiva etäisyys harvinaisen maametallin kompleksoimiseksi.

Tämä mekanismi erityissuoritusmuotoina voidaan käyttää edellä kuvattuja diamiinitrihappokelaatteja tai di-ja triamiinitetrahappokelaatteja, joita kuvattiin edellä ensimmäisenä kelaattina. Vasta-aineeseen kytketty substi-15 tuoitu dipikoliinihappo voi toimia toisena ligandina. Nämä suoritusmuodot ovat vain tyypillisiä esimerkkejä. Muita vastaavia materiaaleja voitaisiin käyttää yhtä hyvin.

Tämä mekanismi on suurelta osin sama kuin metallinsiirron ollessa kyseessä; erona on se, että molemmat ligan-20 dit pysyvät kompleksissa yhdistyneinä harvinaiseen maametallin tässä tapauksessa, kun taas metallinsiirron ollessa kyseessä ensimmäinen ligandi on vapaana metallista siirron tapahduttua.

Keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavin esimerkein. 25 Ne annetaan keksinnön toteuttamisessa käyttökelpoisten edustavien materiaalien valmistuksen kuvaamiseksi ja keksinnön erilaisten tyypillisten suoritusmuotojen valaisemiseksi, eikä niitä tule pitää keksinnön piiriä rajoittavina.

Esimerkki 1 30 Aryylisubstituoitujen pyridiiniligandien valmistus Tämän esimerkin mukaista menetelmää, joka perustuu Halen ja Solasin US-hakemuksen 712 774, käytetään valmistettaessa joukko aryylisubstituoituja pyridyylitetrahappo-ligandeja. Näillä ligandeilla on yleinen rakenne, 30 93997

Ar-(R)n,, ^CH2-COOH

\ ^ CH -COOH

Lo>

^ CH2 COOH

R' R ‘ ' ( CH )—;- c 2 n

CH-COOH

2 jossa n ja n' ovat riippumattomasti kokonaislukuja 1 tai 2, Ar on aryyli, n" on kokonaisluku, joka on yhtä suuri kuin ryhmän Ar käytettävissä olevien sitoutumiskohtien lukumää-10 rä, ja kukin ryhmistä R, joita on n" kpl, R' ja R" on riippumattomasti edellä esitetty ryhmä ja erityisesti vety, alkoksyyli, amiini tai isotiosyanaatti. Eräässä esimerkinomaisessa valmistuksessa toteutetaan seuraavat reaktiot: A. 1,5-di(2-furyyli)-3-fenyyli-1,5-pentaanidioni 15 Bentsaldehydi (62,6 g, 60 ml, 0,49 mol), 85-%:inen 2-asetyylifuraani (165 g, 150 ml, 1,27 mol) ja 85-%:inen kaliumhydroksidi (35 g, 0,53 mol) saatetaan reagoimaan lämpötilassa 60 °C. Reaktion jälkeen otetaan talteen kiteinen tuote. Pentaanidionisaanto 103,5 g eli 57,3 %.

20 B. 4-fenyyli-2,6-di(2-furyyli)pyridiini 1,5-di(2-furyyli)-3-fenyyli-1,5-pentaan-dionia, 143 g hydroksyyliamiinihydrokloridia, 129 g, Aldrich 102 337, n-butanolia, 1,600 ml, Sigma 13F-5070

Vaiheessa A valmistettu "dioni", hydroksyyliamiini 25 ja butanoli yhdistetään, refluksoidaan sekoittaen, jäähdytetään, ja sekoitetaan noin 60 tuntia. Tuloksena oleva musta liuos käsitellään, jolloin saadaan noin 79 g kiteistä tuotetta.

C. 4-fenyyli-2,6-pyridiinidikarboksyylihappo 30 Vaiheen B difuryylipyridiinituote hapetetaan perman- ganaatilla.

Vaiheen B tuotetta, 23 mmol KMn04:a, 45,4 g t-butanolia, 1 500 ml 35 Vettä 300 ml 31 93997

Vaiheen B tuote lisätään t-butanoliin. Seos kuumennetaan sekoittaen, lisätään H~0 ja sitten KMnO. annoksittain noin 30 minuutin aikana lämpötilassa 75 °C. Seosta refluk-soidaan 90 min. Tuote käsitellään, jolloin saadaan halut- 5 tua kiteistä 4-fenyyli-2,6-pyridiinidikarboksyylihappoa.

Tuloksena oleva dikarboksyylihappo on itsessään sopiva li-gandiksi harvinaisten maametallien vesiliukoisten kelaattien muodostuksessa sekä myös välituotteena tässä reaktiosarjas-sa.

10 D. 4-fenyyli-2,6-pyridiinidikarboksamidi 4-fenyyli-2,6-pyridiinidikarboksyylihappoa, 21,5 mol Oksalyylikloridia, 4,8 ml Metyleenikloridia, 80 ml Dimetyyliformamidia, 5 pisaraa 15 Pyridiinidikarboksyylihappo lisätään Cl^C^siin ja DMF:iin. Pullo suljetaan CaSO^-kuivausputkella ja jäähdytetään jäissä. Lisätään vaiheittain oksalyylikloridi. Tuloksena oleva liuos konsentroidaan ja lisätään 28-%:iseen NH.OH:iin 5-10 minuutin aikana sekoittaen, sekoitetaan 4 20 1 tunti, suodatetaan, pestään vedellä ja kuivataan, jol loin saadaan haluttua amidia.

E. 4-fenyyli-2,6-pyridiinikarbonitriili 4-fenyyli-2,6-pyridiinidikarboksamidia, 17,5 mmol p-dioksaania, 170 ml 25 Pyridiiniä, 11,3 ml ’* Trifluorietikkahappoanhydridiä, 11,0 ml

Ensimmäiset kolme aineosaa yhdistetään, ja jäähdytetään seos lämpötilaan 10 °C. Lisätään anhydridi, ja seosta sekoitetaan kaksi tuntia huoneen lämpötilassa. Tulokse- 30 na oleva tummaliuos käsitellään, jolloin saadaan haluttua dikarbonitriiliä.

F. 4-fenyyli-2,6-di(aminometyyli)-pyridiini 4-fenyyli-2,6-pyridiinidikarbonitriiliä, 13,5 mmol Etanolia, joka sisältää 2 % HClO^:a, 370 ml 35 10 % palladiumia hiilellä, 3,7 g • · 32 93997

Nitriili suspentoidaan etanolin ja HC10^:n seokseen. Lisätään katalysaattori, ja järjestelmän paine nostetaan arvoon 276 kPa vedyllä. 30 minuutin kuluttua otetaan talteen keltainen kiinteä aine saostamalla, ja liuotetaan se 5 veteen ja NaOH:iin. Tuloksena oleva vapaa amiini otetaan talteen tummana öljynä.

G. 4-fenyyli-2,6-bis/N,N-di(metoksikarbonyylimetyy-li) -aminometyyli_7-pyridiini

Vaiheen F amiinia, 12,0 mmol 10 1,8-bis(dimetyyliamino)-naftaleenia, 10,3 g

Metyylibromiasetaattia, 7,35 g Asetonitriiliä, 130 ml

Emäs, amiini ja asetonitriili sekoitetaan keskenään. Sitten lisätään joukkoon pisaroittain metyylibromiasetaat-15 ti. Kun seosta on pidetty noin 16 tuntia suunnilleen lämpötilassa 45 °C, tuote käsitellään, jolloin saadaan haluttua esteriä.

H. Tetraesterin saippuointi

Vaiheessa G saatu tetraesteri saippuoidaan seoksessa, 20 joka sisältää metanolia ja vettä suhteessa 1:1 ja ^CO^ra. Liuoksen pH säädetään arvoon 7, ja se kuivataan, jolloin saadaan haluttua tetrahappoligandia. Muissa valmistuksissa toistetaan tämä menettely, mutta käytetään eri aldehydejä, jolloin muodostuu eri tetrahappoja.

25 Esimerkki 2

Diamiinitrihappojen valmistus Nämä materiaalit valmistetaan US-patenttijulkaisussa 4 352 751 esitellyllä menetelmällä.

Esimerkki 3 30 Fenantroliinitetrahappoligandien valmistus Nämä materiaalit valmistetaan EP-hakemuksessa 0 068 875 (Eastman Kodak) kuvatulla menetelmällä.

33 93997

Esimerkki 4

Homogeeninen määritys, jossa fluoresenssia voimistetaan energiansiirrolla A. 2,6-bisZN,N-di(karboksimetyyli)aminometyyli/-4-5 (4-nitrofenyyli)-pyridiinitetrametyyliesteri

Savuava typpihappo (0,03 ml, 0,4325 mmol) lisätään huoneen lämpötilassa trifluorimetaanisulfonihapon liuokseen metyleenikloridissa (4 ml). Kun on sekoitettu 5 minuuttia, lisätään hitaasti lämpötilassa 0 °C liuos, joka 10 sisältää 2,6-bis-/N,N-di(karboksimetyyli)aminometyyli7-4-fenyylipyridiinitetrametyyliesteriä, kuten esimerkin 1 kohdassa G valmistettua tuotetta, (86 mg, 0,173 mmol) pienessä määrässä metyleenikloridia. Tämän liuoksen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan, ja jatketaan sekoitusta yksi 15 tunti. Sitten reaktioseos kaadetaan jäille, ja seos neutraloidaan natriumkarbonaatilla. Uuttamalla metyleeniklo-ridilla, kuivaamalla sitten natriumsulfaatilla ja haihduttamalla saadaan 90 mg raakatuotetta.

B. 2,6-bis/N,N-di(karboksmetyyli)-aminometyyli/-4-20 (4-aminofenyyli)-pyridiinitetrametyyliesteri

Edellä mainistussa rekatiossa saatu raakatuote (90 mg, 0,17 mmol) liuotetaan etanoliin (13 ml). Lisätään 10 mg 10 % Pd/C-katalysaattoria, ja seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa vedyn paineessa 100 kPa yksi tunti. Ka-25 talysaattori poistetaan suodattamalla, ja liuotin haihdu- < tetaan, jolloin saadaan 60 mg 4-aminoyhdistettä. 3-amino-yhdiste (51 mg) valmistetaan samalla tavalla vastaavasta 3-nitroyhdisteestä (70 mg, 0,129 mmol). Nämä tai saman kaltaiset aryylipyridiinit, joiden aryylirenkaissa on 30 amiinisubstituentteja, voidaan saattaa reagoimaan tiofos-geenin kanssa, jolloin amiini muuttuu isotiosyanaatiksi, joka puolestaan voi kytkeytyä amiinipitoisiin kohdemole-kyyleihin tms.

« 34 93997 C. 2, 6-bis/N,N-di (karboksimetyyli) aminometyyli_7-4-(4- ja 3-aminofenyyli)-pyridiinitetrametyyliestereiden kytkeminen teofylliini-8-voihappoon

Isobutyyliklooriformiaatti (0,02 ml, 0,117 mmol) lisä-5 tään teofylliini-8-voihapon (31,3 mg, 0,117 mmol) liuokseen dimetyyliformamidissa (1,5 ml), joka sisältää trietyyliamii-nia (0,20 ml, 0,117 mmol), lämpötilassa 0 °C argonatmos-fäärissä. Kun seosta on pidetty 0,5 tuntia lämpötilassa 0 °C, lisätään 4-amiinin (40 mg, 0,117 mmol) liuos kloro-10 törmissä. Liuosta sekoitetaan 17 tuntia lämpötilassa 0-5 °C, ja poistetaan sitten liuottimet haihduttamalla, jolloin jää 103 mg raakatuotetta. Tämä materiaali käsitellään kro-matografisesti silikageelillä eluoiden kloroformin ja meta-nolin seoksella (9:1) ja käänteisfaasi-C-18-silikageelillä 15 eluoiden metanolin ja veden seoksella (7:3), jolloin saadaan 60 mg (saanto 67 %) haluttua tuotetta. Vastaava 3-aminoyhdiste (51 mg, 0,10 mmol) käsitellään samalla tavalla, jolloin saadaan 50 mg materiaali, jossa teofylliini-johdannainen on kytkeytynyt 3-asemaan.

20 D. 2,6-bis/N,N-di(karboksimetyyli)-aminometyyli)-4- (4-(teofylliini-8-butyyriamido)-fenyyli7-pyridiinitetra-happo

Edellisessä vaiheessa saatu tetrametyyliesteri (34 mg, 0,045 mmol) liuotetaan metanoliin (2 ml), joka sisäl-25 tää 0,2 ml 1 N natriumhydroksidia, ja refluksoidaan 3 tuntia. Sitten liuos jäähdytetään jäähauteessa, tehdään happamaksi 1 N HCl:lla, ja haihdutetaan, jolloin saadaan raaka-tuote. Puhdistus RP-pylväskromatografisesti eluenttina metanolin ja veden seos (6:4) antaa tulokseksi 14 mg tetra-30 happoa. Saippuoitaessa 40 mg (0,05 mmol) vastaavaa 3-subs-tituoitua yhdistettä saadaan 14,6 mg sen tetrahappoa RP-kromatografiän jälkeen.

E. Kelaattien valmistus

Kohdan D mukaiset tetrahapot liuotetaan erikseen 0,01

_C

35 M natriumboraattiliuokseen pitoisuudeksi 10 mol/1. Sitten kuhunkin liuokseen lisätään ekvivalenttinen moolimäärä ve- i 35 93997 sipitoista terbiumkloridia, ja annetaan seistä muutamia minuutteja. Fluoresenssimittaukset tehdään, ja ne osoittavat että on muodostunut tetrahappojen ja terbiumin kelaattikomp-lekseja moolisuhteessa 1:1 ja että nämä kompleksit ovat 5 fluoresoivia ja stabiileja.

F. Määritys, jossa fluoresenssia voimistetaan energiansiirrolla

Teofylliinin määritys tehdään antamalla edellä mainitun fluoroforilla leimatun teofylliinimerkkiaineen terbium-10 kelaatin (ts. 2,6-bis/N,N-di(karboksimetyyli)aminometyyli/- 4-/4-teofylliini-8-butyyliamido) -fenyyli_7-pyridiinin ter-biumkelaatin) kilpailla teofylliinistandardien kanssa sitoutumisesta antiteofylliinivasta-aineeseen. Leimatun teofylliinin fluoresenssi voimistuu sen sitoutuessa vasta-ai-15 neeseen, ja tämä voimistuminen on verrannollinen sitoutuneen leimatun teofylliinin määrään ja kääntäen verrannollinen näytteessä olevaan teofylliinimäärään. Määritys tehdään polystyreeniputkissa (12 x 15 mm), joihin on lisätty 1 ml 0,01 M natriumboraattipuskuria (pH 8,5). Tämän jälkeen li-20 sätään 10 μΐ 1 pM merkkiainetta (8,7 ng) ja 10 ui teofyl-liinistandardia (0, 5,4, 16,2 54 ja 540 ng). Kun putkeen lisätään 25 ui liuosta, joka sisältää noin 0,3 jimol/l anti-teofylliinivasta-ainetta 0,01 M boraattiliuoksessa, joka on 0,1 M natriumkloridin suhteen ja sisältää 1 % normaalia 25 ihmisseerumia (lopullinen pitoisuus koeputkessa noin 7,5 “ nmol/1), havaittu fluoresenssi voimistuu 400 - 50 % stan dardin mukaan. Tämä vastaa B/BQ-arvoja 80, 64, 53 ja 14 % standardien 5,4, 16,2, 54 ja vastaavasti 540 ng ollessa kyseessä.

30 Esimerkki 5 Määritys, jossa fluoresenssi sammutetaan energiansiirrolla Tämä esimerkki valaisee fluoresenssin sammutustyyppisen homogeenisen energiansiirtomäärityksen periaatteita, 35 jolloin kohteen kaltainen molekyyli on fluoresoiva terbium-kelaatti ja vasta-aineen kaltainen molekyyli on antikoh- * · » ψ 36 93997 devasta-aine, johon on kytketty sopiva sammuttaja. Tarkemmin määriteltynä noudattamalla esimerkissä 1 yleisesti ja US-patenttihakemuksen nro 712 774 esimerkissä 18 tarkemmin esitettyä menettelyä valmistetaan jäljempänä olevassa 5 reaktiokaaviossa 1 näkyvä liganditetraesteri 1_ yhdeksän-vaiheisella reaktiosarjalla 3-nitrobentsaldehydistä ja 1-asetyylifuraanista. Tämä materiaali kytketään sitten analysoitavaan kohdefenyltoiiniin kahdeksan hiiltä sisältävällä siltaryhmällä saattamalla 3-(7-karboksiheptyyli)-5,5-10 di-fenyylihydantoiini 2 reagoimaan 1_:n kanssa käyttämällä 1-etyyli-3-(3-N,N-dimetyyliaminopropyyli)-karbodi-imidiä ja N-hydroksisukkinimidiä. Tuloksena oleva tetraesteri saippuoidaan, jolloin saadaan ligandilla leimattu fenyltoiini-analogi, joka kelatoidaanterbiumin kanssa, jolloin saadaan 15 merkkiaine _3* Tällä voimakkaasti fluoresoivalla yhdisteellä on emissiomaksimi aallonpituudella 544 nm, ja se soveltuu ihanteellisesti energian siirtämiseen rodamiini B:hen, jonka absorptiomaksimi on aallonpituudella 544 nm. Antifenyl-toiinivasta-aine voidaan siten leimata TRITCtllä (tetra-20 metyylirodamiini-isotiosyanaatilla) noudattamalla alalla tunnettuja menettelyjä (Fluorescent Antibody Methods,

Academic Press, New York 1968), jolloin saadaan sammuttajalla leimattu spesifisen sitoutumisparin vasta-aineen kaltainen jäsen. Spesifinen sitoutuminen, joka tapahtuu 25 sekoitettaessa spesifisen sitoutumisparin kaksi jäsentä, tuo fluoresoijan ja sammuttajan sellaiselle etäisyydelle toisistaan, jota energiansiirron tapahtuminen vaatii, ja sammutuksen määrä on kääntäen verrannollinen näytteessä olevaan fenyltoiinimäärään.

Il 37 93997 (#" ©E- 5 Ιο) jL ' W 7 f C31 co2h ^ χ· k>ac jj^T] 10 * » »ms T^~ I l I » 2. It co . H 0*

“2 f°2 “2 f°2 3- TbCl3 JOI

C«3 CHj CHj CHj [//^V *

1 N.......Τ'?*··· -N

,s ' c-Ί vro eo- CO- CO- -CC-

Reaktiokaavio 1 3

Esimerkki 6 20 Määritys, jossa fluoresenssia voimistetaan energian- siirrolla Tämä esimerkki valaisee fluoresenssin voimistustyyp-pisen homogeenisen energiansiirtomäärityksen periaatteiden soveltamista, jolloin kohteen kaltainen molekyyli on fluore- 25 soiva europiumkelaatti ja vasta-aineen kaltainen molekyyli on antikohdevasta-aine, johon on kytketty sopiva voimistaja. Tarkemmin määriteltynä valmistetaan noudattamalla EP-hakemuksen 0 068 875 (Eastman Kodak) mukaista menetelmää fluoroforiligandi 4^ ja kytketään se alla olevassa reaktio- 30 kaaviossa 2 esitetyllä tavalla teofylliinianalogiin 5^ käyttämällä 1-/3-(N ,N-dimetyyliamino)-propyyli7-3-etyyli-karbodi-imidiä (EDAC) ja N-hydroksisukkinimidiä (NHS). Tuloksena oleva yhdiste saippuoidaan ja kelatoidaan euro-piumiin, jolloin saadaan spesifisen sitoutumisparin koh- 35 teenkaltainen jäsen 6.

38 93997 Q|, o 0=/ -K—CHj . ’m χ jgr “W- r

"V rnT

ry έ· _ r1^ 10 fOT r^· A ^

co, co co C02 OH

I 2 I 2 I 2 i 2 »· ·· ·:£\^3·\?Ί» is “* “* r'-x -:£0.

_ Reaktiokaavio 2 ®2 “j “3 *

II

39 93997

(N

O

u

CN

, s M «N co|

S

s f§ >-t 8 8 r>Oi s~§ § roj x υ X/ 10 CM 1

U X I

m rl I o \ ° 5

s/ I

Jf -> JL i @ toj :* I >··

V

>N x~ u n

+ X

(N O

O 2 z u i ^ x n Ό O &

M

rn *

Ui (M

U X

«h n (O) 2 \ ' O O Cu

CU

(Ό) 40 93997 i ϊ ΐ i i ϊ

"p“ I

u < n 0

1 <-< CM

+ . <0 ---->Z -* y\ cd (a) i cn y^\ *2 Z \ >

V cQ

o <*l J2 . o / «Η

/ 4J

ΊΓ «d

1 <U

yS. ¢3 (o)

X

S

v.

CM

X

u l

CM

X

U

Ϊ Ϊ ! <

II

41 93997

Esimerkki 7

Ensimmäisen kelaatin, teofylliiniin kytketyn tri-pon, valmistus homogeenisiä määrityksiä varten Alla olevan reaktiokaavion 4 mukaisesti teofyl-5 liini-8-voihappo (K), 210 mg, 0,70 mmol) liuotetaan dime-tyyliformamidiin (DMF, 8 ml) ja liuos jäähdytetään jää-hauteessa lämpötilaan 0°C. Sitten lisätään trietyyliamii-ni (72,6 mg, 0,72 mmol) ja sen jälkeen isobutyylikloori-formiaatti (95 mg, 0,69 mmol) ja liuosta sekoitetaan läm-10 pötilassa 0°C 30 minuuttia, minä aikana muodostuu valkoinen sakka ja syntyy välituoteseka-anhydridiä 1_1. Lisätään etyleenidiamiinia (620 mg, 10,3 mmol), jolloin saadaan kirkas liuos, jota seisotetaan yön yli lämpötilassa 0°C. Sitten seos väkevöidään pyöröhaihduttimella lämpötilassa 15 70 - 80°C ja jäännös trituroidaan dietyylieetterin kans sa. Tuloksena oleva öljymäinen kiinteä jäännös uudelleen-kiteytetään etanolista, jolloin saadaan 160 mg (0,52 mmol, saanto 75 %) teofylliinijohdannaista \2_, sp. 199 - 201°C (hajoaa).

20 jL2 (155 mg, 0,51 mmol) ja etyleenidiamiinitetra- etikkahappodianhydridi (_X_3, 300 mg, 1,17 mmol) liuotetaan DMFriin (10 ml) ja pidetään seosta lämpötilassa 65°C kolme tuntia. Sitten lisätään vettä (1,5 ml) ja jatketaan kuumennusta 1,5 tuntia, minkä jälkeen seos jäähdytetään 25 lämpötilaan 0°C. Muodostuva sakka (EDTA, 134 mg) poiste-*· taan suodattamalla ja suodos väkevöidään pyöröhaihdutti mella. Jäljelle jäävä siirappimainen öljy trituroidaan asetonin (40 ml) kanssa ja tuloksena oleva kiinteä aine uudelleenkiteytetään kahdesti etanolista (40 ml), jolloin 30 saadaan 199 mg (0,2 mmol, saanto 40 %) teofylliiniin kytkettyä trihappokelaattia 14a (sp. noin 130 - 160°C, hajoaa) . Homologiset yhdisteet 14b ja 14c valmistetaan samalla tavalla 1,6-diaminoheksaanista ja 1,10-diaminode-kaanista.

35 Lisäksi valmistetaan muita analogeja käyttämällä sellaisia diamiinisiltaryhmiä kuin bis-2-aminoetyyli-eetteriä, 1,2-bis(2-aminoetoksi)etaania ja N,N-bis(3-aminopropyyli)piperatsiinia.

42 93997 ro ro x re x o—o—u

CM

X

0 0 0—0 0 0=0 ·—* | 1 «hi ro

'Tm rM

S 1 />-x > jp / 'v u Ö-Z. V> 7 >< O* f 31 ° JP 0=0 10

g ™ TO

o x ro O — /Tv. ^ cm <r Z X u ro O o

•H Z X \ *H

O ro Ps. >

0={ W 2\ Z-X

b ‘ M w ° / I /-° |

Λ ^ V

: o • x o o 0 ro

CM

X

,Ρτ * u \ r° hv o n 43 93997 x

CM O

X o O <N CJ—u X II X T

Ο,/Ο^Ο 2-U-U_i ^ x018 II > Y-u

^2^ (J H I X

I ϋ. (N (NO

(NJ — . — X O

Λ o i ^ y~u fN O 2 CJ — i

E U T -IS

u I ο_Λ γν o T =T* SI 5-8 z — CJ _

I <N

™ I

*7^ 3 g A s- ^οΛy- v, u 'g'

/ (NO

X O (Ö oj CJ — U -1-1 E O = T — (N| f U ° T X 10 •Hl C i™ g « N (N / O—CJ 1-1 \ <N X X -<r \ — CJ —2 \ H W \ rs, 5 o \ 7 N X o t I U —U >

°r^roX^ I

II ^ °=u ΰ

On «

t CM OJ

™ X (Vj « (N j** SPr) · v _j I r\j w

H A

— <x N O

z 2^ Z-X (N VO —I

^ n /==*{ " " " X / V n π c c C^O^O U"Zv

\ “ <ULQ (J

/> \ hr hr ^ 0' \n -1-1-1

X

u i 44 9 3 9 9 7

Esimerkki 8

Ensimmäisen kelaatin, teofylliiniin kytketyn tet-rahapon, valmistus homogeenisiä määrityksiä varten Edellä esitetyn reaktiokaavion 5 mukaisesti väli-5 tuote V2 (164 mg, 0,53 mmol) liotetaan DMF:iin (3 ml) ja lisätään liuos hitaasti dietyleenitriamiinipentaetikka-happodianhydridin Γ5 liuokseen DMF:ssa (5 ml) ja pidetään seosta lämpötilassa 65°C kaksi tuntia. Kahden tunnin kuluttua TLC osoittaa _12:n hävinneen, jolloin lisätään vet-10 tä (1,0 ml) ja jatketaan kuumennusta 40 minuuttia. Kun seosta on pidetty yön yli huoneen lämpötilassa, muodostunut sakka (DTPA, 220 mg) poistetaan suodattamalla ja suodos väkevöidään pyöröhaihduttimella. Jäykkäliikkeinen jäännös trituroidaan asetonin kanssa. Tuloksena oleva 15 kiinteä aine liukenee osittain kuumaan etanoliin. Poistetaan vielä DTPA:ta ja suodos jäähdytetään, jolloin haluttu tuote IJi kiteytyy. Lisäämällä suodokseen dietyyli-eetteriä saadaan toinen annos kiinteää ainetta. Kokonaissaanto on 190 mg, sp. 129 - 160°C, hajoaa vapauttaen hii-20 lidioksidia.

Esimerkit 9-12

Vasta-aineeseen kytkettyjen toisten ligandien valmistus (9) Tämä valmistus noudattaa reaktiokaaviota 6.

25 Ensimmäisessä reaktiossa laitetaan reaktioastiaan 5,16 i ^ul (1 yUmol) esimerkin 4 kohdan B mukaisen 4-aminotetra- esterin Y]_ kloroformiliuosta. Liuotin haihdutetaan argon suojakaasuna. Lisätään 1 ml metanolia ja sen jälkeen 4 ^ul 1 N NaOH-liuosta metanolissa. Reaktioseosta sekoi-30 tetaan yön yli huoneen lämpötilassa. Sitten lisätään sekoittaen 50 ^ul 20 mM SPDP-liuosta etanolissa (1 ^umol).

Tunnin kestäneen reaktion jälkeen saadaan JJL Lisätään 1 yumol DTT:tä etanolissa ja seosta sekoitetaan yksi tunti, minkä jälkeen liuotin haihdutetaan, jolloin saadaan 35 ligandi _19. 10 ^umol af f initeettikromatografisesti puhdistettua antiteofylliinivasta-ainetta (erän numero . · » 45 93997 "CA # 007") laimennetaan 750 ^ul:ksi 10 mM fosfaattipus-kuroidulla suolaliuoksella (PBS). Sitten lisätään 116 ^ug (0,37 yumol) SPDP:tä ja annetaan reagoida sekoittaen huoneen lämpötilassa 45 minuuttia, jolloin saadaan sivuryh-5 mällä varustettu vasta-aine 2£, joka otetaan talteen ult-rasuodattamalla. Sitten sekoitetaan 400 ^umol ligandia 19 vasta-aineeseen 20^ metanolin ja veden seoksessa li-gandin ja vasta-aineen välisen moolisuhteen ollessa noin 40:1 ja sekoitetaan yön yli huoneen lämpötilassa, jolloin 10 saadaan ligandilla leimattu vasta-aine 2Λ. Julkaisussa Proc. Natl. Acad. Sei. 77 (1980) 4539 esitettyjen kuvien perusteella voitaisiin odottaa, että vasta-aineessa on keskimäärin neljä ligandinkiinnityskohtaa. Reaktiotuote suodatetaan ja ultrasuodatetaan PBS:ää vastaan kaiken 15 reagoimattoman ligandin poistamiseksi.

» 93997 i 46 NH, HN-CO-(CH-) |2 - 2 2 , ts) @

T 1. IN NaOH, MeOH

2. SPDP* r^|

N ^ , N \ N N

.» γί n rί r ί C°2 C02 C02 C02 C02Na COjNa CO^a CONa ch3 ch3 ch3 ch3 ia

— DTT

(HSCH2CHOH)2

15 HN-CO-(CH2) 2-6-S-(CH2) 2-CO-NH—HN—CO (ch2) 2“SH

j I Antiteofylliini- | { \ j

s' vasta-aine J

JL SPDP* [ iol S— (CH2) 2~CO—NH—Ab fry] 20 r'" ί 4-

I I 20 II

/N’ /N \ m r ί γί n CO^a C02Na COjNa CO^a CO^a CO^a C0^a CONa 21 19 25 · SPDP ΓθΊ ^

. I^J>L-s-s-(ch2)2-co-o-n J

0

Reaktiokaavio 6 47 93997 (10) Tämä valmistus noudattaa reaktiokaaviota 7. Lähtöaineena on ligandi 2_2, joka valmistetaan esimerkin 4 kohdan B mukaisesta 3-aminotetraesteristä. Lisätään 1 ^umol 22 57,4 ^ulrssa vettä 36,8 ^uljaan (1 ^umol) DSS (Pierce 5 Chemical) DMSOrssa. Kun seos on ollut viisi minuuttia huoneen lämpötilassa, lisätään 100 nmol tuloksena olevaa sameaa 23-suspensiota 10 affiniteettikromatografisesti puhdistettuun antiteofylliinivasta-aineeseen (10 nmol).

Tätä seosta pidetään huoneen lämpötilassa 15 minuuttia ja 10 pysäytetään sitten reaktio yhtä suurella tilavuudella (38,6 ^ul) 1 M ammoniumasetaattia, jolloin saadaan sivu-ketjulla varustettu vasta-aine “2Λ_, joka otetaan talteen ultrasuodattamalla. Tämä vasta-aineeseen kytkeminen toistetaan sitten käyttämällä loput 900 nmol 23_ ja 9 nmol 15 vasta-ainetta (ligandin ja vasta-aineen suhde 100:1).

48 93997 l ΓΜ z 0

X

V

z f tn

CM

X _ O 33

»— CM

b /— 8 V / ^oV/θ; = —-

_y' 'y_ / CM

'- 2 O

. 33 *H

\ cm > \ O cd '-o cd o

•H

f S

cd 0) pd « w

Q

Q

• CM

X

f m nT1 ®

H cT

b /—" 1 r- * (oV/O; * 31 W \-/ rz

Zv =

\ <N

\ O '-u 49 93997 23 (CH2) 5-NH-CO-{CH2) ^-CO-NH—^Ab)

5 (OJ

Antiteofylliini- Θ

Ip) _I

/ nN \ \

10 I I

N N

r ί r ί

C02H C02H CO^i C02H

" ·" ‘h-'"-*’ 20

Reaktiokaavio 7 (jatkoa) (11) Tämä valmistus noudattaa reaktiokaaviota 8.

Se on suurin piirtein samanlainen kuin edellä oleva esi-25 merkki 10, mutta lähtöaineena on ligandi 2jj, joka valmistetaan esimerkin 4 osan B mukaisesta 3-aminotetraesteris-tä ja siinä käytetään kytkemisaineena DST:tä (Pierce Chemical). Käytetään ligandin ja vasta-aineen moolisuh-detta 100:1, jolloin saadaan leimattu antiteofylliini-30 vasta-aine 26. 1 · • % 50 9 3 9 9 7 f»_N-(CH2) 3-NH2 (of roi y^. N 1’ DST‘ 1 ' 2. Antiteofyl- 10 N 1 ^ liini-Ab n n C02H co2h co2h co2h 25 15 N-C-N— (CH2> 3~J1~(CH2^3

fo OH OH O

II I I II

..NH—C-CH-CH-C-Wi © 26

Reaktiokaavio 8 25 OH OB ..

* dst

II

I * 1 51 93 997 (12) Kuten reaktiokaavio 9 osoittaa, toistetaan edellä esitetty esimerkki 11 käyttämällä kytkemisaineena DSS (Pierce Chemical), jolloin saadaan leimattu antiteo-fylliinivasta-aine 27.

5

__ 1. DSS

25 - 2. Antiteofylliini-Ab *

H _ HO OH

I / \ III II I

fN—(CHj) N N-(CH2)3-W-C-(CH2)6-C-N—f Abj 27 15

Reaktiokaavio 9

Esimerkit 9-12 osoittavat, että ligandeja voidaan kytkeä vasta-aineisiin monen pituisilla siltaryhmil-20 lä, jolloin voidaan sopivalla tavalla säätää ligandien välistä etäisyyttä ja helpottaa metallin siirtymistä tällaisten ligandien välillä.

Esimerkki 13 Määritys, jossa fluoresenssia voimistetaan metal-25 linsiirrolla #

Esimerkkien 7 ja 8 mukaisten teofylliiniin kytkettyjen tri- ja tetrahappojen terbiumkelaatit valmistetaan seuraavasti. Näiden esimerkkien mukaiset tri- ja tetraha-pot liuotetaan erikseen 0,01 M natriumboraattiliuokseen 30 pitoisuudeksi 10 mol/1. Sitten lisätään ekvivalentti- nen moolimäärä vesipitoista terbiumkloridia kuhunkin liuokseen ja seosten annetaan seistä muutama minuutti. Tehdään fluoresenssimittaukset ja ne osoittavat, että on muodostunut tetrahappojen ja terbiumin kelaattikomplekseja moo-35 lisuhteessa 1:1 ja että nämä kompleksit ovat stabiileja, mutta vain vaatimattomasti fluoresoivia.

52 93997

Teofylliinin määritys tehdään antamalla yhden ter-biumkelaati11a leimatuista teofylliineistä kilpailla teo-fylliinistandardien kanssa sitoutumisesta yhteen esimerkkien 9-12 mukaisista toiseen ligandiin kytketyistä an-5 titeofylliinivasta-aineista. Leimattu teofylliini tuo vasta-aineeseen sitoutuessaan sisältämänsä terbiumin hyvin lähelle vasta-aineeseen kiinnittynyttä toista ligan-dia. Terbiumioni siirtyy suoraan tähän toiseen ligandiin, jolloin muodostuu uusi kelaattikompleksi toisen ligandin 10 kanssa, joka on voimakkaasti fluoresoiva ja helposti de-tektoitavissa käyttämällä fluoresoivan taustan torjumis-menetelmiä. Tämän uuden kelaatin muodostuminen saa aikaan fluoresenssin voimistumisen ja tämä voimistuminen on verrannollinen näytteessä olevaan teofylliinimäärään. Määri-15 tys tehdään polystyreeniputkissa (12 x 15 mm), joihin on lisätty 1 ml 0,01 M natriumboraattipuskuria (pH 8,5). Tämän jälkeen lisätään 10 ^ul 1 ^uM merkkiaineliuosta (8,7 ng) ja 10 ^,ul teofylliinistandardia (0, 5,4, 16,2, 54 ja 540 ng). Kun lisätään 25 ^ul noin 0,3 ^uM toisella kelaa-20 tiliä leimattuna antiteofylliinivasta-aineen liuosta 0. 01 M boraattiliuoksessa, joka sisältää 0,1 mol/1 nat-riumkloridia ja 1 % normaalia ihmisseerumia (lopullinen pitoisuus koeputkessa noin 7,5 nmol/1), havaittu fluoresenssi voimistuu kääntäen verrannollisesti näytteiden 25 teofylliinipitoisuuteen.

Esimerkki 14

Sekaligandimääritys Tämä esimerkki valaisee homogeenisen sekaligandi-määrityksen periaatteiden soveltamista, jolloin kohteen 30 kaltainen molekyyli on suhteellisen fluoresoimaton ter-biumkelaatti ja vasta-aineen kaltainen molekyyli on anti-kohdevasta-aine, johon on kytketty sopiva toinen ligandi, joka sisältää sekä fluoroforiryhmän että kelatoivan ryhmän. Tarkemmin määriteltynä valmistettiin fenyylipyridii-35 nihappo 2%_ US-patenttihakemuksen nro 712 774 esimerkin 1. C mukaisesti. Kuten reaktiokaavio 10 osoittaa, nitraa-

• I

t ' 53 93997 maila, pelkistämällä nitroryhmä amiiniksi ja konjugoi-malla antiteofylliinivasta-aineeseen käyttämällä disukkin-imidyylisuberaattia saatiin _29, spesifisen sitoutumispa-rin vasta-aineen kaltainen jäsen. Teofylliiniin kytketyt 5 tri- ja tetrahappokelaatit, joiden valmistusta kuvataan esiemrkeissä 7 ja 8, toimivat spesifisen sitoutumisparin kohteen kaltaisina jäseninä. Sitoutuneen kompleksin muodostuttua vasta-aineen fluoroforiligandin funktionaalinen pyridiinidihapporyhmä on riittävän lähellä ja kykenevä 10 miehittämään terbiumin ne koordinaatiopaikat, jotka eivät ole kohteen kaltaisen teofylliinijohdannaisen tri- tai tetrahappojen miehittämiä. Jos analysoitava teofylliini reagoi vasta-aineen kanssa, se ei tuo mukanaan kompleksia muodostavaa dihappoa. Sekaligandin fenyylipyridiinifluo-15 rofori voimistaa kelaatin fluoresenssia ja tämän voimis-tuksen määrä on käänteisesti verrannollinen analysoitavan teofylliinin määrään tutkittavassa näytteessä.

o o UH TOC (CH,)-l^NHAb I 2 I ‘ ®

20 ύ p „ P

X τϊ;—* I * X.

OL OL JUL

HOjC ^ M M CO^H BOjC N COjH

25 28

Reaktiokaavio 10

Claims (30)

54 93997

1. Homogeeninen menetelmä vesiliuoksessa tapahtuvan spesifisen sitoutumisreaktion määrittämiseksi kvanti- 5 tatiivisesti, tunnettu siitä, että a. sekoitetaan vesiliukoinen yhdiste, joka sisältää ensimmäistä merkkiainetta sisältävän, biologisesti spesifisen ryhmän, vesiliuokseen, joka sisältää ensimmäistä merkkiainetta sisältävän biologisesti spesifisen ryhmän 10 sisältävän yhdisteen biologisesti spesifisen vastinparin, jolloin muodostuu vesiliukoinen tuote, joka sisältää spesifisen sitoutumisparin, joka tällaisen spesifisen sitoutumisen seurauksena sisältää uuden merkkiaineen, joka fluoresenssiltaan on erilainen kuin ensimmäinen merkkiai- 15 ne, jolloin ainakin toinen ensimmäisestä ja uudesta merkkiaineesta on harvinaista maametallia sisältävä fluoresoiva kelaatti, joka on vesiliukoinen vesiliuoksessa ja jossa metallin ja ligandin välinen sitoutumisvakio on suurempi kuin noin lO1^'1 ja jonka vaimenemisaika on pitempi kuin 20 ympäristön sisältämien aineiden pisin vaimenemisaika; b. viritetään vaiheessa a. saatu vesiliukoinen tuote vähintään yhdellä elektromagneettisella säteily-pulssilla, jonka kesto on lyhyempi kuin pitkäikäisen fluo-resenssiemission vaimenemisaika, jolloin muodostuu viri- * 25 tetty vesiliukoinen tuote; c. detektoidaan viritetyn vesiliukoisen tuotteen emittoima fluoresenssi, sen jälkeen kun ympäristön sisältämien aineiden fluoresenssi on vaimentunut oleellisilta osiltaan, ja 30 d. suhteutetaan kohdassa c. detektoitu fluoresens si vesiliuoksessa tapahtuvan spesifisen sitoutumisreaktion määrään.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sekä ensimmäinen merkkiaine 35 että toinen merkkiaine ovat harvinaisen maametallin ke- • « 55 93997 laattikomplekseja, joista toisen fluoresenssi sammuu spesifisen sitoutumisreaktion seurauksena.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sekä ensimmäinen merkkiaine 5 että uusi merkkiaine ovat harvinaisen maametallin kelaat-tikomplekseja, joista toisen fluoresenssi voimistuu spesifisen sitoutumisreaktion seurauksena.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sammunut fluoresenssi on seu- 10 rausta energiansiirrosta ensimmäisestä merkkiaineesta ryhmään, joka on tuotu ensimmäisen merkkiaineen läheisyyteen spesifisen sitoutumisreaktion avulla.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että läheisyys on etäisyys noin 15 0,5 -7,5 nm.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että harvinaisen maametallin ke-laatti sisältää terbiumia tai europiumia.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että ryhmä, joka tuodaan ensim mäisen merkkiaineen läheisyyteen spesifisen sitoutumisreaktion avulla, on ryhmä, joka osallistuu spesifiseen sitoutumisreaktioon.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että ryhmä, joka tuodaan ensim mäisen merkkiaineen läheisyyteen spesifisen sitoutumisreaktion avulla, on ryhmä, joka on liittynyt ryhmään, joka osallistuu spesifiseen sitoutumisreaktioon.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että läheisyyteen tuotava ryhmä on : IV ryhmän siirtymämetallin kompleksi.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että läheisyyteen tuotava ryhmä on rodamiini. < · 56 93997

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen merkkiaine on aryylisubstituoidun 2,6-[N,N-bis(karboksialkyyli)aminoal-kyyli]pyridiiniligandin europiumkelaatti.

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen merkkiaine on aryylisubstituoidun 2,6-[N,N-bis(karboksialkyyli)aminoal-kyyli]pyridiiniligandin terbiumkelaatti.

13. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että voimistunut fluoresenssi on seurausta energiansiirrosta ensimmäiseen merkkiaineeseen ryhmästä, joka on tuotu ensimmäisen merkkiaineen läheisyyteen spesifisen sitoutumisreaktion kautta.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että läheisyys on etäisyys noin 0,5 - 7,5 nm.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että harvinaisen maametallin ke-laatti sisältää terbiumia tai europiumia.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ryhmä, joka tuodaan ensimmäisen merkkiaineen läheisyyteen spesifisen sitoutumisreaktion avulla, on ryhmä, joka osallistuu spesifiseen sitoutu-misreaktioon.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että läheisyyteen tuotava ryhmä on antiteofylliinivasta-aine.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen merkkiaine on 30 aryylisubstituoidun 2,6-[N,N-bis(karboksialkyyli)aminoal- ; kyyli]pyridiiniligandin europiumkelaatti. . . ·

19. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen merkkiaine on aryylisubstituoidun 2,6-[N,N-bis(karboksialkyyli)aminoal- 35 kyyli]pyridiiniligandin terbiumkelaatti. • t 57 93997

20. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ryhmä, joka tuodaan ensimmäisen merkkiaineen läheisyyteen spesifisen sitoutumisreakti-on avulla, on ryhmä, joka on liittynyt ryhmään, joka osal- 5 listuu spesifiseen sitoutumisreaktioon.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että energiaa siirretään ligan-diin, joka on ensimmäinen harvinaisen maametallin kelaat-ti.

22. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sekä ensimmäinen että uusi merkkiaine ovat harvinaisen maametallin kelaattikomplek-seja, joista toinen on muodostettu harvinaisen maametal- li-ionin suoralla ligandien välisellä siirrolla, joka ta- 15 pahtuu kahden ligandin välillä, jotka on tuotu ensimmäisen läheisyyteen spesifisellä sitoutumisreaktiolla.

23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäisen kelaattikomplek-sin stabiilisuus on vähintään suunnilleen yhtä kertalukua 20 pienempi kuin uuden kelaattikompleksin stabiilisuus.

24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että harvinainen maametalli on europium tai terbium.

25. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että uudella merkkiaineella on voimakkaampi fluoresenssi kuin ensimmäisellä merkkiaineella.

26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen merkkiaine on 30 alkyylipolyamiinipolykarboksyylihapon europium- tai ter- . biumkelaatti.

27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uusi merkkiaine on aryyli-substituoidun 2,6-[N,N-bis(karboksyylialkyyli)aminoalkyy- 35 li]pyridiiniligandin europium- tai terbiumkelaatti. 58 93997

28. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uusi merkkiaine on 2,6-[N,N-bis(karboksyylialkyyli)aminoalkyyli]fenantroliiniligandin europium- tai terbiumkelaatti.

29. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uuden merkkiaineen fluoresenssi on heikompi kuin ensimmäisen merkkiaineen fluoresenssi .

30. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että sekä ensimmäinen että uusi merkkiaine ovat harvinaisen maametallin kelaattikomplek-seja, joista toinen on muodostettu lisäämällä lisäligan-di, joka on tuotu ensimmäisen läheisyyteen spesifisen si-toutumisreaktion avulla. 15 Λ · 59 93997