FI80801C - Konjugat av en monoklonal antikropp och anvaendning. eller ett fragment daerav och ett kelaterande aemne, dess framstaellning - Google Patents
Konjugat av en monoklonal antikropp och anvaendning. eller ett fragment daerav och ett kelaterande aemne, dess framstaellning Download PDFInfo
- Publication number
- FI80801C FI80801C FI870122A FI870122A FI80801C FI 80801 C FI80801 C FI 80801C FI 870122 A FI870122 A FI 870122A FI 870122 A FI870122 A FI 870122A FI 80801 C FI80801 C FI 80801C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- conjugate
- antibody
- dtpa
- fragment
- chelating agent
- Prior art date
Links
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 title claims description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 108010089417 Sex Hormone-Binding Globulin Proteins 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 2
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102100034937 Poly(A) RNA polymerase, mitochondrial Human genes 0.000 claims 1
- 102100030758 Sex hormone-binding globulin Human genes 0.000 claims 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 15
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 13
- -1 cyclic anhydride Chemical class 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- RAZLJUXJEOEYAM-UHFFFAOYSA-N 2-[bis[2-(2,6-dioxomorpholin-4-yl)ethyl]azaniumyl]acetate Chemical compound C1C(=O)OC(=O)CN1CCN(CC(=O)O)CCN1CC(=O)OC(=O)C1 RAZLJUXJEOEYAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000034755 Sex Hormone-Binding Globulin Human genes 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- DIGMLMRBDDSXMD-MSOXLDFBSA-N dnc005791 Chemical compound N=1N=NN(CCCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)[C@H](CS(O)(=O)=O)NC(=O)[C@H](CS(O)(=O)=O)NC(=O)[C@H](CS(O)(=O)=O)NC(=O)[C@H](CS(O)(=O)=O)NC(=O)CC[C@H](NC(=O)CN(CCN(CCN(CC(O)=O)CC(O)=O)CC(O)=O)CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS(O)(=O)=O)C(=O)N[C@@H](CS(O)(=O)=O)C(=O)N[C@@H](CS(O)(=O)=O)C(=O)N[C@@H](CS(O)(=O)=O)C(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)CCCCN2C(=NN=N2)C(C)(C)CCCCOC=2N=C(C=C(C=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)C=1C(C)(C)CCCCOC(N=1)=CC(C=2C=CC=CC=2)=CC=1C1=CC=CC=C1 DIGMLMRBDDSXMD-MSOXLDFBSA-N 0.000 description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 5
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 5
- 229910016644 EuCl3 Inorganic materials 0.000 description 4
- 102100035703 Prostatic acid phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- NNMXSTWQJRPBJZ-UHFFFAOYSA-K europium(iii) chloride Chemical compound Cl[Eu](Cl)Cl NNMXSTWQJRPBJZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 108010043671 prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100208721 Mus musculus Usp5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 229910021644 lanthanide ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
80801
Monoklonaalisen vasta-aineen tai sen fragmentin ja kela-toivan aineen konjugaatti, sen valmistus ja käyttö Tämä keksintö koskee fluorisoivalla aineella merkattua monoklonaalisen vasta-aineen tai sen fragmentin ja kela-toivan aineen konjugaattia in vitro-diagnostiikkaa varten.
Immunologiset menetelmät ovat tulleet standardimenetelmiksi kliinisessä kemiassa, erikoisesti määritettäessä biologisesti aktiivisia yhdisteitä, joiden pitoisuudet ovat alhaisia. Radio-immunoassayt ovat eniten käytettyjä määritysmenetelmiä. Radioaktiivisille leimoille on etsitty vaihtoehtoja niiden terveydellisen haitan ja useissa tapauksissa lyhyen säilyvyysajan vuoksi. EP-hakemukset 0184899 ja 0186947 koskevat paramagneettisia varjoaineita in vivo-diagnostisia, esim. NMR- menetelmiä varten, joka aine erään keksinnön suoritusmuodon mukaan voi olla kela-toivan aineen kautta polymeeriseen tai polymeroituun hiilihydraattiin tai polymeroituun sokerialkoholiin tai sen johdannaiseen sidottu paramagneettinen metalli. Eräs vaihtoehto radioaktiivisille leimoille on fluorisoiva leima. Eräät lantanidi-ionit, erikoisesti Eu3+ ja Tb3+, muodostavat voimakkaasti fluorisoivia kelaatteja sopivien . . orgaanisten monihampaisten ligandien esim. etyleenidiami- notetraetikkahapon (EDTA) ja dietyleenitriaminopentaetik-kahapon (DTPA) kanssa.
Patenttijulkaisussa WO 84/03698 on kuvattu Eu3+:aa kela-toivia DTPA-johdannaisia, joita voidaan liittää vasta-aineisiin in vitro diagnostiikkaa varten. Kelatoivat yhdisteet, esim. N1- ja N2-(p-isotiosyanatobentsyyliJdietylee-nitriamiinitetraetikkahappo, syntetisoidaan työläällä ne-. . livaiheisella menetelmällä, jossa joudutaan käyttämään työturvallisuuden kannalta ärsyttäviä ja myrkyllisiä rea- 2 80801 gensseja (bromietikkahappo ja tiofosgeeni). Synteesin toisessa vaiheessa syntyy isomeeriseos. Isomeerit erotetaan toisistaan HPLCrllä ja synteesisarjaa jatketaan puhtailla isomeereillä. Eu3+ kelatoidaan synteesisarjan kolmanteen vaiheeseen (I Hemmilä et ai., Anal. Biochem. 197 (1984) 335), sekin monivaiheisesti.
DTTA:n isosyanaattijohdannaisen Eu3+-kelaatin annetaan reagoida vasta-aineen kanssa. Reaktio on hidas (yli yön, 4°C) ja konjugaatioaste on huono, noin 10 %, mistä johtuen reagenssia on käytettävä runsaasti ylimäärin (kelaat-ti/vasta-aine = 60:1). Tästä syystä sitoutumaton kelaatti on poistettava geelisuodatuksella. Tällä suhteella konju-gaatti sisältää 7 Eu3+/lgG.
US-patentti 4,454,106 koskee DTPA:n liittämistä vasta-aineeseen seka-anhydridimenetelmällä ja saadun konjugaatin leimaamista mm. fluorisoivalla metallilla, esim. Eu3+. Patentissa kuvatulla menetelmällä saadaan n. 1,5 DTPA/ IgG. Tämä sitoutumissuhde on saatu testaamalla H^In-• leimalla. Patentissa ei ole kuitenkaan esimerkkiä Eu3+:n : käytöstä leimana. Eu3+-leimauksesta ei ole myöskään kir- ; jallisuudessa esimerkkiä DTPA-anhydridien kohdalla, joten leimausta ei voida kuvitella suoritetun jollakin aikai-’ semmin kuvatulla tavalla. Lisäksi esim. TR-FIA:n herk- . . kyyttä ei saada vielä riittäväksi suhteella 1,5 Eu3+/lgG, vaan within-assay ja between-assay variaatiot ovat suuret .
DTPA:ta on liitetty proteiineihin myös käyttäen DTPA:n i · 3 80801 syklistä anhydridiä (cDTPAA) (I), jonka kaava on 0 0 0 yH-CH2 ch28oh O N-CH2Ch2-n-CH2CH2-N O (i) C-CH^ \h,-/
H S
(Hnatowich et ai., Int. J. Appi. Radiat. Isot. 33 (1982) 327). US-julkaisu 4,479,930 (Hnatowich) koskee disyklisen anhydridin käyttöä kelatoivana aineena radioaktiivista metallia varten. Tarkoituksena on aikaansaada stabiileja radioaktiivisesti leimattuja biologisia molekyylejä in vivo-analyysejä varten. cDTPAA:n käytöllä on monia etuja. Se on helposti yhdellä vaiheella syntetisoitavissa oleva aine. Sitä on saatavissa myös kaupallisesti (Sigma, Aldrich). Se on yksiselitteinen kuivissa olosuhteissa stabiili aine toisin kuin seka-anhydridi (US-pat. 4,454,106), joka on valmistettava aina juuri ennen käyttöä. Menetelmän toistettavuus on epästabiilisuuden takia huono, ja syntyneelle anhydridille ei ole luotettavaa analyysimenetelmää.
Toisaalta cDTPAA on niukkaliukoinen yhdiste. Hnatowich on käyttänyt pienten cDTPAA-määrien annostelussa kloroformi-suspensiota. Epähomogeenisesta seoksesta annostelu ei ole kovin tarkkaa tällä menetelmällä.
Tämän keksinnön mukaiselle konjugaatille on ominaista, että kelatoiva aine on mono- tai bisyklinen DTPA.
Time-resolved fluoroimmunoassay:ssa (TR-FIA) käytetään hyväksi eroa spesifisen signaalin ja ei-spesifisen taustan fluoresenssin elinaikojen välillä, jolloin signaali-. . kohinasuhde paranee. Melkein kaikissa julkaistuissa mene telmissä käytetään Eu3+ leimattua vasta-ainetta, josta 4 80801 sitoutunut Eu3+ kvantitoidaan dissosiatiivisen fluoresenssin kehittymisen jälkeen. Wallac-LKB on patentoinut DELFIA-menetelmän (Dissociative Eu Fluorescence Enhancement FIA (EP 64484).
Tämä keksintö yksinkertaistaa patentissa WO 84/03698 kuvattua menetelmää, jossa usealla synteesivaiheella saatu Eu3+-DTTA-kelaatti liitetään vasta-aineeseen 12 h:n reak-tioajalla +4°C:ssa. Tässä keksinnössä proteiinista muodostetaan ensin DTPA-konjugaatti mono- tai bisyklisellä anhydridillä. Bisyklinen anhydridi on joko kaupallinen tuote tai valmistettu Eckelmanin mukaan (Eckelman et ai., J. Pharm. Sei. 64 (1975) 704). Monosyklinen anhydridi on valmistettu Halpernin mukaan (Radioimmunoimaging and Ra-dioimmunotherapy, Ed. S W Burchiel & B A Rhodes, Elsevier 1983, s. 198-9). Tyypillisesti derivaattaa tehtäessä mono-tai bisyklinen anhydridi liuotetaan kuivaan DMSOihon, toisin kuin Hnatowich, jolloin täydellisen liukenemisen seurauksena pienien määrien pipetointitarkkuus on hyvä. Tästä homogeenisesta liuoksesta pipetoidaan sopiva määrä vasta-aineen bikarbonaattiliuokseen. Reaktioaika on l h huoneenlämpötilassa. Näin saatua vasta-aineen DTPA-deri-vaattaa voidaan käyttää erilaisiin diagnostisiin tarkoi- * . tuksiin in vitro ja in vivo.
. TR-FIA:ssa Eu3+-kelaatin on oltava riittävän stabiili mutta helposti dissosioituva happamissa olosuhteissa. Mitä useampihampainen kompleksinmuodostaja on, sen stabiilimman kompleksin se muodostaa. Tällaisista komplekseista dissosioituminen on myös hidasta. On kuitenkin havaittu (I Hemmilä, Lanthanides as Probes for Time-resolved Fluo-rometric Immunoassays, Thesis 1986), että neljä kelatoi-vaa happoryhmää sisältävästä epäsymmetrisestä N'-bentsyy-li-DTTA:sta Eu3+ dissosioituu nopeammin (1 min) kuin vastaavasta symmetrisestä N2-bentsyyli-DTTA:sta (20 min).
li 5 80801 Käytettäessä DTPA:n syklistä anhydridiä vasta-aineen DTPA-derivaatan valmistamisessa syntyy epäsymmetrinen, neljä kelatoivaa happoryhmää sisältävä konjugaatti (II), jonka rakenne on vastaava kuin N'-bentsyyli-DTTA-konju-gaatilla (III). Vain DTTA:n proteiiniin liittävä ryhmä ja sidos ovat erilaiset
HOOC
j) ^H2 CHjCOOH yCHjCOOH
Prot-NH-C-Nft/OVcH2“N-CH2CH2-N-CH2CH2N (III) ^—' CH2cooh
HOOC
p ch2 ch2cooh ch2cooh Prot-NH-C-H-CH2CH2Hl-CH2CH2“1i ch2cooh (II) Näin ollen syklisellä anhydridillä valmistettu vasta-aineen DTPA-derivaatta on verrattavissa N-bentsyyli-DTTA-derivaattaan käytettäväksi TR-FIA:aan. Syklisellä anhydridillä työskentely on yksinkertaisempaa ja hyvin paljon nopeampaa. Kaupallisen tai yhdellä helpolla synteesivai-heella valmistetun DTPA-anhydridin annetaan reagoida vasta-aineen kanssa 1 h huoneenlämmössä.
. . Ylimäärä DTPA:ta poistetaan dialysoimalla samalla kun puskuri vaihdetaan leimaukseen sopivaksi. Kelatoiva aine lisätään kaupallisesti edullisesti saatavana kloridina. EuCl3:ta ei tarvitse käyttää ylimäärin vaan testattua sopivaa määrää, joten geelisuodatusta ei tarvitse suorittaa. Sen sijaan patenttijulkaisussa WO 84/03698 kuvattu reagenssi valmistetaan työläästi neljällä synteesivai-heella. Synteesissä syntyy kaksi isomeeriä, joista vain toinen muodostaa nopeasti dissosioituvan Eu-kelaatin. Tästä seuraa, että käyttökelpoisen kelaatin saanto isomeerien erotuksen jälkeen on huono. Lisäksi, koska konju- β 80801 gaatioaste on huono, työläästi syntetisoitavan reagenssin kulutus on suuri. Lisäksi, koska kelatoitava metalli liitetään tässä keksinnössä viimeisessä vaiheessa, samaa vasta-aineen DTPA-konjugaattia voidaan käyttää eri diagnostisiin tarkoituksiin, sekä in vitro että in vivo valitsemalla metalli kuhunkin tarkoitukseen sopivaksi.
Johdannaisten teossa on käytetty PAP:n (Prostatic Acid Phosphatase) monoklonaalisen vasta-aineen puhdistettua F(ab')2-fragmenttia ja puhdistettua kokonaista vasta-ainetta sekä SHBG:n (Sex Hormone Binding Globulin) puhdistettua monoklonaalista vasta-ainetta. Bisyklinen DTPA on ollut Sigman valmistama. Mono cDTPA:n olemme valmistaneet itse. Dimetyylisulfoksidi (DMSO) on SNEA:n tai Aldrichrn valmistamaa.
Esimerkki 1 DTPA:n liittäminen monoklonaaliseen vasta-aineeseen 1) Proteiinin käsittely
Puhdistettu monoklonaalinen PAP-vasta-aine käytetään sellaisenaan tai pilkotaan pepsiinillä F(ab')2:ksi, joka puhdistetaan käyttäen proteiini-A-Sepharose-4B-affini-teetti-kromatografiaa. Saatu F(ab')2-fraktio (0,02 M PBS-puskurissa, pH 8,0) tai kokonainen monoklonaalinen vasta-aine (IgG) konsentroidaan Amiconin konsentrointilaitteel-la ja dialysoidaan NaHCO3-puskuriin, pH 8,0. Dialysoitu näyte kylmäkuivataan ja pakastetaan. F(ab')2 liuotetaan veteen juuri ennen käyttöä siten, että proteiinikonsen-; traatioksi tulee 10 mg/ml ja NaHC03:n konsentraatioksi 0,1 M. SHBG-vasta-aine on käytetty kokonaisena (IgG).
li 7 80801 2) Derivaatan teko A. cDTPA/F(ab')2-derivaatta/lgG-derivaatta
Konjugaatioreaktiota varten cDTPAA liuotetaan kuivaan DMSO:iin, josta pipetoidaan haluttu määrä proteiiniliuok-seen. Liuosta sekoitetaan 30 s-1 min ja inkuboidaan huoneenlämmössä 1 tunti. Liuoksen pH tarkistetaan. Näyte dialysoidaan 0,1 M Na-sitraattipuskuriin, pH 5 vapaan DTPA:n poistamiseksi. Esim. cDTPA/F(ab')2/IgG = 5 tehtäessä cDTPA-DMSO-liuosta (17,85 mg/ml) pipetoidaan 5 /ui proteiiniliuokseen, jossa 5 mg F(ab')2 tai IgG/0,5 ml.
Lisättäessä DMSOra proteiiniliuokseen on otettava huomioon, ettei DMS0:n määrä ole yli 5 % proteiiniliuoksen tilavuudesta .
B. mono cDTPA/F(ab1)2-derivaatta/IgG-derivaatta
Tehdään vastaavasti kuin syklinen derivaatta. Mono cDTPAA lisätään DMSO-liuoksessa proteiiniliuokseen.
Esimerkki 2 PAP-vasta-aineen tai sen F(ab')2-fragmentin DTPA-konju-gaatin leimaus EuCl3:lla
Leimaus suoritettiin käyttäen 10 M Eu:ta suhteessa vasta-aine-DTPA-konjugaattiin. Kun leimausta suoritetaan patentissa WO 84/03698 kuvatulla Eu-DTPA-johdannaiskelaatilla, käytetään sitä 160 M ylimäärin suhteessa vasta-aineeseen.
EuCl3 (Fluka 46130) liuotettiin 0,1 M natriumsitraatti-puskuriin, pH 5-6, 2,75 mg EuCl3/ml, 15 min ennen käyttöä. vasta-aineen tai sen fragmentin DTPA-konjugaatti liuotettuna 0,1 M natriumsitraattipuskuriin (10 mg konju- s 80801 gaatti/ml, pH 5-6) sekoitettiin sopivaan määrään EuCl3-natriumsitraattiliuosta ja inkuboitiin 1 h huoneenlämpö-tilassa. Leimaantumis-% on 98.
Esimerkki 3 SHBG-vasta-aineen DTPA-konjugaatin leimaus EuCl3:lla
Vasta-aineen DTPA-johdannainen oli valmistettu käyttäen suhdetta DTPA/IgG = 20:1. EuCl3 (Fluka 46130) liuotettiin 0,1 M natriumsitraattipuskuriin pH:ssa 6. Leimaus suoritettiin käyttäen Eu:ta noin 10 M suhteessa IgG-DTPA-johdannaiseen huoneenlämpötilassa yhden tunnin ajan.
Esimerkki 4
Vertailun vuoksi leimattiin SHBG-vasta-aine patenttijulkaisussa WO 84/03698 kuvatulla Eu-kelaatilla. Tällöin käytettiin Eu-kelaattia 160 M ylimäärin suhteessa vasta-, . aineeseen. Muut leimausolosuhteet olivat: 50mM K2HP04, pH = 9,4, inkubaatio yli yön +4eC:ssa. Leimatun vasta-aineen erotus suoritettiin geelisuodatuksella ylimääräisen : kelaatin poistamiseksi.
Inkuboinnin jälkeen reaktioseos kaadettiin geelisuodatus-kolonniin (Sepharose 6B 1,5 cm x 30 cm, ylhäällä Sephadex 6-25, 1,5 cm x 5 cm). Eluointi suoritettiin käyttämällä 0,05 M Tris-HCl, 0,9 % NaCl, 0,1 % NaN3 (ph 7,75, 25°C) eluointipuskurina.
Fluoresenssi määritettiin siten, että otettiin 10 /ul:n näyte 200 /ul:aan Delfia Enhancement-liuosta. Ravistelun jälkeen mitattiin fluoresenssi Arcus fluorometrilla. Eu-; : pitoisuus laskettiin käyttämällä arvoa 0,2 pmol Eu = 106cps vertailuarvona.
9 80801
Vertailutulokset: Käytettäessä EuCL3-leimaa saatiin seuraavat määrä Eu-mo-lekyylejä kiinni vasta-aineisiin:
Eu-molekyylit/proteiinimolekyylit cDTPA/F(ab')2 (5:1) 1,9-2,0 CDTPA/F(ab')2 (10:1) 2,7 cDTPA/IgG (10:1) 2,4 cDTPA/IgG (20:1) 3,7 (esim. 3) CDTPA/IgG (50:1) 6,9 m-CDTPA/IgG (300:1) 11,0
Patenttijulkaisun WO 84/03698 esimerkissä leimattaessa 60 M ylimäärällä Eu-kelaattia saadaan 7 Eu-molekyyliä/IgG ja nostettaessa suhdetta 160-500 M ylimäärin Eu-kelaattia ei suhde nouse yli 10 Eu-molekyyliä/IgG. Suhteella 160 M Eu-kelaattia ylimäärin saatiin 9,3 Eu-molekyyliä yhteen vasta-ainemolekyyliin (esim. 4).
Esimerkkien 3 ja 4 leimat testattiin SHBG Delfia kit menetelmällä käyttäen suunnilleen samaa proteiinipitoisuutta molempien leimausten laimennuksessa. Tämä tarkoittaa lyhyesti sitä, että mikrotiitterilevyjen kaivot päällystettiin polyklonaalisilla anti-SHBG-vasta-aineilla. ver-tailutulokset ja leimaukset pipetoitiin kaivoihin ja in-kuboitiin, pestiin ja mitattiin Delfia Enhancement-liuos-ta käyttäen.
80801 SHBG-vertailuliuokset EuCl3-leimaus Eu-kelaatti-leimaus nmol/1 (esim. 3) cps (esim. 4), cps 0 3197 4281 6,25 43535 81940 12,5 77255 147983 25 146026 263334 50 238831 442793 100 389177 841566 200 787518 1579440 SHBGtn TR-FIA toimi samalla tavoin molemmilla leimauksilla ja niiden erotuskyky eri standardien suhteen oli yhtä hyvä.
Erään sovellutuksen mukaan keksintö koskee myös menetelmää kelatoivan aineen ja biologisen molekyylin välisen konjugaattiasteen määrittämiseksi. Konjugaattiasteella tarkoitetaan moolisuhdetta kelatoiva aine/biologinen molekyyli. Konjugaattiaste määritellään tavallisesti siten, että konjugaatin kelatoiviin ryhmiin liitetään jokin radioaktiivinen isotooppi. Tämä määritystapa on kuitenkin hankala ja epätarkka johtuen isotooppien lyhyestä puoliintumisajasta. Kun sen sijaan, kuten tässä keksinnössä, liitetään Eu:ta kelatoiviin ryhmiin ja mitataan fluoresenssi, voidaan konjugaattiaste määrittää hyvin tarkasti ja yksinkertaisesti.
li
Claims (6)
1. Fluorisoivalla aineella merkattu monoklonaalisen vasta-aineen tai sen fragmentin ja kelatoivan aineen konju-gaatti in vitro-diagnostiikkaa varten, tunnettu siitä, että kelatoiva aine on mono- tai bisyklinen DTPA.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen konjugaatti, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti on SHBG-antigeenin vasta-aine tai sen fragmentti .
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen konjugaatti, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti on PAP-antigeenin vasta-aine tai sen fragmentti.
4. Patenttivaatimusten 1-3 mukainen konjugaatti, tunnettu siitä että fluorisoiva aine on Eu.
5. Menetelmä patenttivaatimusten 1-4 mukaisen konjugaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että biologinen molekyyli ja kelatoiva aine ensiksi liitetään yhteen, jonka jälkeen konjugaatin leimausta suoritetaan fluori-soivalla aineella.
6. In vitro-diagnostinen immunologinen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään patenttivaatimusten 1-4 mukaista konjugaattia analyytin antigeenin määrittämiseksi.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI870122A FI80801C (fi) | 1987-01-14 | 1987-01-14 | Konjugat av en monoklonal antikropp och anvaendning. eller ett fragment daerav och ett kelaterande aemne, dess framstaellning |
| PCT/FI1987/000163 WO1988005537A1 (en) | 1987-01-14 | 1987-12-08 | Conjugate of biological molecules and a chelating agent |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI870122 | 1987-01-14 | ||
| FI870122A FI80801C (fi) | 1987-01-14 | 1987-01-14 | Konjugat av en monoklonal antikropp och anvaendning. eller ett fragment daerav och ett kelaterande aemne, dess framstaellning |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI870122A0 FI870122A0 (fi) | 1987-01-14 |
| FI870122L FI870122L (fi) | 1988-07-15 |
| FI80801B FI80801B (fi) | 1990-03-30 |
| FI80801C true FI80801C (fi) | 1990-07-10 |
Family
ID=8523765
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI870122A FI80801C (fi) | 1987-01-14 | 1987-01-14 | Konjugat av en monoklonal antikropp och anvaendning. eller ett fragment daerav och ett kelaterande aemne, dess framstaellning |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| FI (1) | FI80801C (fi) |
| WO (1) | WO1988005537A1 (fi) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5792444A (en) * | 1989-05-09 | 1998-08-11 | The General Hospital Corporation | Labeled chemotactic peptides to image focal sites of infection or inflammation |
| EP0709100A1 (en) * | 1994-09-30 | 1996-05-01 | Nihon Medi-Physics Co., Ltd. | Contrast agent, containing several detection groups per molecule |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4647447A (en) * | 1981-07-24 | 1987-03-03 | Schering Aktiengesellschaft | Diagnostic media |
| US4668503A (en) * | 1982-07-26 | 1987-05-26 | Trustees Of University Of Massachusetts | Process for labeling amines with 99m Tc |
| US4479930A (en) * | 1982-07-26 | 1984-10-30 | Trustees Of The University Of Massachusetts | Amines coupled wth dicyclic dianhydrides capable of being radiolabeled product |
| NL194579C (nl) * | 1983-01-21 | 2002-08-05 | Schering Ag | Diagnostisch middel. |
| SE465907B (sv) * | 1984-11-01 | 1991-11-18 | Nyegaard & Co As | Diagnosticeringsmedel innehaallande en paramagnetisk metall |
| DD229595A1 (de) * | 1984-12-14 | 1985-11-13 | Adw Ddr | Verfahren zur herstellung von mit chelatbildnern gekoppelten biomolekuelen |
| WO1987007955A1 (en) * | 1986-06-17 | 1987-12-30 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Homogeneous fluoroassay methods employing fluorescent background rejection and water-soluble rare earth metal chelate fluorophores |
-
1987
- 1987-01-14 FI FI870122A patent/FI80801C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-12-08 WO PCT/FI1987/000163 patent/WO1988005537A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI870122L (fi) | 1988-07-15 |
| WO1988005537A1 (en) | 1988-07-28 |
| FI80801B (fi) | 1990-03-30 |
| FI870122A0 (fi) | 1987-01-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4808541A (en) | Determination method utilizing reagents covalently labelled with essentially non-fluorescent lanthanide chelates in combination with time-resolved fluorescence spectroscopy and the reagents to be used in the method | |
| Heirwegh et al. | Recent advances in the separation and analysis of diazo-positive bile pigments | |
| US4476229A (en) | Substituted carboxyfluoresceins | |
| JP2866419B2 (ja) | 希土類クリプテート及びその製造方法とその合成中間体とその蛍光トレーサーとしての利用方法 | |
| Mukkala et al. | The synthesis and use of activated N-benzyl derivatives of diethylenetriaminetetraacetic acids: alternative reagents for labeling of antibodies with metal ions | |
| Bailey et al. | Terbium chelate for use as a label in fluorescent immunoassays | |
| JPS58757A (ja) | 同位体を使用しない免疫検定を実施する方法、ラベルされた分析物とかかる検定に使用するキット | |
| JPH02504640A (ja) | 表面カップリング官能性を有するイットリウム、ランタニドおよびアクチニドの大環状錯体 | |
| JPH0137693B2 (fi) | ||
| CA1152490A (en) | Beta-galactosyl-umbelliferone-labeled protein and polypeptide conjugates | |
| CN105572095A (zh) | 一种人血清白蛋白的检测试剂及定量检测方法 | |
| US20210395606A1 (en) | Chromophoric structures for macrocyclic lanthanide chelates | |
| SK374392A3 (en) | Method of determination of concentration of different matters | |
| CN105842464B (zh) | 基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr的装置及其制备方法 | |
| FI87022C (fi) | Maerkta och maerkningsbara reagenser foer fluorometriska bestaemningar | |
| Yang et al. | Time-resolved fluorescence immunoassay with measurement of a europium chelate in solution: dissociation conditions and application for determination of cortisol | |
| JP3713087B2 (ja) | ハプテンのイムノアッセイおよびそれに使用可能なハプテントレーサー抗体複合体ならびにそれらの製造方法 | |
| US4771008A (en) | Method for quantitative analysis of thyroid hormone | |
| US6190923B1 (en) | Diethylenetriamine-N,N′,N″-triacetic acid derivatives | |
| FI80801C (fi) | Konjugat av en monoklonal antikropp och anvaendning. eller ett fragment daerav och ett kelaterande aemne, dess framstaellning | |
| US3983099A (en) | Thyroxine-and triiodothyronine-tyrosine dipeptide derivatives | |
| US11614445B2 (en) | Background blockers for binding assays | |
| CN102539761A (zh) | 一种促甲状腺素定量检测试剂盒(时间分辨荧光免疫法)制备方法 | |
| JPH0758291B2 (ja) | アナライトが存在可能な媒体中のアナライトをルミネセンスによって検出および／または測定するための均質方法およびその方法に使用するキット | |
| Degan et al. | Time-resolved fluoroimmunoassay |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: INNOFARM OY |