DD229595A1 - Verfahren zur herstellung von mit chelatbildnern gekoppelten biomolekuelen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Chelatbildnern enthaltenden und dadurch zur Komplexbildung mit Metallionen befaehigten biologisch wirksamen Verbindungen, beispielsweise Proteine, Antikoerper, Enzyme, Hormone, Polysaccharide, lebende Zellen (im weiteren Biomolekuele genannt). Derartige Komplexverbindungen der modifizierten Biomolekuele mit radioaktiven oder auch inaktiven Metallionen werden insbesondere in der Human- und Veterinaermedizin zu diagnostischen Zwecken sowohl in vivo als auch in vitro eingesetzt. Die aus dem Stand der Forschung und dem Ziel der Erfindung resultierende Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von mit Chelatbildnern gekoppelten Biomolekuelen zu schaffen, das es erlaubt, die Herstellungsbedingungen dem jeweiligen Biomolekuel anzupassen und somit Chelatbildner enthaltende Biomolekuele mit definierten komplexchemischen Eigenschaften zu erhalten. Erfindungsgemaess wird diese Aufgabe dadurch geloest, dass eine Loesung oder Suspension der Biomolekuele mit dem in einer Reinheit 95% eingesetzten, in wasserfreien Pyridin geloesten zyklischen Saeureanhydrid eines Chelatbildners unter Zugabe eines wasserbindenden Mittels bei Konstanthaltung eines vorgewaehlten p H-Wertes eingesetzt wird.

Description

/I

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Chelatbildnern enthaltenden und dadurch zur Komplexbildung mit Metallionen befähigten biologisch wirksamen Verbindungen, beispielsweise Proteine, Antikörper, Enzyme, Hormone, Polysaccharide, lebende Zellen (im weiteren Biomoleküle genannt). Derartige Komplexverbindungen der modifizierten Biomoleküle mit radioaktiven oder auch Inaktiven Metallionen werden insbesondere in der Human- und Veterinärmedizin zu . diagnostischen Zwecken sowohl in vivo als auch in vitro eingesetzt.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Versuche zur Herstellung mit Chelatbildnern gekoppelter Biomoleküle werden ausgehend von den cyclischen Anhydriden der Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), beziehungsweise Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) w^HP&efl- an Humanserumalbumin, Humanserumalbumin-Mikrosphären, Fibrinogen, Antikörpern und Heparin durchgeführt.

Die ungenügende Reproduzierbarkeit der Kopplungsreaktion, die sich aus der Verwendung der Anhydride in fester Form ergibt /D.J. Hnatowich, W.W. Layne, R.L. Childa Int. J. Appl. Radist. Isot. 33 (1982) 327-32/lassen die beschriebenen Methoden für eine Routineanwendung in der Eh.armakaprod.uktion ungeeignet erscheinen. Als Verbesserung erweist sich der Einsatz von in Chloroform, DirnethylsuIfoxid oder Acetonitril gelöstem Anhydrid der DTPA. Selbst unter diesen Bedingungen gelingt es jedoch nicht, bei einem Molverhält-

nis von DTPA-Anhydrid/Bioraolekül von 1:1 mehr als 0,7 Mol DTPA pro Mol Biomolekül zu koppeln /a.a.O/, was möglicherweise auf schnelle Hydrolyse oder ungenügende Reinheit des DTPA-Anhydrid zurückzuführen ist. Bachteilig bei allen bisher bekannten Verfahren zur Kopplung von Ghelatbildnern an gelöste Biomoleküle ist die Tatsache, daß man bestimmte Puffersysteme benötigt, wobei sich Infolge der begrenzten Pufferkapazität der pH-Wert während der Kopplungsreaktion ändern kann /CH. Paik, I.A. Ebbert, P.R. Murphy, CR. Lassmann et al. J. EuCl. Med. 24 (1983) 1158-63/. Es gibt außerdem Hinweise darauf, daß der Puffer selbst die Effektivität der Kopplungsreaktion dadurch beeinflußt, daß die als Konkurrenzreaktion auftretende Hydrolyse des DTPA-Anhydrid in unterschiedlichen Puffern verschieden schnell verläuft /D.J. Hnatowich, W.W. Layne, R.L. Childs, Int. J. Appl. Radiat. Isot. 33 (1982) 327-32; CH. Paik, M.A. Ebbert, P.R. Murphy, CR. Lassmann et al. J. Hucl. Med. 24 (1983) 1158-63/ so daß für jede Art von Biomolekülen eine Optimierung von Puffersystem und pH-Wert für die Kopplungsreaktion erfolgen muß und die Kopplungsmethode damit nicht universell einsetzbar ist.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, Biomoleküle in einer zur Komplexbildung mit Metallionen befähigten Form für den Einsatz in der Human- und Veterinärmedizin insbesondere zu diagnostischen Zwecken bereitzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die aus dem Stand der Forschung und dem Ziel der Erfindung resultierende Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von mit Chelatbildnern gekoppelten Biomolekülen zu schaffen, das es erlaubt, die Herstellungsbedingungen dem jeweiligen Biomolekül anzupassen und somit Chelatbildner enthaltende Biomoleküle mit definierten komplexchemischen Eigenschaften zu erhalten.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß eine Lösung oder Suspension der Biomoleküle mit dem in einerReinheit ^ 95 % eingesetzten, in wasserfreiem Pyridin gelösten zyklischen Säureanhydrid eines Chelatbildners unter Zugabe eines wasserbindenden Mittels bei Konstanthaltung eines vorgewählten pH-Wertes eingesetzt wird.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen darin, daß die Konzentration der Lösung des'Säureanhydrids reproduzierbar und in einem größeren Bereich frei wählbar ist. Die Hydrolyse des Anhydrids wird durch den Zusatz des wasserbindenden Mittels unterdrückt und damit die Ausbeute stabilisiert. Die Biomoleküle können in nativer Form als Lösung und in denaturierter Form als Suspension eingesetzt werden, wobei Volumen und Konzentration sowohl der Lösung als auch der Suspension in weiten Grenzen frei wählbar sind. Vorteilhaft ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, daß bei beliebig einstellbarer Ionenstärke gearbeitet werden kann und daß der pH-Wert frei wählbar ist. Das raaolare Verhältnis von Säureanhydrid des Chelatbildners und Biomolekül ist auf Grund der hohen Reinheit exakt bestimmbar und frei wählbar,

so daß es möglich, wird, je nach dem vorgesehenen Verwendungszweck die erforderliche Menge Chelatbildner an die Biomoleküle zu koppeln

Die erfindungsgeniäß hergestellten Lösungen oder Suspensionen von Chelatgruppen enthaltenden Biomolekülen enthalten nur geringe Mengen an freiem Chelatbildner, wodurch die Reinigung des Endproduktes verkürzt und eine hohe Ausbeute inbezug auf das eingesetzte Säureanhydrid des Chelatbildners erreicht wird. Mit dem dargestellten Verfahren können u.a. die cyclischen Säureanhydride· der Ethylendiamintetraessigsäure und der Diethylentriaminpentaessigsäure an Biomoleküle gekoppelt werden, wobei die Kopplung von DTPA-Anhydrid wegen der hohen Stabilität von DTPA-Komplexen bevorzugt wird.

Diese Stabilität ist von großer Bedeutung, da die erfind ungs gemäß modifizierten und mit Metallionen komplexierten Biomoleküle im Rahmen der human- und veterinärmedizinischen Diagnostik in vivo angewendet werden sollen.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren erforderliche Reinheit des cyclischen Anhydrids DTPA wird vorteilhaft dadurch erzielt, daß das Anhydrid der DTPA aus einer 5 Vol% Essigsäureanhydrid enthaltenden Pyridinlösung mehrfach umkristallisiert wird.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll an nachfolgenden Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

1. Kopplung von DTPA-Anhydrid an Humanserumalbumin (HSA)

20 ml einer wäßrigen 10 %igen Lösung von Humanserumalbumin werden unter Rühren durch Zugabe von Kalilauge auf einen pH-Wert von 8,5 gebracht. 20 g DTPA (Merck), werden mit 20 g Essigsäureanhydrid p.a. und 25 ml Pyridin (Siedefraktion 113 - 116 ⁰C) im Wasserbad unter Rühren bei 60 - 65 ⁰C ca. 48 h erwärmt. Der Peststoff wird über eine G4-Pritte abgetrennt und mit wenig Pyridin gewaschen. Das Rohprodukt wird 3-fach aus einer Pyridinlösung, die 5 Vol. % Essigsäureanhydrid enthält, umkristallisiert und im Trockenschrank bei 70 ⁰C getrocknet. Das so erhaltene cyclische DTPA-Anhydrid weist eine Reinheit ^95 % auf.

Dieses zyklische DTPA-Anhydrid wird in wasserfreiem Pyridin mit einem Zusatz von 5 VoI % Essigsäureanhydrid gelöst. 4,5 ml," entsprechend 50 mg DTPA-Anhydrid, dieser Lösung werden mit Hilfe einer Mikrodosierpumpe kontinuierlich innerhalb einer Stunde zur HSA-Lösung gegeben.

Das molare Verhältnis von DTPA-Anhydrid zu HSA beträgt 1:*I. Die Reaktion des DTPA-Anhydrid's mit dem HSA verläuft unter ständiger Kontrolle und Konstanthalten des pH-Wertes (pH = 8,5) mit Hilfe eines Titrierautomaten.

liach Beendigung der Reaktion kann der geringe Anteil an entstandener Diethylentriaminpentaessigsäure (<5 %) durch Dialyse, Gelchromatographie oder Ionenaustausch abgetrennt werden.

Derartig 1:1 modifiziertes HSA wird vorzugsweise mit

*1 Ί Tm "1*1*1

3-wertigen Metallionen, insbesondere ^J In, In, 6

Ga sowie den seltenen Erden komplexiert. Dieses 1:1 modifizierte HSA hat den Vorzug, daß der native Charakter des HSA weitgehend erhalten bleibt. Nachteilig ist die ungenügend spezifische Markierbarkeit mit dem in der Nuklearmedizin bevorzugten ¹²¹Tc. Eine ausreichend hohe spezifische Markierbarkeit damit kann nur durch Kopplung einer größeren Anzahl von DTPA-Gruppen erreicht werden, wie sie das folgende Beispiel beschreibt.

10,65 g durch Dialyse gereinigtes Humanserumalbuiain werden in 230 ml Wasser gelöst und durch Zugabe von 55 ml 5 m HaCl-Lsg, die Ionenstärke eingestellt. Die Dosierung von 559 mg DTPA-Anhydrid, gelöst in 45 ml Pyridin, das 5 Vol. % Essigsäureanhydrid enthält, erfolgt wie oben . Der pH-Wert beträgt während der Kopplung 8,3-8,5.

ÜTach Beendigung der Kopplungsreaktion werden alle Salze, das Pyridin und nicht gekoppeltes DTPA durch Dialyse abgetrennt. Anschließend wird die Lösung lyophilisiert, und man erhält das lagerungsfähige DTPA-HSA mit einem mittleren Kopplungsverhältnis DTPA/HSA von 8:1.

2. Kopplung von DTPA-Anhydrid^ an Humanserumalbuminmikrosphären

5 ml einer wäßrigen Suspension von 300 mg Humanserumalbuminmikrosphären werden auf pH 8,5 gebracht. Unter intensivem Rühren und Konstanthalten des pH-Wertes erfolgt bei Raumtemperatur die kontinuierliche Zugabe der DTPA-Anhydridlösung innerhalb von 10 Minuten mittels einer Mikrodosierpumpe. Es werden 8,74 mg DTPA-Anhydrid

in 700 /Ul 5 Vol. % Essigsäureanhydrid enthaltendem Pyridin gelöst. Das molare Verhältnis von DTPA-Anhydrid zu HSA beträgt 5:1.

Hach Beendigung der Reaktion und Sedimentation der Mikrosphären wird die überstehende Lösung, die nicht umgesetztes DTPA enthält, verworfen. DTPA-Reste werden durch mehrmaliges Waschen mit verdünnter Ammoniaklösung und Wasser entfernt, anschließend lassen sich die Mikrosphären durch mehrmaliges Waschen mit Aceton wieder entwässern.

ÜTach einer Markierung mit In können diese modifizierten HSA-MikroSphären bekanntermaßen zum Beispiel für die Myocard- und Lungendiagnostik eingesetzt werden.

3. Kopplung von DTPA-Anhydrid an Erythrocyten

Das aus 4 ml Vollblut gewonnene und mit isotonischer Kochsalzlösung 4 χ gewaschene Erythrocytensediment wird mit isotonischer Kochsalzlösung auf ein Volumen von 5 ml aufgefüllt und mit Hilfe des in Pkt. 1 genannten Titrierautomaten auf den pH-Wert des Vollblutes (pH 7,4) eingestellt. Unter vorsichtigem Rühren und Konstanthalten des pH-Wertes werden innerhalb 15 min 40 /Ul in wasserfreiem Pyridin mit 5 Vol. % Essigsäure-

—6 anhydrid gelöstes zyklisches DTPA-Anhydrid (1,34.10" Mol) zugegeben. Dabei werden ca. 50 % des DTPA-Anhydrid, entsprechend 6,9.10 Mol an die Erythrocyten gekoppelt. Diese modifizierten Erythrocyten können nach entsprechender Markierung in der Milz- und Herz-Kreislaufdiagnostik verwendet werden.

Claims (2)

1. Erfindungsanspruch

   1. Verfahren zur Herstellung von mit Chelat'bildnern gekoppelten Biomolekülen unter Verwendung von Säureanhydriden der Chelatbildner, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung oder Suspension der Biomoleküle mit dem in einer Reinheit ^ 95 % eingesetzten, in wasserfreiem Pyridin gelösten zyklischen Säureanhydrid eines Chelatbildners unter Zugabe eines wasserbindenden Mittels bei Konstanthaltung eines vorgewählten pH-Wertes eingesetzt wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Chelatbildner DTPA eingesetzt wird deren Anhydrid aus einer 5 Vol. % Essigsäureanhydrid enthaltenden Pyridinlösung mehrfach umkristalliert wird.