DD225718A1

DD225718A1 - Reinigungsverfahren von sulfatase durch affinitaetschromatografie

Info

Publication number: DD225718A1
Application number: DD26285584A
Authority: DD
Inventors: Hans-Hubert Heilmann; Gerald Mueller
Original assignee: Univ Berlin Humboldt
Priority date: 1984-05-09
Filing date: 1984-05-09
Publication date: 1985-08-07

Abstract

Das Verfahren kann Anwendung finden in der Medizin und Biotechnologie. Ziel der Erfindung ist die Entwicklung eines einfachen, spezifischen Reinigungsverfahrens aus sulfatase-haltigen Loesungen. Erfindungsgemaess wird das erreicht, indem Sulfatase-Substrate an einem hochmolekularen Traeger gebunden mit einer sulfatase-haltigen Loesung im Batch- oder Saeulenverfahren in Kontakt gebracht werden und die gebundene Sulfatase vom Traeger eluiert wird.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Reinigungsverfahren für Sulfatasen, die in der Medizin und Biotechnologie angewendet werden können.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Zur Isolierung und Reinigung von Proteinen und Enzymen werden in vielen Fällen chromatographische Methoden herangezogen. Die Affinitätschromatographie hat dabei besondere Bedeutung erlangt. Weiterhin zeichnet sie sich durch ihre hohe Spezifität aus. Die Affinitätschromatographie ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Ligand, der mit dem zu isolierenden oder zu reinigenden Protein oder Enzym einen Komplex bildet, an eine unlösliche Matrix (hochmolekularer Träger) gebunden wird. Durch die direkte kovalente Bindung eines kleinen Liganden an den hochmolekularen Träger kommt es zu sterischer Behinderung zwischen dem hochmolekularen Träger und dem Enzym, das am Liganden binden soll. Deshalb wird ein Spacer zwischen hochmolekularem Träger und Liganden chemisch eingefügt.

Der gebildete Komplex aus Ligand und Protein oder Enzym muß dann unter bestimmten, für das zu isolierende oder zu reinigende Protein bzw. Enzym spezifischen Bedingungen gespalten werden, um diese biologischen Makromoleküle zu gewinnen.

Ein affinitätschromatographisches Verfahren für die Isolierung von Sulfatase aus menschlicher Leber wird in der Literatur beschrieben (Agogbua, S. I. O. &Wynn, C. H., Biochem. Soc. Trans. 3 [1975] 405-408; Agogbua, S. I. O. &Wynn, C. H., Biochem. J. 153(1976)415—421). Hierbei wird nachderDiazotierungdes4-Aminobenzamidoethyl-DerivatesvonSepharose4ß, 4-Hydroxy-2-nitrophenylsulfat bei pH 10,0 gekuppelt. Eigene Untersuchungen dazu ergaben zwar ebenfalls ein rötliches Gel, das jedoch keine Sulfatgruppen enthält. Die von den Autoren angegebene Struktur des Affinitätsgels scheint somit recht zweifelhaft, zumal die elektrophile Substitution von 4-Hydroxy-2-nitrophenylsulfat in 4-Stellung zur Nitrogruppe erfolgen soll. Weiterhin kann das bei der Diazotierung einwirkende Agens H₂NO₂ bzw. ON-OSOf auch andere im Gel vorhandene N-Atome elektrophil angreifen. In späteren Publikationen wird das von den obigen Autoren synthetisierte Affinitätsgel nicht mehr zur Isolierung von Sulfatasen verwendet.

Die in mehreren und zeitaufwendigen Schritten erfolgenden Isolier- und Reinigungsverfahren von Sulfatasen verlaufen bisher unter anderem über Anionen- bzw. Kationenaustauscherchromatographie an Diethylaminoethylcellulose bzw. Carboxymethylcellulose (Farooqui, A.A., Clin. Chim. Acta 100 [1980] 285-299; Fluharty, A. L & Edmond, J., Meth. Enzymol. 50 [1978] 537-547; Waheed, A. & Van Etten, R. L., Arch. Biochem. Biophys. 194 [1979] 215-225) oder Cibacron-ßlue-Sepharose (Ahmad, A., Surolia, A. & Bachhawat, B. K., Biochim. Biophys. Acta 481 [1977] 542-549). Sowohl das Lectin Concanavalin-A als auch der Farbstoff Cibacron Blue F3G-A haben ein weites Bindungsspektrum insbesondere gegenüber Glycoproteinen (Enzymen). Die bisher verwendeten chromatographischen Trennverfahren für die Isolierung von Sulfatasen sind somit nicht spezifisch.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein vereinfachtes, spezifisches Reinigungsverfahren für Sulfatasen aus sulfatasehaltigen Lösungen zu entwickeln.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Zur Isolierung bzw. Reinigung von Sulfatase werden erfindungsgemäß Sulfatase-Substrate an einen hochmolekularen Träger gebunden, die immobilisiert nicht durch Sulfatase abbaubar sind und mit einer sulfatasehaltigen Lösung in Kontakt gebracht. Die Wechselwirkung der Enzymlösung mit den immobilisierten Substraten erfolgt bei Temperaturen von 4°C bis Zimmertemperatur und bei pH-Werten von 5-7.

Die Reinigungsmethode kann sowohl im Batch- als auch im Säulenverfahren durchgeführt werden. Im Säulenverfahren wird die gebundene Sulfatase durch Erhöhung der lonenstärke des Elutionsmittels mit Hilfe eines ünearen Gradienten von 0-1 mol/l NaCI eluiert. Im Batch-Verfahren wird die gebundene Sulfatase mit Hilfe des Ausgangspuffers, der 1 mol/l NaCI enthält, eluiert. Aus der Proteinfraktion mit Sulfatase-Aktivität wird nach Dialyse die gereinigte Sulfatase anschließend durch Lyophilisation erhalten.

Als Sulfatase-Substrate im Sinne der Erfindung kommen solche Substanzen in Frage, die funktionell Gruppen, wie NH₂-oderr -COOH-Gruppen enthalten, die eine kovalente Bindung über einen Spacer an den Träger erlauben. Vorzugsweise sind das Substrate, wie 5-Amino-2-hydroxyphenylsulfat, 5-Carboxy-2-hydroxyphenylsulfat und (1',4'-Butandicarbonsäure-1'-amido)-2-hydroxyphenylsulfat. Verfahren zur Herstellung solcher Substanzen sind bekannt. Als Spacermoleküle im Sinne der Erfindung kommen solche Substanzen in Frage, die funktioneile Gruppen enthalten, die eine kovalente Bindung sowohl an die Sulfatase-Substrate als auch an den Träger erlauben. Vorzugsweise sind das Spacermoleküle, wie 6-Aminohexansäure, Adipinsäuredihydrazid oder deren Vielfachen. Als Trägermaterialien im Sinne der Erfindung kommen solche hochpolymeren Substanzen in Frage, die unlöslich, makroporös und leicht mit Hilfe herkömmlicher und bekannter Methoden zu aktivieren

sind. Die Aktivierung von Agarose mit BrCN und die Umsetzung mit 6-Aminohexansäure erfolgt analog; P. Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245 (1970) 3059-3065. Bis zu einer Konzentration von 5mmo1/l 5-Amino-2-hydroxyphenylsuifat besitzt das Affinitätsgel eine hohe Bindungskapazität von 2,2 mg Protein/μΓηοΙ kovalent gebundenem 5-Amino-2-hydroxyphenylsulfat bzw. 6,6 mg Protein/ml Gel gegenüber der Sulfatase.

Die nach diesen Verfahren präparierten Suifatase-Produkte weisen 11,5mal (Säulenverfahren) bzw. 6,5mal (Batchverfahren) höhere Aktivitäten auf als die käufliche Sulfatase. Im Gegensatz zu den in der Literatur verwendeten Reinigungsverfahren (lonenaustauscherchromatographie und Affinitätschromatographie an Con-A-Sepharose bzw. Cibacron-Blue-Sepharose) ist das hier beschriebene Verfahren einfacher und spezifischer. _i \

Ausführungsbeispiele Beispiel 1:

33 ml Agarose, die mit BrCN aktiviert und mit 6-Aminohexansäure umgesetzt werden, werden in einer 80-ml-Suspension von 0,2 mol/i KCI mit 0,13g (0,5mmol) 5-Amino-2-hydroxyphenylsulfat versetzt und mit1 mol/l HCI auf pH4,5 eingestellt. Anschließend werden unter starkem Rühren 0,19g (1,0mmol) N-Ethyl-N'-O-dimethylaminopropyD-carbodiimidhydrochlorid portionsweise innerhalb von 10 Minuten hinzugefügt und der pH zwischen 4,5-4,7 durch Zugabe von 1 mol/l NaOH bzw. 1 mol/l HCI gehalten. Nach 2-3 Stunden ist der pH-Wert relativ konstant, und die Suspension wird noch 24 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach dem Absaugen wird das Affinitätsgel nacheinander mit 600ml 0,2 mol/l KCI und 1 200ml Wasser gewaschen.

Für die Affinitätschromatographie werden 9,6ml Gel mehrmals mit einem Pyridin/Essigsäure-Puffer, 0,05 mol/l, pH 6,5 gewaschen und in eine kleine Säule (15,0cm Höhe χ 0,9cm Durchmesser) gefüllt. 8,6mg Sulfatase (Helix pomatia) mit einem Proteingehalt von 2,4mg werden in 1,5ml Pyridin/Essigsäure-Puffer, 0,05 mol/l pH 6,5 gelöst und auf die Säule aufgegeben. Die Durchfiußrate beträgt 3,0ml pro Stunde, und jeweils 3,0-ml-Fraktionen werden gesammelt. Nach dem Äquilibrieren der Säule mit 45,0ml Ausgangspuffer wird die lonenstärke des Elutionsmittels mit Hilfe eines linearen Gradienten innerhalb von 32 Stunden von 0-1 mol/l NaCI erhöht und die Elution danach beendet. In den gesammelten Fraktionen wird die Sulfatase-Aktivität mit Hilfe des Substrats 2-Hydroxy-5-nitrophenylsulfat und der Proteingehalt mit Hilfe der Coomassie-Brilliant-Blau-Methode bestimmt. Die in Fraktion 22 eluierte Sulfatase (Proteingehalt: 0,3mg) hat nach der Dialyse eine 11,5mal höhere spezifische Aktivität als die Ausgangssulfatase.

Beispiel 2:

0,5ml des Affinitätsgels, das nach Beispiel 1 synthetisiert wurde, wird mit einem Pyridin/Essigsäure-Puffer, 0,05 mol/l, pH 6,0 mehrmals gewaschen und in 1,0 ml desselben Puffers suspendiert. Nach der Zugabe von 1,0 m| einer sulfatasehaltigen Lösung (2,9mg Protein) wird nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur im Überstand keine Sulfatase-Aktivität mehr nachgewiesen. Das Gel wird mit dem Ausgangspuffer gewaschen, und die gebundene Sulfatse wird durch Elution mit Hilfe des Ausgangspuffers, der 1,0 mol/l NaCI enthält, in Freiheit gesetzt (Proteingehalt 0,35 mg). Dienach der Dialyse bestimmte spezifische Sulfatase-Aktivität ist 6,5mal höher als in der Ausgangslösung.

Ablauf plan:

Reinigungsverfahren von Sulfatase nach Anspruch

	Säulenverf ahren	Bindung des Sulfat ase sub st rat s


hochmolekularer, nicht löslicher Träger

		Zugabe der Sulfatase-
		haltigen Lösung




Aktivierung		Batchverfahren ] : . "I
	I

Bindong des Spacer













Affinitätsgel

Xquilibri eren

Sluieren

DialysLeren

Lyophilisieren

j gereinigte Sulfatase

Claims

Erfindungsansprüche:

1. Reinigungsverfahren von Sulfatase durch Affinitätschromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß man Sulfatase-Substrate an einen hochmolekularen Träger bindet, mit einer Sulfatase-haltigen Lösung im Batch- oder Säulenverfahren in Kontakt bringt und die gebundene Sulfatase vom Träger in an sich bekannter Weise eluiert.

2. Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Sulfatase-Substrate 5-Amino-2-hydroxyphenylsulfat, 5-Carboxy-2-hydroxyphenylsulfat oder Derivate dieser Verbindungen eingesetzt werden.

3. Reinigungsverfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Sulfatase-Substrate über einen Spacer, vorzugsweise über 6-Aminohexansäure oder Adipinsäuredihydrazid oder deren Vielfachen, an den Träger gebunden werden.

4. Reinigungsverfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger Agarose oder Polyacrylamid eingesetzt werden.

5. Reinigungsverfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß 5-Amino-2-hydroxyphenylsülfat an Agaiose, nach erfolgter BrCN-Aktivierung und Umsetzung mit

6-Aminohexansäure, bis zu einem Bindungsgrad von 5mmol/l bzw. 100mmol/kg ankondensiert wird.

Hierzu 1 Seite Tabelle