DD229595A1

DD229595A1 - METHOD FOR THE PRODUCTION OF CHELATE FIXED BIOMOLECULARS

Info

Publication number: DD229595A1
Application number: DD27083984A
Authority: DD
Inventors: Bernhard Noll; Renate Beyer
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1984-12-14
Filing date: 1984-12-14
Publication date: 1985-11-13

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Chelatbildnern enthaltenden und dadurch zur Komplexbildung mit Metallionen befaehigten biologisch wirksamen Verbindungen, beispielsweise Proteine, Antikoerper, Enzyme, Hormone, Polysaccharide, lebende Zellen (im weiteren Biomolekuele genannt). Derartige Komplexverbindungen der modifizierten Biomolekuele mit radioaktiven oder auch inaktiven Metallionen werden insbesondere in der Human- und Veterinaermedizin zu diagnostischen Zwecken sowohl in vivo als auch in vitro eingesetzt. Die aus dem Stand der Forschung und dem Ziel der Erfindung resultierende Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von mit Chelatbildnern gekoppelten Biomolekuelen zu schaffen, das es erlaubt, die Herstellungsbedingungen dem jeweiligen Biomolekuel anzupassen und somit Chelatbildner enthaltende Biomolekuele mit definierten komplexchemischen Eigenschaften zu erhalten. Erfindungsgemaess wird diese Aufgabe dadurch geloest, dass eine Loesung oder Suspension der Biomolekuele mit dem in einer Reinheit 95% eingesetzten, in wasserfreien Pyridin geloesten zyklischen Saeureanhydrid eines Chelatbildners unter Zugabe eines wasserbindenden Mittels bei Konstanthaltung eines vorgewaehlten p H-Wertes eingesetzt wird.The invention relates to the preparation of biologically active compounds containing chelating agents and thereby capable of complexing with metal ions, for example proteins, antibodies, enzymes, hormones, polysaccharides, living cells (referred to below as biomolecules). Such complex compounds of the modified biomolecules with radioactive or inactive metal ions are used in particular in human and veterinary medicine for diagnostic purposes both in vivo and in vitro. The object resulting from the state of the art and the aim of the invention is to provide a process for the preparation of biomolecules coupled with chelating agents, which makes it possible to adapt the production conditions to the respective biomolecule and thus to obtain chelating agents containing biomolecules with defined complex-chemical properties. According to the invention, this object is achieved by using a solution or suspension of the biomolecules with the cyclic acid anhydride of a chelating agent dissolved in anhydrous pyridine with the addition of a water-binding agent while maintaining a preselected p H value.

Description

/I/ I

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Chelatbildnern enthaltenden und dadurch zur Komplexbildung mit Metallionen befähigten biologisch wirksamen Verbindungen, beispielsweise Proteine, Antikörper, Enzyme, Hormone, Polysaccharide, lebende Zellen (im weiteren Biomoleküle genannt). Derartige Komplexverbindungen der modifizierten Biomoleküle mit radioaktiven oder auch Inaktiven Metallionen werden insbesondere in der Human- und Veterinärmedizin zu . diagnostischen Zwecken sowohl in vivo als auch in vitro eingesetzt.The invention relates to the preparation of biologically active compounds containing chelating agents and thereby capable of complexing with metal ions, for example proteins, antibodies, enzymes, hormones, polysaccharides, living cells (referred to below as biomolecules). Such complexes of modified biomolecules with radioactive or inactive metal ions are particularly in human and veterinary medicine. used for diagnostic purposes both in vivo and in vitro.

Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions

Versuche zur Herstellung mit Chelatbildnern gekoppelter Biomoleküle werden ausgehend von den cyclischen Anhydriden der Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), beziehungsweise Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) w^HP&efl- an Humanserumalbumin, Humanserumalbumin-Mikrosphären, Fibrinogen, Antikörpern und Heparin durchgeführt.Attempts to prepare biomolecules coupled with chelating agents are carried out starting from the cyclic anhydrides of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) .sub.WHP and ef- human serum albumin, human serum albumin microspheres, fibrinogen, antibodies and heparin.

Die ungenügende Reproduzierbarkeit der Kopplungsreaktion, die sich aus der Verwendung der Anhydride in fester Form ergibt /D.J. Hnatowich, W.W. Layne, R.L. Childa Int. J. Appl. Radist. Isot. 33 (1982) 327-32/lassen die beschriebenen Methoden für eine Routineanwendung in der Eh.armakaprod.uktion ungeeignet erscheinen. Als Verbesserung erweist sich der Einsatz von in Chloroform, DirnethylsuIfoxid oder Acetonitril gelöstem Anhydrid der DTPA. Selbst unter diesen Bedingungen gelingt es jedoch nicht, bei einem Molverhält-Insufficient reproducibility of the coupling reaction resulting from the use of the anhydrides in solid form / D. Hnatowich, W.W. Layne, R.L. Childa Int. J. Appl. Radist. Iseult. 33 (1982) 327-32 /, the methods described appear to be unsuitable for routine use in the eighth armaccouction. An improvement is the use of DTPA anhydride dissolved in chloroform, dimethylsulfoxide or acetonitrile. Even under these conditions, however, it is impossible to

nis von DTPA-Anhydrid/Bioraolekül von 1:1 mehr als 0,7 Mol DTPA pro Mol Biomolekül zu koppeln /a.a.O/, was möglicherweise auf schnelle Hydrolyse oder ungenügende Reinheit des DTPA-Anhydrid zurückzuführen ist. Bachteilig bei allen bisher bekannten Verfahren zur Kopplung von Ghelatbildnern an gelöste Biomoleküle ist die Tatsache, daß man bestimmte Puffersysteme benötigt, wobei sich Infolge der begrenzten Pufferkapazität der pH-Wert während der Kopplungsreaktion ändern kann /CH. Paik, I.A. Ebbert, P.R. Murphy, CR. Lassmann et al. J. EuCl. Med. 24 (1983) 1158-63/. Es gibt außerdem Hinweise darauf, daß der Puffer selbst die Effektivität der Kopplungsreaktion dadurch beeinflußt, daß die als Konkurrenzreaktion auftretende Hydrolyse des DTPA-Anhydrid in unterschiedlichen Puffern verschieden schnell verläuft /D.J. Hnatowich, W.W. Layne, R.L. Childs, Int. J. Appl. Radiat. Isot. 33 (1982) 327-32; CH. Paik, M.A. Ebbert, P.R. Murphy, CR. Lassmann et al. J. Hucl. Med. 24 (1983) 1158-63/ so daß für jede Art von Biomolekülen eine Optimierung von Puffersystem und pH-Wert für die Kopplungsreaktion erfolgen muß und die Kopplungsmethode damit nicht universell einsetzbar ist.to couple more than 0.7 moles of DTPA per mole of biomolecule from DTPA anhydride / biornaecule 1: 1, possibly due to rapid hydrolysis or insufficient purity of the DTPA anhydride. Bach part of all previously known methods for coupling Ghelatbildnern to dissolved biomolecules is the fact that you need certain buffer systems, which may change due to the limited buffer capacity, the pH during the coupling reaction / CH. Paik, I.A. Ebbert, P.R. Murphy, CR. Lassmann et al. J. EuCl. Med. 24 (1983) 1158-63 /. There is also evidence that the buffer itself affects the effectiveness of the coupling reaction in that the hydrolysis of the DTPA anhydride occurring in competition with different buffers proceeds at different rates / D .J. Hnatowich, W.W. Layne, R.L. Childs, Int. J. Appl. Radiat. Iseult. 33 (1982) 327-32; CH. Paik, M.A. Ebbert, P.R. Murphy, CR. Lassmann et al. J. Hucl. Med. 24 (1983) 1158-63 / so that for each type of biomolecules an optimization of buffer system and pH for the coupling reaction must be made and the coupling method is therefore not universally applicable.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Das Ziel der Erfindung besteht darin, Biomoleküle in einer zur Komplexbildung mit Metallionen befähigten Form für den Einsatz in der Human- und Veterinärmedizin insbesondere zu diagnostischen Zwecken bereitzustellen.The object of the invention is to provide biomolecules in a form capable of complexing with metal ions for use in human and veterinary medicine, in particular for diagnostic purposes.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Die aus dem Stand der Forschung und dem Ziel der Erfindung resultierende Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von mit Chelatbildnern gekoppelten Biomolekülen zu schaffen, das es erlaubt, die Herstellungsbedingungen dem jeweiligen Biomolekül anzupassen und somit Chelatbildner enthaltende Biomoleküle mit definierten komplexchemischen Eigenschaften zu erhalten.The object resulting from the state of the art and the aim of the invention is to provide a process for the preparation of biomolecules coupled with chelating agents, which makes it possible to adapt the production conditions to the respective biomolecule and thus to obtain chelating agent-containing biomolecules with defined complex-chemical properties.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß eine Lösung oder Suspension der Biomoleküle mit dem in einerReinheit ^ 95 % eingesetzten, in wasserfreiem Pyridin gelösten zyklischen Säureanhydrid eines Chelatbildners unter Zugabe eines wasserbindenden Mittels bei Konstanthaltung eines vorgewählten pH-Wertes eingesetzt wird.According to the invention, this object is achieved by using a solution or suspension of the biomolecules with the cyclic acid anhydride of a chelating agent used in a purity of 95 % and dissolved in anhydrous pyridine with the addition of a water-binding agent while maintaining a preselected pH.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen darin, daß die Konzentration der Lösung des'Säureanhydrids reproduzierbar und in einem größeren Bereich frei wählbar ist. Die Hydrolyse des Anhydrids wird durch den Zusatz des wasserbindenden Mittels unterdrückt und damit die Ausbeute stabilisiert. Die Biomoleküle können in nativer Form als Lösung und in denaturierter Form als Suspension eingesetzt werden, wobei Volumen und Konzentration sowohl der Lösung als auch der Suspension in weiten Grenzen frei wählbar sind. Vorteilhaft ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, daß bei beliebig einstellbarer Ionenstärke gearbeitet werden kann und daß der pH-Wert frei wählbar ist. Das raaolare Verhältnis von Säureanhydrid des Chelatbildners und Biomolekül ist auf Grund der hohen Reinheit exakt bestimmbar und frei wählbar,The advantages of the method according to the invention are that the concentration of the solution of the acid anhydride is reproducible and freely selectable over a relatively large range. The hydrolysis of the anhydride is suppressed by the addition of the water-binding agent and thus the yield is stabilized. The biomolecules can be used in a native form as a solution and in a denatured form as a suspension, wherein the volume and concentration of both the solution and the suspension can be freely selected within wide limits. It is advantageous in the process according to the invention that it is possible to work with any desired ionic strength and that the pH value can be selected freely. The raaolare ratio of acid anhydride of the chelating agent and biomolecule is due to the high purity exactly determinable and freely selectable,

so daß es möglich, wird, je nach dem vorgesehenen Verwendungszweck die erforderliche Menge Chelatbildner an die Biomoleküle zu koppelnso that it becomes possible, depending on the intended use, to couple the required amount of chelating agent to the biomolecules

Die erfindungsgeniäß hergestellten Lösungen oder Suspensionen von Chelatgruppen enthaltenden Biomolekülen enthalten nur geringe Mengen an freiem Chelatbildner, wodurch die Reinigung des Endproduktes verkürzt und eine hohe Ausbeute inbezug auf das eingesetzte Säureanhydrid des Chelatbildners erreicht wird. Mit dem dargestellten Verfahren können u.a. die cyclischen Säureanhydride· der Ethylendiamintetraessigsäure und der Diethylentriaminpentaessigsäure an Biomoleküle gekoppelt werden, wobei die Kopplung von DTPA-Anhydrid wegen der hohen Stabilität von DTPA-Komplexen bevorzugt wird. The erfindungsgeniäß prepared solutions or suspensions of chelating biomolecules contain only small amounts of free chelating agent, whereby the purification of the final product is shortened and a high yield in relation to the acid anhydride used of the chelating agent is achieved. With the illustrated method, i.a. the cyclic acid anhydrides of ethylenediaminetetraacetic acid and diethylenetriaminepentaacetic acid are coupled to biomolecules, the coupling of DTPA anhydride being preferred because of the high stability of DTPA complexes.

Diese Stabilität ist von großer Bedeutung, da die erfind ungs gemäß modifizierten und mit Metallionen komplexierten Biomoleküle im Rahmen der human- und veterinärmedizinischen Diagnostik in vivo angewendet werden sollen.This stability is of great importance, since the invention modified according to modified and complexed with metal ions biomolecules in the context of human and veterinary diagnostics in vivo to be applied.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren erforderliche Reinheit des cyclischen Anhydrids DTPA wird vorteilhaft dadurch erzielt, daß das Anhydrid der DTPA aus einer 5 Vol% Essigsäureanhydrid enthaltenden Pyridinlösung mehrfach umkristallisiert wird.The purity of the cyclic anhydride DTPA required for the process according to the invention is advantageously achieved by repeatedly recrystallizing the anhydride of the DTPA from a pyridine solution containing 5% by volume of acetic anhydride.

Ausführungsbeispielembodiment

Die Erfindung soll an nachfolgenden Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail in subsequent embodiments.

1. Kopplung von DTPA-Anhydrid an Humanserumalbumin (HSA)1. Coupling of DTPA Anhydride to Human Serum Albumin (HSA)

20 ml einer wäßrigen 10 %igen Lösung von Humanserumalbumin werden unter Rühren durch Zugabe von Kalilauge auf einen pH-Wert von 8,5 gebracht. 20 g DTPA (Merck), werden mit 20 g Essigsäureanhydrid p.a. und 25 ml Pyridin (Siedefraktion 113 - 116 ⁰C) im Wasserbad unter Rühren bei 60 - 65 ⁰C ca. 48 h erwärmt. Der Peststoff wird über eine G4-Pritte abgetrennt und mit wenig Pyridin gewaschen. Das Rohprodukt wird 3-fach aus einer Pyridinlösung, die 5 Vol. % Essigsäureanhydrid enthält, umkristallisiert und im Trockenschrank bei 70 ⁰C getrocknet. Das so erhaltene cyclische DTPA-Anhydrid weist eine Reinheit ^95 % auf.20 ml of an aqueous 10% solution of human serum albumin are brought to a pH of 8.5 with stirring by the addition of potassium hydroxide solution. 20 g of DTPA (Merck) are heated with 20 g of acetic anhydride pa and 25 ml of pyridine (boiling fraction 113-116 ⁰ C) in a water bath with stirring at 60-65 ⁰ C for about 48 h. The pesticide is separated on a G4-Pritte and washed with a little pyridine. The crude product is recrystallized 3 times from a pyridine solution containing 5 vol.% Acetic anhydride and dried in a drying oven at 70 ⁰ C. The cyclic DTPA anhydride thus obtained has a purity of 95 95 % .

Dieses zyklische DTPA-Anhydrid wird in wasserfreiem Pyridin mit einem Zusatz von 5 VoI % Essigsäureanhydrid gelöst. 4,5 ml," entsprechend 50 mg DTPA-Anhydrid, dieser Lösung werden mit Hilfe einer Mikrodosierpumpe kontinuierlich innerhalb einer Stunde zur HSA-Lösung gegeben.This cyclic DTPA anhydride is dissolved in anhydrous pyridine with an addition of 5 % by volume of acetic anhydride. 4.5 ml, corresponding to 50 mg of DTPA anhydride, of this solution are continuously added to the HSA solution within one hour using a microdosing pump.

Das molare Verhältnis von DTPA-Anhydrid zu HSA beträgt 1:*I. Die Reaktion des DTPA-Anhydrid's mit dem HSA verläuft unter ständiger Kontrolle und Konstanthalten des pH-Wertes (pH = 8,5) mit Hilfe eines Titrierautomaten.The molar ratio of DTPA anhydride to HSA is 1: * I. The reaction of the DTPA anhydride with the HSA proceeds under constant control and keeping the pH constant (pH = 8.5) with the aid of a titration machine.

liach Beendigung der Reaktion kann der geringe Anteil an entstandener Diethylentriaminpentaessigsäure (<5 %) durch Dialyse, Gelchromatographie oder Ionenaustausch abgetrennt werden.After completion of the reaction, the small proportion of diethylenetriaminepentaacetic acid formed (<5%) can be separated off by dialysis, gel chromatography or ion exchange.

Derartig 1:1 modifiziertes HSA wird vorzugsweise mitSuch a 1: 1 modified HSA is preferably with

*1 Ί Tm "1*1*1* 1 Ί Tm "1 * 1 * 1

3-wertigen Metallionen, insbesondere ^J In, In, 63-valent metal ions, in particular ^J In, In, 6

Ga sowie den seltenen Erden komplexiert. Dieses 1:1 modifizierte HSA hat den Vorzug, daß der native Charakter des HSA weitgehend erhalten bleibt. Nachteilig ist die ungenügend spezifische Markierbarkeit mit dem in der Nuklearmedizin bevorzugten ¹²¹Tc. Eine ausreichend hohe spezifische Markierbarkeit damit kann nur durch Kopplung einer größeren Anzahl von DTPA-Gruppen erreicht werden, wie sie das folgende Beispiel beschreibt.Ga and the rare earth complexed. This 1: 1 modified HSA has the advantage that the native character of the HSA is largely retained. The disadvantage is the insufficient specific markability with the preferred in nuclear medicine ¹²¹ Tc. A sufficiently high specific markability with it can be achieved only by coupling a larger number of DTPA groups, as described in the following example.

10,65 g durch Dialyse gereinigtes Humanserumalbuiain werden in 230 ml Wasser gelöst und durch Zugabe von 55 ml 5 m HaCl-Lsg, die Ionenstärke eingestellt. Die Dosierung von 559 mg DTPA-Anhydrid, gelöst in 45 ml Pyridin, das 5 Vol. % Essigsäureanhydrid enthält, erfolgt wie oben . Der pH-Wert beträgt während der Kopplung 8,3-8,5.10.65 g of purified by dialysis Humanserumalbuiain be dissolved in 230 ml of water and adjusted by the addition of 55 ml of 5 m HaCl solution, the ionic strength. The dosage of 559 mg of DTPA anhydride dissolved in 45 ml of pyridine containing 5 % by volume of acetic anhydride is as above. The pH during the coupling is 8.3-8.5.

ÜTach Beendigung der Kopplungsreaktion werden alle Salze, das Pyridin und nicht gekoppeltes DTPA durch Dialyse abgetrennt. Anschließend wird die Lösung lyophilisiert, und man erhält das lagerungsfähige DTPA-HSA mit einem mittleren Kopplungsverhältnis DTPA/HSA von 8:1.After completion of the coupling reaction, all salts, pyridine and non-coupled DTPA are separated by dialysis. The solution is then lyophilized to give the storable DTPA-HSA with an average DTPA / HSA coupling ratio of 8: 1.

2. Kopplung von DTPA-Anhydrid^ an Humanserumalbuminmikrosphären2. Coupling of DTPA anhydride to human serum albumin microspheres

5 ml einer wäßrigen Suspension von 300 mg Humanserumalbuminmikrosphären werden auf pH 8,5 gebracht. Unter intensivem Rühren und Konstanthalten des pH-Wertes erfolgt bei Raumtemperatur die kontinuierliche Zugabe der DTPA-Anhydridlösung innerhalb von 10 Minuten mittels einer Mikrodosierpumpe. Es werden 8,74 mg DTPA-Anhydrid5 ml of an aqueous suspension of 300 mg human serum albumin microspheres are brought to pH 8.5. Under intensive stirring and keeping the pH constant, the continuous addition of the DTPA anhydride solution takes place within 10 minutes at room temperature by means of a microdosing pump. There are 8.74 mg of DTPA anhydride

in 700 /Ul 5 Vol. % Essigsäureanhydrid enthaltendem Pyridin gelöst. Das molare Verhältnis von DTPA-Anhydrid zu HSA beträgt 5:1.dissolved in 700 / Ul 5 vol. % Acetic anhydride containing pyridine. The molar ratio of DTPA anhydride to HSA is 5: 1.

Hach Beendigung der Reaktion und Sedimentation der Mikrosphären wird die überstehende Lösung, die nicht umgesetztes DTPA enthält, verworfen. DTPA-Reste werden durch mehrmaliges Waschen mit verdünnter Ammoniaklösung und Wasser entfernt, anschließend lassen sich die Mikrosphären durch mehrmaliges Waschen mit Aceton wieder entwässern.After completion of the reaction and sedimentation of the microspheres, the supernatant solution containing unreacted DTPA is discarded. DTPA residues are removed by repeated washing with dilute ammonia solution and water, then the microspheres can be dewatered by repeated washing with acetone.

ÜTach einer Markierung mit In können diese modifizierten HSA-MikroSphären bekanntermaßen zum Beispiel für die Myocard- und Lungendiagnostik eingesetzt werden.After labeling with In, these modified HSA microspheres can be used, for example, for myocardial and lung diagnostics.

3. Kopplung von DTPA-Anhydrid an Erythrocyten3. Coupling of DTPA anhydride to erythrocytes

Das aus 4 ml Vollblut gewonnene und mit isotonischer Kochsalzlösung 4 χ gewaschene Erythrocytensediment wird mit isotonischer Kochsalzlösung auf ein Volumen von 5 ml aufgefüllt und mit Hilfe des in Pkt. 1 genannten Titrierautomaten auf den pH-Wert des Vollblutes (pH 7,4) eingestellt. Unter vorsichtigem Rühren und Konstanthalten des pH-Wertes werden innerhalb 15 min 40 /Ul in wasserfreiem Pyridin mit 5 Vol. % Essigsäure-The erythrocyte sediment obtained from 4 ml of whole blood and washed with isotonic saline solution 4 × is made up to a volume of 5 ml with isotonic saline solution and adjusted to the pH of the whole blood (pH 7.4) using the titration machine mentioned in point 1. With gentle stirring and keeping the pH constant, 40 / UI in anhydrous pyridine with 5 % by volume of acetic acid are dissolved within 15 min.

—6 anhydrid gelöstes zyklisches DTPA-Anhydrid (1,34.10" Mol) zugegeben. Dabei werden ca. 50 % des DTPA-Anhydrid, entsprechend 6,9.10 Mol an die Erythrocyten gekoppelt. Diese modifizierten Erythrocyten können nach entsprechender Markierung in der Milz- und Herz-Kreislaufdiagnostik verwendet werden.Cyclic DTPA anhydride (1.34.10 "mol) dissolved in the anhydride is added, whereby about 50% of the DTPA anhydride, corresponding to 6.9.10 moles, is coupled to the erythrocytes.These modified erythrocytes can be detected in the spleen and spleen after appropriate labeling Cardiovascular diagnostics are used.

Claims

invention claim

1. A process for the preparation of coupled with chelating biomolecules using acid anhydrides of the chelating agent, characterized in that a solution or suspension of the biomolecules with the used in a purity ^ 95 % dissolved in anhydrous pyridine cyclic acid anhydride of a chelating agent with the addition of a water binding agent is used when maintaining a preselected pH value.

2. The method according to item 1, characterized in that is used as the chelating agent DTPA whose anhydride from a 5 vol. % Acetic anhydride-containing pyridine solution is recrystallized several times.