CN112920399A - 吖啶化合物标记类固醇激素衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域，具体而言，提供了一种吖啶化合物标记类固醇激素衍生物及其制备方法和应用。本发明提供的吖啶化合物标记类固醇激素衍生物，吖啶化合物与类固醇激素衍生物以改性聚乙二醇作为桥连物实现连接。该吖啶化合物标记类固醇激素衍生物发光性能好，检测灵敏度高，假阳率低，产品的产率高且性能稳定。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体而言，涉及一种吖啶化合物标记类固醇激素衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
目前，在免疫分析领域中应用多种免疫分析方法，其中化学发光免疫分析(CLIA)是将免疫反应和化学发光反应相结合，借以检测抗原或抗体的技术。它是将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，免疫反应结束后，加入氧化剂或酶底物而发光，通过测量发射光强度，根据标准曲线测定待测物的浓度。CLIA的主要优点是灵敏度高、标记物有效期长、检测范围宽，可实现全自动化等。该方法已经广泛应用于病毒学、内分泌学、肿瘤学、生殖生理学、血液学、遗传学等医学和生物学各科的临床和科研工作中。其中直接化学发光免疫分析中会用到吖啶类的标记结合物，吖啶酯类的标记结合物的结构性质直接关系到发光分析试剂的性能。
类固醇激素(Steroid hormone)是具有生物活性的有机化合物，具有以特定分子构型排列的四个环。类固醇核心结构由十七个碳原子组成，键合在四个“稠合”环中：三个六元环己烷环和一个五元环戊烷环。类固醇因附着于该四环核心的官能团和环的氧化态而不同。
在直接化学发光免疫试剂中，类固醇激素的检测方法学通常采用竞争法，使用一种高亲和力的抗体，样本中的内源性类固醇激素与吖啶类物质标记的类固醇激素衍生物竞争结合抗体。类固醇激素衍生物通常为含羧基末端基团的衍生物，不能直接使用吖啶类物质进行标记，一般使用含有2个以上伯氨的蛋白或短肽进行桥连接。
使用蛋白或短肽等活性物质，由于分子量的差异交联后容易产生空间位阻，影响类固醇激素衍生物标记后与抗体的结合。蛋白或短肽等生物活性物质的生产容易产生批间差异，使用其做为桥连物质会影响类固醇激素衍生物标记物的批间一致性。此外，使用蛋白或短肽等生物活性物质做为桥连物，在免疫反应中容易产生非特异的吸附，对试剂的性能造成影响。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种吖啶化合物标记类固醇激素衍生物，以缓解现有技术中该类标记物溶解度和稳定性较差，检测假阳性结果较多的问题。
本发明的第二目的在于提供一种吖啶化合物标记类固醇激素衍生物的制备方法，以缓解现有技术中制备方法空间位阻影响大，批间差较大，并且产品稳定性较差的问题。
本发明的第三目的在于提供上述吖啶化合物标记类固醇激素衍生物在化学发光免疫分析中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种吖啶化合物标记类固醇激素衍生物，吖啶化合物与类固醇激素衍生物以改性聚乙二醇作为桥连物实现连接；
所述改性聚乙二醇的两端各至少连接有一个氨基。
进一步地，所述改性聚乙二醇包括氨基聚乙二醇氨基及其衍生物或多臂聚乙二醇氨基；
优选地，所述改性聚乙二醇的平均分子量为400-40000，优选为1000-5000。
进一步地，所述类固醇激素衍生物包括孕酮、睾酮、雌二醇、雌三醇、皮质醇、维生素D2或维生素D3中任一种的衍生物；
优选地，吖啶化合物包括吖啶酯或吖啶磺酰胺。
进一步地，所述类固醇激素衍生物为含有羧基衍生基团的类固醇激素衍生物；
优选地，羧基衍生基团包括羧甲基肟或半琥珀酸。
上述吖啶化合物标记类固醇激素衍生物的制备方法，以改性聚乙二醇作为桥连物，将吖啶化合物与类固醇激素衍生物连接，得到吖啶化合物标记类固醇激素衍生物。
进一步地，吖啶化合物、改性聚乙二醇和类固醇激素衍生物的摩尔比为(1-10)：(0.5-20)：1，优选为(4-6)：(0.5-1.5)：1。
进一步地，将类固醇激素衍生物活化后与改性聚乙二醇偶联，再与吖啶化合物连接，所述类固醇激素衍生物为含有羧基衍生基团的类固醇激素衍生物；
优选地，将改性聚乙二醇与吖啶化合物偶联，再与活化后的类固醇激素衍生物连接，所述类固醇激素衍生物为含有羧基衍生基团的类固醇激素衍生物；
优选地，将活化剂加入类固醇激素衍生物、改性聚乙二醇和吖啶化合物混合物中连接，所述类固醇激素衍生物为含有羧基衍生基团的类固醇激素衍生物。
进一步地，含有羧基衍生基团的类固醇激素衍生物的活化方法包括碳化二亚胺法；
优选地，活化用活化剂包括EDC、EDC和NHS、DCC或DIC。
进一步地，吖啶化合物与类固醇激素衍生物连接后还包括封闭的步骤，再得到吖啶化合物标记类固醇激素衍生物；
优选地，封闭用封闭剂包括甘氨酸、精氨酸、Tris缓冲液或BSA。
上述吖啶化合物标记类固醇激素衍生物在化学发光免疫分析中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的吖啶化合物标记类固醇激素衍生物，吖啶化合物与类固醇激素衍生物以改性聚乙二醇作为桥连物实现连接，其中，改性聚乙二醇的两端各至少连接有一个氨基。该物质发光性能好，检测灵敏度高，同时稳定性好，假阳率低。将桥连接的蛋白或短肽替换改性聚乙二醇，避免使用蛋白或短肽等活性物质做桥连物造成的由于分子量的差异交联后产生的空间位阻效应，避免空间位阻效应影响吖啶化合物标记类固醇激素衍生物与抗体的结合，此外，聚乙二醇可以增加吖啶化合物标记类固醇激素衍生物溶解度和稳定性，抑制吖啶化合物标记类固醇激素衍生物与其他物质的非特异性结合，提高试剂灵敏度和稳定性。
本发明提供一种吖啶化合物标记类固醇激素衍生物的制备方法，以改性聚乙二醇作为桥连物，将吖啶化合物与类固醇激素衍生物连接，得到吖啶化合物标记类固醇激素衍生物。该制备方法批间差较小，过程中空间位阻影响小，产品的产率高且性能稳定。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
一种吖啶化合物标记类固醇激素衍生物，吖啶化合物与类固醇激素衍生物以改性聚乙二醇作为桥连物实现连接，其中，改性聚乙二醇的两端各至少连接有一个氨基。
该物质发光性能好，检测灵敏度高，同时稳定性好，假阳率低。将桥连接的蛋白或短肽替换改性聚乙二醇，避免使用蛋白或短肽等活性物质做桥连物造成的由于分子量的差异交联后产生的空间位阻效应，避免空间位阻效应影响吖啶化合物标记类固醇激素衍生物与抗体的结合，此外，聚乙二醇可以增加吖啶化合物标记类固醇激素衍生物溶解度和稳定性，抑制吖啶化合物标记类固醇激素衍生物与其他物质的非特异性结合，提高试剂灵敏度和稳定性。
需要说明的是，桥连物是指连接两个或两个以上物质的中间物质；本发明的技术方案中是以改性聚乙二醇作为桥连物，用吖啶化合物标记类固醇激素衍生物，其中，是以改性聚乙二醇作为连接臂连接吖啶化合物和类固醇激素衍生物，所以，改性聚乙二醇的两端分别含有可以与吖啶化合物和类固醇激素衍生物发生偶联发应的官能团，也就是说，本领域常用的技术方案中，可以实现吖啶化合物-改性聚乙二醇-类固醇激素衍生物结构形式化合物的连接方式均属于本发明所要保护的范围，例如，类固醇激素衍生物上修饰有羧基，聚乙二醇的一端修饰有氨基与之反应，吖啶化合物上修饰有羧基，聚乙二醇的另一端修饰有氨基与之反应。
在优选地实施方式中，改性聚乙二醇包括氨基聚乙二醇氨基及其衍生物或多臂聚乙二醇氨基。需要说明的是，氨基聚乙二醇氨基是指NH2-PEG-NH2；多臂聚乙二醇氨基是指大约有3至10个分支臂，例如六臂PEG氨基(上海芃硕生物PS6-N-10K)的结构式如下：
在优选地实施方式中，改性聚乙二醇的平均分子量为400-40000，优选为1000-5000。改性聚乙二醇的平均分子量典型但非限制性的为400、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、12000、14000、16000、18000、20000、22000、24000、26000、28000、30000、32000、34000、36000、38000或40000。
在优选地实施方式中，类固醇激素衍生物包括孕酮、睾酮、雌二醇、雌三醇、皮质醇、维生素D2或维生素D3中任一种的衍生物。本发明中的类固醇激素可以为本领域常用到的类固醇激素，在此不作特定的限定，例如可以为孕酮、睾酮、雌二醇、雌三醇、皮质醇、维生素D2或维生素D3等等，优选为孕酮、雌二醇或睾酮。
在优选地实施方式中，吖啶化合物包括吖啶酯或吖啶磺酰胺。本发明中的吖啶化合物可以为本领域常用到的吖啶化合物，在此不作特定的限定，例如可以为吖啶酯或吖啶磺酰胺等等。
在优选地实施方式中，类固醇激素衍生物为含有羧基衍生基团的类固醇激素衍生物。含有羧基衍生基团的类固醇激素衍生物是指通过活化反应可以使得该类固醇激素修饰有羧基活性官能团，便于与改性聚乙二醇发生偶联反应，本发明中，羧基衍生基团可以为羧甲基肟、半琥珀酸等等。
本发明提供上述吖啶化合物标记类固醇激素衍生物的制备方法，以改性聚乙二醇作为桥连物，将吖啶化合物与类固醇激素衍生物连接，得到吖啶化合物标记类固醇激素衍生物。该制备方法批间差较小，过程中空间位阻影响小，产品的产率高且性能稳定。
在优选地实施方式中，吖啶化合物、改性聚乙二醇和类固醇激素衍生物的摩尔比为(1-10)：(0.5-20)：1，优选为(4-6)：(0.5-1.5)：1。吖啶化合物、改性聚乙二醇和类固醇激素衍生物的摩尔比例如可以但不限于为1：0.5:1、1:20:1、10:0.5:1、10:20:1、4:1.5:1、6:0.5:1或5:1:1。
在优选地实施方式中，将类固醇激素衍生物活化后与改性聚乙二醇偶联，再与吖啶化合物连接，类固醇激素衍生物为含有羧基衍生基团的类固醇激素衍生物。
在优选地实施方式中，将改性聚乙二醇与吖啶化合物偶联，再与活化后的类固醇激素衍生物连接，类固醇激素衍生物为含有羧基衍生基团的类固醇激素衍生物。
在优选地实施方式中，将活化剂加入类固醇激素衍生物、改性聚乙二醇和吖啶化合物混合物中连接，类固醇激素衍生物为含有羧基衍生基团的类固醇激素衍生物。
在本发明中改性聚乙二醇为桥连物，可以先于类固醇激素衍生物或吖啶化合物偶联，再与吖啶化合物或类固醇激素衍生物连接，也可以类固醇激素衍生物、改性聚乙二醇和吖啶化合物三者先放一起，再加活化剂(EDC等)一步反应，三种方式均可得到吖啶化合物标记类固醇激素衍生物。
在优选地实施方式中，含有羧基衍生基团的类固醇激素衍生物的活化方法包括碳化二亚胺法。碳化二亚胺为双功能试剂，先与羧基反应，再与氨基缩合，活化剂例如可以为EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、EDC和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、DCC(二环己基碳二亚胺)或DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)等等，优选为EDC和NHS。
在优选地实施方式中，吖啶化合物与类固醇激素衍生物连接后还包括封闭的步骤，再得到吖啶化合物标记类固醇激素衍生物。利用封闭剂将剩余未发应的活性官能团进行封闭，提高试剂的稳定性和准确性。封闭剂可以但不限于甘氨酸、精氨酸、Tris缓冲液或BSA，优选为甘氨酸。
在优选地实施方式中，以孕酮为例，羧基衍生基团为羧甲基肟，改性聚乙二醇为氨基聚乙二醇氨基，吖啶化合物为吖啶酯DMAE-NHS，具体的制备方法包括：
(a)将孕酮-3-(O-羧甲基)肟溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，浓度为10mg/ml，取100μl，按摩尔比1:1:1.2量加入EDC和NHS，EDC和NHS溶于0.1M PBS PH7.2中，浓度均为10mg/ml。室温反应15-30分钟，加入与孕酮-3-(O-羧甲基)肟0.5-20倍摩尔量的氨基聚乙二醇氨基(NH2-PEG-NH2)，氨基聚乙二醇氨基溶于0.1M PBS PH7.2缓冲液，室温反应1-2小时。
(b)将吖啶酯DMAE-NHS溶于DMF中，浓度为10mg/ml，向(a)反应完的溶液中加入1-10倍孕酮-3-(O-羧甲基)肟摩尔量的DMAE-NHS，室温反应1-2小时，加入10μl 1M甘氨酸，室温反应15-30分钟，最后使用0.1M PBS PH7.2缓冲液将反应完溶液按孕酮-3-(O-羧甲基)肟的质量定容为1mg/ml浓度，放置冰箱2-8度保存，得到吖啶酯标记孕酮衍生物。
本发明最后提供吖啶化合物标记类固醇激素衍生物在化学发光免疫分析中的应用。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
孕酮-3-(O-羧甲基)肟、睾酮-3-(O-羧甲基)肟、DMF、EDC、NHS、甘氨酸品牌为Sigma，DMAE-NHS品牌为赫利森生物，NH2-PEG-NH2为品牌为Creative PEGWorks。
实施例1
一种吖啶酯标记孕酮衍生物的制备方法，具体为：
(a)将孕酮-3-(O-羧甲基)肟溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，浓度为10mg/ml，取100μl，按摩尔比1:1:1.2量加入EDC和NHS，EDC和NHS溶于0.1M PBS PH7.2中，浓度均为10mg/ml。室温反应半小时，加入与孕酮-3-(O-羧甲基)肟同等摩尔量的氨基聚乙二醇氨基(NH2-PEG-NH2，平均分子量为5000)，氨基聚乙二醇氨基溶于0.1M PBS PH7.2缓冲液，室温反应两小时。
(b)将吖啶酯DMAE-NHS溶于DMF中，浓度为10mg/ml，向步骤(a)反应完的溶液中加入5倍孕酮-3-(O-羧甲基)肟摩尔量的DMAE-NHS，室温反应两小时，加入10μl 1M甘氨酸，室温反应半小时，最后使用0.1M PBSPH7.2缓冲液将反应完溶液按孕酮-3-(O-羧甲基)肟的质量定容为1mg/ml浓度，放置冰箱4度保存，得到吖啶酯标记的孕酮衍生物。
实施例2
一种吖啶酯标记孕酮衍生物的制备方法，具体为：
(a)将氨基聚乙二醇氨基(NH2-PEG-NH2，数均分子量为5000)，溶于0.1M PBS PH7.2缓冲液中，浓度为1mg/ml，取1ml，加入1.5倍氨基聚乙二醇氨基摩尔量的DMAE-NHS，DMAE-NHS溶于DMF中，浓度为10mg/ml，室温反应半小时。
(b)将孕酮-3-(O-羧甲基)肟溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，浓度为10mg/ml，按摩尔比1:1:1.2量加入EDC和NHS，EDC和NHS溶于0.1M PBSPH7.2缓冲液中，浓度均为10mg/ml。向步骤(a)反应完的溶液中加入与氨基聚乙二醇氨基同等摩尔量的孕酮-3-(O-羧甲基)肟的混合溶液，室温反应两小时，加入10μl 1M甘氨酸，室温反应半小时，最后使用0.1MPBSPH7.2缓冲液将反应完溶液按孕酮-3-(O-羧甲基)肟的质量定容为1mg/ml浓度，放置冰箱4度保存，得到吖啶酯标记的孕酮衍生物。
实施例3
一种吖啶酯标记睾酮衍生物的制备方法，具体为：
(a)分别将睾酮-3-(O-羧甲基)肟溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，浓度为10mg/ml，将吖啶酯DMAE-NHS溶于DMF中，浓度为10mg/ml，将氨基聚乙二醇氨基(NH2-PEG-NH2，数均分子量为5000)溶于0.1M PBSPH7.2缓冲液中，浓度为1mg/ml，取100μl睾酮-3-(O-羧甲基)肟溶液，以睾酮-3-(O-羧甲基)肟：DMAE-NHS：氨基聚乙二醇氨基三种物质按摩尔比1:1.5:1比例混合。
(b)向步骤(a)混合的溶液中加入与睾酮-3-(O-羧甲基)肟同等量摩尔量EDC和1.2倍摩尔量NHS，EDC和NHS溶于0.1M PBS PH7.2中，浓度均为10mg/ml，室温反应两小时，然后加入10μl 1M甘氨酸，室温反应半小时，最后使用0.1M PBS PH7.2缓冲液将反应完溶液按睾酮-3-(O-羧甲基)肟的质量定容为1mg/ml浓度，放置冰箱4度保存，得到吖啶酯标记的睾酮衍生物。
试验例1
以实施例1中的吖啶酯标记孕酮衍生物作为实验组，常规BSA为桥连物的吖啶酯标记孕酮衍生物作为对照组，检测不同浓度孕酮样本(0ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、60ng/ml)。具体操作如下：
取25μl孕酮样本，加入50μl孕酮抗体包被的磁珠试剂和50μl实验组试剂或对照组试剂，37度温育反应15-20分钟，反应完成后清洗，加入100μl预激发液，使用ThermoScientific Luminoskan微孔板发光读取仪加入100μl激发液检测发光值(RLU)。
对比结果如下表：
从上述表格的结果可以看出，本发明提供的吖啶化合物标记类固醇激素衍生物在检测样本时，检测发光值与灵敏度均优于对比例。
试验例2
以实施例1中的吖啶酯标记孕酮衍生物作为实验组，常规BSA为桥连物的吖啶酯标记孕酮衍生物作为对照组，在4度和37度条件下各放置7天，检测不同浓度孕酮样本(0ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、60ng/ml)。具体操作如下：
取25μl孕酮样本，加入50μl孕酮抗体包被的磁珠试剂和50μl实验组试剂或对照组试剂，37度温育反应15-20分钟，反应完成后清洗，加入100μl预激发液，使用ThermoScientific Luminoskan微孔板发光读取仪加入100μl激发液检测发光值(RLU)。
对比结果如下表：
从上述表格的结果可以看出，本发明提供的吖啶化合物标记类固醇激素衍生物稳定性显著优于对比例。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种吖啶化合物标记类固醇激素衍生物，其特征在于，吖啶化合物与类固醇激素衍生物以改性聚乙二醇作为桥连物实现连接；
所述改性聚乙二醇的两端各至少连接有一个氨基。
2.根据权利要求1所述的吖啶化合物标记类固醇激素衍生物，其特征在于，所述改性聚乙二醇包括氨基聚乙二醇氨基及其衍生物或多臂聚乙二醇氨基；
优选地，所述改性聚乙二醇的平均分子量为400-40000，优选为1000-5000。
3.根据权利要求1所述的吖啶化合物标记类固醇激素衍生物，其特征在于，所述类固醇激素衍生物包括孕酮、睾酮、雌二醇、雌三醇、皮质醇、维生素D2或维生素D3中任一种的衍生物；
优选地，吖啶化合物包括吖啶酯或吖啶磺酰胺。
4.根据权利要求1-3任一项所述的吖啶化合物标记类固醇激素衍生物，其特征在于，所述类固醇激素衍生物为含有羧基衍生基团的类固醇激素衍生物；
优选地，羧基衍生基团包括羧甲基肟或半琥珀酸。
5.权利要求1-4任一项所述的吖啶化合物标记类固醇激素衍生物的制备方法，其特征在于，以改性聚乙二醇作为桥连物，将吖啶化合物与类固醇激素衍生物连接，得到吖啶化合物标记类固醇激素衍生物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，吖啶化合物、改性聚乙二醇和类固醇激素衍生物的摩尔比为(1-10)：(0.5-20)：1，优选为(4-6)：(0.5-1.5)：1。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，将类固醇激素衍生物活化后与改性聚乙二醇偶联，再与吖啶化合物连接，所述类固醇激素衍生物为含有羧基衍生基团的类固醇激素衍生物；
优选地，将改性聚乙二醇与吖啶化合物偶联，再与活化后的类固醇激素衍生物连接，所述类固醇激素衍生物为含有羧基衍生基团的类固醇激素衍生物；
优选地，将活化剂加入类固醇激素衍生物、改性聚乙二醇和吖啶化合物混合物中连接，所述类固醇激素衍生物为含有羧基衍生基团的类固醇激素衍生物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，含有羧基衍生基团的类固醇激素衍生物的活化方法包括碳化二亚胺法；
优选地，活化用活化剂包括EDC、EDC和NHS、DCC或DIC。
9.根据权利要求5-8任一项所述的制备方法，其特征在于，吖啶化合物与类固醇激素衍生物连接后还包括封闭的步骤，再得到吖啶化合物标记类固醇激素衍生物；
优选地，封闭用封闭剂包括甘氨酸、精氨酸、Tris缓冲液或BSA。
10.权利要求1-4任一项所述的吖啶化合物标记类固醇激素衍生物在化学发光免疫分析中的应用。
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Legal Events
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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