JPH10506708A - 特定位にとり込まれたマーカー基およびハプテンを有するオリゴマー担体分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規複合体、それらの製造方法、ならびに免疫学的検出方法における、またはDNA診断のための、そうした複合体の抗原としての利用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 特定位にとり込まれたマーカー基およびハプテンを有するオリゴマー担体分子 本発明は新規複合体、それらの製造方法並びに免疫学的検出方法における抗原 として、またはＤＮＡ診断のためのこれらの複合体の使用に関する。 体液、特にヒト血清中の免疫グロブリンの検出は微生物、特にウイルス、例え ば、HIV、肝炎ウイルス等による感染を診断するのに使用される。試験試料中の 特定の免疫グロブリンの存在は、特定の免疫グロブリンと反応する一種または数 種の抗原との反応により通常検出される。試料液中の特定の免疫グロブリンの検 出方法は感度が良く、信頼でき、簡単かつ迅速である必要がある。 更に別の免疫学的方法は、分析物に免疫学的に類似するハプテンと分析物が、 受容体、例えば、抗体の結合部位について競合するような方法で分析物が定性的 また定量的に検出される競合イムノアッセイである。この場合、分析類似体は標 識形態または固相に結合できる形態で通常使用される。 近年、非放射性マーカー基に基づく多くの検出系が開発されており、この場合 、試験試料中の分析物、例えば、特定の抗体の存在が光学的（ルミネセントまた は蛍光）検出系、NMR-活性検出系または金属−沈殿検出系で測定し得る。 EP-A -0307149は、２種の組換えポリペプチドが抗原として使用され、そのうちの一つ が固相に固定され、かつ他の抗原がマーカー基を有し、それにより両方の組換え 抗原が試験の特異性を増大するために異なる生物中で発現される抗体に関する免 疫学的試験を開示している。 EP-A-0366673は、抗体が、精製された標識抗原および固相結合された形態の同 精製抗原との反応により検出される、試料中の抗体の検出方法を開示している。 例えば、ヒトIgGが抗原として開示されている。 EP-A-0386713は２種の固体担体を使用するHIVに対する抗体の検出方法を記載 しており、この方法では種々のHIV抗原を２種の固体担体に固定し、その担体の それぞれを試料のアリコートおよび標識HIV抗原と接触させ、抗体の存在を試験 の少なくとも一つで陽性反応により検出する。組換え生産されたポリペプチドが HIV抗原として開示されている。 EP-A-0507586は特定の免疫グロブリンに対する免疫学的試験を行う方法を記載 しており、この方法では試料が免疫グロブリンを結合できる２種の抗原と接触さ せられ、第一抗原は固相担体への結合に適した基を有し、かつ第二抗原はマーカ ー基を有する。マーカー基は直接的マーカー基、例えば、酵素、色素体、金属粒 子であってもよく、または間接的マーカー基、即ち、抗原に結合されたマーカー 基がマーカー基に対する受容体（これは代わりにシグナル発生基を有する）と反 応し得る。フルオレセイン誘導体がこのような間接的マーカー基の例として挙げ られ、その受容体は酵素に結合している抗体であり、Ｂ型肝炎表面抗原の如きポ リペプチドが抗原として開示されている。SH基がフルオレセインを結合するのに 使用される誘導体化によりこの抗原に導入される。 EP-A-0507587はIgM抗体の検出に特に適している方法を開示しており、この方 法では試料が検出すべき抗体に対する標識抗原および検出すべき抗体に対して向 けられた、かつ固相に結合できる二次抗体とともにインキュベートされる。 EP-A-0199804およびEP-A-0580979はルミネセント金属キレート基、特にルテニ ウムキレート基およびオスミウムキレート基で標識された抗原を使用する検出の 免疫学的方法を開示する。免疫グロブリンが活性化金属錯体との反応により統計 的に標識される抗原として使用される。 EP-A-0178450は、免疫学的活性物質、例えば、抗体が結合し得る金属キレート 、特にルテニウム錯体を開示する。結合が免疫反応性物質と金属キレートの統計 的反応により得られる。 EP-A-0255534は金属キレート結合した抗原または抗体を使用するルミネセンス イムノアッセイを開示する。例えば、結合は金属キレート活性エステル誘導体と 抗体の統計的反応により得られる。 WO 90/05301は(i)添加された分析物、(ii)分析物の結合パートナーまたは(iii )(i)または(ii)に結合し得る反応性成分に結合されるルミネセント金属キレート を使用するエレクトロケミルミネセンスによる分析物の検出方法および定量測定 方法を開示する。ルミネセンスは金属キレートに結合して活性化され、必要によ り磁性微粒子に結合した後に測定される。 従来技術から知られている抗体を検出するための免疫学的方法において、通常 組換えＤＮＡ方法により生産されるポリペプチド抗原が通常使用される。しかし ながら、このようなポリペプチド抗原を使用する時に問題が起こり得る。こうし て、組換えポリペプチドはしばしば融合ポリペプチドの形態でのみ生産でき、そ の場合、融合部分は試験で偽陽性結果を導き得る。加えて、組換え発現により生 産されたポリペプチドはしばしば試料液中で非常に低い安定性を有するにすぎず 、凝集する傾向がある。更なる欠点は、マーカー基をこのようなポリペプチドに 選択的かつ再生的に導入することがしばしば可能ではないことである。 更に、 組換えポリペプチド抗原の生産は高コストを要し、かつ組換えポリペプチドの異 なるロット中で免疫反応性の大きな変化が生じ得る。 感度および正確さについて非常に高い要件を有する競合イムノアッセイでさえ も、エストラジオールまたはテストステロンのような非常に低い濃度でのみ存在 する分析物を特にエレクトロケミルミネセンスに基づく検出系で検出する時に既 知の抗原を使用して必要とされる低い検出限界を得ることはしばしば非常に困難 である。 それ故、本発明の目的は、免疫学的試験のための抗原が簡単かつ有効な方法で 生産し得る方法を提供することであり、この場合、従来技術から知られている抗 原の欠点が少なくとも一部排除される。加えて、その方法は抗原へのマーカー基 の選択的かつ再生性の導入を可能にすべきである。 この問題は、１−10のハプテン分子および反応性側鎖基に結合された１−10の マーカー基または固相結合基を含む、最高100のモノマー単位を有するポリマー 担体を含んでなる複合体により解決され、そのモノマー単位はアミノ酸、ヌクレ オチドおよびペプチド核酸から選ばれる。 １−10のハプテン分子および特定数のマーカー基または固相結合基を含む、本 発明の複合体を免疫学的検出方法において抗原として使用する場合、驚くことに 、かなり高い感度および正確さを得ると同時に既知のモノマー抗原および多量体 抗原に較べて低下された低い検出限界を得ることが可能である。更に、本発明の 複合体は固相合成、例えば、ペプチド固相合成により簡単な方法で構築し得る。 ハプテン分子またはマーカー基もしくは固相結合基により誘導体化される、この モノマー単位、例えば、アミノ酸誘導体は所定の位置にとり込まれる。加えて、 遊 離官能基を有するモノマーが位置する担体鎖の位置で固相合成の完結後に付加的 なハプテンまたはマーカー基もしくは固相結合基を選択的にとり込むことが可能 である。これは複合体へのハプテン分子およびマーカー基または固相結合基の特 定かつ再生性のとり込みを可能にする。複合体の個々の基の間の距離は正確に特 定でき、必要により変化し得る。シグナルクエンチングは、シグナル強さがマー カー基の数に比例して増大するように複合体のマーカー基の距離を選択すること により低く保ち得る。また、マーカー基の特定の空間配向は、例えば、らせん担 体の場合にシグナル強さの改良に寄与する。それ故、マーカー基の間の距離はら せん担体、例えば、一本鎖核酸または二本鎖核酸の場合３−６または／および13 −16のモノマー単位であることが好ましい。 複合体の主鎖を形成するポリマー担体分子は100のモノマー単位、好ましくは ３−80のモノマー単位、特に好ましくは５−60のモノマー単位の最大長さを有す る。 モノマー単位はアミノ酸、ヌクレオチドおよびペプチド核酸から選ばれる。ポ リマー担体はアミノ酸から成るペプチド鎖、好ましくは線状ペプチド鎖を含むこ とが好ましい。しかしながら、担体はまたハプテン分子およびマーカー基または 固相結合基が反応性側鎖基に結合されるオリゴヌクレオチドであってもよい。 加えて、ポリマー担体はペプチド核酸を含むことができる。ペプチド核酸は式 (CH₂)_k-CHR'-N［CO-(CH₂)₁-L］-CH₂-(CH₂)_m-NH-CO- （式中、Ｌは水素、フェニル、天然性ヌクレオベースおよび非天然性ヌクレオベ ースからなる群から選ばれ、R'は水素およびアミノ酸、好ましくはαアミノ酸（ これは天然性または非天然性である）の側鎖を含む群から選ばれ、ｋおよびｍは それぞれ独立に０または１であり、かつｉは独立に０〜５である） の同じモノマー単位または異なるモノマー単位からつくられたポリアミド主鎖を 含む。ハプテン分子およびマーカー基または固相結合基はペプチド核酸のヌクレ オベースまたは／およびアミノ酸側鎖に結合し得る。ペプチド核酸およびそれら の製造がWO92/20703に記載されている。この開示がここに参考にされる。 ペプチド核酸の場合でさえも、担体は一本鎖または二本鎖として存在し得る。 少なくとも一つのPNAストランド、例えば、PNAストランドと核酸ストランド、 例えば、ＤＮＡストランドを有する二本鎖担体が特に好ましい。 複合体は１−10のハプテン分子、好ましくは１−６のハプテン分子、特に好ま しくは１または２のハプテン分子を含む。ハプテンは100-2000Daの分子量を有す る免疫反応性分子であることが好ましい。このようなハプテンは薬理活性物質、 例えば、抗生物質、オピエート、アンフェタミン、バルビツレート、細胞増殖抑 制剤（例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、バンコマイシン等）、パラセ タモル、サリチレート、フェニトイン、キニンおよびキニン誘導体、テオフィリ ン等、ホルモンおよび代謝産物、例えば、ステロール、胆汁酸、性ホルモン（例 えば、エストラジオール、エストリオール、テストステロン、プロゲステロン、 プレグネノロンおよびこれらの誘導体）、コルチコイド（例えば、コルチゾル、 コルチコステロン、コルチゾンおよびこれらの誘導体）、カルデノリドおよびカ ルデノリド−グリコシド（例えば、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、ストロファン シン、ブファジエノリド等）、ステロイド−サポゲニン、ステロイドアルカロイ ド、ペプチドホルモン、クレアチニン、甲状腺ホルモン（例えば、Ｔ₃、Ｔ₄）、 神経伝達物質（例えば、セロトニン、コリン、γ−アミノ酪酸）、ビタミンおよ び媒介物質、例えば、プロスタグランジン、ロイコトリエン、ロイコエンジイン およびトロンボキサンから選ばれる。 一方、ハプテンはまた好ましくは30までのアミノ酸の長さを有する免疫反応性 ペプチドエピトープから選ばれる。このようなペプチドエピトープは、例えば、 病原生物、例えば、バクテリア、ウイルスおよび原生動物または自己免疫抗原か ら誘導し得る。免疫反応性ペプチドエピトープは、例えば、ウイルス抗原、例え ば、HIV I、HIV IIまたはＣ型肝炎ウイルス(HCV)のアミノ酸配列から誘導し得る 。 加えて、ハプテンはまた試料中で検出される核酸配列に相補性である好ましく は50までのヌクレオチドの長さを有する核酸から選ばれる。最後に、ハプテンは また50までのモノマー単位の長さを有するペプチド核酸から選ばれる。 更に、本発明の複合体は１−10、好ましくは２−８のマーカー基または固相結 合基を含む。マーカー基の好ましい例はルミネセント金属キレートおよび蛍光標 識である。固相結合基の好ましい例はビオチンおよびビオチン類似体、例えば、 ストレプトアビジンまたはアビジンと特異的に反応し得るデスチオビオチンおよ びイミノビオチンである。 ハプテン分子およびマーカー基または固相結合基は反応性アミノまたは／およ びチオール側鎖基を介して、特に好ましくは反応性一級アミノ側鎖基を介して担 体鎖に結合されることが好ましい。このような側鎖基は、適当なモノマー、例え ば、リシン、オルニチン、ヒドロキシリシンまたはシステインの如きアミノ酸を 担体鎖にとり込むことにより生じ得る。 本発明の或る実施態様では、ハプテンおよびマーカー基または固相結合基と担 体鎖の間にスペーサーをとり込むことが好ましいかもしれない。スペーサーは好 ましくは可撓性であり、好ましくは３−30の原子の鎖長を有する。スペーサーは 親水性基、例えば、オキシアルキレン側鎖基または／およびヒドロキシ側鎖基を 含むことが特に好ましい。 好ましいマーカー基はルミネセント金属キレート、即ち、検出できるルミネセ ンス反応を生じることができる金属キレートである。このルミネセンス反応は、 例えば、蛍光測定またはエレクトロケミルミネセンス測定により検出し得る。こ れらの金属キレートの金属は、例えば、遷移金属または稀土類金属である。金属 はルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウ ム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロムまたはタングステンで あることが好ましい。ルテニウム、イリジウム、レニウム、クロムおよびオスミ ウムが特に好ましい。ルテニウムが最も好ましい。 金属と一緒に金属キレートを形成するリガンドは通常多座リガンド、即ち、幾 つかの配位部位を有するリガンドである。多座リガンドは、例えば、芳香族リガ ンドおよび脂肪族リガンドを含む。好適な芳香族多座リガンドは芳香族複素環リ ガンドを含む。好ましい芳香族複素環リガンドは窒素を含むポリ複素環、例えば 、ビピリジル、ビピラジル、ターピリジルおよびフェナントロリルである。これ らのリガンドは、例えば、置換基、例えば、アルキル、置換アルキル、アリール 、置換アリール、アラルキル、カルボキシレート、カルボキシアルデヒド、カル ボキサミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、ア ミノカルボニル、アミジン、グアニジウム、ウレイド、硫黄を含む基、リンを含 む 基およびＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドのカルボキシレートエステルを含むこ とができる。好ましいリガンドはC₂-C₃アルキレンオキシ基、C₂-C₃アルキレンチ オ基およびC₂-C₃アルキレンアミノ基、特にエチレンオキシ基を含む。キレート はまた一つまたは幾つかの単座リガンドを含むことができる。単座リガンドの例 として、一酸化炭素、シアニド、イソシアニド、ハロゲニド並びに脂肪族、芳香 族および複素環のホスフィン、アミン、スチルベンおよびアルシンが挙げられる 。 ルミネセント金属キレートはビピリジルリガンドまたはフェナントロリルリガ ンドを有する金属キレートから選ばれることが特に好ましい。好適な金属キレー トおよびその製造の例がEP-A-0178450、EP-A-0255534、EP-A-0580979および WO 90/05301に記載されている。これらの開示がここに参考にされる。ルテニウム− （ビピリジル）₃キレートが最も好ましい金属キレートである。これらのキレー トは、例えば、Igen Inc．社(Rockville，MD，USA)から活性エステル誘導体の形 態で市販されている。 マーカー基としてエレクトロケミルミネセンス反応により検出できるルミネセ ント金属錯体を使用する場合、担体鎖または／および金属錯体と担体の間のスペ ーサーへの少なくとも一つの正電荷または／および負電荷担体、例えば、アミノ 基またはカルボキシレート基のとり込みが有利であると判明した。担体鎖は、例 えば、合成中のグルタミン酸またはアスパラギン酸のとり込みにより生じ得る一 つまたは幾つかの負電荷を含むことが特に好ましい。またその他のマーカー基ま たは固相結合基、例えば、蛍光基またはビオチンの場合、電荷担体を担体鎖また は／およびスペーサー中にとり込むことが有利であるかもしれない。 好ましいマーカー基の更に別の例は蛍光標識、例えば、フルオレセイン、クマ リン、ローダミン、レゾルフィン、シアニンおよびこれらの誘導体である。蛍光 マーカー基を使用する場合、エネルギー伝達による蛍光クエンチングを阻止する ために空間配向およびスペーシングに関して蛍光マーカー基を固定する担体主鎖 のらせん構造を使用することが有利であると判明した。好適ならせん構造を生じ るモノマーの例はプロリンまたはプロリン側鎖基を有するペプチド核酸誘導体で ある。 本発明の複合体は、モノマー単位から成るポリマー担体、好ましくはペプチド 担体を固相で合成し、(a)その合成中に、モノマー誘導体をハプテン分子または ／およびマーカー基もしくは固相結合基に共有結合される担体の所定の位置に導 入し、または／および(b)その合成後に、活性化されたハプテン分子または／お よびマーカー分子もしくは固相結合基を担体の反応性側鎖基に結合する方法によ り製造される。 本発明の方法の別法(a)では、モノマー誘導体が固相合成中に導入され、これ が好ましくはリシンまたはオルニチンの如き塩基性アミノ酸の一級アミノ側鎖基 を介して、またはシステインの如きアミノ酸のチオール側鎖基を介してハプテン 分子または／およびマーカー基もしくは固相結合基に共有結合される。相当する モノマー誘導体は、例えば、活性化されたハプテン分子または活性化されたマー カー基もしくは固相結合基、例えば、活性エステル誘導体を遊離一級アミノ基に 、またはマレイミド誘導体を必要により部分的に保護されていてもよいモノマー 誘導体、例えば、アミノ酸誘導体に結合することにより合成される。好ましい金 属キレート結合されたリシン誘導体が図１に示される。図２はビオチニル化され たリシン誘導体を示す。 本発明の意味内で“活性エステル”という用語は、ペプチドのその他の反応性 基と干渉する副反応が起こり得ないような条件下でペプチドの遊離アミノ基と反 応し得る活性化されたエステル基を含む。Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエス テルが活性エステル誘導体として使用されることが好ましい。また、類似のｐ− ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、イミダゾリルエス テルまたはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステルがＮ−ヒドロキシスクシ ンイミドエステルの他に使用し得る。 オリゴヌクレオチド担体へのとり込みに適しているハプテンの誘導体、マーカ ー基および固相結合基の合成が、例として蛍光色素５−カルボキシフルオレセイ ンを使用し、これをホスホルアミジト誘導体に変換する、Theisenら(Tetrahedr on Letters 33(1992)，5033-5036)に記載されている。このホスホルアミジト誘 導体はオリゴヌクレオチドの5'末端または／および3'末端で、またはオリゴヌク レオチド配列内にとり込まれ得る。 本発明の方法の別法(b)によれば、導入された基が固相合成に使用されたモノ マー誘導体の保護基の開裂後に、好ましくは担体のアミノ側鎖基または／および チオール側鎖基、特に好ましくは一級アミノ側鎖基に結合される。 ハプテンおよびマーカー基または固相結合基は別法(a)に従って、即ち、それ ぞれの場合に導入される基に結合されるモノマー誘導体を固相合成中に使用する ことにより導入されることが好ましい。この別法によれば、例えば、ルミネセン ト金属キレート、ビオチンまたはペプチドハプテンが問題なく導入し得る。しか しながら、感受性蛍光色素もしくは標識またはその他のハプテン、例えば、ステ ロイドの場合、この操作は不適当である。何となれば、これらの物質は固相合成 の条件下で分解し得るからである。この場合、複合体は別法(b)に従って、即ち 、意図された担体分子へのその後の結合により合成される。勿論、別法(a)およ び(b)の組み合わせを使用することがまた可能である。 ２種の異なる基、例えば、ハプテンおよびマーカー基またはハプテンおよび固 相結合基を別法(b)に従って、即ち、合成の完結後に導入することがまた可能で ある。これに関して、別法(b)に記載の方法は、例えば、導入される第一基がア ミノ側鎖基に結合され、導入される第二基が担体分子のチオール側鎖基に結合さ れるような方法で行い得る。一方、導入される両方の基がそれぞれ担体の所定の 一級アミノ側鎖基に選択的に結合でき、この場合、第一保護基を有するモノマー 誘導体がハプテン分子が結合される担体の位置でアミノ側鎖基について使用され 、またアミノ側鎖基について第二保護基を有するモノマー誘導体が、マーカー基 または固相結合基が結合される担体の位置で使用され、第一保護基および第二保 護基は、それが保護基の選択的開裂ひいては二つの反応工程における選択的結合 を可能にするように選ばれる。この目的のために、第一保護基および第二保護基 は酸不安定性アミノ保護基、例えば、Bocまたは酸安定性保護基、例えば、フェ ニルアセチルから選択し得る。 本発明の方法において、所望のモノマー配列を有する担体分子が固相で合成さ れる。ペプチド担体は、市販のペプチド合成装置（例えば、Applied Biosystems からの装置A431またはA433）を使用して製造されることが好ましい。その合成は 、好ましくはアミノ酸誘導体を使用してペプチドのカルボキシル末端で開始する 既 知の方法に従って行われる。結合に必要とされるアミノ末端基がフルオレニルメ チルオキシカルボニル(Fmoc)残基で誘導体化されるアミノ酸誘導体が使用される ことが好ましい。使用されるアミノ酸の反応性側鎖基は、ペプチド合成の完結後 に容易に開裂し得る保護基を含む。これの好ましい例はトリフェニルメチル(Trt )、ｔ−ブチルエーテル(tBu)、ｔ−ブチルエステル(OtBu)、tert.-ブトキシカル ボニル(Boc)、2,2,5,7,8-ペンタ- メチルクロマン-6- スルホニル(Pmc)またはフ ェニルアセチルの如き保護基である。 ハプテンまたは標識を導入することが意図されているペプチドの位置に配置さ れる一級アミノ側鎖基を有するリシン残基またはその他のアミノ酸誘導体のアミ ノ側鎖基は別法(a)に従って導入される基に共有結合される。 20の天然アミノ酸の他に、ペプチドはまた人工アミノ酸、例えば、β−アラニ ン、γ−アミノ−酪酸、ε−アミノ−カプロン酸、ノルロイシンまたはオルニチ ンを含むことができる。これらの人工アミノ酸は天然アミノ酸と同様に保護形態 で合成に使用される。 本発明の方法の別法(b)によれば、ハプテンまたは標識が、ペプチドを保護基 の開裂後にそれぞれの場合に所望される活性化された基（これはペプチドの遊離 一級アミノ基と反応する）と反応させることにより導入される。1.5〜４当量の 活性エステルが遊離一級アミノ基に対し使用されることが好ましい。続いて、反 応生成物が好ましくはHPLCにより精製される。別法(b)による二つの異なる活性 化された基の導入は、先に説明したように二つの選択的に開裂できる保護基を使 用することにより達成される。 複合体のペプチド主鎖は免疫反応性アミノ酸配列、即ち、免疫学的検出方法に おける抗原としての複合体の意図される適用において試験操作に干渉しないアミ ノ酸配列を有する。 一方、担体分子の主鎖はまたヌクレオチドまたはペプチド核酸を含むことがで きる。オリゴヌクレオチド担体分子の合成は市販のＤＮＡ合成装置中で行い得る 。ハプテン分子およびマーカー基または固相結合基はホスホルアミジト誘導体(T heisenら，上記文献; Applied Biosystems，User Bu-lletin 67，FAM Amidite， 1992年５月)として導入されることが好ましく、または／およびそれらは続いて 遊 離反応性側鎖に結合される。ペプチド核酸をベースとする担体分子は、例えば、 WO92/20703に記載された方法に従って固相ペプチド合成と同様に合成される。ハ プテン分子またはマーカー基もしくは固相結合基はペプチドおよびオリゴヌクレ オチド担体について記載された方法に従って導入し得る。 また、本発明は、ハプテン分子が免疫反応性分子である場合に免疫学的方法に おける抗原としての複合体の使用またはハプテンが核酸である場合にＤＮＡ診断 のための複合体の使用に関する。 二種以上のハプテン分子を含む複合体はポリハプテンとして免疫学的検出方法 に使用し得る。 本発明の好ましい実施態様は試料液中の特定の抗体の測定のための免疫学的方 法における複合体の使用に関する。微生物、例えば、バクテリア、ウイルスまた は原生動物による感染を指示するこのような抗体が測定されることが好ましい。 ウイルスに対し向けられる抗体、例えば、HIVまたは肝炎ウイルスに対し向けら れる抗体が測定されることが特に好ましい。試料液は血清であることが好ましく 、ヒト血清であることが特に好ましい。加えて、本発明の複合体はブリッジ試験 法で免疫学的方法に使用されることが好ましい。 したがって、本発明は、ａ）測定すべき抗体に対する少なくとも一つの本発明 の複合体とともに試料液をインキュベートし、ｂ）その抗体を上記ペプチド複合 体との結合によって検出することを特徴とする、液体試料中の特異的抗体の免疫 学的定量方法に関する。 本発明の免疫学的定量方法は、実際、公知の検査法に従って、例えば単一の反 応相の均一系イムノアッセイとして、あるいは２つ以上の反応相の不均一系イム ノアッセイとして行うことができる。抗体の存在が固相の存在下で検出される不 均一系検査法を用いることが望ましい。このような検査法の一実施態様は、いわ ゆる二抗原ブリッジテスト法である。この場合、試料液を反応性の固相の存在下 で、測定すべき抗体に対する二抗原とともにインキュベートする。ここで、二抗 原のうちの第一抗原はマーカー基を有し、第二抗原は固相に結合しているか、ま たは固相に結合可能な形態で存在する。第一または／および第二抗原は、本発明 の複合体である。試料液中の測定すべき抗体は、任意の方法でインキュベーショ ン液から固相を分離した後、固相または／および液相の標識を定量することによ って検出される。第一抗原はルミネセンス金属キレートまたは蛍光基で標識され た複合体であることが望ましい。第二抗原は好ましくはビオチンで標識され、ス トレプトアビジンまたはアビジンで被覆された固相に結合可能である。 検査手順は、好ましくは第一抗原、抗体および固相に結合した第二抗原からな る、標識化され固定化された複合体を得るために、試料液を標識された第一抗原 および固相に結合した第二抗原と混合することを含んでなる。抗体検出のための ほかの検査法と比べて、ブリッジテスト法は感度の上昇（すなわちIgG，IgM，Ig A，IgEといったすべての免疫グロブリンクラスが検出される）、ならびに特異性 の向上（すなわち非特異的反応性が低下する）をもたらす。 本発明の第二の好ましい態様は、競合イムノアッセイにおける複合体の利用に 関する。競合イムノアッセイは通常、比較的低分子の分析物の検出に用いられ、 原則的に二つの検査法、「標識抗体」法および「標識アナログ」法、で実施する ことが可能である。「標識抗体」法において、測定すべき分析物を含有する試料 液を、分析物と免疫学的に競合する固相に結合可能なハプテン、および標識され たレセプター、たとえばハプテンおよび分析物に対する抗体、とともにインキュ ベートする。この検査法において、固相に結合する標識は、分析物の濃度に反比 例する。「標識アナログ」法においては、測定すべき被検体を含有する試料液を 、分析物と免疫学的に競合する標識されたハプテン、および固相に対して結合可 能であって、分析物およびハプテンに対するレセプターとともにインキュベート する。固相に結合した標識ハプテンの量は、測定すべき遊離の分析物の濃度に反 比例する。 本発明は、競合イムノアッセイの原理に基づいて、「標識アナログ」法によっ て試料液中の分析物を検出する方法に関するが、その方法の特徴は、（ａ）反応 性固相の存在下で、試料液を、マーカー基を含有する本発明の複合体、および固 相に結合し、または固相に結合可能であって、分析物および複合体のハプテン成 分との特異的免疫反応に加わることができるレセプターとともにインキュベート すること、（ｂ）固相を任意の方法でインキュベーション液から分離すること、 および（ｃ）固相または／およびインキュベーション液における複合体のマーカ ー成分を測定することによって、試料液中の分析物の存在または／およびその量 を決定することである。固定化を可能にするレセプターとしてビオチニル化抗体 またはビオチニル化抗体断片が好ましく用いられ、反応性固相としてストレプト アビジンまたはアビジンで被覆された固相が好ましく用いられる。 本発明のさらに別の主題は、競合イムノアッセイの原理に基づいて、「標識抗 体」法によって試料液体中の分析物を検出する方法であるが、その方法の特徴は 、（ａ）反応性固相の存在下で、試料液を、固相結合基を含有する本発明の複合 体、およびマーカー基を有し、分析物および複合体のハプテン成分との特異的免 疫反応に加わることができるレセプターとともにインキュベートすること、（ｂ ）固相を任意の方法でインキュベーション液から分離すること、および（ｃ）固 相または／およびインキュベーション液におけるレセプターのマーカー成分を測 定することによって、試料液中の分析物の存在または／およびその量を決定する ことである。ビオチニル化複合体およびストレプトアビジンまたはアビジンで被 覆した固相が好ましく用いられる。標識レセプターとしては、抗体または抗体断 片が好ましく用いられる。 ルミネセンス金属キレート基は、ルミネセンス核種が電気化学的に電極表面に 生じる、電気化学ルミネセンスによって、好ましく検出される。ルミネセンスは 、定性的に、または／および定量的に、検出することが可能である。ルミネセン スアッセイを実施した例は、EP-A-0 580 979，WO 90/05301，WO 90/11511および WO 92/14138に見いだされる。これにより上記に開示されたルミネセンスアッセ イの方法および装置を参照する。電気化学ルミネセンスアッセイおいて、固相は 好ましくは微粒子からなり、特に好ましくは固相上で第二抗原と相互作用するよ うな被覆を施された磁性微粒子からなる。微粒子は好ましくはストレプトアビジ ンで被覆される。 電気化学ルミネセンスは好ましくは、例えばアミンのような、金属複合体のた めの還元剤の存在下で測定される。脂肪族アミンが望ましいが、特にアルキル基 がそれぞれ１個から３個までの炭素原子を有するような第一級、第二級、および 第三級アルキルアミンが望ましい。トリプロピルアミンが特に好ましい。しかし ながら、アミンはアニリンまたはヘテロ環式アミンのような芳香族アミンでもよ い。 さらに、たとえば、エトキシル化フェノールのような非−イオン系界面活性剤 を増幅剤として所望により存在させることも選択可能である。こうした物質は、 たとえばTriton X100またはTriton N-401の名称で市販されている。 一方、ルミネセンス金属キレート基を蛍光によって検出することも可能であり 、この場合、金属キレートは適当な波長の光の照射よって励起され、その結果生 じた蛍光放射を測定する。蛍光アッセイを実施した例は、EP-A-0 178 450および EP-A-0 255 534にみられる。これにより上記開示を参照する。 ルミネセンス金属キレートと同様に本発明の複合体の望ましいマーカー基であ る蛍光基の検出は、上記のように、常法による励起および蛍光測定によって行う ことができる。 本発明のさらなる主題は、標識を有するか、または固相に結合可能である、少 なくとも一つの本発明の複合体を含有する免疫学的試薬である。二抗原ブリッジ テストの原理に基づいて特異抗体を免疫学的に定量するための試薬は、(a)本発 明の標識複合体、または／および(b)固相に結合しているか、あるいは固相に結 合可能な形態で存在する、本発明のもう一つの複合体を含有する。 競合イムノアッセイの原理に基づいて分析物、特に比較的低分子の分析物、を 定量するための試薬は、レセプターとの結合に関して定量すべき分析物と免疫学 的に競合する、標識された複合体（「標識アナログ」法）、または固相に結合可 能な複合体（「標識抗体」法）を含有する。競合イムノアッセイの試薬は、好ま しくは定量すべき分析物および本発明の複合体と免疫学的に反応することができ る、標識されたレセプター（「標識抗体」法）または固相に結合可能なレセプタ ー（「標識アナログ」法）のいずれかを、本発明の複合体から空間的に分離され た状態で、含有する。 本発明は下記の実施例および図面によっていっそう明快に説明される。図面は 下記を示す： 図１ 金属キレート−リシン誘導体 図２ ビオチン−リシン誘導体 図３ 本発明の複合体 図４ 対照複合体 実施例１ 金属キレート−リシン誘導体の調製 EP-A-0 580 979記載のルテニウム複合体、Ru(ビピリジン)₂（ビピリジン-CO -N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）6mmolを50mlジメチルホルムアミドに溶 解し、α−Fmocリシン溶液を滴下して添加した。溶媒を除去した後、残渣を少量 のアセトンに溶解し、300mlクロロホルムと混合し、短時間に加熱して沸騰させ た。溶媒を分離した後、図１に示す化合物を個体として得た。 実施例２ 金属キレート標識、ビオチニル化ペプチドの調製 たとえば、Applied Biosystems製A431またはA433といったバッチペプチド合 成装置を用いたフルオレニルメチルオキシカルボニル−(Fmoc)固相ペプチド合成 法によって、金属キレートで標識され、さらにビオチニル化されたペプチドを調 製した。このために、表１に示すアミノ酸誘導体を、それぞれについて4.0当量 使用した： ペプチド配列への金属キレートおよびビオチン基の導入は、金属キレートと結 合した、またはビオチンと結合したアミノ酸誘導体を直接組み込む（たとえば、 金属キレート活性エステルでε−誘導体化されたリシン残基を介して（図１）、 またはビオチン−誘導体化されたリシン残基を介して（図２）配列内に組み込む 、あるいは、対応するα−誘導体化アミノ酸残基によってN-末端に組み込む）こ とによって行われた。 アミノ酸、またはアミノ酸誘導体をN-メチルピロリドンに溶解した。0.4-0.7m mol/g負荷された(JACS 95(1973)，1328)400-500mgの4-(2',4'-ジメトキシフェニ ル-Fmoc-アミノエチル)-フェノキシレジン(Tetrahedron Letters 28(1987),2107 )上でペプチドを合成した。反応溶媒としてジメチルホルムアミド中で、Fmoc- アミノ酸誘導体に対して４当量のジシクロヘキシルカルボジイミド、および４当 量のN-ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて結合反応を20分間行った。20% ピ ペリジン／ジメチルホルムアミド溶液を用いて、それぞれの合成ステップ後20分 間でFmoc基を切断した。 ２０ｍｌトリフルオロ酢酸、０．５ｍｌエタンジチオール、1mlチオアニソー ル、1.5gフェノールおよび1ml水を用いて、室温40分間で、支持体からのペプチ ドの遊離、および酸に不安定な保護基の切断を行った。次に、反応溶液を300ml 冷ジイソプロピルエーテルと混合し、０℃で40分間保持して、ペプチドを完全に 沈殿させた。沈殿物を濾過し、ジイソプロピルエーテルで再度洗浄し、少量の50 % 酢酸に溶解して、凍結乾燥した。得られた粗製品を、適当な濃度勾配（溶出液 Ａ：水、0.1%トリフルオロ酢酸、溶出液Ｂ：アセトニトリル、0.1%トリフルオロ 酢酸）を用いた、delta-PAK RP C18材(カラム50X300mm，100Å，15μ)上での調 製用HPLCによって約120分間で精製した。溶出された物質を、イオンスプレー質 量分析法によって同定した。 酸に安定なフェニルアセチル保護基は、固定化された、または可溶性のペニシ リンＧ-アミダーゼを用いて有機溶媒成分を有する水性溶液中で、室温で酵素的 に除去した。 実施例３ ハプテンとの結合 金属キレートで標識された、またはビオチニル化されたペプチドをジメチルホ ルムアミドに溶解し、活性化したハプテン（たとえば、N-ヒドロキシスクシンイ ミドエステル）を、結合可能なペプチド上の位置（たとえば、リシンのアミノ側 鎖基）に対してわずかに過剰に（約30%）添加した。室温で１時間攪拌し、高真 空下で溶媒を除去し、ペプチドを調製用HPLCで精製した。 標識基として図１に示す金属キレート−リシン誘導体を、ハプテンとしてエス トラジオール（Ｅ２）を用いた以下の構造を有する複合体を調製した： Ｉ：AcK(BPRu)UEUEUK(E2)UEUEUK(BPRu)UEUK(E2)-NH₂ II：AcK(BPRu)UEUEUK(E2)UEUEUK(BPRu)U-NH₂ 複合体Ｉを図３に示す。ペプチド鎖のアミノ末端はアセチル基（Ac）で保護さ れている。カルボニル末端は酸アミド基として存在する。 金属キレートおよびハプテン分子は、それぞれリシンのε-アミノ側鎖基を介 してペプチド鎖に結合される。 複合体Ｉの配列を有する複合体は、ハプテン分子としてテストステロンを用い たアナログ法で合成される。 合成された複合体の構造は、¹H-NMR(500MHz)によって調べられ、確認された。 実施例４ 血清中のエストラジオールの定量 ヒト血清中のエストラジオールを定量するために、「標識アナログ」法に基づ く競合二段階アッセイを行った。このために、90μl溶液１（50mmol/l 4-モルフ ォリンエタンスルホン酸(MES)，pH6.8にそれぞれ溶解した0.69nmol/lの本発明の 複合体Ｉ（図１）または1.68nmol/lの対照複合体（図４）、0.1%ウシ血清アルブ ミン、0.1% Thesit、0.01% メチルイソチアゾロン、0.1%オキシピリオン、30ng/ ml脱離試薬ジヒドロテストステロン）を、ポリエチレン容器の中で37℃、10 分間、50μl試料（血清試料またはエストラジオール標準）とともにインキュベ ートした。次に、90μl溶液２（50mmol/l MESバッファー、pH6.0に溶解した0.7 μg/mlまたは1.4μg/mlビオチンおよびポリクローナル抗−エストラジオールウ サギFab'の複合体）および50μlビーズ懸濁液（720μg/mlストレプトアビジン− 被覆磁粒子、Dynal Company）を連続して添加した。 37℃でさらに10分間インキュベートした後、150μlの混合物を測定セルに移し た。そこで、ビーズ粒子とそれに付着したルテニウム標識を電極表面で磁性によ って濃縮し、電気化学的に発生した化学ルミネセンスのシグナルを28℃で検出し た。 表２に示す上記実験の結果は、本発明の複合体が対照の複合体と比較して感度 と低検出限界に関して検査性能を相当に向上させたことを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｕ 33/532 33/532 Ｂ 33/544 33/544 Ｚ (31)優先権主張番号 Ｐ４４３０９９８．８ (32)優先日 1994年８月31日 (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 Ｐ４４３９３４５．８ (32)優先日 1994年11月４日 (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＦＩ，Ｊ Ｐ，ＫＲ，ＮＯ，ＮＺ，ＵＳ (72)発明者 ヘルマン，ルパート ドイツ連邦共和国 ディー−82362 ヴァ イルハイム イン デル アウ 23番地 (72)発明者 ヘス，エヴァ ドイツ連邦共和国 ディー−82319 スタ ムバーグ アム ミュールバーグ １エイ 番地 (72)発明者 マーシャル，アンドレアス ドイツ連邦共和国 ディー−69469 ヴァ インハイム ショールシュトラーセ ３番 地 (72)発明者 サイデル，クリストフ ドイツ連邦共和国 ディー−82362 ヴァ イルハイム アメルシュトラーセ 39番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．1-10のハプテン分子および反応性側鎖基に結合した1-10のマーカー基または 固相結合基を含有する、最大で100モノマー単位からなるポリマー担体を含んで なる複合体であって、モノマー単位がアミノ酸、ヌクレオチド、およびペプチド 核酸から選択される、該複合体。 ２．ポリマー担体が3-80長さのモノマー単位を有する、請求項１記載の複合体。 ３．ポリマー担体が5-60長さのモノマー単位を有する、請求項１または２記載の 複合体。 ４．1-6のハプテン分子を含有する、前記請求項のうち一つに記載の複合体。 ５．2-8のマーカー基または固相結合基を含有する、前記請求項のうち一つに記 載の複合体。 ６．ポリマー担体がアミノ酸から構成されるペプチド鎖である、前記請求項のう ち一つに記載の複合体。 ７．ポリマー担体がヌクレオチドまたは／およびヌクレオチドアナログから構成 される鎖を含んでなる、請求項１−５記載の複合体。 ８．ポリマー担体がペプチド核酸からなる鎖を含んでなる、請求項１−５記載の 複合体。 ９．ポリマー担体が二本鎖として存在する、請求項７または８記載の複合体。 １０．二本鎖がペプチド核酸を含んでなる少なくとも一本の鎖を含有する、請求 項９記載の複合体。 １１．ハプテン分子およびマーカー基または固相結合基が反応性アミノ基または ／およびチオール基を介してポリマー担体に結合している、前記請求項のうち一 つに記載の複合体。 １２．ルミネセンス金属キレートまたは蛍光基から選択されるマーカー基を含有 する、前記請求項のうち一つに記載の複合体。 １３．ビオチンまたはビオチンアナログから選択される固相結合基を含有する、 請求項１−１１のうち一つに記載の複合体。 １４．マーカー基がルミネセンス金属キレートであって、ポリマー担体が正電荷 または／および負電荷担体を含有する、請求項１２記載の複合体。 １５．マーカー基が蛍光基であって、ポリマー担体が必然的にらせん構造をとる 、請求項１２記載の複合体。 １６．ハプテンが≦2000Daの分子量を有する免疫学的に反応性の分子である、前 記請求項のうち一つに記載の複合体。 １７．ハプテンが薬理学的に活性な物質、ホルモン、代謝物質、ビタミン類、伝 達物質および神経伝達物質から選択される、請求項１６記載の複合体。 １８．ハプテンが３０アミノ酸までの長さを有する免疫学的に反応性のペプチド エピトープである、請求項１−１５のうち一つに記載の複合体。 １９．ハプテンが50ヌクレオチドまでの長さを有する核酸から選択される、請求 項１−１５のうち一つに記載の複合体。 ２０．ハプテンが５０モノマー単位までの長さを有するペプチド核酸から選択さ れる、請求項１−１５のうち一つに記載の複合体。 ２１．モノマー単位からなるポリマー担体が固相上で合成され、ここにおいて、 (a)その合成中にモノマー誘導体をハプテン分子または／およびマーカー基もし くは固相結合基に共有結合される、担体上のあらかじめ決められた位置に導入し 、または／および(b)その合成後に、活性化されたハプテン分子または／および マーカー基もしくは固相結合基を担体の反応性側鎖基に結合する、請求項１−２ ０のうち一つに記載の複合体を製造するための方法。 ２２．ペプチド担体がアミノ酸誘導体から合成される、請求項２１記載の方法。 ２３．変法(a)において、ハプテン分子または／およびマーカー基もしくは固相 結合基がそれぞれモノマー誘導体の第一級アミノ基またはチオール基に結合する 、請求項２１または２２記載の方法。 ２４．変法(b)において、固相合成に使用されたモノマー誘導体の保護基を切断 した後で、担体のアミノ側鎖基または／およびチオール側鎖基への結合を行う、 請求項２１または２２記載の方法。 ２５．合成後に、変法(b)において、ハプテン分子およびマーカー基または固相 結合基を担体の第一級アミノ側鎖基に結合するが、ここにおいて、アミノ側鎖基 のための第一の保護基を有するモノマー誘導体が担体のハプテン分子が結合すべ き位置に用いられ、アミノ側鎖基のための第二の保護基を有するモノマー 誘導体が担体の標識基または固相結合基が結合すべき位置に用いられ、さらに第 一および第二の保護基が、保護基の選択的切断が可能であることによって選択さ れる、請求項２１，２２または２４記載の方法。 ２６．第一および第二の保護基が酸に不安定な保護基または酸に安定な保護基か ら選択される、請求項２５記載の方法。 ２７．請求項１−２０のうち一つに記載の複合体の、免疫学的方法または核酸診 断法における抗原としての使用。 ２８．２以上のハプテン分子を含有する複合体を、免疫学的検出法においてポリ ハプテンとして使用する、請求項２７記載の使用。 ２９．競合イムノアッセイにおける、請求項２７または２８記載の利用。 ３０．特異的抗体を検出するためのイムノアッセイにおける、請求項２７または ２８記載の使用。 ３１．(a)反応性固相の存在下で、試料液を、請求項１−１６のうち一つに記載 されたマーカー基を含有する複合体、および固相に結合し、または固相に結合可 能であって、分析物および複合体のハプテン成分との特異的免疫学的反応に加わ ることができるハプテンとともにインキュベートし、 (b)固相を任意の方法でインキュベーション液から分離し、さらに (c)試料液中の分析物の存在または／およびその量を、固相または／およびイ ンキュベーション液における複合体のマーカー成分を測定することによって判定 する、 競合イムノアッセイの原理に基づいて、「標識アナログ」法により試料液体中 の被検体を検出するための方法。 ３２．ビオチニル化抗体またはビオチニル化抗体断片をレセプターとして用い、 ストレプトアビジンまたはアビジンで被覆された固相を使用する、請求項３１記 載の方法。 ３３．(a)反応性固相の存在下で、試料液を、請求項１−２０のうち一つに記載 された固相結合基を含有する複合体、およびマーカー基を有し、分析物、および 複合体のハプテン成分との特異的免疫学的反応に加わることができるレセプター とともにインキュベートし、 (b)固相を任意の方法でインキュベーション液から分離し、さらに (c)試料液中の分析物の存在または／およびその量を、固相とインキュベーシ ョン液の一方または両方におけるレセプターの標識成分を測定することによって 判定する、 「標識抗体」法による、競合イムノアッセイの原理に基づいて試料液体中の被 検体を検出するための方法。 ３４．ビオチニル化複合体およびストレプトアビジンまたはアビジンで被覆され た固相を使用する、請求項３３記載の方法。 ３５．(a)試料液を、測定すべき抗体に対して反応する、請求項１−２０のうち 一つに記載された少なくとも一つの複合体とともにインキュベートし、 (b)複合体との結合によってその抗体を検出する、 試料中の特異抗体を検出するための方法。 ３６．(a)反応性固相、および測定すべき抗体に対して反応する二抗原（第一抗 原はマーカー基を有し、第２抗原は固相に結合している、または固相に結合可能 な形態で存在する）の存在下で、試料液をインキュベートし、 (b)固相を任意の方法でインキュベーション液から分離し、さらに (c)試料液中の分析物の存在または／およびその量を、固相または／およびイ ンキュベーション液における標識を定量することによって検出するが、ここにお いて請求項１−２０のうち一項記載の複合体を第一または／および第二抗原とし て使用する、請求項３５記載の方法。 ３７．ルミネセンス金属キレートまたは蛍光基で標識された複合体を第一抗原と して用いる、請求項３６記載の方法。 ３８．ビオチニル化複合体またはストレプトアビジンまたはアビジンで被覆され た固相を第二抗原として用いる、請求項３６または３７記載の方法。