CN1153555A - 具有确定引入的标志基团和半抗原的低聚载体分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的结合物，其制备方法以及该结合物作为抗原在免疫学的检证法中或DNA-诊断中的应用。

Description

具有确定引入的标志基团和半抗原的低聚载体分子
本发明涉及新的结合物，它的制备方法以及这些结合物作为抗原在免疫学的检证方法中或对于DNA-诊断的应用。
在体液，特别是在人血清中免疫球旦白的检证是应用于微生物，特别是病素，如HIV(Human lmmunodeficiency virus，人类免疫缺陷病毒即艾滋病病素)，肝炎病毒等的感染的诊断。特异的免疫球旦白在被检查样品中的存在一般是通过一个或多个与这种特异免疫球旦白起反应的抗原来证实，在试样液体中测定特异免疫球旦白的方法必须是敏感的、可靠的、简单和迅速。
另一个免疫学的方法是竞争免疫测定法，在这种方法中一个分析物的定性和定量的检测可通过下述方法作到，即一个与这个分析物在免疫学上类似的半抗原和这个分析物来竞争在一个受体上的，例如在一个抗体上的结合部位，分析物类似物在此一般是以标志的形式或者是以在一个固体相上结合的形式来使用。
最近几年日益增多地发展了以非放射性的标志基团为基础的检证系统，在这些方法中分析物，例如一种特异抗体在被检查试样中的存在可以借助光学的(例如发光或荧光)，核磁共振-活性的或金属-沉淀的检测系统来确定。
EP-A-O307149公开了对于一个抗体的一个免疫试验，在这个试验中应用两个重组的多肽作为抗原，其中的一个是固定在一个固体相上，和另外一个携带一个标志基团，为了提高检证的特异性两个重组抗原是挤压在不同的生物体上。
EP-A-366673公开了在一个试样中检证抗体的一个方法，在此方法中一个抗体通过与一个提纯的标志抗原和与相同的提纯抗原以一种固体相结合的形式反应来证实。并公开了例如以人的IgG作为抗原。
EP-A-0386713说明了一个抗HIV抗体的一个检证方法，是应用两个固相载体，在两个固相载体上固定了不同的HIV-抗原，分别与一个等分的试样和一个标志的HIV-抗原接触，抗体的存在是通过在这些试验中至少有一个是阳性反应来验证的。并公开了以重组制出的多肽作为HIV-抗原。
EP-A-0507586说明了一个特异免疫球旦白免疫学试验的实施方法，即：一个试样与两个能结合这个免疫球旦白的抗原接触，其中一个抗原携带着一个能结合在一个固相载体上的基团，另一个抗原携带着一个标志基团。标志基团可以是一个直接的标志基团，例如一个酶，一个色素原，一个金属粒子，或者也可以是一个间接的标志基团，亦即带在抗原上的标志基团可以与一个该标志基团的受体起反应，这个受体又携带着一个产生信号的基团。例如荧光素衍生物便是这样一个间接的标志基团，它的受体是一个抗体，该抗体又与一个酶相结合。公开的抗原有多肽，例如肝炎B-表面抗原，向这种抗原通过衍生化导入SH-基，荧光素便是与这些基团相结合的。
EP-A-0 507 587公开了一个专门用以检证IgM抗体的方法，即将试样与一个针对待检抗体的标志抗原和与另一个同样针对待检抗体并可结合在一个固相上的抗原一起孵育。
EP-A-0 199 804和EP-A-0 580 979公开了一个免疫学检证方法，是应用用发光的金属螯合物基团，特别是用钌螯合物基团和锇螯合物基团标志的抗原。用免疫球旦白作为抗原，这些免疫球旦白是通过与活性金属络合物反应随机标志的。
EP-A-0 178 450公开了金属螯合物，特别是钌络合物，在它上面可以结合上一个免疫活性物质，例如抗体，这个结合是通过免疫反应物质与金属螯合物的统计反应来实现。
EP-A-0 255 534公开了一个发光免疫测定法，是应用一个结合了金属螯合物的抗原或抗体。这种结合是通过例如一个金属螯合物-活性酯衍生物与一个抗体的随机反应来进行的。
WO 90/05301公开了一个通过电化学发光的方法来检证和定量测量分析物，是应用发光的金属螯合物结合在(i)一个加入的分析物，(ii)分析物的一个结合伙伴或(iii)一个反应部分上，后者可以与(i)或(ii)结合。发光测量通过将金属螯合物结合在激活的和必要时磁性的微粒上来完成的。
根据现有技术水平已知的对于抗体的免疫学检证方法通常是应用多肽-抗原，这种多肽-抗原大多数是通过重组的DNA-方法来制备。然而在使用这种多肽-抗原时会出现问题。常常有可能是重组多肽只产生一种融合多肽的形式，它的融合部分在试验中可以导致错误的阳性结果。再者通过重组压榨法产生的多肽的试样液体中常常只有较小的稳定性并且倾向于聚集。另一个缺点是标志的基团向这种多肽的导入常常是没有选择和再复制的可能。
此外重组的多肽抗原的制备代价高，并且免疫学反应在不同价格的重组多肽中可以出现较大的偏差。
当利用已知的抗原，应用对敏感性和精确性要求极高的竞争免疫测定法来检证浓度极小的分析物如雌(甾)二醇或睾(甾)醇时，尤其是当应用以电化学发光为基础的检证系统时，很难以达到所要求的检证下限值。
因此本发明所要解决的问题是提供一个能够用简单的和高效率的方式制备用于免疫试验的抗原的方法，使在现有技术状况下所制备的已知抗原的缺点至少可以部分地排除。此外这种方法应该能够使标志基团选择性地和可复制性地导入抗原中
这个问题通过结合物得到解决，它包含一个具有最多100个单体单元的聚合物载体，这个载体含有结合在反应侧基上的1-10个半抗原分子和1-10个标志基团或固体相结合基团，其中单体单元是由氨基酸，核甙酸和肽的核酸选出。
通过将本发明的结合物(含有1-10个半抗原分子和一定数目的标志基团或固体相结合基团)作为抗原应用在一个免疫学检证方法中，使人惊异的是在与已知的单体和多体的抗原相比较，检证下限值降低的同时可以达到一个明显提高的敏感性和精确性。除此之外本发明的结合物可以很简单的方式通过固相合成。例如肽-固相合成而获得。对此，单体单元，例如氨基酸衍生物，总是可以装在预定的位置上，单体单元是与一个半抗原分子或与一个标志基团或者与一个固体相结合基团衍化出来的。此外在固相合成结束后在存在有带有自由官能团的单体的载体链部位可以附加选择性的引入半抗原或标志基团或者是固体相结合基团。因此将半抗原分子和标志基团或者是固体相结合基团准确而又可复制地引入结合物已成为可能。在结合物上的单个基团之间的距离可以准确的确定和必需时也可以变化。通过对结合物上标志基团的距离的选择可以使信号熄灭保持在极小。从而使信号的强度与标志基团的数目成正比增加。并且标志基团的一个确定的空间方向，例如在螺旋形的载体，有助于改善信号的强度。尤其是在螺旋载体，例如单股的或特别是双股的核酸中，标志基团之间的距离则总计为3-6或/和13-16个单体单元。
构成结合物主链的聚合载体分子其长度最大为100个单体单元优选3-80个单体单元，特别优选是5-60个单体单元。
单体单元是由氨基酸，核甙酸和肽的核酸选出。优选的是聚合载体包含一个由氨基酸构成的肽链，优选是一个直线的肽链。载体也可以包含一个由核甙酸或核甙酸类似物构成的核酸链，在其反应的侧基上结合有半抗原分子和标志基团或者固体相结合基团。这种核酸链可以是单股的或者是双股的。在双股的核酸载体常常发现标志基团的信号强度提高，例如在荧光标志基团中量子收率改善。
此外聚合载体可以由肽核酸(PNA)构成。肽核酸包含一个聚酰胺主链，它由相同或不相同的下式单体单元构成。
(CH2)k-CHR-N[CO-(CH2)i-L]CH2-(CH2)m-NH-CO-，其中L是由氢，苯基，自然存在的核硷和非自然存在的核硷构成的组中选出，R’是由氢和自然和非自然存在的氨基酸、优选是α-氨基酸侧链组中选出，k和m分别为0或1，i是独立的0至5。半抗原分子和标志基团或固体相结合基团可以结合在肽核酸的核碱-或/和氨基酸侧链上。肽核酸和它的制备在WO 92/20703有说明。在这里将其公开内容并入。
在肽核酸情况下载体可以是单股或是双股的。特别优选的是带有至少一个PNA-股，例如一个PNA-股和一个核酸股，例如一个DNA-股的双股的载体。
结合物含有1-10个半抗原分子，优选1-6个半抗原分子和特别优选的是1或2个半抗原分子。而半抗原优选是具有100-2000Da分子量的免疫学反应分子。这种半抗原分子以例如由药理学活性物质选出，例如抗生素，鸦片制剂，安非他明，巴比妥类，细胞抑制药(例如庆大霉素，妥布霉素，万古霉素等)，扑热息痛，水杨酸盐，苯妥因，奎宁和奎宁衍生物，茶硷等，激素和代谢产物如甾醇，胆酸，性激素(例如雌(甾)二醇，雌(甾)三醇，睾(甾)酮，黄体酮，孕烯醇酮和它们的衍生物)，肾上腺皮质激素类(例如皮质(甾)醇，皮质(甾)酮，可的松和它们的衍生物)，卡烯内酯和卡烯内酯-甙(例如地高辛，地高辛配基，毒毛旋花子甙，蟾二烯羟酸内酯等)，类甾醇皂甙配基，甾类生物碱，肽激素，股酐酸，甲状腺激素(例如T3，T4)，神经递质(例如5-羟色胺，胆硷，γ一氨基丁酸)，维他命和介质如前列腺素，白三烯(Lenkotrienen)，白内二炔(Leuko-En-diinen)和凝血噁烷类。
另一方面半抗原可以由免疫学反应的肽抗原决定簇选出，它优选有直至30个氨基酸的长度。这种肽抗原决定簇可以来自例如致病的生物，如细菌，病毒和原虫或者自体免疫抗原。例如这种免疫学反应肽抗原决定簇可以来自病毒的抗原，如HIVI，HIVII或肝炎C-病毒(HCV)的氨基酸序列。
除此之外半抗原也可以由具有一个长度优选至50个核甙酸的核酸中选出，这些核甙酸补充到核酸序列，这个核酸序列在试样中应该被检证。半抗原也可以由具有一个长度直至50个单体单元的肽核酸选出。
此外本发明的结合物含有1-10个，优选2-8个标志基团或固体相结合基团。对于标志基团优选的例子是发光的金属螯合物和荧光标志。对于固体相结合基团优选的例子是生物素和生物素类似物，如脱硫生物素和非米诺(Immino)生物素，它们可以与抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白完成一个特异反应。
半抗原分子和标志基团或固体相结合基团优选通过反应的氨侧基或/和硫羟侧基，特别优选的是通过反应的伯氨基侧基结合在载体侧链上。这种侧基可以通过向载体链导入相应的单体，例如氨基酸如细胞溶素，乌氨酸，羟(基)赖氨酸或半胱胺酸来制造。
在本发明确定的实施形式中优选的可以是，将一个间隔基导入到半抗原或标志基团或固体相结合基团和载体链之间。间隔基优选是易弯曲的和最好是有一个3-30个原子的链长度，特别优选的是间隔基含有亲水的基团，例如氧化烯-或/和羟基-侧基。
优选的标志基团是发光的金属螯合物，亦即能够产生一个可以检证的发光反应的金属螯合物。这个发光反应的检证可以通过例如荧光-或通过电化学发光测量来完成。这种金属螯合物的金属是例如一个过渡金属或者是一个稀土金属。这种金属优选的是钌，锇，铼，铱，铑，铂，铟，钯，钼，锝，铜，铬或钨。特别优选的是钌，铱，铼，铬和锇。最优选的是钌。
与金属一起构成金属螯合物的配位体通常是多配位基-配位体。亦即配位体具有多个配合位。多配位基配位体包括例如芳香族的和脂肪族的配位体。适合的芳香族的多配位基-配位体包含有芳香族杂环的配位体。优选的芳香族杂环配位体是含N的多杂环例如联吡啶，联吡唑(Bipyrazy)，三联吡啶和菲酚基。这种配位体可以包括例如取代基如烷基，取代的烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，羧酸根，羧基醛，羧酰胺，氰基，氨基，羟基，亚氨基，羟基羰基，氨基羰基，脒，胍盐，酰脲，含硫的基，含磷的基和N-羟基琥珀酰亚胺的羧酸酯。优选的配位体含有C2-C3-亚烷基氧基，C2-C3-亚烷基硫基和C2-C3-亚烷基氨基，特别是亚乙基氧基。螯合物也可以含有一个或多个单配位基-配位体。单配位基配位体的例子包括一氧化碳，氰化物，异氰化物，卤化物，和脂肪族的，芳香族的和杂环的膦，胺，芪和胂。
特别优选的发光金属螯合物是由具有联吡啶或菲酚基的配位体的金属螯合物选出。适合的金属螯合物的例子和它的制备是在EP-A-017 450，EP-A-0255534，EP-A-0580979和WO90/05301有所说明。在此引入这些公开。最优选的金属螯合物是钌-(联吡啶)3-螯合物。这种螯合物可以活性酯衍生物的形式在商业市场上得到，例如从Igen Inc.(Rockville，MD，USA)。
在应用一个可通过电化学发光反应检证的发光的金属配合体作为标志基团时，至少将一个阳性或/和阴性电荷载体，例如氨基或羧酸根基团，引入到载体链或/和引入到金属配合体和载体链之间的间隔基表明是合适的。特别优选的是载体链含有一个或多个阴性电荷，它可能是例如通过在合成过程中引入谷氨酸或天冬氨酸产生的。并且在其它的标志基团或固体相结合基团，例如荧光基团或生物素中，向载体链或/和向间隔基引入电荷载体是优选的。
对于优选的标志基团的另一个例子是荧光标志，如荧光素，香豆素，若丹明，试卤灵，花香和它们的衍生物。在应用发荧光的标志基团时载体主链为一个螺旋结构证明是有利的，它固定荧光标志基团有关空间定位和距离以防止通过能量传递所致的荧光熄灭。对于产生一个适合的螺旋结构的单体的例子是脯氨酸或者是带有一个脯氨酸侧基的肽核酸衍生物。
本发明的结合物的制备是通过以下方法，即由单体单元在固相合成一个聚合载体，优选肽载体，其中(a)在合成过程中将单体衍生物引入到载体的预定部位，单体衍生物与半抗原分子或/和标志基团或固体相结合基团共价结合；或/和(b)在合成后将活性的半抗原分子或/和标志基团或固体相结合基团结合在载体的反应侧基上。
由本发明方法演变的改进方法(a)是在固相合成时引入单体衍生物，它最好是通过碱性氨基酸如细胞溶素或乌氨酸的伯氨基侧基或者是通过氨基酸如半胱氨酸的硫羟侧基与半抗原分子或/和标志基团或固体相结合基团共价结合。相应的单体衍生物的制备例如可以通过将一个活性的半抗原分子或者一个活性的标志基团或者是固体相结合基团，例如一个活性酯衍生物结合在一个自由的伯氨基上或者是将一个马来酰亚胺衍生物结合在一个必要时是部分被保护的单体衍生物，例如氨基酸衍生物的一个自由硫羟基上来完成。在图1中所示是一个优选的结合了金属螯合物的细胞溶素衍生物。在图2所示是一个生物素化的细胞溶素衍生物。
“活性酯”的概念按本发明的意思包括活性酯基团，它能与肽的自由氨基在这样的条件下反应，即没有可能与肽的其它反应基团出现干扰的副反应。优选的是应用N-羟基琥珀酰亚胺作为活性酯衍生物。除了N-羟基琥珀酰亚胺也可以应用类似的p-硝基苯基-，五氟苯基-，咪唑基-或N-羟基苯并三唑基酯。
适合引入低(聚)核苷酸载体中的半抗原-，标志基团-和固体相结合基团衍生物的制备，在Theisen等发表的文章(Tetrahedron Letter33(1992)，5033-5036)中举例荧光染料5-羧基荧光素时有所说明，该荧光染料被转化成磷酰胺衍生物。这个磷酰胺衍生物可以引入到低(聚)核苷酸衍生物的5’-尾端或/和3’-尾端或者是引入到低(聚)核苷酸序列之内。
由本发明方法演变的改进方法(b)是在用于固相合成的单体衍生物的保护基离解之后，最好是将引入基团结合在载体的氨基-或/和硫羟-侧基上，特别优选的是结合在伯氨基侧基上。
优选的是按改进方法(a)引入半抗原和标志基团或固体相结合基团，亦即在固体相合成时应用结合了待引入基团的单体衍生物。例如发光的金属螯合物，生物素或肽半抗原可以按照这种改进方法顺利地导入。然而在敏感的荧光染料或-标志基团或其它半抗原，如类固酮中，前面的方法有较小的优越性，因为这些物质通过在固相合成时控制的条件可以遭到破坏。在这种情况结合物的制备优选是按照改进方法(b)，即通过在完成了的载体分子上的补充结合来实现。自然改进方法(a)和(b)相结合是可能的。
也可以按照改进方法(b)即合成结束之后将两个不同的基团引入，例如一个半抗原和一个标志基团或一个半抗原和一个固体相结合基团。对此可以按改进方法(b)例如这样进行，即第一个待引入的基团结合在载体分子的氨基侧基和第二个待引入的基团结合在载体分子的硫羟侧基。另一方面也可以将这二个待引入基团分别选择性地结合在载体的预定的伯氨基侧基上，在此在载体的应该与半抗原发生结合的部位，应用一个带有用于氨基侧基的第一个保护基的单体衍生物，而在载体的应该与标志-或固体相结合基团发生结合的部位，应用一个带有用于氢基侧基的第二个保护基的单体衍生物，并且第一个和第二个保护基是这样选择的，即一个选择性保护基的解离及其之后一个选择性的结合能够分在两个反应步骤完成。对此第一个和第二个保护基可以由酸不稳定的氨基保护基，如BOC或酸稳定的保护基，如苯乙酰基选出。
在按本发明的方法中具有所希望的单体序列的载体分子是在一个固体相制备。肽载体的制备优选是用商业上的肽-合成设备(例如Applied生物系统设备A431或A433)。合成根据已知方法来实现，优选是在应用氨基酸衍生物的条件下由肽的羧基末端开始。优选使用氨基酸衍生物，它们用于结合所需要的氨基-端基是与芴基甲基羟基羰基(Fmoc)-残基衍化了的。加入的氨基酸的反应侧基含有保护基，它们在肽合成结束后可以顺利的解离。对此优选的例子是保护基，如三苯甲基(Trt.)，叔丁醚(TBu)，叔丁酯(OtBu)，叔丁氧基(BOC)，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酸基(Pmc)或苯乙酰基。
赖氨酸的残基的或其它具有伯氨基侧基的氨基酸衍生物的氨基侧链，按改进方法(a)与待引入的基团共价结合。所提及的伯氨基侧基位于肽的部位，在这个部位应该引入一个半抗原或一个标志基团。
除了20种天然的氨基酸之外肽还可以包含人工的氨基酸，如β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，ε-氨基己酸，正亮氨酸或乌氨酸。这些人工的氨基酸是与天然氨基酸类似以被保护的形式用于合成。
按本发明方法的改进方法(b)在合成结束后半抗原或标志的引入是通过肽的保护基解离之后与所期望的活性基团转化实现，这个活性基团与肽的自由的伯氨基反应。每一个自由伯氨基优选是加入1.5至4当量的活性酯。然后将反应产物提纯，优选是通过高压液体色谱法(HPLC)。两个不同活性基团的引入是按照改进方法(b)通过应用两个如上述的选择性解离的保护基完成的。
结合物的肽主链上占有一个非免疫反应的氨基酸序列，亦即一个氨基酸序列，在结合物作为抗原用于预定的免疫学检证方法时不影响试验的进行。
另一方面载体分子的主链也可以由核苷酸或肽的核酸组成。一个低(聚)核苷酸载体分子的合成可以在一个商业的DNA-合成设备内完成。半抗原分子和标志基团或固体相结合基团优选是作为磷酰胺衍生物导入(Theisen等，Supra；应用生物系统(Applied Biosystem)，应用者公报(User Bulletin)67，FAM Amidite，1992年5月)或/和追加地结合在自由反应的侧基上。肽核酸基础上的载体分子的合成是类似于固相肽合成，例如按照在WO92/20703中所说明的方法。半抗原分子或标志基团或固体相结合基团的导入可以用有关的对于肽-和低(聚)核苷酸载体所说明的方法进行。
本发明的目的并且也是应用结合物作为在免疫学方法中的抗原(当半抗原分子是一个免疫反应分子时)或者用于DNA-诊断(当半抗原是一个核酸时)。
含有多于1个半抗原分子的结合物可以在免疫学检证方法中作为多半抗原来使用。
本发明的一个优选的实施形式是结合物在免疫学方法的应用，此方法是用于确定在一个试液中的抗体。优选是确定这些抗体，它们可以指明由微生物，如细菌，病毒或原虫，所致的感染。特别优选的是确定针对病毒的抗体，例如针对爱滋病病毒(HIV)或肝炎病毒的抗体。试液最好是血清，特别优选的是人血清。此外优选的是本发明的结合物在免疫学方法中以桥试验形式使用。
因此本发明的目的是一个免疫确定试液中特异抗体的方法，其特征在于，(a)试液与至少一个本发明的结合物一起孵育，该结合物是针对欲确定抗体的，(b)此抗体通过与肽结合可以证实。
本发明的免疫学测定方法实质上可以根据任何已知的试验方式进行，例如在一个均匀的有一个单一反应相的免疫测定法或在一个不均匀的有多于一个反应相的免疫测定法。优选应用一个不均匀的试验形式，在这种方法中固体相的出现可以证实抗体的存在。这种试验形式的一个实施形式是所谓的双抗原-桥-试验方案。在这里试样液与两个针对欲检测的抗体的抗原在反应固相存在的情况下孵育，其中第一个抗原携带一个标志基团和第二个抗原结合在固体相上或者以一个可以结合在固体相的形式存在。第一个或/和第二个抗原是一个本发明的结合物。在试液中欲检测的抗体必要时在固相由孵育液分出后通过测定在固相中或/和在液相中的标志来证实。优选第一个抗原是一个用一种发光的金属螯合物或一个荧光基团标志的结合物。第二个抗原最好是用生物素标志的并且是可以结合在固体相上的，这个固体相是用抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白涂层的。
试验的进行优选是包括试液与第一个标志的抗原和固相侧的第二个抗原混合，以得到一个由第一个抗原，抗体和固相结合的第二个抗原构成的标志的、固定的配合体。桥试验形式与其它抗体检证试验形式相比较不仅提高了敏感性，即它可以辨认所有免疫球蛋白的类别，如IgG，IgM，IgA和IgE，而且也提高了特异性，即它减少了非特异性反应。
本发明的第二个优选的实施形式涉及将结合物应用在一个竞争免疫测定法。竞争免疫测定一般是用于检证低分子量的分析物，并且原则上可以以两个试验形式进行，即“标记抗体”形式和“标记类似物”形式。在“标志抗体”形式中含有欲检测的分析物的试液是试液用一个可以结合在固体相上的半抗原(它与分析物免疫学竞争)和一个标志的、针对半抗原和分析物的受体(例如抗体)进行标志。在这种试验形式结合在固体相的标志与分析物浓度成反比。在“标志类似物”的形式中是将含有欲检测分析物的试液用一个标志的、与分析物免疫竞争的半抗原和一个针对分析物和半抗原的受体(此受体可以结合在一个固体相上)一起孵育。结合在固体相上的标志的半抗原的量是与自由的、待检分析物的浓度成反比。
因此本发明的目的是根据竞争免疫测定法的原则以“标志类似物”的形式检证在一个试液中分析物的方法，其特征在于，(a)试液在反应固体相存在下与一个本发明的结合物(它含有一个标志基团)和一个受体(它是结合在固体相上或者是可以结合在固体相上的并且它可以与分析物和结合物的半抗原成分发生一个特异的免疫学反应)一起孵育，(b)必要时固体相从孵育液分开和(c)在试液中分析物的存在或/和它的量通过测量在固体相或/和在孵育液中结合物的标志部分来确定。优选应用一个含生物素的抗体或一个含生物素的抗体片段作为可以固定的受体和应用一个用抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白涂层的固体相作为反应固体相。
本发明另外一个目的是根据竞争免疫测定法的原则以“标记抗体”的形式检证试液中分析物的方法，其特征在于，(a)试液在反应固体相存在下与一个本发明的结合物(它含有一个固体相结合基团)和一个受体(它携带一个标志基团并且可以与分析物和结合物的半抗原部分发生一个特异的免疫学反应)一起孵育，(b)必要时固体相从孵育液分开和(c)在试液中分析物的存在或/和它的量是通过测量在固体相或/和在孵育液中受体的标志部分来确定。优选地是应用一个含生物素的结合物和一个用抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白涂层的固体相，优选是应用一个抗体或一个抗体片段作为标志受体。
发光的金属螯合物基团的检证优选是通过电化学发光来实现，在此发光的物体在一个电极表面以电化学方式产生。荧光的检证可以定性或/和定量进行。关于发光分析法进行的实例在EP-A-0580979，WO90/05301，WO90/11511中和在WO92/14138中可以找到。在那里面公开的用于发光分析法的方法和设备在此引入。在电化学发光分析法中的固体相优选是由微粒组成，特别优选的是磁性的微粒，它具有一个复盖层，它与固体相侧的第二个抗原相互作用。微粒优选用抗生蛋白链菌素涂层。
电化学发光-测量优选是在有金属配合体的还原剂存在的情况下进行，例如胺。优选的是脂肪族胺，特别是伯，仲，叔的烷基胺，它们的烷基分别具有一至三个碳原子。特别优选的是三丙胺。然而胺也可以是一个芳香胺，如苯胺或杂环胺。
另外必要时可以存在一个非离子的表面活性剂作为活化剂，例如乙氧基化的酚。这种物质例如在商业上以标志为Triton×100或Triton N-401可以买到。
另外发光的金属螯合物的检证也可以通过荧光实现，在此金属螯合物通过合适的波长的光的照射来激发并测量由此产生的荧光射线。有关荧光-分析法实施的例子在EP-A-0178450和EP-A-0255534中可以找到。这些公开文章在此引入供参考。
荧光基团也如发光金属螯合物一样属于本发明结合物的优选的标志基团，其检证可以如前所述用己知的方法通过激发和测量荧光来实现。
本发明的另一个目的是一种免疫学试剂，它至少含有一个本发明的标志的或可以结合固体相的结合物。用于按照双抗原-桥试验原则进行免疫学测定特异抗体的试剂含有(a)一个标志的按本发明的结合物或/和(b)另外一个本发明的结合物，后者结合在固体相或者是以一个可以结合在固体相的形式存在。
根据竞争免疫测定法的原则用于确定一个分析物，更可取的是测定一个低分子量的分析物的试剂含有一个标志的结合物(“标记类似物”形式)或含有一个可以结合固体相的结合物(“标记抗体”形式)，这个结合物与欲确定的分析物免疫学地竞争结合一个受体。优选地，用于竞争免疫测定法的试剂空间上从本发明的结合物分开，它含有或者一个标志受体(“标记抗体”形式)或者一个可以结合固体相的受体(“标记类似物”形式)，该受体可以与欲确定的分析物和与本发明的结合物发生免疫学反应。
通过以下实施例和附图对本发明作了进一步说明，
图1表示一种金属螯合物-赖氨酸-衍生物，
图2表示一种生物素-赖氨酸衍生物，
图3表示按本发明的结合物，
图4表示对比结合物。
实施例1
金属螯合物-赖氨酸-衍生物的制备
6mmol按照EP-A-0580979的钌配合物钌(二吡啶)2(二吡啶-CO-N-羟基琥珀酰亚胺酯)加在50ml二甲基甲酰胺中使之溶解并且向其中滴加α-Fmoc-赖氨酸溶液。蒸去溶剂后将残留物溶于少量丙酮中，与300ml氯仿混合和加热至煮沸短时间。将溶剂分开后得到如图1所示的作为固体的化合物。
实施例2
金属螯合物-标志的和含生物素的肽的制备
金属螯合物-标志肽或含生物类的肽是借助于芴基甲基氧基碳基-(Fmoc)-固相肽合成在一个批料肽合成器中制备的，例如应用生物系统(Applied Biosystems)A431或A433中所叙。对此应用表1中所示的氨基酸衍生物时每一种分别取4.0当量。
 A  Fmoc-Ala-OH
 C  Fmoc-Cys(Trt)-OH
 D  Fmoc-Asp(OtBu)-OH
 E  Fmoc-Glu(OtBu)-OH
 F  Fmoc-Phe-OH
 G  Fmoc-Gly-OH
 H  Fmoc-His(Trt)-OH
 I  Fmoc-Ile-OH
 K  Fmoc-Lys(Boc)-OH
 L  Fmoc-Leu-OH
 M  Fmoc-Met-OH
 N  Fmoc-Asn(Trt)-OH
 p  Fmoc-Pro-OH
 Q  Fmoc-Gln(Trt)-OH
 R  Fmoc-Arg(Pmc)-OH
 S  Fmoc-Ser(tBu)-OH
 T  Fmoc-Thr(tBu)-OH
 U  Fmoc-β丙氨酸-OH
 V  Fmoc-Val-OH
 W  Fmoc-Trp-OH
 Y  Fmoc-Tyr(tBu)-OH
 Z  Fmoc-ε-氨基己酸-OH
 Nle  Fmoc-ε-Norleucin-OH
 Abu  Fmoc-γ-氨基丁酸-OH
金属螯合物基团和生物素基团向肽序列的导入是通过金属螯合物基团或生物素结合的氨基酸衍生物的直接引入来完成，例如在序列内通过用金属螯合物-活性酯ε-衍生物的赖氨酸残基(图1)或通过用生物素衍生的赖氨酸残基(图2)或N-末端通过应用相应的α-衍生的氨基酸残基。
氨基酸或氨基酸衍生物溶解在N-甲基-吡咯烷酮中。肽是在400-500mg 4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基-树脂(四面体简讯(Tetrahedron Letters)28(1987)，2107)用0.4-0.7mmol/g的负荷合成的(JACS 95(1937)，1328)。结合反应是涉及Fmoc-氨基酸衍生物与4当量二环己基碳二亚胺和4当量N-羟基苯并三唑在二甲基甲酰胺反应介质中在20分钟时间进行。在每一个合成步骤之后Fmoc-基团用20％的哌啶在二甲基甲酰胺中在20分钟被解离。
肽由载体的释放和酸不稳定的保护基的解离是用20ml三氟醋酸，0.5ml乙二硫醇，1ml硫苯胺，1.5g酚和1ml水在室温下40分钟发生。反应溶液随即与300ml冷却的二异丙醚混合和在0℃保持40分钟以使肽完全沉淀、将沉淀物过滤，用二异丙醚再洗涤，用少量50％的醋酸溶解和冰冻干燥。得到的粗产物借助于制剂高压液体色谱法(HPLC)在Delta-PAKRPC18-材料上(柱50×300mm，100，15μ)通过一个相应的梯度(洗脱液A：水，0.1％三氟醋酸，洗脱液B：乙腈，0.1％三氟醋酸)在约120分钟的时间内提纯，洗提物的同一性用离子流-质谱分析测试。
酸稳定的苯乙酰保护基的移去是用固定的或可溶的青霉素G-酰胺酶在具有有机溶剂成分的水溶液中在室温下酶促发生的。
实施例3
与半抗原结合
金属螯合物标志的或含生物素的肽在二甲基甲酰胺中溶解和对于肽的能够结合的部位(例如赖氨酸的氨侧基)总是稍稍过量(约30％)地加入激活了的半抗原(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)。在室温下搅拌1小时，在高度真空中将溶剂除去并将肽通过制剂高压液体色谱法提纯。
在应用图I所示的金属螯合物-赖氨酸-衍生物作为标志基团和雌(甾)二醇作为半抗原时结合物是以下面的结构制备的：
I：AcK(BPRu)UEUEUK(E2)UEUEUK(BPRu)UEUK(E2)-NH2
II：AcK(BPRu)UEUEUK(E2)UEUEUK(BPRu)U-NH2
结合物1在图3示出，肽链的氨基末端是被乙酰基(AC)保护。羧基末端是作为酰胺基存在。
金属螯合物-和半抗原分子分别通过赖氨酸的ε-氨基侧基结合在肽链。
以类似的方法应用睾(甾)酮作为半抗原分子合成了具有结合物I的序列的结合物。
制出的结合物的结构通过1H-NMR(500MHz)检查和证实。
实施例4
血清中雌(甾)二醇的测定
为了检测人血清中雌(甾)二醇根据“标记类似物”形式进行了竞争的二步-测定法。为此90μl溶液1(0.69nmol/l本发明的结合物I(图3)或1.68nmol/l对比结合物(图4)，分别在50nmol/l 4-吗啉乙磺酸(MES)，pH6.8，0.1％牛血清白蛋白，0.1％Thesit，0.01甲基异噻唑，0.1％Oxypyrion，30ng/ml分离试剂二氢睾酮中)与50μl试样(血清试样或雌(甾)二醇标准)在一个聚苯乙烯容器中在37℃孵育10分钟。随后陆续加入90μl溶液2(0.7μg/ml或1.4μg生物素和多克隆的抗-雌(甾)二醇-免-抗原结合分段(Fab’)的结合物在50mmol/l MES-缓冲液pH6.0中)和50μl颗粒悬浮液(720μg/ml抗生蛋白链菌素涂层的磁性激粒，Fa.Dynal)。
在37℃继续孵育10分钟后将150μl的混合物移到一个测量小室中。在那里在电极表面发生颗粒微粒和在它上面附着的钌标志物的磁性浓缩和在28℃检查到一个电化学产生的化学发光信号。
在表2显示的试验结果表明，本发明的结合物与对比结合物相比较在敏感性和检证下限方面明显改善了试验效果。
表2
抗原   结合物I(本发明)     结合物(对比)
抗原浓度(nmol/l)     0.69     1.68
钌配合物浓度(nmol/l)     1.68     1.68
抗血清浓度(μg/ml)     0.7     1.4
计数标准F     80412     87709
计数标准B     653420     1224219
计数标准A     861140     1445270
比例B/A     0.759     0.847
比例F/A     0.093     0.061
比例F/E     0.546     0.442
检证下限pg/ml(3％VK) 15.9 25.1

Claims (38)

1.结合物，含有一个具有最多至100个单体单元的聚合载体，此载体含有结合在反应侧基上的1-10个半抗原分子和1-10个标志基团或固体相结合基团，其中单体单元是由氨基酸，核苷酸，核苷酸类似物和肽的核酸选出。
2.按权利要求1的结合物，其特征在于，聚合载体具有3-80个单体单元的长度。
3.按权利要求1或2的结合物，其特征在于，聚合载体具有5-60个单体单元的长度。
4.按前述权利要求中之一的结合物，其特征在于，它含有1-6个半抗原分子。
5.按前述权利要求中之一的结合物，其特征在于，它含有2-8个标志基团或固体相结合基团。
6.按前述权利要求中之一的结合物，其特征在于，聚合载体含有一个由氨基酸构成的肽链。
7.按权利要求1-5中之一的结合物，其特征在于，聚合载体含有一个由核苷酸或/和核苷酸类似物构成的链。
8.按权利要求1-5中之一的结合物，其特征在于，聚合载体含有一个由肽核酸构成的链。
9.按权利要求7或8的结合物，其特征在于，聚合载体是作为双股存在。
10.按权利要求9的结合物，其特征在于，双股至少有一个链含有肽核酸。
11.按前述权利要求中之一的结合物，其特征在于，半抗原分子和标志基团或固体相结合基团是通过反应的氨基侧基或/和硫羟侧基结合在聚合载体上。
12.按前述权利要求中之一的结合物，其特征在于，它含有的标志基团是由发光的金属螯合物或荧光基团选出的。
13.按权利要求1至11中之一的结合物，其特征在于，它含有的固体相结合基团是由生物素和生物素类似物选出的。
14.按权利要求12的结合物，其特征在于，标志基团是发光的金属螯合物并且聚合载体至少含有一个阳性的或/和阴性的电荷载体。
15.按权利要求12的结合物，其特征在于，标志基团是荧光基团，聚合载体显示一个基本上螺旋形的结构。
16.按前述权利要求中之一的结合物，其特征在于，半抗原是一个免疫学反应分子，其分子量≤2000 Da。
17.按权利要求16的结合物，其特征在于，半抗原是由药理学生物活性物质，激素，代谢产物，维他命，介质和神经递质选出。
18.按权利要求1至15中之一的结合物，其特征在于，半抗原是由免疫学反应的肽抗原决定簇选出，它具有直至30个氨基酸的长度。
19.按权利要求1至15中之一的结合物，其特征在于，半抗原是由具有长度直至50个核苷酸的核酸选出。
20.按权利要求1至15中之一的结合物，其特征在于，半抗原是由具有长度至50个单体单元的肽核酸选出。
21.按权利要求1至20中之一的结合物的制备方法，其特征在于，聚合载体是由单体单元在固体相上合成，其中
(a)当合成时单体衍生物引入载体的预定的部位，单体衍生物是与半抗原分子或/和标志基团或固体相结合基团共价结合，或/和
(b)合成后激活了的半抗原分子或/和标志基团或固体相结合基团结合在载体的反应侧基上。
22.按权利要求21的方法，其特征在于，肽载体是由氨基酸衍生物合成。
23.按权利要求21或22的方法，其特征在于，在其改进方法(a)中半抗原分子或/和标志基团或固体相结合基团总是结合在单体衍生物的伯氨基或硫羟基上。
24.按权利要求21或22的方法，其特征在于，在其改进方法(b)中在载体的氨基侧基或/和硫羟侧基的结合是在用于固体相合成的单体衍生物的保护基解离之后发生。
25.按权利要求21，22或24的方法，其特征在于，在改进方法(b)中的合成之后半抗原分子和标志基团或固体相结合基团结合在载体的伯氨基侧基上，其中在载体的应该与半抗原分子发生结合的部位，是应用了一个具有用于氨基侧基的第一个保护基的单体衍生物，和在载体的应该与标志基团或固体相结合基团发生结合的部位是应用了一个具有用于氨基侧基的第二个保护基的单体衍生物并且第一个和第二个保护基是这样选出的，即选择性的保护基解离是可能的。
26.按权利要求25的方法，其特征在于，第一个和第二个保护基是由酸不稳定的或酸稳定的保护基选出。
27.按权利要求1至20中之一的结合物用于在免疫学方法中作为抗原或用于核酸诊断。
28.按权利要求27的应用，其特征在于，将含有多于1个半抗原分子的结合物作为多半抗原用于免疫检证方法。
29.在竞争免疫测定法中按权利要求27或28的应用。
30.在检证特异抗体的免疫测定法中按权利要求27或28的应用。
31.根据竞争免疫测定法原则以“标记类似物”形式检证试液中分析物的方法，其特征在于，
(a)试液在反应固体相存在下与一个按权利要求1至20中一项的结合物(它含有一个标志基团)和一个受体(它是结合在固体相上或者是可以结合在固体相上并且它可以与分析物或者是结合物的半抗原成分发生免疫学反应)一起孵育。
(b)必要时固体相从孵育液分开和
(c)在试液中分析物的存在或/和它的量通过测量在固体相或/和在孵育液中结合物的标志部分来确定。
32.按权利要求31的方法，其特征在于，是利用一个含生物素的抗体或一个含生物素的抗体片段作为受体，并且利用以抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白涂层的固体相。
33.根据竞争免疫测定法原则以“标记抗体”的形式检证试液中分析物的方法，其特征在于，
(a)试液在反应固体相存在下与一个按权利要求1至20中的一项的结合物(它含有一个固体相结合基团)和一个受体(它携带一个标志基团并且可以与分析物和结合物的半抗原成分发生一个特异的免疫学反应)一起孵育。
(b)必要时固体相从孵育液分开和
(c)在试液中分析物的存在或/和它的量通过测量在固体相或/和在孵育液中受体的标志部分来确定。
34.按权利要求33的方法，其特征在于，应用一个含生物素的结合物和一个用抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白涂层的固体相。
35.检证试液中特异抗体的方法，其特征在于，
(a)试液至少与一个按权利要求1至20中之一的结合物(这个结合物是针对欲确定的抗体的)一起孵育和
(b)抗体通过与结合物结合而被证实。
36.按权利要求35的方法，其特征在于，
(a)试液在反应固体相存在下和两个针对欲确定的抗体的抗原一起孵育，其中第一个抗原携带一个标志基团和第二个抗原结合在固体相上或者以可以结合在固体相上的形式存在，
(b)必要时固体相从孵育液分开和
(c)抗体的存在或/和它的量通过测定在固体相或/和在液体相中的标志来证实，
其中是用权利要求1至20中一项的结合物作为第一或/和第二个抗原。
37.按权利要求36的方法，其特征在于，应用一个用发光的金属螯合物或者荧光基团标志的结合物作为第一种抗原。
38.按权利要求36或37的方法，其特征在于，应用一个含生物素的结合物和一个用抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白涂层的固体相作为第二个抗原。
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