CN1075817C - 亲水的金属络合物 - Google Patents

亲水的金属络合物 Download PDF

Info

Publication number
CN1075817C
CN1075817C CN95194207A CN95194207A CN1075817C CN 1075817 C CN1075817 C CN 1075817C CN 95194207 A CN95194207 A CN 95194207A CN 95194207 A CN95194207 A CN 95194207A CN 1075817 C CN1075817 C CN 1075817C
Authority
CN
China
Prior art keywords
group
formula
unit
complex compound
hydrophilic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN95194207A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1152923A (zh
Inventor
R·海尔曼
H-P·约瑟尔
G·帕皮尔特
F·沃特尔
B·福洛比尔
J·爱斯比尼尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE4430998A external-priority patent/DE4430998A1/de
Application filed by Roche Diagnostics GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Publication of CN1152923A publication Critical patent/CN1152923A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1075817C publication Critical patent/CN1075817C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in eptitope analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/141111—Diverse hetero atoms in same or different rings [e.g., alkaloids, opiates, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本发明涉及新的亲水金属络合物和其在免疫化验中作为发光示踪基的应用。

Description

亲水的金属络合物
本发明涉及新的亲水络合物和其作为发光的示踪基在免疫测定中的应用。
由发光的金属络合物现有技术是已知的。欧洲专利EP-A-O178450公开了钌络合物，它是连接在一种免疫活化的物质上，在这当中，钌络合物含有三个相同的或不同的双环的或多环的、具有至少二个含氮杂环的配位体，同时至少这种配位体之一由至少一个起水溶作用的基如-SO3H或-COOH所取代，并同时这种配位体至少之一由至少一个反应基如-COOH直接或经一间隔基所取代，并同时配位体经氮原子与钌相结合。
欧洲专利EP-A-O580979公开了使用锇络合物或钌络合物作为示踪基用于电化发光。作为这种络合物的配位体提到含氮的杂环，例如双吡啶。世界专利WO87/06706公开了另外的金属络合物，这些络合物适于作示踪基用于电化发光测定。
由现有技术已知的金属络合物的缺点在于，在电化发光测量时通过氧-猝灭和光致离解量小产率低和/或对蛋白质的非特异性键合高。
因此本发明的基本任务在于，至少部分地去掉现有技术的一些缺点。
出乎意外地发现；在发光的金属络合物中引入C2-C3-亚烷基氧-，C2-C3-亚烷基硫-或/和C2-C3-亚烷基氨基-单元、并特别是乙二醇-单元或/和丙二醇-单元时，减少了这种具有免疫反应物的金属络合物的共轭吸附，并因此也改善了在免疫测定中的稳定性和共轭的重新寻获。另外可得到一提高的量小产率。
此外还发现：金属络合物的性质也可通过引入多羟基-单元得到改善。这种多羟基-单元可扩充成为具有多次增殖的树枝状结构。此外通过引入聚胺-结构，可使电化发光测量所需的电子供体直接结合到金属络合物的配位体范围中。
一种按本发明的进一步改进涉及一种笼式的或半笼式的金属络合物，其中配位体是一次或多次、优选是经亲水的间隔基互相连结的。这种情况也导致光稳定性的根本性改善和减少氧-猝灭。
因此本发明的主题是通式(Ⅰ)的金属络合物：
〔M(L1L2L3)〕n-XmA    (Ⅰ)式中M是一选自稀土金属离子或过渡金属离子的二价的或三价的金属阳离子，L1,L2和L3是相同的或不同的，并且为具有至少二个含氮杂环的配体，且L1,L2和L3经氮原子连结在金属阳离子上，X是一反应性的或可活化的功能基，它共价连结在配位体L1,L2,L3的至少一个上，n是从1至10的一个整数，m是从1至6的一个整数至优选1至3,A为一个或多个为电荷平衡必需的、带负电荷的基团，其中络合物含有至少一个选自C2-C3亚烷基氧-单元、C2-C3-亚烷基硫-单元、C2-C3-亚烷基氨基-单元和多羟基-单元的亲水基。
金属络合物主要是发光的金属络合物，也就是说，一种能生成可证明发光反应的金属络合物。这种发光反应的证明例如可通过荧光测量或通过电化发光测量进行。在这种金属络合物中的金属阳离子例如是一种过渡金属或一种稀土金属。这种金属主要是钌，锇，铼，铱，铑，铂，铟，钯，钼，锝，铜，铬或钨。特别优选的是钌，铱，铼，铬和锇。最常优选的是钌。
配位体L1,L2和L3是具有至少二个含氮杂环的配位体。优选的是芳烃杂环例如双吡啶基，双吡唑基，三吡啶基和菲酚基。特别优选的是选自双吡啶环体系和菲咯啉环体系的配位体L1,L2和L3。
金属络合物的反应性的或可活化的功能基X是一种能与免疫活化物质连结的反应基，或一种能以简单方式转化成这种反应基的可活化基。优选的X基是一活化的羧酸基如羧酰卤、羧酸酐或活化酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯，对硝基苯酯，五氟苯基酯，咪唑基酯或N-羟基苯并三唑基酯，马来酰亚胺，胺，羧酸，硫醇，卤根，羟基或可光活化的基团。
此外络合物含有一个或多个为电荷平衡所需的负电荷基A。例如适合的负电荷基是卤根，OH-，碳酸根。烷基羧酸根，例如三氟乙酸根，硫酸根，六氟磷酸根和四氟硼酸根。特别优选的是六氟磷酸根，三氟乙酸根和四氟硼酸根。
本发明的金属络合物与由现有技术已知的金属络合物的区别在于，它含有至少一个选自C2-C3-亚烷基氧-单元，C2-C3-亚烷基硫-单元，C2-C3-亚烷基氨基-单元和多羟基-单元的亲水基。
多羟基-单元主要选自式(Ⅱa)或(Ⅱb)的基团：
-NR-W    (Ⅱa)    -O-W    (Ⅱb)其中W为一至少具有二个羟基的有机基团，并R为氢或C1-C5-烷基，优选为氢或C1-C3-烷基、有机基W优选含有2至6、并特别优选2至4个羟基。另外较适宜的W应含有2到10、特别优选3至6个碳原子。特别的、适合的多羟基单元的例子是多醇的基团如甘油或氨基多醇的基团。一种优选的氨基多醇是三(2-氨基-2(羟基-甲基)-1，3-丙三醇)。在这种情况下，多羟基-单元具有式NR-C(CH2OH)3。这种多醇或氨基多醇是优选以酯或酰胺的形式结合在金属络合物上。
本发明的金属络合物的C2-C3-亚烷基氧-单元、C2-C3-亚烷基硫-单元和C2-C3-亚烷基氨基-单元优选是C2-单元，并特别是乙烯氧基-单元。金属络合物中每一金属阳离子含有优选1至30、并特别优选2到20个C2-C3-亚烷基-氧-单元，C2-C3-亚烷基硫-单元或C2-C3-亚烷基氨基-单元。这些单元是金属络合物杂环配位体取代基组分。它们可处在配位体之一和反应性的或可活化的功能基X之间的连接物中，或/和处在单一的取代基中。亚烷基氧-单元，亚烷基硫-单元或亚烷基氨基-单元也可经一桥接头互相连结起来，该桥接头上有时有一功能基X。另一方面，数个络合物一单元也可经桥头互相连结起来。下面叙述了本发明金属络合物的优选实施例。
在本发明的第一优选实施形式中，本发明的金属络合物具有通式(Ⅲ)：[
Figure C9519420700111
]-X A(Ⅲ)式中m，X和A定义如前面，R1,R2,R3,R4,R5和R6是相同或不同的，并各为一个或多个取代基，前提条件是，X经取代基R1,R2,R3,R4,R5或R6之一连结在配位体之一上，并取代基R1,R2,R3,R4,R5和R6之一至少含有一个选自C2-C3-亚烷基氧-单元，C2-C3-亚烷基硫-单元和C2-C3-亚烷基氨基-单元的亲水基。
根据由虚线标明的基团是否存在，络合物配位体可能是取代的菲咯啉体系或双吡啶体系。
在配位体上的取代基R1,R2,R3,R4,R5和R6，只要它们不含亲水基，则优选氢，C1-C5-烷基，特别优选C1-C3-烷基。亲水基优选总共含有1至30、特别优选2至20个亚烷基氧-单元，亚烷基硫-单元或/和亚烷基氨基-单元，特别是乙烯氧-单元。
亲水基可以是在具有连接能力的功能基X和配位体之一之间的连接物组分。在这种情况下，金属络合物主要具有通式(Ⅲa)：
Figure C9519420700112
A(Ⅲa)式中M,X和A定义如上，R1,R2,R3,R4和R5定义如上。S是从0至6的一个整数，优选从1至4,Y为选自C2-C3-亚烷基氧-单元，C2-C3-亚烷基硫-单元和C2-C3亚烷基氨基-单元，特别是乙烯氧-单元的具有1至10、优选具有2至6个亲水基单元的一个亲水连接物基。
但功能基X不一定非经亲水连接与配位体连结起来。在这种情况下，发明的金属络合物优选具有通式(Ⅲb)：
Figure C9519420700121
(Ⅲb)式中M,X和A定义如前，R1,R2,R3,R4和R5定义如前，前提条件是，R1,R2,R3,R4或/和R5含有一亲水取代基，该基通常包含1至10、优选2至6个C2-C3-亚烷基氧-单元，C2-C3-亚烷基硫-单元或/和C2-C3亚烷基氨基-单元，特别是乙烯氧-单元。
图1a和1b中表明了式(Ⅲa)化合物的一个实施例。这种化合物含有亲水物只在基X-一个马来酰亚胺(图1a)或N-羟基琥珀酰亚胺酯(图1b)-和配位体之间连接。但同样的其他配位体也可有亲水基。在图1b中表明了式(Ⅲb)化合物的一个例子。这里基X是N-羟基琥珀酰亚胺酯。
本发明的金属络合物的配位体也可互相连结，所以金属络合物是以半笼式或笼式的形式存在。
一种优选的本发明的以半笼或笼形式存在的金属络合物的实施形式具有通式(Ⅳ)：A(Ⅳ)
式中M,X,n和A定义如前，R1,R2和R3相同或不同，并各为一个或多个连在双吡啶配位体或菲咯啉配位体上的取代基-定义如前，Y各为亲水的连接基，它包括选自C2-C3-亚烷基氧-单元，C2-C3-亚烷基硫-单元和亚烷基氨基单元，特别是乙烯氧-单元的1至10个亲水单元。
若取代基R1,R2和R3以式(Ⅳ)并必要时经亲水连接基共价互相连结起来时，则式(Ⅳ)的络合物具有笼的形式。
在图2和3a中表明了式(Ⅳ)半笼式络合物的例子。在图3b中表明了笼式络合物的例子。在图2中的X基是一羧基。金属阳离子和阴离子在图3a和3b中没有标出来。
式(Ⅳ)的络合物不仅可为单体，而且也可为由优选5个以下的单一金属络合物组成的低聚物。为此，有连接能力的功能基X举例来说可以是一个在芳烃核例如苯核上的取代基，在这当中，芳烃核上二个或多个剩下的取代位置可通过半笼式的或笼式的金属络合物取代。
在图4和5中表明了式(Ⅳ)的低聚的金属络合物的例子。在这些图中未标出金属离子和阴离子。
在本发明的另一优选实施形式中，金属络合物是用多羟基-单元取代的，并具有通式(Ⅴ)：A(Ⅴ)式中M,X和A定义如前，Z为一连接基，R1’,R2’,R3’,R4’和R5’是相同的或不同的，并各为一个或多个取代基，例如氢或C1-C5-，特别是C1-C3-烷基，S是从0至6、优选从1至4的一个整数，前提条件是，R1’,R2’,R3’或/和R4’含有一亲水取代基，它包含一个多羟基-单元。
金属络合物(Ⅴ)的配位体X可经一亲水的连结物例如式(Ⅲa)的连结物。但也可经式(Ⅲb)的连结物与配位体连接。取代基R5’优选氢或C1-C5-，特别是C1-C3-烷基。
在图6中表明了式(Ⅴ)化合物的一个例子。X基是一羧基。
通式(Ⅴ)的金属络合物中多羟基-单元的OH-基必要时可被亲水基取代，例如通过C2-C3-亚烷基氧-单元、C2-C3-亚烷基硫-单元或/和C2-C3-亚烷基氨基-单元取代。
在本发明的特定实施形式中，多羟基-单元的OH-基的亲水取代基是通式(Ⅵa)或(Ⅵb)的树枝状物：
-A1-NR-W1(A2-NH-W2)n’  (Ⅵa)
-A1-O-W1(A2-O-W2)n’    (Ⅵb)式中-A1和A2是相同的或不同的，并为连接物基团，-W1和W2是相同的或不同的，并为至少具有2个羟基的有机基团，-R为氢或C1-C5-烷基，优选氢或C1-C3-烷基，并-n’是0或相应为W1的羟基数目。
连接物基A1和A2优选是式(CH2)m’(C=O)-基团，式中m’是1至5、特别是1至3。
W1和W2基优选是多羟基-单元，它的定义相应于式(Ⅱa)，(Ⅱb)所定义的基团。若n’是0，则是第一代树枝状聚合物。若n’相应于W1的羟基数目，则代表第二代树枝状聚合物。树枝状聚合物的羟基-端基必要时可被取代，例如通过式A3-R’的一个连接基，其中A3如A1和A2连接物基所定义，并R’为C1-C5，优选C1-C3-烷基。
制备本发明的金属络合物是通过一种金属盐、例如一种金属卤代物与相应的配位体的反应进行的，并必要时通过六氟磷酸盐阴离子或六氟硼酸盐阴离子接着进行卤离子离子交换。这类方法在现有技术中，例如在欧洲专利EP-B-0178450和EP-B-0255534中记述过。这里就此对这种公开作了引证参考。
制备亲水的N-杂环的配位体，可以简单的方式通过在芳烃的配位体上的取代、例如经甲苯磺酸根的取代来进行。也可以相应的方式，用带功能式X的亲水连接物的连结来进行。
制备半笼结构的或笼结构的式(Ⅳ)金属络合物例如可通过在双吡啶配位体上或菲咯啉配位体上加上亚烷基氧-单元，亚烷基硫-单元或/和亚烷基氨基-单元、并经醚或酰胺键在桥端头连接这种单元来实现。使用二个桥端头可得到笼结构。优选是在一三价桥端头上连接3个配位体，例如三个(Tris)。络合物本身，如前所述，是通过与金属盐转化制备的。
制备半笼和笼式金属络合物可按反应示意图Ⅲ(图9a和9b)进行。
制备通式(Ⅴ)金属络全物例如通过按反应路线Ⅰ(图7)的反应进行，方法是，使相应取代的配位体与氨基多醇或部分被保护的多醇进行转化，借此式(Ⅱa)或(Ⅱb)的亲水基加在配位体上。
制备树枝状的金属络合物相应于反应路线Ⅱ(图8)进行。
本发明的另一主题是一处包含生物物质在内的共轭物，在生物物质上至少连接一种本发明的金属络合物。
适合的生物物质的例子是细胞，病毒，亚细胞微粒，蛋白质，脂蛋白，糖蛋白，肽，多肽，核酸，低聚糖，多糖，脂多糖，细胞代谢物，半抗原，激素，药理的有效物质，生物碱，类固醇，维生素，氨基酸和糖。
金属络合物与生物活性物质的结合主要是经金属络合物上反应性的或可活化的功能基进行的，该功能基可与生物物质的功能基共价结合。若功能基是活性酯，举例来说则可与生物物质的自由氨基结合。若功能基是马来酰亚胺基，则可进行与生物物质的自由SH-基结合。以相似的方式也可实现生物物质功能基的活化，举例来说，接着可与金属络合物的自由的羧酸基、氨基或硫羟基反应。
在本发明的特别优选的实施例中，使金属络合物连结在肽上，肽具有的长度优选为最大50个氨基酸，并特别优选为最大30个氨基酸。制备这种金属络合物示踪肽优选通过下述方法进行，使肽与所希望的氨基酸序列在固相上合成，与此同时a)在合成之后，使活化的金属络合物、优选金属络合物-活化酯衍生物连接到肽的N-末端的氨基上，或/和b)在合成期间，使一个氨基酸衍生物导入到肽的至少一个位置上，此氨基酸衍生物与金属络合物是共价连接的。金属络合物在肽的N-末端的氨基酸上的连接优选通过在肽从固相上解离之前、并在保护基从氨基酸衍生物的反应侧基上解离之前进行，该氨基酸衍生物是为肽合成所使用的。
肽优选含有免疫反应的抗原决定基区和间隔基区，其中至少-个金属络合物-示踪基连结在间隔基区。间隔基区优选具有1至10个氨基酸的长度并定位在肽的氨基末端或/和羧基末端。
间隔基区主要含有氨基酸，氨基酸具有电荷或/或能构成氢桥。间隔基区的氨基酸优选由下述化合物构成，这些化合物为：甘氨酸，β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，ε-氨基己酸，赖氨酸和结构式为MH2-[(CH2)yO]x-CH2-CH2-COOH的化合物，式中Y是2或3,X是1至10。
肽的抗原决定基区主要来源于致病的生物体，例如细菌，病毒，和原生动物或来源于自身免疫-抗原。抗原决定基区特别优选来源于病毒性的抗原，例如HIVⅠ,HIVⅡ或肝炎C-病毒(HCV)的氨基酸序列。
生物物质的其他优的实施例是生物素，核酸，抗体或抗体断片，多肽抗原，也就是说免疫反应的多肽，或半抗原，即分子量从150至2000的有机分子，特别是甾类主环系统的分子，如卡烯丙酯，卡烯内酯-苷(例如地谷新，地谷新配基)，甾族-生物碱，性激素例如黄体酮，糖皮质激素等。半抗原的其他例子是前列腺素，无色-烯-二炔，凝血恶烷，药理的有效物质等。
本发明的另外的一个主题是本发明的金属络合物或本发明的共轭体在免疫检定方法中的应用。
此外金属络合物还用作示踪基，藉其帮助，可在试液中进行定性的或/和定量的分析测定。金属络合物的确定主要是通过电化发光来实现的，同时产生的发光物电化地作用于电极的表面上。用现有技术的金属络合物进行发光测定的例子出现在欧洲专利EP-A-O,580 979,世界专利WO90/05301,WO90/11511和WO92/14138中。因此上述公开的发光测定方法和设备在此声明并入本发明。电化发光测定是在固相存在下进行的，它主要由微粒、特别是由磁性的微粒组成，这种微粒具有一反应层，例如具有抗生蛋白链菌素，以这种方式可证明含金属络合物作为示踪基的免疫络合物结合在固相上。
电化发光测量优选是在络合物的还原剂例如胺存在下进行的。优选的是脂族胺，特别是伯、仲和叔烷基胺，其烷基通常有1至3个碳原子。特别优选的是三丙基胺。但胺也可是芳族胺，如苯胺或杂环胺。这种还原剂可在络合物的配位体范围内已整合成为一个整体。这样的体系特别适合于测定以高浓度形式存在的分析物。
另外必要时，加强剂可为一种非离子的表面活化剂，例如乙氧基化的酚。这样的物质是例如以商业名为Triton X100或Triton N401可买到的。
另一方面，通过荧光也可证实发光金属络合物，在这当中，通过用适宜波长的光辐射激发金属螯合物并测量由此产生的荧光发射。进行荧光测定的一些例子出现在EP-A-O 178450和EP-A-O 255534中。
此外通过下述实施例和图5对本发明进行说明：
图1a为一种式(Ⅲa)金属络合物，
图1b为一种式(Ⅲb)金属络合物，
图1c为一种式(Ⅳ)金属络合物，
图2为一种式(Ⅳ)金属络合物，
图3a为一种式(Ⅳ)金属络合物，
图3b为一种式(Ⅳ)金属络合物，
图4为一种式(Ⅳ)金属络合物，
图5为一种式(Ⅳ)金属络合物，
图6为一种式(Ⅴ)金属络合物，
图7为制备式(Ⅴ)金属络合物的反应示意图，
图8为制备式(Ⅴ)金属络合物的另一反应示意图，
图9a和9b为制备式(Ⅳ)金属络合物的反应示意图和
图10为金属络合物-黄体酮-共轭物
实施例1
制备亲水的双吡啶-配位体(4,4’-双(甲氧基-乙氧基-乙氧基)-双吡啶)
使50ml二异丙基酰胺锂在由环己烷、乙苯和四氢呋喃组成的混合物中的溶液冷却至-78℃。滴入350ml在四氢呋喃中的50mmol双吡啶溶液。搅拌2小时，然后滴入在四氢呋喃中的100mmol甲氧基-乙氧基-乙氧基-甲苯磺酸酯的溶液。在-78℃经1小时后，使反应混合物在室温过夜。然后加入氯化钠水溶液。接着用一旋转蒸发器除掉四氢呋喃，并用乙酸酯提取残余物。
产物经硅胶色谱提纯。洗提剂：乙酸酯-甲醇-氨95/4/1，或用具有乙酸酯-石油醚的氨基-硅胶作为洗提剂。
H-NMR(CDCl3):3.6ppm(m.CH2CH2)=16H
             7.12-8.5ppm(bpy)=6H
实施例2
制备双(双乙二醇-双吡啶)-二氯钌络合物
将三氯化钌连同双倍摩尔过剩量的在实施例1中制备的配位体和7至8倍过剩量的氯化锂溶入二甲基甲酰胺(DMF)中，并在回流下煮沸6小时。除去溶剂，使残余物溶入水，并用乙酸酯提取，并接着用氯仿提取。合并氯仿相，干燥，过滤并在旋转蒸发器上浓缩。
产物用薄层色谱经氨基硅胶用乙腈/水10/1纯化(Rf=0.58)。
实施例3
合成双(双乙二醇-双吡啶)-4(4(4’-甲基-2,2’双吡啶基))-丁酸
3.0g在实施例2中制备的钌-络合物在氩气氛下溶入240ml乙醇-水的混合物中。向其中加入0.82g双吡啶基-丁酸-衍生物，并在回流下加热3小时。将溶液进行浓缩，用乙酸酯洗涤并用氨仿提取。旋转浓缩，并经SP-交联葡聚糖(凝胶)纯化残余物(洗提剂：NaC/HCl在水中)。
产率：500mg，纯度(HPLC):93％
质谱(ms)(PosLIMS):1455.5=Ru2+络合物PF6 -
实施例4
制备亲水的金属络合物-活化酯衍生物
将260mg在实施例3中制备的络合物溶入二氯甲烷中，并加入当量摩尔数量的二环己基碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺酯。搅拌12小时，滤出DCH并旋转浓缩。粗产物经制备的高压液体色谱(HPLC)纯化。产率为85％。
实施了例5
制施备亲水的金施属络合物-马来酰亚胺-衍生物
按照EP-A-O 580979，将150mg金属络合物钌(双吡啶)2(双吡啶-CO-N-羟基丁二酰亚胺酯)与100mg马来酰亚胺基-氨基-二噁辛烷(MADOO)和三乙胺一起在二氨甲烷中进行约12小时的转化。反应混合物用水摇荡，分离三次，并将得自有机相的残余物经交联葡聚糖(凝胶)-HL20-柱子用二氯甲烷/甲醇净化。得到图1a标明的化合物Ru(双吡啶)2(双吡啶-CO-MADOO)。质谱：M+=1025.3(相应于Ru2+PF6 -络合物)
实施例6
制备亲水的金属络合物-活化酯-衍生物
使0.5mmol在实施例5中作原料使用的钌络合物在20ml二氯甲烷中与0.5mmol单-BOC-二氨基二噁辛烷在20ml二氯甲烷中和当量的三乙胺进行转化，纯化如实施例5所述。BOC-保护基按标准方法(三氟乙酸/二氯甲烷)分离。
将生成的产物与当量摩尔数量的辛二酸-双-N-15羟基琥珀酰亚胺在二甲基甲酰胺中、在室温下转化2小时。去掉溶剂，将残余物吸收入水中，并冰结干燥。生成的产物在图1b中标明。H-NMR:7.2-8.9ppm：双吡啶(22H)；
  2.8ppm N-羟基琥珀酰亚胺酯(4H)
实施例7
合成金属络合物-庚烷-共轭物
10mg得自实施例4的N-羟基琥珀酰亚胺酯与3.2mg黄体酮-3-羧甲基-肟-金刚烷基二氧基辛烷(diamondioxyoctan)溶入2ml二氯甲烷中，再添加1.2μl三乙胺并在室温搅拌12小时。除去溶剂并使残余物经交联葡聚糖纯化。生成的共轭物示于图10中。
质谱(posLIMS):M+=1923.0(钌-络合物-黄体酮-共轭物2+三氟乙酸酯)
实施例8
制备金属螫合物-示踪的-肽
利用芴基甲氧基羰基-(Fmoc)-固相肽合成法，在批处理肽合成器中，例如Applied Biosystems(应用的生物体系)A431或A433，备金属螯合物-示踪的肽。为此使用了各4.0当量的表1中所示的氨基酸衍生物：表1
 A  Fmoc-Ala-OH
 C  Fmoc-Cys(Trt)-OH
 D  Fmoc-Asp(OtBu)-OH
 E  Fmoc-Glu(OtBu)-OH
 F  Fmoc-Phe-OH
 G  Fmoc-Gly-OH
 H  Fmoc-His(Trt)-OH
Ⅰ Fmoc-Ile-OH
 K1  Fmoc-Lys(Boc)-OH
 K2  Boc-Lys(Fmoc)-OH
 K3  Fmoc-Lys(BPRu)-OH
 L  Fmoc-Leu-OH
 M  Fmoc-Met-OH
 N  Fmoc-Asn(Trt)-OH
 P  Fmoc-Pro-OH
 Q  Fmoc-Gln(Trt)-OH
 R  Fmoc-Arg(Pmc)-OH
 S  Fmoc-Ser(tBu)-OH
 T  Fmoc-Thr(tBu)-OH
 U  Fmoc-β丙氨酸-OH
 V  Fmoc-Val-OH
 W  Fmoc-Trp-OH
 Y  Fmoc-Tyr(tBu)-OH
 Z  Fmoc-ε-氨基己酸-OH
 Nle  Fmoc-ε-正亮氨酸-OH
 Abu  Fmoc-γ-氨基丁酸-OH
在方案(a)中(在固相合成结束之后导入示踪标记)，将活化的亲水钌(双吡啶基)3-络合物(BPRu)连结到肽的N-终端氨基酸上。在间隔基区使用了赖氨酸-衍生物K1并在抗原决定基区使用了赖氨酸-衍生物K2。
按方案(b)，金属螯合基导入肽序列是通过直接引入连结金属螯合物的氨基酸衍生物进行的，例如在序列内经一个与金属螯合物活化酯ε-衍生化的赖氨酸基例如赖氨酸-衍生物K3，或通过使用α-衍生化的氨基酸基的N-终端来进行。
使氨基酸或氨基酸衍生物溶入N-甲基-吡咯烷酮中，在400-500mg 4-(2’,4’-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基-树脂(四面体学28(1987)2107)上，肽的分布为0.4-0.7mmol/g(JACS95(1973),1328)。关于Fmoc-氨基酸衍生物的连结反应，用4当量的二环己基碳化二亚胺和4当量的N-羟基苯并三唑在20分钟内进行，在二甲基甲酰胺中作反应介质。在每一合成步骤之后，用20％的哌啶在二甲基甲酰胺中裂解Fmoc-基20分钟。
肽序列中存在半胱氨酸时，在合成结束以后，用碘在六氟异丙醇/二氯甲烷中在固相上直接进行氧化。
从载体上释放肽和耐酸保护基的分解是在室温用20ml三氟乙酸、0.5ml乙二硫醇，1ml苯硫基甲烷，1.5g酚和1ml水在40分钟内进行。接着向反应液中掺入300ml冷却的二异丙基醚，并在0℃保持40分钟，使肽完全沉淀。滤出沉淀，用二异丙醚洗涤，用少量50％的乙酸溶解，并冷冻干燥。得到的原料利用预备的高压液体色谱(HPLC)在Delta-Pak RP C18-物质上(柱子50×30mm 100A,15μ)经一相应的梯度(洗脱剂A：水，0.1％三氟乙酸，洗脱剂B：乙腈，0.1％三氟乙酸)在约120分钟内进行纯化。洗脱物的本体利用离子喷射-质谱仪检验。
引入金属螯合物示踪标记是按方案(a)经相应的活化酯-衍生物在结合在载体上的肽的自由N-终端氨基上进行的。此外向每一自由伯式功能氨基滴加4当量的亲水钌(双吡啶基)3-络合物(BPRu)，活化用N-羟基苯并三唑/二环己基碳化二亚胺，并溶入少量的二甲亚砜中，并在室温搅拌。转换是经分析用高压液体色谱进行的。产物自载体分离后，利用备好的高压液体色谱纯化，洗脱物本体利用离子喷射-质谱仪检验。
肽的制备也可通过方案(a)和(b)的结合实现，也就是说，在序列内引入连结金属螯合物的氨基酸衍生物，裂解N-终端的Fmoc-基并使自由N-终端的氨基与金属螫合物酯衍生物反应。
在按方案(b)固相合成期间，在唯一的直接引入连结的金属螯合物的氨基酸衍生物时，事后导入金属螫合物-活化酯不再是必需的。
由HIVⅠ或HIVⅡ的区域gp120,gp41和gp32制备了表2中所示的肽-金属络合物-共轭物。表2：钌基化的线性肽
 gp120  BPRu-UZU-NNTRKSISIGPGRAFYTBPRu-UZ-NTTRSISIGPGRAFYBPRu-UZ-NTTRSISIGPGRAFYNNTRKSISIGPGRAFYT-K(BPRu)BPRu-UZU-IDIQEERRMRIGPGMAWYS
 gp41/1  BPRu-UZU-AVERYLKDQQLLGIWBPRu-UGGG-QARILAVERYLKDQQLLGIWGASGBPRu-GGGG-QARILAVERYLKDQQLLGIWGASGBPRu-UZU-WGIRQLRARLLALETLLQN
 gp41/2  BPRu-UZU-LGIWGCSGKLICTTAVBPRu-UGGG-GCSGKLICTTAVPWNASWS(GCSGKLICTTAVPWNASWS)K-(BPRu)
 gp41/3  BPRu-UZU-KDQQLLGIWGSSGKL
 gp41/4  BPRu-UZU-ALETLLQNQLLSLW
 gp32  BPRu-UZU-NSWGCAFRQVCHTTBPRu-GGG-QAQLNSWGCAFRQVCHTTVPWPNDSLT
由HCV的NS5-区，NS4-区和芯区合成了表3中所示的肽。表3：钉基化的线性肽
 Core1  BPRu-GGGG-KNKRNTNRR
 Core1+2  BPRu-UZU-KNKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGV
 NS4/1+2  BPRu-UZ-SQHLPYIEQG-NleNle-LAEQFKQQALGLLQT
 NS4/3m  BPRu-UZ-SRGNHVSPTHYVPESDAA
 NS5/1  BPRu-UZ-SRRFAQALPVWARPD
 Core1+2+3  BPRu-UZ-KNKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVLLPRR
 Core1m  BPRu-UZ-NPKPQKKNKRNTNRR
 Core3m  BPRu-UZ-GQIVGGVYLLPRRGPRLG
 Core2m  BPRu-UZ-PQDVKFPGGGQIVGGV
 NS4/3m-I  BPRu-UZU-SRGNHVSPTHYVPESDAA
 NS4/1  BPRu-UZU-SQHLPYIEQ
通过在树脂上N-终端衍生化，或在序列中经一个与生物素活化酯-ε-衍生化的赖氨酸基(Fmoc-赖氨酸(生物素)-OH)能制备生物素示踪的肽。
实施例9
制备二乙基-α,α,α’,α’-四(乙氧基羰基)-2,2’-双吡啶-4,4’-二基-二丙酸酯(图7中的相应化合物(1))。
向由6.85g(29.5mmo1)三乙基-甲烷-三羧酸酯和4.1g(29.7mmo1)碳酸钾在50ml甲苯/二甲基甲酰胺(3/2)中组成的混合物中，在50℃和好的搅拌情况下，滴加2.00g(5.8mmo1)4,4’-双(溴甲基)-2,2’-双吡啶在40ml甲苯/二甲基甲酰胺中(3/2)。在65℃继续搅拌4天，过滤并接着在真空中去掉溶剂。将油状残余物收入100ml甲苯中，并先后3次用水、3次用7％苛性钠溶液、并3次用水振荡分离。集中有机相，并经硫酸钠干燥，在真空中去掉挥发分后，将残余物用环己烷重结晶，为完全除去不纯物，进行柱色谱分离(SiO2,CHCl3/甲醇(10∶1)第一带)。无色晶体(环己烷)
产率：2.95g(79％)
熔点：116℃1H-NMR(250MHz,CDCl3,25℃):δ=1,21(t,18H,3J=7,2Hz),3,57(s,4H),4,22(q,12H,3J=7,2Hz),7,25(dd,2H,3J=5,1Hz,4J=1,2Hz),8,29(d,2H,4J=1,2Hz),8,51(dd,2H,3J=5,1Hz,4J=1,2Hz)13C-NMR(75MHz,CDCl3,25℃):δ=13,96(CH3),38,1(CH2),62,6(H2CO),66,5(CCO),123,4,123,6,145,9,149,0,155(吡啶基-C,CH),166,5(C=O).IR(KBr/固相)[cm-1]:556,610,863,1026,1186,1258,1305,1594,1737vs.2988MS-50:(180℃,70eV,300μA,m/e):gef.:644,2585C32H40N2O12(644,682)
实施例10
制备N,N’-双(2-羟基-1,1-双(羟甲基)-乙基)-α,α-双羟基-2,2’-双吡啶-4,4’-二基二丙酰胺(相应表7中的化合物(2))
向由752.7mg(1.17mmol)得自实施例7的六酯和848.6mg(7.00mmol)α,α,α-三-(羟甲基)-甲胺在10ml经CaH2干燥的二甲基亚砜训组成的溶液中、搅拌下加入967.5mg(7.00mmol)碳酸钾。在加碱之后混合物变为淡黄色。在25℃继续搅拌10小时后，离心分离悬浮液，并自固体碳酸钾倾析溶液。在真空(0.001毫巴)、30℃去除溶剂。使黄色油状的残余物悬浮入微量水中，并通过慢慢加入干燥的丙酮(经P4O10蒸馏过)使产物沉淀出来。在冷却中进行完全沉淀。倾析溶液并经P4O10干燥残余物数天。剩下一种吸湿性的无色固体，它可直接用于精制。
产率：0.652g(67％)1H-NMR(250MHz,DMSO-d6,25℃):δ=3,08(d,4H),3,22(s,8H),3,47(d,8H,2J=10,8Hz),3,55(d,8H,2J=11,1Hz),3,69(t,2H),4,6-5,1(bs,OH),7,27(d,2H,吡啶基-H,3J=4,8Hz),7,4-7,7(s,NH),8,23(s,2H,吡啶基.-H),8,51(d,2H,吡啶基-H,3J=4,8Hz)13C-NMR(75MHz,DMSO-d6,25℃):δ=30,7(CH2),59,7(CH2OH),61,7(CR4),63,34(CR4),78,5(CCO),122,8,126,0,146,0,148,7,155,0(吡啶基.-C,CH2),170,2(CONH)IR:(Kbr/固相)[cm-1]:3336,2936,2880,1675,1597,1559,1533,1465,1363,1051(vs)FAB·-MS(m-NBA,m/e):833,3,855,3,871,3,965,2(M+H),(M+Na)·,(M+K)·,(M+Cs)·C14H52N6O18    (832,3)
实施例11按反应示意图Ⅲ(图9a和9b)制备半笼式的或笼式的亲水配位体投料：2.6g(10mmol)双吡啶-甲基溴
  80ml2-甲氧基乙胺
  10g碳酸钾实验进行：
在搅拌下，将溴化物加到粉碎的碳酸钾在2-甲氧基乙胺中的悬浮液中。然后在室温搅拌悬浮液12小时。接着过滤，蒸去过剩的2-甲氧基乙胺，并在真空中干燥残余物。残余物进行色谱分离(SiO2；CH2Cl2/CH3OH/NH3,100∶10∶1)。得一浅黄色油。
产率：1.06g(3.85mmol)38％1H-NMR(250MHz,CDCl3):1,95(s,1H,NH)；2,26(s,3H,Pyri-dyl-CH3),2,7(t,3J=5,28 Hz,2H,OCH2)；3,24(s,3H,OCH3)；3,41(t,3J=5,28Hz,2H,NCH2)； 3,76(s,2H，吡啶基-CH2),7,5(dd,3J=8,35Hz,4J=2,17Hz,1H,吡啶基H)；7,69(dd,3J=8,19Hz,4J=2,24Hz,1H)，吡啶基：H)；8,17(d,3J=8,02Hz,1H,吡啶基-H)；8,22(d,3J=8,24Hz,1H，吡啶基-H)；8,39(d4J=1,84Hz,1H,吡啶基H)；8,85(d,4J=1,85Hz,1H，吡啶基 H)ppm.
Figure C9519420700281
投料：2.26(10mmol)三一醇
  6.67(35mmol)甲苯磺酰基氯化物实验进行：
在冷却、保护气体和搅拌情况下，将甲苯磺酰基氯化物在20ml吡啶中的溶液掺入三醇在20ml吡啶中的溶液中，使反应混合物的温度不超过10℃。然后在室温再搅拌24小时。接着小心地浇上由10ml水，20ml甲醇和8ml浓盐酸组成的混合物。沉淀出的产物或分离出的油进行过滤或分离并色谱纯化(SiO2；CH2Cl2/CH3OH/NH3,100∶10∶1)。得无色晶体。
熔点smp:57-59℃1H-NMR(250MHz,CD2Cl2):2,4(s,9H,Ar-CH3)；3,25(s,2H,CH2)；3,88(s,6H,CH2)；4,22(s,2H,CH2)；7,02-7,1(m,2H,Ar-H)；7,25-7,3(m,3H,Ar-H)；7,31(d,3J=6,46Hz,6H,Ar-H)；7,31(d,3J=6,46Hz,6H,Ar-H)；7,67(d,3J=6,46Hz,Ar-H)ppm13C-NMR u.DEPT-135(62,8MHz,CDCl3)；145,36；137,20,131,75；43,82(Cq)；130,05；128,39；128,33；127,92；127,75；127,23(CH)；73,28,66,71；66,31(CH2)；21,67(CH3)ppm
实施例13
亲水金属络合物在免疫检测中的应用
为证明抗肝炎C-病毒(HCV)特定的抗体，进行了双抗原桥接试验。在这种情况下，用钌示踪的抗原和生物素化的抗原对要测定的抗体在有抗生蛋白链菌素覆盖层的固相存在下卵化试样液。在试样液中，根据闪光体系(Flash-system)、可通过电化发光测定固相的示踪标记确定抗HCV-抗体的存在。
作为抗原，使用了含HCV氨基酸1207-1488的HCV-多肽。这种氨基酸序列和制备这样的多肽已在DE-A-4428705.4中叙述过。
为了用琥珀酰亚胺酯活化的钌金属络合物使HCV-多肽衍生化，将冷冻干燥的多肽溶入100mM磷酸钠缓冲液中，其pH6.5，蛋质浓度为10mg/ml，含0.1％SDS。通过添加5M，使pH值调至8.5，并用二硫苏糖醇使溶液的最终浓度为2mM。向这种溶液加入与所希望的化学计量量相应数量的、在二甲基亚砜中的琥珀酰亚胺酯活化的钌金属络合物，并接着在65℃搅拌下孵化60分钟。用通过赖氨酸增加反应混合物，使反应最终浓度为10mM，并经继续30分钟孵化而停止。接着使料经pH6.5,0.1％SDS的100mM磷酸钠缓冲液进行透析。将蔗糖(终浓度6.5％(W/V))掺入产生的蛋白质溶液，并分批冷冻干燥。
为制备一种用马来酰亚胺活化的钌络合物衍生化的HCV-多肽，将冷冻干燥的蛋白质收入pH6.5,0.1％SDS(蛋白质浓度10mg/ml)的100mM磷酸钠缓冲液中。向这种溶液加入与所希望的化学计量量相应数量的、在二甲基亚砜中的马来酰亚胺活化的钌络合物，并在25℃在搅拌下，孵化60分钟。用通过赖氨酸增加反应混合物，使反应终浓度为10mM，并经继续30分钟的孵化而停止。反应混合物接着进行如上所述的透析，加入蔗糖并分批冷冻干燥。
进行了三个实点，其中使用了各不相同的钌化的抗原。对实点A(对比)，使在实施例5和6中作为原料使用的钌-络合物按EP-A-O580979以化学计量的比例1∶3连结在多肽上。对实点B，多肽与在实施例5中制备的本发明亲水钌-络合物以化学计量的比例1∶3相连结。作为生物素化了的抗原，在所有3个实点中都用了多肽，此多肽以化学计量的比例1∶6已经连结在马来酰亚胺活化的生物素上。这种钌化的抗原和生物素化的抗原已各以浓度为400ng/ml的试验被使用。
表4中是A,B和C的实点结果，以电化发光-计数表示。可明显看出，只有使用本发明亲水金属络合物作示踪基，才能在阴性血清试样和关键的阳性血清试样间有准确的区别。这种区别以高比例(阳性/阴性)显示出来。表4
    实验     A(比较)     B     C
阴性试样     323317     84584     44274
阳性试样     465769     346734     313185
比例阳性/阴性     1,4     4     7

Claims (22)

1．通式(Ⅰ)的金属络合物：
[M(L1L2L3)]n-XmA    (Ⅰ)
式中
-M是选自稀土金属离子或过渡金属离子的2价-或3价金属阳离子，
-L1,L2和L3相同或不同，并为具有至少二个含氮杂环的配位体，其中L1,L2和L3经氮原子结合在金属阳离子上，
-X是反应性的或可活化的功能基，它共价结合在L1,L2,L3配位体的至少一个上，选自一种活化的羧酸基团、马来酰亚胺、羧酸、硫醇、卤根和可光活化的基团，
-n是从1至10的一个整数，
-m是从1至6的一个整数，和
-A为一个或多个为平衡电荷必需的负电荷基，
其特征在于，
络合物含有至少一个亲水基，亲水基选自亚乙基氧-单元和多羟基-单元。
2．按照权利要求1的络合物，其特征在于，金属阳离子M是钌-，铼-，锇-，铬-或铱离子。
3．按照权利要求1或2的络合物，其特征在于，金属阳离子是一个钌离子。
4．按照权利要求1至3之一的络合物，其特征在于，配位体L1,L2,L3含有双吡啶-环体系或/和菲咯啉-环体系。
5．按照权利要求1至4之一的络合物，其特征在于，反应性的或可活化的功能基X是羧酸酰卤，羧酸酐，活性酯，马来酰亚胺，胺，羧酸，硫醇，卤化物或可光活化的基团。
6．按照权利要求1至5之一的络合物，其特征在于，带负电荷的基团A是六氟磷酸根，三氟乙酸根，四氟硼酸根或卤根离子。
7．按照权利要求1至6之一的络合物，其特征在于，多羟基-单元选自式(Ⅱa)或(Ⅱb)的基团
     -NR-W      (Ⅱa)       -O-W       (Ⅱb)
式中W为具有至少2个羟基的有机基团，R为氢或C1-C5-烷基。
8．按照权利要求7的络合物，其特征在于，多羟基-单元为式-NR-C(CH2OH)3所示。
9．按照权利要求1至8之一的络合物，其特征在于，C2-C3-亚烷基氧-，C2-C3-亚烷基硫-或C2-C3-亚烷基氨基-单元是乙烯氧基-，乙烯硫基-或乙烯氨基-单元。
10．按照权利要求1至9之一的络合物，其特征在于，每一金属阳离子存在有1至30个C2-C3-亚烷基氧-单元，C2-C5-亚烷基硫-单元或C2-C3-亚烷基氨基-单元。
11．按照权利要求1至10之一的、具有通式(Ⅲ)的络合物；[
Figure C9519420700031
]-XA   (Ⅲ)式中M,X和A定义如权利要求1,R1,R2,R3,R4,R5和R6相同或不同，并各为一个或多个取代基，其前提条件是，X经R1,R2,R3,R4,R5或R6取代基之一与配位体之一相结合，并至少R1,R2,R3,R4,R5或R6取代基之一含有至少一个选自C2-C3-亚烷基氧-，C2-C3-亚烷基硫-和C2-C3-亚烷基氨基-单元的亲水基。
12．按照权利要求11的通式(Ⅲa)的络合物：
Figure C9519420700041
A(Ⅲa)
式中M,X和A定义如权利要求1,R1,R2,R3,R4和R5定义如权利要求11,S是0至6的一个整数，Y为选自C2-C3-亚烷基氧-，C2-C3-亚烷基硫-和C2-C3-亚烷基氨基-单元的、具有1至10个亲水单元的一个亲水基。
13．按照权利要求1的通式(Ⅲb)的络合物：
Figure C9519420700042
A(Ⅲb)
式中M,X和A定义如权利要求1,R1,R2,R3,R4和R5定义如权利要求11,S是0至6的一个整数，其前提条件是，R1,R2,R3,R4或/和R5含有一个亲水取代基，该取代基包括1至10个C2-C3-亚烷基氧-单元，C2-C3-亚烷基硫-单元或/和C2-C3-亚烷基氨基-单元。
14．按照权利要求1至10之一的通式(Ⅳ)的络合物：
Figure C9519420700051
A(Ⅳ)
式中M,X,n和A定义如权利要求1,
R1,R2和R3相同或不同，并各为一个或多个取代基，Y各为一亲水的连接物基团，它包含选自C2-C3-亚烷基氧-，C2-C3-亚烷基硫-和C2-C3-亚烷基氨基-单元的1至10个亲水单元。
15．按照权利要求1至10之一的通式(Ⅴ)的络合物：
Figure C9519420700052
A(Ⅳ)
式中M,X和A定义如权利要求1,Z为一连接物基，R1’,R2’,R3’,R4’和R5’相同或不同，并各为一个或多个取代基，其前提条件是，R1’,R2’,R3’或/和R4’含有至少一个亲水取代基，该取代基包括一个多羟基-单元。
16．按照权利要求15的络合物，其特征在于，多羟基-单元的OH-基是通过另外的亲水基取代的。
17．按照权利要求16的络合物，其特征在于，这些另外的亲水基包含一个树枝状物或一个式(Ⅵa)或(Ⅵb)树枝状物的构件：
-A1-NR-W1(A2-NR-W2)n’  (Ⅵa)
-A1-O-W1(A2-O-W2)n’(Ⅵb)
式中
-A1和A2相同或不同，并为连接体基，
-W1和W2相同或不同，并为一个具有至少2个羟基的有机基团，
-R为氢或C1-C5-烷基，并
-n’是0或与W1的羟基数相应的数。
18．含有生物物质的共轭物，在此生物物质上连结了至少一个通式(Ⅰ)的金属络合物：
〔M(L1L2L3)〕n-XmA   (Ⅰ)
式中
-M是选自稀土金属离子或过渡金属离子的二价-的或三价的金属阳离子，
-L1,L2和L3相同或不同，并为具有至少二个含氮杂环的配位体，其中L1,L2和L3是经氮原子连结在金属阳离子上，
-X是反应性的或可活化的功能基，它至少共轭连结在配位体L1,L2,L3的一个上，
-n是从1至10的一个整数，
-m是从1至6的一个整数并
-A为一个或多个为平衡电荷必需的负电荷基，
其特征在于，络合物含有至少一个亲水基，亲水基选自亚乙基氧-单元和多羟基-单元，且生物物质是生物素，抗体或抗体断片，核酸，多肽抗原，免疫反应性的肽或半抗原。
19．按照权利要求1至17之一的金属络合物或按照权利要求18的共轭物在免疫检定方法中的应用。
20．按照权利要求19的应用，用在电化发光方法中。
21．按照权利要求20的应用，其特征在于，在还原剂存在下，对金属络合物进行电化发光测量。
22．按照权利要求21的应用，其特征在于，还原剂是在金属络合物的配位体范围内整合成一整体。
CN95194207A 1994-07-25 1995-07-24 亲水的金属络合物 Expired - Fee Related CN1075817C (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DEP4426276.0 1994-07-25
DE4426276 1994-07-25
DE4430998A DE4430998A1 (de) 1994-07-25 1994-08-31 Metallchelat-markierte Peptide
DEP4430998.8 1994-08-31
DE4439346A DE4439346A1 (de) 1994-07-25 1994-11-04 Hydrophile Metallkomplexe
DEP4439346.6 1994-11-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1152923A CN1152923A (zh) 1997-06-25
CN1075817C true CN1075817C (zh) 2001-12-05

Family

ID=27206620

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN95194207A Expired - Fee Related CN1075817C (zh) 1994-07-25 1995-07-24 亲水的金属络合物

Country Status (8)

Country Link
US (1) US5981286A (zh)
EP (1) EP0772616B1 (zh)
JP (1) JP3583436B2 (zh)
CN (1) CN1075817C (zh)
AT (1) ATE187732T1 (zh)
DE (1) DE59507438D1 (zh)
ES (1) ES2143059T3 (zh)
WO (1) WO1996003410A1 (zh)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030078416A1 (en) * 1996-04-30 2003-04-24 Yitzhak Tor Substituted phenanthrolines
WO1998007364A1 (de) 1996-08-16 1998-02-26 Roche Diagnostics Gmbh Kontrollsystem für die überwachung der regelmässigen einnahme eines medikamentes
US20040072937A1 (en) * 2001-02-10 2004-04-15 Tomalia Donald A. Nanocomposites of dendritic polymers
DE19811582A1 (de) * 1998-03-17 1999-09-23 Roche Diagnostics Gmbh Stabilisierung und Verstärkung von Elektrochemilumineszenz-Signalen
ES2180241T3 (es) 1998-05-06 2003-02-01 Roche Diagnostics Gmbh Eliminacion de interferencias causadas por factores reumaticos.
DE19828441A1 (de) * 1998-06-25 1999-12-30 Roche Diagnostics Gmbh Verwendung derivatisierter Reagenzien in Chemilumineszenz- und Elektrochemilumineszenz-Nachweisverfahren
US6300143B1 (en) * 1999-03-01 2001-10-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Electrochemiluminescent assays for eukaryotic cells
JP4236342B2 (ja) * 1999-07-30 2009-03-11 東レ・ダウコーニング株式会社 カルボシロキサンデンドリマーおよびデンドリマー含有有機重合体
US20020121638A1 (en) * 2000-06-30 2002-09-05 Vladimir Grushin Electroluminescent iridium compounds with fluorinated phenylpyridines, phenylpyrimidines, and phenylquinolines and devices made with such compounds
US7075102B2 (en) 2000-06-30 2006-07-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Electroluminescent iridium compounds with fluorinated phenylpyridines, phenylpyrimidines, and phenylquinolines and devices made with such compounds
US7132681B2 (en) 2000-06-30 2006-11-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Electroluminescent iridium compounds with fluorinated phenylpyridines, phenylpyrimidines, and phenylquinolines and devices made with such compounds
US7476452B2 (en) 2000-06-30 2009-01-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Electroluminescent iridium compounds with fluorinated phenylpyridine ligands, and devices made with such compounds
US6670645B2 (en) 2000-06-30 2003-12-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Electroluminescent iridium compounds with fluorinated phenylpyridines, phenylpyrimidines, and phenylquinolines and devices made with such compounds
DE10048417A1 (de) * 2000-09-29 2002-04-11 Roche Diagnostics Gmbh Verbindungen mit verzweigtem Linker
US7897404B2 (en) * 2000-09-29 2011-03-01 Roche Diagnostics Operations, Inc. Conjugates of defined stoichiometry
US6808939B2 (en) 2001-06-29 2004-10-26 Igen International, Inc. ECL labels having improved non-specific binding properties, methods of using and kits containing the same
US7320833B2 (en) 2001-11-07 2008-01-22 E.I. Du Pont De Nemours And Company Electroluminescent platinum compounds and devices made with such compounds
US6989273B2 (en) * 2002-02-08 2006-01-24 Canon Kabushiki Kaisha Light emissive iridium (III) complexes
DE10239098A1 (de) * 2002-08-26 2004-03-11 Roche Diagnostics Gmbh Erzeugung von Chemilumineszenz durch Wasserstoff
US7816016B1 (en) 2003-02-13 2010-10-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Electroluminescent iridium compounds and devices made therefrom
ITTO20040372A1 (it) * 2004-06-01 2004-09-01 Giuseppe Caputo Composti luminescenti aventi un braccio di legame funzionalizzato.
CN100412080C (zh) * 2005-04-06 2008-08-20 友达光电股份有限公司 有机金属络合物及包括它的有机发光二极管和显示器
JP4435033B2 (ja) * 2005-06-16 2010-03-17 株式会社東芝 蛍光パターン形成物、記録媒体、セキュリティー媒体、及び記録方法
US8865398B2 (en) * 2006-09-01 2014-10-21 Abbott Laboratories Combination hepatitis C virus antigen and antibody detection method
US8637194B2 (en) 2008-09-02 2014-01-28 Bio-Nano Power, Llc Bio-nano power cells and their uses
ES2531960T3 (es) * 2011-02-11 2015-03-23 Fábrica Nacional De Moneda Y Timbre - Real Casa De La Moneda Pigmentos luminiscentes y su uso en aplicaciones de seguridad
US11726095B2 (en) 2013-08-13 2023-08-15 Anteo Technologies Pty Ltd Conjugating molecules to particles
CN103588801A (zh) * 2013-12-02 2014-02-19 天津大港油田圣达科技有限公司 一种微量元素井间示踪剂的使用方法
CN103615237B (zh) * 2013-12-02 2016-06-15 天津大港油田圣达科技有限公司 一种微量元素井间示踪剂及其应用
WO2016207124A1 (en) 2015-06-25 2016-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Cell based assay for determining antibody or ligand binding and function
WO2018114772A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Assay for determining antibody or ligand binding and function
CA3169298A1 (en) * 2020-02-27 2021-09-02 The Trustees Of Princeton University Intercellular and intracellular proximity-based labeling compositions and systems

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5075447A (en) * 1984-09-17 1991-12-24 Hoffmann-La Roche Inc. Ruthenium complexes useful as carriers for immunologically active materials
DK365785A (da) * 1984-09-17 1986-03-18 Hoffmann La Roche Metalcomplexer
US5238808A (en) * 1984-10-31 1993-08-24 Igen, Inc. Luminescent metal chelate labels and means for detection
DE3751516T2 (de) * 1986-04-30 1996-02-15 Igen Inc Elektrochemilumineszenz-testverfahren.
IL100867A (en) * 1991-02-06 1995-12-08 Igen Inc Method and device for improved luminescence testing

Also Published As

Publication number Publication date
EP0772616A1 (de) 1997-05-14
US5981286A (en) 1999-11-09
CN1152923A (zh) 1997-06-25
ES2143059T3 (es) 2000-05-01
WO1996003410A1 (de) 1996-02-08
DE59507438D1 (de) 2000-01-20
JPH10503485A (ja) 1998-03-31
JP3583436B2 (ja) 2004-11-04
ATE187732T1 (de) 2000-01-15
EP0772616B1 (de) 1999-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1075817C (zh) 亲水的金属络合物
JP2771900B2 (ja) 荷電されたリンカーを含む金属錯体
US20090264618A1 (en) Compounds With a Branched Linker
US20080187904A1 (en) Metal chelate-labelled pepetides
JPH10504539A (ja) 複数の抗原を使用した特異的免疫グロブリンの測定
EP0774120B1 (de) Metallchelat-markierte peptide
CN103270040B (zh) 催化剂及其制备和用途
JPH04505623A (ja) イムノアッセイにおいて利用するためのシステインチオール保護ペプチド
EP0774119B1 (de) Oligomere trägermoleküle mit definiert eingebauten markierungsgruppen und haptenen
FR2836382A1 (fr) Nouveaux agents de couplages, leurs conjugues, ainsi que l'utilisation de ces conjugues dans des methodes de diagnostic
US20240053332A1 (en) Methods and Compositions Utilising Vitamin B12 Binding
DE19654764A1 (de) Verfahren zur Herstellung eines Peptidgemisches

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20011205

Termination date: 20120724