CN103270040B - 催化剂及其制备和用途 - Google Patents
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Abstract
公开了基于肽‑卟啉的新分子，其具有低分子量(2000‑5000amu)，任选与生物分子共价结合，其能够催化使用清洁剂如H2O2的水溶液或水‑醇溶液进行的过氧化、氧化、羟化、苯酚硝化和惰性化合物环氧化反应，催化功能与天然酶类相当或更高。本发明的化合物可用作精细化学、控制和净化水的催化剂及实验室诊断剂，并可键合和/或吸附在固相基质或纳米颗粒上。
Description
发明领域
本发明涉及用基于肽的合成化合物官能化的含氮大环卟啉样物质，及其制备和作为催化剂在精细化学中的用途。其可用作例如催化剂的水溶液或水-醇溶液，用于水控制和净化以及实验室诊断剂中的过氧化、氧化、羟基化、酚硝化和惰性化合物环氧化反应。它们还可用于例如免疫组化试验、原位杂交、ELISA试验，以及DNA印迹、RNA印迹和蛋白质印迹试验。本发明的化合物可单独使用或与生物分子例如抗体、抗原、酶、受体、核酸、肽和蛋白质共价结合使用。本发明的化合物具有广泛的应用，因为其代表天然和突变的血红素蛋白类(haemoproteins)的低分子量(2000-5000amu)类似物，因此建议作为特别有利的表达或提取的替代产品。本发明的化合物也可在固相基质和/或顺磁和非顺磁纳米颗粒支持物上使用。
技术状况
文献中已知众多的氮大环化合物的各种组合物，其中氮大环中插入不同的金属离子。从应用的角度看最有前途的是中心(meso)-四芳基取代的卟啉类(“Metallo-porphyrins in catalytic oxidations”(1994)Sheldon R.A.编辑，Dekker,NY；D.Mansuy,C.R.Chimie,2007,10,pp392；Meunier,B.Chem.Rev.1992,92,pp.1411)。尽管如此，大部分已有的氮大环化合物鉴于诸多理由不具有工业实用性，其理由包括：1)水和生物液体中的溶解性低；2)催化过程中的低更新性和/或低选择性；3)需要使用强氧化剂活化。
随后开发了在β-吡咯环和中心位置取代的其它卟啉以改善催化性质(参见，例如Bruice T.C.等人，PNAS,1986,pp4646)。然而，这些化合物同样由于水中溶解度而严重受限，实际上能够用于水相/有机相界面。
用亲水基团在中心位置取代的卟啉(阴离子和阳离子类型)是水溶性 的，但仍然缺乏足够的催化效力以用于精细化学工业中(Lindsay Smith,J.R.等人，J.Chem.Soc.Chem.Comm1985,pp410；Bernadou,J.等人，Tetrahedron letters,1988,pp6615)。
最近描述了新的肽-卟啉缀合物。它们可基于与卟啉结合的肽的数目分成单和双加合物。例如，微过氧化物酶是从细胞色素c经蛋白水解得到的单加合卟啉。这些化合物的特征也在于在肽成分的半胱氨酸和原卟啉IX的乙烯基之间有两个硫醚键。根据蛋白消化中使用的酶，可获得不同的微过氧化物酶，其肽链特征在于氨基酸数目不同(Aron,J.；Baldwin,D.A.；Marques,H.M.；Pratt,J.M.；Adams,P.A.J.Inorg.Biochem.1986,27,227)。这些化合物通常称为微过氧化物酶MP8、MP9、MP10和MP11(Munro,O.Q.；Marques,H.M.Inorg.Chem.1996,35,3752；Adams,P.A.In:Peroxidases in Chemistry andBiology,1993,Vol.II,Everse,J.,Everse,K.E.&Grisham,M.B.,eds,pp.171-200.CRCPress,Boston,MA,USA；Marques,H.M.Dalton Trans.2007,4371)。
迄今为止的微过氧化物酶的肽序列最佳形式如下所示：
MP8：H-Cys-Ala-Gln-Cys-His-Thr-Val-Glu-OH(J.Aron，D.A.Baldwin，H．M．Marques，J．M．Pratt，P．A．Adams，J．Inorg．Biochem.1986，27，227；D．A．Baldwin，H．M．Marques，J．M．Pratt，J．Inorg．Biochem．1986，27，245；M．S．A．Hamza，J．M．Pratt，J．Chem．Soc．，Dalton Trans．1994，1367)；
MP9：H-Cys-Ala-G1n-Cys-His-Thr-Val-Glu-Lys-OH(Baldwin，D．A.；Mabuya，M．B.；Marques，H．M．S．Afr.J.Chem．1987，40，103)；MP11：H-Val-G1n-Lys-Cys-Ala-Gln-Cys-His-Thr-Val-Glu-OH(Carraway，A．D.；McCollum，M.G.；Peterson，J．Inorg．Chem．1996，35，6885)；MP’11：H-Lys-Thr-Arg-Cys-Glu-Leu-Cys-His-Thr-Val-Glu-OH(C.Dallacosta，E．Monzani，L．Casella，ChemBioChem．5，2004，1692)；Ac-MP8：Ac-Cys-Ala-Gln-Cys-His-Thr-Val-Glu-OH(Munro，O．Q.；Marques，H．M．Inorg．Chem．1996，35，3752；Munro，O．Q.；Marques，H．M．Inorg．Chem．1996，35，3768；Carraway，A．D.；McCollum，M．G.；Peterson，J．Inorg．Chem．1996，35，6885)；bis-Ac-MP11：Ac-Val-Gln-Lys(Ac)-Cys-Ala-Gln-Cys-His-Thr-Val-Glu-OH(Carraway，A.D.；McCollum，M.G.；Peterson，J．Inorg．Chem．1996，35，6885)；Fmoc-Pro-MP8：Fmoc-Pro-Cys-Ala-Gln-Cys-His-Thr-Val-Glu-OH(Casella，L.；De Gioia，L.；Frontoso Silvestri，G.；Monzani，E.；Redaelli，C.；Roncone，R.；Santagostini，L．J．Inorg．Biochem．2000，79，31)；Pro-MP8：H-Pro-Cys-Ala-Gln-Cys-His-Thr-Val-Glu-OH(Casella，L.；De Gioia，L.；Frontoso Silvestri，G.；Monzani，E.；Redaelli，C.；Roncone，R.；Santagostini，L．J．Inorg．Biochem．2000，79，31)；Pro2-MP8：H-Pro-Cys-Ala-Gln-Cys-His-Thr-Val-Glu-OH(Casella，L．；De Gioia，L.；Frontoso Silvestri，G.；Monzani，E.；Redaelli，C.；Rollcone，R.；Santagostini，L．J．Inorg．Biochem．2000，79，31)；MP9-22-(FmocAlaPro)：H-Cys-Ala-Gln-Cys-His-Thr-Val-Glu-Lys(Fmoc-Ala-Pro)-OH(Casella，L.；De Gioia，L.；Frontoso Silvestri，G.；Monzani，E.；Redaelli，C.；Rollcone，R.；Santagostini，L．J．Inorg．Biochem．2000，79，31)．
微过氧化物酶结构上与所要求保护的肽截然不同，其虽然具有五配位铁(涉及其序列中的单组氨酸残基)，但与辣根过氧化物酶(HRP)相比催化活性非常温和。下表举例列出了使用H2O2氧化ABTS过程中使用MP8、MP11和HRP酶的一些动力学参数：
此外，在使用H2O2氧化催化有机底物的过程中观察到催化剂快速的降解。使用微过氧化物酶的另一限制性的因素是其低水溶性。N-乙酰化的微过氧化物酶在水中更易溶解，并且在使用H2O2作为氧化剂的有机底物氧化中具有更好的催化活性，但仍然易于降解，催化活性较低。因此微过氧化物酶未用于工业。
其他肽-卟啉单加合缀合物的实例由Casella L.等人报道(J.Chem.Soc.DaltonTrans.1993,2233)，并且最近由Nicolis S.等人再次综述(Comptes Rendus Chimie10,2007,380-391)。这些分子与要求保护的分子在结构上有很大差异，具有与微过氧化物酶类似的许多缺陷，例如低催化活性，因此未发现其工业应用。
Benson报道了新的肽-卟啉二加合缀合物(Benson,D.R.；Hart,B.R.；Zhu,X.；Doughty,M.B.J.Am.Chem.Soc.1995,117,8502；Arnold,P.A.；Benson,D.R.；Brink,D.J.；Hendrich,M.P.；Jas,G.S.；Kennedy,M.L.；Petasis,D.T.；Wang,M.Inorg.Chem.1997,36,5306；Wang,M.；Kennedy,M.L.；Hart,B.R.；Benson,D.R.Chem.Commun.1997,883；Williamson,D.A.；Benson,D.R.Chem.Commun.1998,961；Liu,D.；Williamson,D.A.；Kennedy,M.L.；Williams,T.D.；Morton,M.M.；Benson,D.R.J.Am.Chem.Soc.1999,121,11798；Liu,D.；Lee,K.-H.；Benson,D.R.Chem.Commun. 1999，1205；Kennedy，M．L；Silchenko，S．；Houndonougbo，N．；Gibney，B．R．；Dutton，P．L．；Rodgers，K．R．；Benson，D．R．J．Am．Chem．Soc．2001，123，4635)。这些化合物特征在于有两个同样的肽与中心血红素(mesohaem)的丙酰基键合，称为PSM(肽夹心的中心血红素)：
PSM1，Ac-AKEAAHAEAAEAA-NH2；PSM2，Ac-AAEAAEAHAAEKA-NH2；PSM3，Ac-AKEAHAAEAAEAA-NH2；PSM4，Ac-AAEAAEAAHAEKA-NH2；
PSM5，Ac-AAHAEAAEAKEAA-NH2；PSM6，Ac-AAEAAEAHAAEKA-NH2；PSM7，Ac-AAEFAEAHAAEKA-NH2；PSM8，Ac-AAEWAEAHAAEKA-NH2．
这些分子上的相同的含组氨酸的肽的出现引起了铁的六配位。因此这些分子在涉及H2O2的有机底物氧化反应中表现出非常低的催化活性，因为其缺乏底物键合的远端部位。这一系列中尚没有化合物用于工业用途。
其他双加合化合物是被称为Mimochrome的那些，见Nastri F．等人，Chem．Eur．J．1997，3，pp340；D’Auria G．等人，Chem．Eur．J．1997，3，pp350；Nastri F．等人，J．Biol．Inorg Chem．1998，3，pp671；Nastri F．等人，Biopolymers(Peptide Ｓcience)1998，pp5；Lombardi A．等人，Chem Rev．2001，pp316；Lombardi A．等人，Inorg．Chim．Acta 1998，275-276，pp301；Lombardi A．等人，Chem．Eur．J．2003，9，pp5643；Di Costanzo L．等人，J．Biol．Inorg．Chem．2004，9，pp1017；和Lombardi A等人综述，Chem．Rev．2001，101，3165-3189．
Mimochrome I、II和IV(Nastri F．等人，Chem．Eur．J．1997，3，pp340；D’Auria G．等人，Chem．Eur．J．1997，3，pp350；Lombardi A．等人，Inorg．Chim．Acta 1998，275-276，pp301；Lombardi A．等人，Chem．Eur．J．2003，9，pp5643；Di Costanzo L.等人，J．Biol．Inorg．Chem．2004，9，ppl017)的特征同样是双组氨酸的铁配位，因此与Benson描述的PSM具有同样的缺陷，而Mimochrome III、V和VI(Lombardi A．等人，Chem．Rev．2001，101，3165-3189)提供五配位。然而，由于两个长度相同的肽链的特定氨基酸组 成，这些近来的类似物的催化活性并不比天然的过氧化物酶更高或相当。下表举例列出了使用H2O2氧化ABTS过程中使用Mimochrome和HRP酶的一些动力学参数：
因此，Mimochrome也未发现工业应用。
其他更精细的系统包括血红素抗体酶(haemoabzymes)(Ricoux R.,Raffy Q.,Mahy J.P.C.R.Chimie2007,10,684-702)，其缺点是分子量很高，并且本身容易变性和降解。下表举例列出了使用H2O2氧化ABTS过程中使用血红素抗体酶和HRP酶的一些动力学参数：
其他肽-卟啉复合物系统也有报道：Sasaki T.和Kaiser E.T.,JACS1989,pp380；Akerfeldt K.S.等人，JACS,1992,pp9656；Arnold,P.A.等人，JACS1997,pp3181；SakamotoS.等人，Chem Commun.1997,pp1221； Kennedy,M.L.等人，JACS2001,123,pp4635，和最近由Reedy,C.J.和Gibney,B.R.综述(Chem.Rev.2004,104,pp.617)。所有这些化合物具有血红素中心六配位，因此不具有任何工业有用的催化活性。特别地，Helichrome系统(Sasaki T.和Kaiser E.T.,JACS1989,pp380)、Tetraphyllin系统(Akerfeldt K.S.等人，JACS,1992,pp9656)和肽-中心血红素缀合物(Arnold,P.A.等人，JACS1997,pp3181；Sakamoto S.等人，Chem Commun.1997,pp1221)是合成的肽-卟啉缀合物的实例，其中卟啉环被共价掺入肽序列，以诱导螺旋结构。Choma C.T.等人(JACS1994,pp856)和Robertson D.E.等人(Nature1994,pp425)开发的系统是六配位合成血红素蛋白的首个实例，其由采用“四螺旋束”结构基序的肽序列组成，能够在其内部或以非共价的形式结合一个或多个血红素基团。
但上述化合物仍然没有表现出相当于或超过天然过氧化物酶的性能。
迄今为止的结构方案不足以同时满足下列要求：1)高催化性能；2)高催化更新能力；3)在水中或水-醇溶液中具有足够的溶解性；4)在催化循环中抗降解；5)低分子量和高比活性。与在pH4.6的最大活性相比，辣根过氧化物酶在中性pH下催化活性下降。
此外，满足在需要H2O2活化的反应中具有高催化活性要求的天然或突变的酶类，例如过氧化物酶、细胞色素P450、氧化酶和单氧合酶等是特别昂贵的，并且容易变性，因此存储期有限，但主要的一点是其分子量太大(30,000-200,000Da)，这可限制它们的工业使用。例如，用HRP官能化的顺磁性纳米颗粒是已知的(Xiaoyan Y.等.,Anal.Biochem.2009,393,pp56)。然而，涂覆的程度非常低，仅包括锚定在纳米颗粒上的有限数目的催化位点，因此催化放大的程度较低。
许多标准的实验室诊断方法，例如免疫组化试验、原位杂交、ELISA和印迹，均使用了检测所需产品的方法，其包括将含有要检测的分析物的试验样本和能与该分析物特异性相互作用的识别分子一起孵育。识别现象随后通过信号的产生进行量化，例如发光、比色、荧光、电化学或放射性信号。很多情况下，当分析物以低浓度存在时，信号需要通过在试验中加 入一种或多种放大层而被放大。例如，如果识别元件是一抗，则加入用催化色原体转化的酶官能化的二抗。对于每个识别元件，大量的色原体由此在特定的时间内产生。
使用不超过3个辣根过氧化物酶分子官能化的抗体通常用于ELISA试验中。过氧化物酶的分子大小(约45000Da)决定了较低的取代程度，因此，尽管需要，但无法获得更高程度取代的抗体。由于颜色的产生不仅依赖ELISA试验板中结合的抗体数，还与扩增分子识别的酶分子数量有关，因此这一方面是尤其相关的。而且，小分子，例如肽、抗原、寡核苷酸、PNA、受体激动剂或拮抗剂和酶抑制剂当与大分子例如天然或突变的酶类结合时，就失去了识别靶分子的能力。
因此，迄今为止计划用于免疫组化试验、原位杂交、ELISA试验，以及DNA印迹、RNA印迹和蛋白质印迹试验的天然或突变酶类不足以同时满足下列需求：1)高灵敏度；2)高稳定性；3)通用性和使用简便性。
发明描述
本发明涉及新一类低分子量的肽-卟啉缀合物(2000-5000Da)，其中特定的氨基酸组成保证了高催化效力的拟生态性质，其之前未被报道过。本发明的化合物可单独使用或与所需的大分子共价结合使用，所述大分子例如单或多克隆抗体、抗体片段、抗原、受体、受体激动剂和拮抗剂、生物素、酶类、酶抑制剂、核酸、PNA、肽类和蛋白质。本发明的化合物也可在固体基质和/或顺磁性和非顺磁性纳米颗粒支持物上使用。
本发明的化合物具有下列通式(I)：
其中：
大环的氮原子以任何可能的氧化态与金属离子Me络合，所述金属离子选自Fe、Mn和Ru；
R1是通式(II)的基团:
其中:
n=1或2或3；
A是Suc或Ace或Ace-Asp或Ace-Asn或Ace-Pro或Ace-Lys-Pro、或Ace-Orn-Pro；
X1选自氨基酸Glu、Aada、Arg、hArg、Leu、Lys和Orn；
Y2选自氨基酸Gln、Glu、Lys、Orn；
Y3选自氨基酸Gln、Glu、Lys、Orn；
Y4是Leu；
X5选自氨基酸His、hCys、Met、4Taz和5Taz；
X6选自氨基酸Ser、Thr、Asn、Gln、aThr、Glu、Lys、Orn；
Y7选自氨基酸Gln、Glu、Lys、Orn；
X8是在侧链上具有适于形成酰胺键的官能团的氨基酸，其选自Glu、Aada、Orn、Lys、Dap和Dab；
X9选自氨基酸Glu、Aada、Arg、hArg、Leu、Lys、Orn；
Y10选自氨基酸Gln、Glu、Lys、Orn；
B是NH2或Ile-NH2或Ile-Thr-NH2或Ile-Thr-Leu-NH2或Ile-Thr-Leu-Lys-NH2或Ile-Thr-Leu-Orn-NH2；
如果X8的侧链官能团是胺，那么L是CO；或者如果X8的侧链官能团是羧基，那么L是NH；
R2和R7相同或不同，为H或CH3；取代基R3、R4、R5、R6或R8其中之一具有式Q-(CH2)s-，其中:s=1或2或3，并且Q是NH2CO或 CH3CONH或HOOC或CH3OOC，或取代基R3、R4、R5、R6或R8中有一个是通式(III)的基团：
其中:
m=1或2或3；
C是Suc或Ace或Ace-Asp或Ace-Asn或Ace-Pro或Ace-Lys-Pro或Ace-Orn-Pro；
Z1选自氨基酸Glu、Aada、Arg、hArg、Leu、Lys和Orn；
W2选自氨基酸Gln、Glu、Lys、Orn；
W3选自氨基酸Gln、Glu、Lys、Orn；
W4是Leu；
Z5选自氨基酸Ser、Gly、Ala和Aib；
Z6选自氨基酸Gln、Glu、Lys、Orn、Ser、Thr、Asn、aThr；
W7选自氨基酸Gln、Glu、Lys、Orn；
Z8是在侧链上具有适于形成酰胺键的官能团的氨基酸，其选自Glu、Aada、Orn、Lys、Dap和Dab；
Z9选自氨基酸Glu、Aada、Orn、Lys、Arg、hArg和Leu；
D是NH2或Lys-NH2或Orn-NH2；
如果Z8的侧链官能团是胺，那么P是CO；或者如果Z8的侧链官能团是羧基，那么P是NH；
其余不由式(III)表示的取代基R3、R4、R5、R6和R8相同或不同地选自H、甲基、乙基或乙烯基。
下表显示了根据通式(II)和(III)的一些化合物的序列组合，其中每一行中各单元格表示序列中给定位置的可能变化：
通式(II)
通式(III)
根据本发明优选的化合物是通式(I)的那些，其中：
大环的氮原子以任何可能的氧化态与金属离子Me络合，所述金属离子选自Fe、Mn和Ru；
R1具有通式(II)，其中：
n=2或3；
A是Suc或Ace或Ace-Asp或Ace-Asn或Ace-Pro；
X1选自氨基酸Glu、Aada、Arg、hArg、Leu；
Y2是Gln或Glu；
Y3是Gln或Glu；
Y4是Leu；
X5选自氨基酸His、hCys、Met、4Taz和5Taz；
X6选自氨基酸Ser、Thr、Asn、Gln、aThr、Glu；
Y7是Gln或Glu；
X8是在侧链上具有适于形成酰胺键的官能团的氨基酸，其选自Glu、Aada、Orn、Lys、Dap和Dab；
X9选自氨基酸Glu、Aada、Arg、hArg、Leu；
Y10是Lys或Orn；
B是NH2或Ile-NH2或Ile-Thr-NH2或Ile-Thr-Leu-NH2；
如果X8的侧链官能团是胺，那么L是CO；或者如果X8的侧链官能团是羧基，那么L是NH；
R2和R7，其相同或不同，为H或CH3；
取代基R3、R4、R5、R6或R8之一具有式Q-(CH2)s-，其中s=2或3，Q是NH2CO或CH3CONH或HOOC或CH3OOC，或取代基R3、R4、R5、R6或R8之一具有式(III)，其中:
m=2或3；
C是Suc、Ace、Ace-Asp、Ace-Asn或Ace-Pro；
Z1选自氨基酸Glu、Aada、Arg、hArg和Leu；
W2是Gln或Glu；
W3是Gln或Glu；
W4是Leu；
Z5选自氨基酸Ser、Gly、Ala和Aib；
Z6选自氨基酸Gln、Glu、Ser、Thr、Asn、aThr；
W7是Gln或Glu；
Z8是在侧链上具有适于形成酰胺键的官能团的氨基酸，其选自Glu、Aada、Orn、Lys、Dap和Dab；
Z9选自氨基酸Glu、Aada、Orn、hArg和Leu；
D是NH2；
如果Z8的侧链官能团是胺，那么P是CO；或者如果Z8的侧链官能团是羧基，那么P是NH；
其余不由式(III)表示的取代基R3、R4、R5、R6和R8相同或不同地选自H、甲基、乙基或乙烯基。
下表显示了根据通式(II)和(III)的一些化合物的序列组合，其中每一行中各单元格表示序列中给定位置的可能变化:
通式(II)
通式(III)
更优选的本发明的化合物是通式(I)的那些，其中：
大环的氮原子以任何可能的氧化态与金属离子Me络合，所述金属离子选自Fe、Mn和Ru；
R1具有通式(II)，其中:
n=2；
A是Ace-Asp或Ace-Asn或Ace-Pro；
X1选自Glu、Aada、Arg、hArg、Leu；
Y2是Gln或Glu；
Y3是Gln或Glu；
Y4是Leu；
X5选自氨基酸His、4Taz和5Taz；
X6选自氨基酸Ser、Thr、Asn、aThr；
Y7是Gln或Glu；
X8选自氨基酸Orn、Lys、Dap和Dab；
X9选自氨基酸Glu、Aada、Arg、hArg、Leu；
Y10是Lys或Orn；
B是Ile-Thr-Leu-NH2；
L是CO；
R2和R7是CH3；
R8具有式Q-(CH2)s-其中：s=2，并且Q是NH2CO或CH3CONH或HOOC或CH3OOC，或R8具有通式(III)，其中:
m=2；
C是Ace-Asp或Ace-Asn或Ace-Pro；
Z1选自氨基酸Glu、Aada、Arg和hArg；
W2是Gln或Glu；
W3是Gln或Glu；
W4是Leu；
Z5选自氨基酸Ser、Gly、Ala和Aib；
Z6选自氨基酸Gln、Glu、Ser；
W7是Gln或Glu；
Z8选自氨基酸Orn、Lys、Dap和Dab；
Z9选自氨基酸Glu、Aada、Arg和hArg；
D是NH2；
P是CO；
R3、R4、R5、R6、其相同或不同，是H或甲基。
下表显示了根据通式(II)和(III)的一些更优选的化合物的序列组合，其中每一行中各单元格表示序列中给定位置的可能变化:
通式(II)
通式(III)
进一步更优选的本发明化合物是通式(I)的那些，其中：
大环的氮原子以任何可能的氧化态与金属离子Me络合，所述金属离子选自Fe、Mn和Ru；
R1具有通式(II)，其中:
n=2；
A是Ace-Asp；
X1是Glu或Arg或Leu；
Y2是Gln或Glu；
Y3是Gln或Glu；
Y4是Leu；
X5是His；
X6选自氨基酸Ser、Thr、Asn、aThr；
Y7是Gln或Glu；
X8是Lys；
X9是Glu或Arg或Leu；
Y10是Lys或Orn；
B是Ile-Thr-Leu-NH2；
L是CO；
R2和R7是CH3；
R8具有式Q-(CH2)s-，其中：s=2并且Q是NH2CO或CH3CONH或HOOC或CH3OOC，或R8具有通式(III)，其中:
m=2；
C是Ace-Asp；
Z1是Glu或Arg；
W2是Gln或Glu；
W3是Gln或Glu；
W4是Leu；
Z5选自氨基酸Ser、Gly、Ala和Aib；
Z6选自氨基酸Gln、Glu、Ser；
W7是Gln或Glu或Aib；
Z8是Lys；
Z9是Glu或Arg；
D是NH2；
P是CO；
R3、R4、R5、R6相同或不同，是H或甲基。
下表显示了根据通式(II)和(III)的一些进一步更优选的化合物的序列组合，其中每一行中各单元格表示序列中给定位置的可能变化:
通式(II)
通式(III)
通式(I)的化合物也可与适当的平衡离子组合使用，条件是其适用于特定的用途。
下文所描述的低分子量化合物(例如本发明的化合物)的全新的独特的性质来源于所选的结构解决方案。首次报道并要求保护具有下述结构特征的肽-卟啉双加合物：a)两条肽长度不同；一条肽链含有10-16个氨基酸残基，另一条含有9-12个氨基酸残基；b)两条肽长度相同，即10或11或12个氨基酸残基，之前未报道过与卟啉共价结合。还首次报道并要求保护具有下述结构特征的肽-卟啉单加合物：a)肽链含有10-16个氨基酸残基；b)肽序列之前未报道过与卟啉共价结合。
所有这些结构解决方案令人惊讶地使要求保护的化合物具有了良好的水溶性(>mM)，即使当很多组成部分为非亲水时也是如此。该特征非常重要，因为其使得所述分子可用于水溶液和水-醇溶液，从而消除了之前报道的众多其他修饰的卟啉的应用问题。
此外，与先前报道的那些方法不同，当所述分子用作催化剂以活化惰性分子例如H2O2、O2或NO时，其高更新数和催化活性与天然或突变的血红素蛋白相当或更高。该特征对于低成本工业应用是尤其必要的。本发明所述化合物具有很高的比活性，更具体的见实施例13所述。其每克催化剂每分钟能够转化数千克的底物。
下表列出了使用H2O2作为氧化剂氧化ABTS过程中本发明某些化合物的比活性。
此外，本发明化合物的化学性质使其与生物分子的共价官能化变得特别简单、经济和具有通用性。首先，小的分子尺寸使得生物大分子，例如单或多克隆抗体、抗体片段、抗原、受体、受体激动剂和拮抗剂、生物素、酶类、酶抑制剂、核酸、PNA、肽类和蛋白质能被所述分子高度取代，从而在增加催化剂数量的同时不改变其性质。因此可使用化学、电化学或光谱探针靶向至目标分子，具有以极高的效率放大识别现象的特征。
另外，如果所述的分子在固相基质或纳米颗粒支持物上使用，使用文献中描述的方法可获得高度包被的支持物。所述包被可高达使用天然或突变酶系统的10倍。
因此，所述化合物可用于1)使用清洁的氧化剂(H2O2、O2)的脂肪族或芳族烃羟基化反应的催化剂；2)使用清洁的氧化剂(H2O2、O2)的脂肪族或芳族烯烃环氧化反应的催化剂；3)使用清洁的氧化剂(H2O2、O2)的脂肪族或芳族烃氧化反应的催化剂；4)使用清洁的氧化剂(H2O2、O2)的脂肪族或芳族烃过氧化反应的催化剂；5)苯酚硝化催化剂；6)污染物降解；7)木质素降解；8)测定水中污染物的探针；9)测定食物中防腐剂的探针；10)测定机体中药物和毒性产物浓度的探针；11)测定药物代谢途径的体外诊断剂；12)测定生物流体中药物和毒性产物浓度；13)免疫诊断学；14)免疫 组织化学试验；15)原位杂交；16)ELISA试验；17)DNA印迹、RNA印迹试验和蛋白质印迹试验；18)细胞荧光测定术；19)电化学设备。
此外，本发明的化合物易于合成和纯化，并且由于其分子量较低，可以比通过表达或提取获得的血红素蛋白更低的成本大规模获得。建议的合成过程主要基于已有的固相肽合成方法，优选使用具有Fmoc化学特征的保护基团。许多合成所述产品需要的氮大环化合物是市售的，或可以用文献所述方法之一合成(Wijesekera T.P.&Dolphin D.，“Metalloporphyrins in catalytic oxidations”1994,主编Sheldon R.A.,DekkerN.Y.)。
本发明涉及的式(I)的化合物可通过已知的各种文献技术合成，这些技术包括固相肽合成、溶液肽合成、有机化学合成方法或其任意组合。所选的合成方案显然依赖于具体分子的组成。优选使用基于固相技术和经典溶液技术的适当组合的合成方法，其能够尤其在工业规模上达到低的生产成本。具体而言，这些方法包括：
i)在溶液中合成肽链片段，其通过将适当活化的N-保护的氨基酸与氨基酸或C-保护的肽链进行连续偶联，分离中间体，随后选择性地使所述片段的N和C末端脱保护，它们的偶联直到获得所需的肽片段。这些阶段之后是选择性脱保护要与氮大环化合物键合的基团，随后进行大环缩合。在必要的情况下，该阶段可进行侧链的完全脱保护。
ii)在不溶性聚合物载体上从C末端到N末端进行肽链的固相合成，选择性地使残基X8的侧链脱保护，必要时从树脂上分离其他侧链上受保护的肽。随后使用已知的形成酰胺键的文献方法，将所述肽与金属络合或非络合形式的氮大环化合物的官能团进行缩合。随后在适当清除剂的存在下用TFA完全脱保护。任选地，金属插入的大环化合物含有氮，如果不是已经存在的话。
下列非限制性的实施例进一步说明了本发明的化合物。
实施例1.3,7,12,17-四甲基卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-Ser6-Ser7-Gln8-Lys 9-Arg10-NH2)-二-丙酰胺的合成；通式(I)的化合物，其中:
大环的氮原子与Fe3+离子配位；R2和R7是CH3；R4和R6是H；R3和R5是CH3；R1是通式(II),其中:n=2；A是Ace-Asp,X1是Glu；Y2是Gln；Y3是Gln；Y4是Leu；X5是His；X6是Ser；Y7是Gln；X8是Lys(N,ε-丙酰胺)；X9是Arg；Y10是Lys；B是Ile-Thr-Leu-NH2；L是CO；A是Ace-Asp；R8是通式(III),其中:m=2；C是Ace-Asp；Z1是Glu；W2是Gln；W3是Gln；W4是Leu；Z5是Ser；Z6是Ser；W7是Gln；Z8是Lys(N,ε-丙酰胺)；Z9是Arg；D是NH2；P是CO。
合成3,7,12,17-四甲基卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-Ser6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-NH2)-二-丙酰胺的不同步骤在下文报道。
十肽(Ace-Asp1(OtBu)-Glu2(OtBu)-Gln3(Trt)-Gln4(Trt)-Leu5-Ser6(tBu)-Ser7(tBu)-Gln8(Trt)-Lys9-Arg10(Pbf)-NH2)(1)的合成
肽(1)使用固相肽合成手册中的Fmoc方法在Sieber Amide树脂上合成，Sieber树脂是9-Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基-Merrifield树脂(100-200目,1%2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃,取代水平0.52mmol g-1)，并且其是合成被保护的肽酰胺类的良好载体。
插入的氨基酸为Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH。9位的Lys残基以Fmoc-Lys(Mmt)-OH的形式插入。甲氧基三苯甲基保护基团(Mmt)是可在弱酸性条件下从赖氨酸侧链除去的保护基团(1%TFA的DCM溶液或AcOH/TFE/DCM1:2:7(v/v))；该特性允许在其他侧链保护基团的存在下选择性除去Mmt基团，而后者需要高达95%的TFA以除去。该基团的选择性去除使得可以通过Lys9的侧链游离ε-氨基将完全保护的肽和卟啉大环偶联。
合成以0.25mmol的量进行。使用20%哌啶/DMF(v/v)溶液完成N-αFmoc的脱保护。每次循环使用2次单独的处理(3分钟和7分钟)。
各氨基酸使用两步偶联(偶联时间45分钟)。第一次偶联使用在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的3当量的Fmoc-氨基酸、3当量的PyBop/HOBt和6当量的DIEA，第二次偶联使用DMF中的2当量的Fmoc氨基酸、2当量的HATU和4当量的DIEA。每次偶联后通过Kaiser试验检查反应是否完全。
合成结束后，N末端用4.7%的醋酸酐和4%的吡啶的DMF溶液进行乙酰化15分钟。
通过用烧结玻璃漏斗加入AcOH/TFE/DCM1:2:7(v/v)处理肽酰-树脂选择性的去除赖氨酸9上的Mmt基团。振荡树脂10分钟，真空下除去溶剂。该步骤重复15次。最后，所述树脂用异丙醇和DCM洗涤。Mmt基团解离后，通过加入1%TFA/DCM(体积百分数)溶液将完全保护的肽酰胺从树脂上解离下来。所述树脂振荡2分钟，将过滤的溶液收集到含有5%吡啶/甲醇(体积百分数)的冰冷的烧瓶中，该处理步骤重复多次。最后，所述树脂用DCM洗涤。通过硅胶薄层色谱以氯仿/甲醇/乙酸80:18:2(v/v/v)检查滤液。合并含有所需产物的组分，减压蒸发至最多5%的体积。
向残余物中加入冰冷的水，将混合物在冰上冷却以帮助保护的肽沉淀。过滤产物，用新鲜水洗涤数次，真空干燥获得粗制的C末端十肽酰胺(1)。
在C18柱上通过分析型RP-HPLC确定产物的均一性，使用乙腈在0.1%TFA中的水溶液梯度洗脱(30分钟，50%-95%，流速为1mLmin-1)。色谱显示在23.8分钟保留时间处有一主峰。肽同一性使用ESI-MS谱检查并证实了预期的分子量(2463a.m.u.)
所述肽的产率为85%。
十四肽Ace-Asp1(OtBu)-Glu2(OtBu)-Gln3(Trt)-Gln4(Trt)-Leu5-His6(Trt)-Ser7(tBu)-Gln8(Trt)-Lys9-Arg10(Pbf)-Lys11(Boc)-Ile12-Thr13(tBu)-Leu14-NH2)(2)的合成
十四肽(2)的合成与十肽(1)类似。氨基酸插入为Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH。9位的赖氨酸残基插入为Fmoc-Lys(Mmt)-OH。
在C18柱上通过分析型RP-HPLC确定产物的均一性，使用乙腈在0.1%TFA中的水溶液梯度洗脱(30分钟，50%-95%，流速为1mLmin-1)。色谱显示在23.4分钟保留时间处有一主峰。肽同一性使用ESI-MS光谱检查并证实了预期的分子量(3311amu)。
所述肽的产率为90%。
肽-卟啉中间体(3):3,7,12,17-四甲基卟啉-18(2)-丙酸-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1(OtBu)-Glu2(OtBu)-Gln3(Trt)-Gln4(Trt)-Leu5-Ser6(tB u)-Ser7(tBu)-Gln8(Trt)-Lys9-Arg10(Pbf)-NH2)丙酰胺单肽加合物的合成
该中间体通过将十肽(1)在溶液中与次卟啉(DP-IX)偶联合成。
将十肽(1)(0.100g,0.040mmol)和次卟啉IX·2HCl(0.028g,0.048mmol)溶于30mL含有DIEA(0.032mL,0.184mmol)的DMF中。随后滴加PyBop(0.025g,0.048mmol)、HOBt(0.0075g,0.048mmol)和DIEA(0.017mL,0.096mmol)的DMF溶液(10mL)。室温下搅拌反应混合物3小时。在C8柱上通过分析型HPLC监测反应，使用乙腈在0.1%TFA中的水溶液梯度洗脱(20分钟，50%-90%)，随后在硅胶上用薄层色谱检测(溶剂系统：氯仿/甲醇90:10)。减压蒸发反应混合物至20%的体积，用冷乙醚沉淀。粗产物用硅胶柱纯化(5×60cm)，用氯仿/甲醇梯度从0-10%甲醇分步洗脱。产物用10%甲醇洗脱，产率48%。分析型RP-HPLC和ESI/MS光谱证实了产物的纯度和同一性(2980amu)。
最终产品:3,7,12,17-四甲基卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-Ser6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-NH2)-二-丙酰胺(4)的合成。
将单肽加合物(3)(0.050g,0.017mmol)、十四肽(2)(0.052g,0.017mmol)和DIEA(0.009mL,0.051mmol)溶于16mL20%TFE(v/v)的DMF溶液中，随后滴加HATU(0.0065g,0.017mmol)的1mL DMF溶液，室温下反应2小时。在反应期间检查pH。反应后用分析型HPLC检测(Vydac C8柱,乙腈的0.1%TFA水溶液梯度洗脱，50%-90%，20分钟，流速1mLmin-1)，随后用薄层色谱检测(溶剂系统氯仿/甲醇90:10)。减压蒸发反应混合物至20%体积，用冷乙醚沉淀。真空干燥粗产品。通过加入解离混合物(0.75g苯酚的苯甲硫醚溶液/H2O/EDT/TFA0.25/0.5/0.5/8.75,v/v/v/v)(1,2-二巯基乙烷:EDT)，在0°C保留2.5h对侧链进行脱保护。该处理重复进行2次。在旋转蒸发仪上浓缩反应混合物至体积为约1-2mL，加入冷的乙醚萃取清除剂和沉淀粗产物。真空干燥粗产品，通过制备RP-HPLC在C18柱上纯化，使用乙腈的0.1%TFA水溶液梯度洗脱，10%-80%，35分钟。冻干收集的含有所需产品的组分，获得了0.025g(7.2×10-3mmol,产率42%)最终产物，分析RP-HPLC显示纯化的产物纯度达到>99%，ESi/MS证实了预期的分子量(3499amu)。
产物3,7,12,17-四甲基卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-Ser6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-NH2)-二-丙酰胺的Fe3+络合物(5)的合成
按照文献的说明将铁离子插入到大环中(Buchler JW.The Porphyrins,卷1(主编D.Dolphin),Academic Press.New York.1979,pp.389).将FeII乙酸盐(50M过量)加入到最终化合物(4)(0.006g,1.7×10-6mol,最终浓度1.0×10-4M)的乙酸/TFE6/4v/v溶液中。将反应混合物保存在40°C3h，氮气下回流。通过分析HPLC监控反应。随后真空除去溶剂，通过制备型RP-HPLC将产物在C18柱上纯化至均一，使用乙腈在0.1%TFA中的水溶液梯度洗脱，10%-80%，58.4min。获得0.0032g(0.90×10-3mmol,产率54%)纯产物。ESI/MS分析证实了预期的分子量(3552amu)。
实施例2.与抗体共价键合的实施例1中化合物的合成
将实施例1中的化合物与单克隆鼠抗体抗人IgG(下文中称IgG)通过双异官能团接头连接。选择硫代-SMCC(接头)，因为该试剂是胺-巯基交联剂。选择双异官能团接头可以获得高缀合水平，因为它们不在两个相同的基团、例如抗体-抗体之间形成交联。缀合方案包括2步。
使用试剂硫代-SMCC修饰化合物(5)的Lys11侧链(6)
将0.002g化合物(5)溶于0.8mL0.1M磷酸盐,NaCl0.15M，pH=7.2。向该溶液中加入0.2mL含有0.0043g硫代-SMCC的水溶液(摩尔比≈1:20)。将反应混合物在室温下搅拌孵育2小时。
反应随后用LC-MS监测，当反应完全时，使用PD10脱盐柱纯化反应混合物，使用100mM磷酸盐，150mM NaCl,pH7.2作为洗脱缓冲液。收集含有所需产物(6)的组分并冻干。
向IgG分子中引入巯基(7)
将0.8mg N-琥珀酰S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)在0.010mL乙腈中的溶液加入到在0.1M碳酸盐缓冲液中的抗体溶液中(IgG,1mg/mL,≈6.710-6M)，pH9。将反应物在室温下搅拌30分钟，使用脱盐柱纯化修饰的抗体，用pH9的0.1M碳酸盐缓冲液洗涤。
SATA修饰抗体的脱乙酰基作用通过向SATA修饰的抗体溶液中加入0.100mL的羟胺储存液(其如下制备：将0.050g盐酸羟胺溶于1.0ml0.1M的碳酸盐缓冲液，pH9)进行(NH2OH摩尔过量约为抗体的30倍)。
将反应物在室温下搅拌2小时，为从过量的羟胺中纯化反应产物，使用脱盐柱，用pH5的100mM磷酸盐缓冲液，150mM NaCl,25mM EDTA平衡。
将修饰的抗体(7)与化合物(6)缀合以获得缀合产物(8)
最终缀合产物(8)通过将0.0025g(6)与0.001g修饰的抗体(7)在0.003L反应体积中反应获得。
将反应物在室温下搅拌2小时，随后通过分析型HPLC分析，使用分 子排阻柱(用0.1M磷酸缓冲液,3.5mM SDS,pH6平衡)。缀合产物通过凝胶过滤纯化，使用玻璃柱(10x150mm,Sephadex G-100超细10-40填充)。用0.1M磷酸缓冲液，0.15M NaCl在pH7洗脱分离，流速为3mL/h。通过分析280与398nm吸光度比例分析缀合比例，估计为13(化合物(6)/IgG)。
实施例3.通式(I)化合物3,7,12,17-四甲基-卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-Ser6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-NH2)-二-丙酰胺的合成，其中：
大环的氮原子与Ru2+离子络合；R2和R7是CH3；R4和R6是H；R3和R5是CH3；R1是通式(II)，其中:n=2；A是Ace-Asp,X1是Glu；Y2是Gln；Y3是Gln；Y4是Leu；X5是His；X6是Ser；Y7是Gln；X8是Lys(N,ε-丙酰胺)；X9是Arg；Y10是Lys；B是Ile-Thr-Leu-NH2；L是CO；A是Ace-Asp；R8是通式(III)，其中:m=2；C是Ace-Asp；Z1是Glu；W2是Gln；W3是Gln；W4是Leu；Z5是Ser；Z6是Ser；W7是Gln；Z8是Lys(N,ε-丙酰胺)；Z9是Arg；D是NH2；P是CO。
化合物的合成始于将钌离子插入大环(DP-IX)，随后，如实施例1中所述将十肽(化合物1)和十四肽(化合物2)与大环偶联。
具体而言，钌在卟啉环中的插入，从而制备Ru(II)-CO-DP-IX络合物的过程使用略微修饰的金属羰基化合物方法进行。
该方法基于使用高沸点疏质子溶剂(例如甲苯，DMF，二噁烷)，使用三钌十二羰基Ru3(CO)12作为“金属载体”以及回流条件下的长时间反应进行。我们优化的试验条件使用乙酸-乙酸钠溶液作为溶剂(Hartmann M.等人，J.Biol.Inorg.Chem.1997,2,pp427)。具体而言，将20.0mg DP-IX溶于6.3ml含有133.0mg乙酸钠的乙酸溶液中，向该溶液中加入83mgRu3(CO)12(～4当量)，将反应混合物在85°C下回流加热。
通过UV-可见光谱和分析RP-HPLC监测金属化的过程。反应24小时 后的分析证实了Ru2+插入到大环中(80%产率)。
冷却反应混合物，随后加入50mL冷水。观察到形成含有所需产品、未反应的DP-IX和过量的Ru3(CO)12的红棕色的固体。通过离心从溶液中分离固体，随后用甲醇处理。加入甲醇后，未反应的DP-IX和所需的产物被溶解。通过离心分离Ru3(CO)12的不溶性沉淀。所需的产物通过RP-HPLC色谱纯化，使用C18柱,2.2x25cm,使用乙腈在0.1%TFA的水溶液中的梯度洗脱，20%-80%，33min。冻干收集的含有所需产物的组分，获得9.6mg(15×10-3mmol,产率44%)纯产品。
通过分析型RP-HPLC验证纯产品的均一性。MALDI质谱分析显示在m/z610amu处有一主峰，对应于Ru(II)-DP-IX分子离子峰。事实上，在用MALDI激光光源对样品离子化的过程中，观察到CO从金属离子上的解离(Ishii K.等人，Inorg.Chem.2004,43,pp7369)。CO的存在进一步通过产物的IR光谱分析得到验证，其显示ν=1989cm-1带，其代表Ru(II)-CO-卟啉络合物。
如实施例1中所述将十肽(化合物1)和十四肽(化合物2)与Ru(II)-CO-DP-IX偶联。
最终产物通过RP-HPLC纯化，产率为42%。通过LC-MS/ESI分析(3625amu)验证均一性和同一性。
实施例4.通式(I)化合物3,7,12,17-四甲基卟啉-18(2)-丙酸-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)丙酰胺的合成，其中：
大环的氮原子与Fe3+离子络合，R2和R7是CH3；R4和R6是H；R3和R5是CH3；R1是通式(II)，其中:n=2；A是Ace-Asp,X1是Glu；Y2是Gln；Y3是Gln；Y4是Leu；X5是His；X6是Ser；Y7是Gln；X8是Lys(N,ε-丙酰胺)；X9是Arg；Y10是Lys；B是Ile-Thr-Leu-NH2；L是CO；A是Ace-Asp；R8是式Q-(CH2)m-，其中:m=2,并且Q是HOOC。
该化合物的合成使用实施例1中所述的十四肽Ace-Asp1(OtBu)-Glu2(OtBu)-Gln3(Trt)-Gln4(Trt)-Leu5-His6(Trt)-Ser7(tBu)-Gln8(Trt)-Lys9-Arg10(Pbf)-Lys11(Boc)-Ile12-Thr13(tBu)-Leu14-NH2)(中间体(2))和DP-IX进行。如实施例1中所述将十四肽与DP-IX偶联。如实施例1所述除去侧链保护基团，并将铁离子插入大环，终产品通过RP-HPLC纯化(48%产率)。通过LC-MS/ESI分析(3625amu)验证均一性和同一性。
实施例5.通式(I)的化合物3,7,12,17-四甲基卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Leu10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-Ser6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-NH2)-二-丙酰胺的合成，其中：
大环的氮原子与Fe3+离子络合；R2和R7是CH3；R4和R6是H；R3和R5是CH3；R1是通式(II),其中:n=2；A是Ace-Asp,X1是Glu；Y2是Gln；Y3是Gln；Y4是Leu；X5是His；X6是Ser；Y7是Gln；X8是Lys(N,ε-丙酰胺)；X9是Leu；Y10是Lys；B是Ile-Thr-Leu-NH2；L是CO；A是Ace-Asp；R8是通式(III),其中:m=2；C是Ace-Asp；Z1是Glu；W2是Gln；W3是Gln；W4是Leu；Z5是Ser；Z6是Ser；W7是Gln；Z8是Lys(N,ε-丙酰胺)；Z9是Arg；D是NH2；P是CO。
该化合物的合成使用下述材料进行：a)十肽(Ace-Asp1(OtBu)-Glu2(OtBu)-Gln3(Trt)-Gln4(Trt)-Leu5-Ser6(tBu)-Ser7(tBu)-Gln8(Trt)-Lys9-Arg10(Pbf)-NH2)(中间体1),如实施例(1)所述合成；b)十四肽Ace-Asp1(OtBu)-Glu2(OtBu)-Gln3(Trt)-Gln4(Trt)-Leu5-His6(Trt)-Ser7(tBu)-Gln8(Trt)-Lys9-Leu10-Lys11(Boc)-Ile12-Thr13(tBu)-Leu14-NH2)(中间体(2))，在位置X9上含有亮氨酸而非精氨酸(Pbf)，如实施例(1)中所述合成；c)DP-IX。十肽、十四肽和DP-IX的偶联如实施例1所述进行。
如实施例1所述除去侧链保护基团，并将铁离子插入大环，终产品通过RP-HPLC纯化(25%产率)。通过LC-MS/ESI分析(3509amu)验证均一 性和同一性。
实施例6.合成通式(I)化合物3,7,12,17-四甲基卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Leu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-Ser6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-NH2)-二-丙酰胺，其中:
大环的氮原子与Fe3+离子络合；R2和R7是CH3；R4和R6是H；R3和R5是CH3；R1是通式(II),其中:n=2；A是Ace-Asp,X1是Leu；Y2是Gln；Y3是Gln；Y4是Leu；X5是His；X6是Ser；Y7是Gln；X8是Lys(N,ε-丙酰胺)；X9是Arg；Y10是Lys；B是Ile-Thr-Leu-NH2；L是CO；A是Ace-Asp；R8是通式(III),其中:m=2；C是Ace-Asp；Z1是Glu；W2是Gln；W3是Gln；W4是Leu；Z5是Ser；Z6是Ser；W7是Gln；Z8是Lys(N,ε-丙酰胺)；Z9是Arg；D是NH2；P是CO。
该化合物的合成使用下述材料进行：a)十肽(Ace-Asp1(OtBu)-Glu2(OtBu)-Gln3(Trt)-Gln4(Trt)-Leu5-Ser6(tBu)-Ser7(tBu)-Gln8(Trt)-Lys9-Arg10(Pbf)-NH2)(中间体1),如实施例(1)所述合成；b)十四肽Ace-Asp1(OtBu)-Leu2-Gln3(Trt)-Gln4(Trt)-Leu5-His6(Trt)-Ser7(tBu)-Gln8(Trt)-Lys9-Arg10(Pbf)-Lys11(Boc)-Ile12-Thr13(tBu)-Leu14-NH2)(中间体(2))，在位置X1上含有亮氨酸而非Glu(OtBu)，如实施例(1)中所述合成；c)DP-IX。十肽、十四肽和DP-IX的偶联如实施例1所述进行。
如实施例1所述除去侧链保护基团，并将铁离子插入大环，终产品通过RP-HPLC纯化(27%产率)。通过LC-MS/ESI分析(3536amu)验证均一性和同一性。
实施例7.通式(I)的化合物3,7,12,17-四甲基卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-Gly6-Ser 7-Gln8-Lys9-Arg10-NH2)-二-丙酰胺的合成，其中
大环的氮原子与Fe3+离子络合；R2和R7是CH3；R4和R6是H；R3和R5是CH3；R1是通式(II),其中:n=2；A是Ace-Asp,X1是Glu；Y2是Gln；Y3是Gln；Y4是Leu；X5是His；X6是Ser；Y7是Gln；X8是Lys(N,ε-丙酰胺)；X9是Arg；Y10是Lys；B是Ile-Thr-Leu-NH2；L是CO；A是Ace-Asp；R8是通式(III),其中:m=2；C是Ace-Asp；Z1是Glu；W2是Gln；W3是Gln；W4是Leu；Z5是Gly；Z6是Ser；W7是Gln；Z8是Lys(N,ε-丙酰胺)；Z9是Arg；D是NH2；P是CO.。
化合物的合成使用下述材料进行：a)十肽(Ace-Asp1(OtBu)-Glu2(OtBu)-Gln3(Trt)-Gln4(Trt)-Leu5-Gly6-Ser7(tBu)-Gl n8(Trt)-Lys9-Arg10(Pbf)-NH2)(中间体1),如实施例(1)所述合成，在Z5位含有甘氨酸代替丝氨酸(tBu)；b)十四肽Ace-Asp1(OtBu)-Glu2(OtBu)-Gln3(Trt)-Gln4(Trt)-Leu5-His6(Trt)-Ser7(tBu)-Gln8(Trt)-Lys9-Arg10(Pbf)-Lys11(Boc)-Ile12-Thr13(tBu)-Leu14-NH2)(中间体(2)),如实施例(1)中所述合成；c)DP-IX。
十肽、十四肽和DP-IX的偶联如实施例1所述进行。如实施例1所述除去侧链保护基团，并将铁离子插入大环，终产品通过RP-HPLC纯化(28%产率)。通过LC-MS/ESI分析(3522amu)验证均一性和同一性。
实施例8.通式(I)的化合物3,7,12,17-四甲基卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Leu2-Gln3-Gln4-Leu5-Ser6-Ser 7-Gln8-Lys9-Arg10-NH2)-二-丙酰胺的合成，其中:
大环的氮原子与Fe3+离子络合；R2和R7是CH3；R4和R6是H；R3和R5是CH3；R1是通式(II),其中:n=2；A是Ace-Asp,X1是Glu；Y2是Gln；Y3是Gln；Y4是Leu；X5是His；X6是Ser；Y7是Gln；X8是Lys(N,ε-丙酰胺)；X9是Leu；Y10是Lys；B是Ile-Thr-Leu-NH2；L是CO；A是Ace-Asp；R8是通式(III),其中:m=2；C是Ace-Asp；Z1 是Leu；W2是Gln；W3是Gln；W4是Leu；Z5是Ser；Z6是Ser；W7是Gln；Z8是Lys(N,ε-丙酰胺)；Z9是Arg；D是NH2；P是CO。
化合物的合成使用下述材料进行：a)十肽(Ace-Asp1(OtBu)-Leu2-Gln3(Trt)-Gln4(Trt)-Leu5-Gly6-Ser7(tBu)-Gln8(Trt)-Lys9-Arg10(Pbf)-NH2)(中间体1),如实施例(1)所述合成，在Z1位含有亮氨酸代替Glu(OtBu)；b)十四肽Ace-Asp1(OtBu)-Glu2(OtBu)-Gln3(Trt)-Gln4(Trt)-Leu5-His6(Trt)-Ser7(tBu)-Gln8(Trt)-Lys9-Arg10(Pbf)-Lys11(Boc)-Ile12-Thr13(tBu)-Leu14-NH2)(中间体(2))，如实施例(1)中所述合成；c)DP-IX。
十肽、十四肽和DP-IX的偶联如实施例1所述进行。如实施例1所述除去侧链保护基团，并将铁离子插入大环，终产品通过RP-HPLC纯化(30%产率)。通过LC-MS/ESI分析(3536amu)验证均一性和同一性。
实施例9.通式(I)的化合物3,7,12,17-四甲基卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-Ser6-Ser7-Gln8-Lys9-Leu10-NH2)-二-丙酰胺的合成，其中:
大环的氮原子与Fe3+离子络合；R2和R7是CH3；R4和R6是H；R3和R5是CH3；R1是通式(II),其中:n=2；A是Ace-Asp,X1是Glu；Y2是Gln；Y3是Gln；Y4是Leu；X5是His；X6是Ser；Y7是Gln；X8是Lys(N,ε-丙酰胺)；X9是Leu；Y10是Lys；B是Ile-Thr-Leu-NH2；L是CO；A是Ace-Asp；R8是通式(III),其中:m=2；C是Ace-Asp；Z1是Glu；W2是Gln；W3是Gln；W4是Leu；Z5是Ser；Z6是Ser；W7是Gln；Z8是Lys(N,ε-丙酰胺)；Z9是Leu；D是NH2；P是CO。
化合物的合成使用下述材料进行：a)十肽(Ace-Asp1(OtBu)-Leu2-Gln3(Trt)-Gln4(Trt)-Leu5-Gly6-Ser7(tBu)-Gln8(Trt)-Lys9-Leu10-NH2)(中间体1),如实施例(1)所述合成，在Z9位含有亮氨酸代替Arg(Pbf)；b)十四肽 Ace-Asp1(OtBu)-Glu2(OtBu)-Gln3(Trt)-Gln4(Trt)-Leu5-His6(Trt)-Ser7(tBu)-Gln8(Trt)-Lys9-Arg10(Pbf)-Lys11(Boc)-Ile12-Thr13(tBu)-Leu14-NH2)(中间体(2))，如实施例(1)所述合成；c)DP-IX.
十肽、十四肽和DP-IX的偶联如实施例1所述进行。如实施例1所述除去侧链保护基团，并将铁离子插入大环，终产品通过RP-HPLC纯化(28%产率)。通过LC-MS/ESI分析(3509amu)验证均一性和同一性。
实施例10.实施例1中所述化合物的过氧化物酶活性
这里描述了化合物Fe(III)-3,7,12,17-四甲基卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-Ser6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-NH2)-二-丙酰胺的过氧化物酶活性，其合成描述于实施例1。使用H2O2和下述第二底物：ABTS和愈创木酚。
在H2O2的存在下形成ABTS+·自由基阳离子后，评价本发明化合物在第二底物ABTS上的过氧化物酶活性。
反应后使用分光光度法测定反应介质中产物的存在。ABTS+·阳离子自由基的形成在660nm处检测(λmax(ε)=660nm(1.40×104M-1cm-1))。反应在50%TFE(v/v)100mM磷酸缓冲液中进行，pH6.5，使用2.0×10-7M催化剂浓度。
化合物的动力学参数通过使H2O2的浓度相对于固定的还原性底物浓度而变化进行确定，反之亦然。
更具体而言，在以不同H2O2浓度(0.01÷200mM)进行的试验中，ABTS浓度保持为0.1mM。在以不同的ABTS浓度(范围0.005÷0.1mM)进行的试验中，H2O2浓度为50mM。
试验数据使用双底物Michaelis-Menten动力学模型拟合，获得下述动力学参数：Km AH 28.4±0.210-2mM和kcat370.9±14s-1。
愈创木酚底物上的过氧化物酶活性通过形成愈创木酚氧化产物四氢愈创木酚进行评价，测定了在470nm处的吸光度变化，ε470=2.66×104 M-1cm-1。
具体而言，在不同的H2O2浓度(范围1÷40mM)下进行试验，愈创木酚浓度保持在0.1mM不变。在不同的愈创木酚浓度下进行试验(浓度范围为0.0025÷0.07mM)，H2O2浓度为10mM。
试验数据使用双底物Michaelis-Menten动力学模型拟合，获得下述动力学参数：Km AH 29.2±0.410-3mM和kcat8.0±0.1s-1。
ABTS氧化在pH=6.5的比活性是104mmol g-1s-1。该数值类似于辣根过氧化物酶(93mmol g-1s-1,pH4.6)。对愈创木酚氧化的比活性2倍高于辣根过氧化物酶。
实施例11.苯酚硝化
评价了化合物Fe(III)-3,7,12,17-四甲基卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-Ser6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-NH2)-二-丙酰胺(其合成如实施例1所述)催化苯酚硝化的能力。反应混合物通过分析型HPLC在Phenomenex Gemini C18柱上分析(150×4.6mm,5μm)，用H2O/0.1%TFA(A)和CH3CN/0.1%TFA(B)线性梯度洗脱，从10%到90%B，20min，流速1mL/min。使用市售样品和4-氰基苯酚作为内标构建校准曲线，由此获得原料和产物的浓度。用1mM苯酚，在含0.2μM催化剂、20mM NaNO2和3mM H2O2的磷酸缓冲液(pH6.5,50%TFE(v/v))存在下，进行苯酚硝化的标准孵育。
反应在室温下进行，孵育40分钟。反应混合物的RP-HPLC分析显示4-和2-硝基苯酚的形成。通过增加H2O2NO2 -和苯酚的浓度，增加了40分钟反应时间时4-和2-硝基苯酚的产率。在底物浓度和氧化剂浓度分别为1.0mM和40mM NO2 -时，硝基苯酚(4-和2-)的产率最高。
在这些条件下，硝基苯酚的总产率为约14.8%。在乳酸过氧化物酶存在下的硝基苯酚总产率仅高4倍。
实施例12.实施例2所述化合物的催化活性
作为实例，下文描述了与抗体共价连接的式Fe(III)-3,7,12,17-四甲基卟啉
-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-Ser6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-NH2)-二-丙酰胺的过氧化物酶活性，其按照实施例2所述合成，使用H2O2作为氧化剂，ABTS作为还原底物。
实验在50%TFE(v/v)100mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中进行。如实施例10中所述，催化过程通过ABTS+·阳离子自由基的形成在660nm处检测(ε=14700M-1cm-1)。化合物的动力学参数通过使H2O2的浓度相对于固定的还原性底物浓度而变化进行确定，反之亦然。
具体而言，在第一次试验中，ABTS和缀合物浓度分别保持在0.1mM和210-7M不变，H2O2浓度在10-100mM变化。在第二次试验中，H2O2和缀合物浓度分别固定在50mM和210-7M，ABTS浓度在范围0.005÷0.1mM变化。
试验数据使用双底物Michaelis-Menten动力学模型拟合，获得下述动力学参数：Km AH 20.123mM mM和kcat91s-1。
实施例13.催化活性的比较
实施例4、5、6、7、8、9中的化合物的催化活性以类似于实施例10所述的方法测定。
下表比较了实施例1、4、5、6、7、8、9中所述化合物和天然以及重组过氧化物酶和其他类似物在过氧化氢存在下对ABTS氧化的催化活性。
对使用H2O2进行的ABTS氧化的催化活性
表中还列出了以比活性(mol g-1min-1)表示的催化活性，其对应于每克催化剂每分钟转化的底物摩尔数。在中性条件下，实施例中的所有化合物的比活性比天然过氧化物酶高200倍，并且与HRP的最大活性(在pH=4.6条件下)相当或更高。所述比活性比现有技术中的化合物(MP8,MP11,ToCPP-13G10,ToCPP-14H7)高100,000倍，也高于Mimochrome家族。
缩写列表
氨基酸的命名和缩写见IUPAC-IUB生物命名委员会的推荐(Eur.J.Biochem.1984,138,pp9)；“侧链”表示α氨基酸上α碳上的任何链；除非另外说明，氨基酸是L构型。其他使用的缩写如下:
Suc=琥珀酰基,Ace=乙酰基,Asp=天冬氨酸,Asn=天冬酰胺,Pro=脯氨酸,Lys=赖氨酸,Orn=鸟氨酸,Glu=谷氨酸,Aada=α-氨基己二酸，Arg=精氨酸,hArg=高精氨酸,Leu=亮氨酸,Gln=谷氨酰胺,His=组氨酸,hCys=高半胱氨酸,Met=甲硫氨酸,4TAZ=β-(4-噻唑 基)-丙氨酸,5TAZ=β-(5-噻唑基)-丙氨酸,Ser=丝氨酸,Thr=苏氨酸,aThr=别-苏氨酸,Dap=2,3二氨基丙酸,Dab=2,4二氨基丁酸,Ile=异亮氨酸,Gly=甘氨酸,Ala=丙氨酸,Aib=α-氨基异丁酸,Fmoc=芴甲氧羰基,TFA=三氟乙酸，tBu=叔丁基,Trt=三苯甲基,PBF=2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃,DVB=二乙烯基苯,Mmt=甲氧基三苯甲基,DMF=二甲基甲酰胺,PyBop=苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷子基-六氟磷酸盐,HOBt=羟基苯并三唑,IDEA=二异丙基乙胺,HATU=2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐,TFE=三氟乙醇,DCM=二氯甲烷,Boc=叔丁氧羰基,硫代-SMCC=硫代琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯,EDTA=乙二胺四乙酸盐,SDS=十二烷基硫酸钠,ABTS=2,2′-连氮基-双-3-乙基-苯并噻嗪-6-磺酸,DP-IX=次卟啉IX。
Claims (12)
1.通式(I)的化合物：
其中：
含氮大环的氮原子与以任何允许的氧化态的金属离子Me络合，所述金属离子选自Fe、Mn和Ru；
R1是通式(II)的基团:
其中:
n＝2；
A选自Ace-Asp，其中Ace是乙酰基；
X1选自Glu和Leu；
Y2是Gln；
Y3是Gln；
Y4是Leu；
X5是His；
X6是Ser；
Y7是Gln；
X8是Lys；
X9选自Arg和Leu；
Y10是Lys；
B是Ile-Thr-Leu-NH2；
L是CO；
R2、R3、R5和R7是CH3；
R4和R6是H；
R8具有式Q-(CH2)s-，其中：s＝2，并且Q是HOOC-，或R8具有通式(III)：
其中：
m＝2；
C是Ace-Asp，其中Ace是乙酰基；
Z1选自Glu和Leu；
W2是Gln；
W3是Gln；
W4是Leu；
Z5选自Ser和Gly；
Z6是Ser；
W7是Gln；
Z8是Lys；
Z9选自Arg和Leu；
D是NH2；
P是CO。
2.根据权利要求1的化合物，其选自:
i)3,7,12,17-四甲基卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-Ser6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-NH2)-二-丙酰胺，其中大环的氮原子与Fe3+离子配位；
ii)3,7,12,17-四甲基卟啉-18(2)-丙酸-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)丙酰胺，其中大环的氮原子与Fe3+离子配位；
iii)3,7,12,17-四甲基卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Leu10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-Ser6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-NH2)-二-丙酰胺，其中大环的氮原子与Fe3+离子配位；
iv)3,7,12,17-四甲基卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Leu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-Ser6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-NH2)-二-丙酰胺，其中大环的氮原子与Fe3+离子配位；
v)3,7,12,17-四甲基卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-Gly6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-NH2)-二-丙酰胺，其中大环的氮原子与Fe3+离子配位；
vi)3,7,12,17-四甲基卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Leu2-Gln3-Gln4-Leu5-Ser6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-NH2)-二-丙酰胺，其中大环的氮原子与Fe3+离子配位；
vii)3,7,12,17-四甲基卟啉-2(18)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-His6-Ser7-Gln8-Lys9-Arg10-Lys11-Ile12-Thr13-Leu14-NH2)-18(2)-N9 ε-(Ace-Asp1-Glu2-Gln3-Gln4-Leu5-Ser6-Ser7-Gln8-Lys9-Leu10-NH2)-二-丙酰胺，其中大环的氮原子与Fe3+离子配位。
3.化合物，其通过将根据权利要求1或2的化合物与肽、抗原、受体配基、生物素、抗生蛋白链菌素、酶抑制剂、寡核苷酸或PNA共价结合而获得。
4.根据权利要求3的化合物，其中所述的肽是蛋白质。
5.根据权利要求4的化合物，其中所述的蛋白质是抗体或其片段，或酶。
6.具有包被的支持物，其中所述包被由根据权利要求1-5任一项的化合物形成，其中所述支持物选自固相基质、纳米颗粒或电极。
7.根据权利要求1-5任一项的化合物或根据权利要求6的支持物作为催化剂在下述反应中的用途：1)使用清洁的氧化剂的脂肪族或芳族烃羟基化反应；2)使用清洁的氧化剂的脂肪族或芳族烯烃环氧化反应；3)使用清洁的氧化剂的脂肪族或芳族烃氧化反应；4)使用清洁的氧化剂的脂肪族或芳族烃过氧化反应；5)苯酚硝化。
8.根据权利要求7的用途，其中所述的清洁的氧化剂是H2O2或O2。
9.根据权利要求1-5任一项的化合物或根据权利要求6的支持物的用途，其用于制备免疫诊断试剂盒。
10.根据权利要求1-5任一项的化合物或根据权利要求6的支持物的用途，其用于非诊断性免疫组织化学、非诊断性原位杂交试剂盒、非诊断性ELISA、非诊断性DNA印迹、非诊断性RNA印迹、非诊断性蛋白质印迹、非诊断性细胞荧光测定术或非诊断性电化学装置。
11.根据权利要求1-5任一项的化合物或根据权利要求6的支持物的用途，其：
-用于污染物降解；
-作为化学探针，用于检测(i)水中的污染物，(ii)食物防腐剂的存在。
12.根据权利要求1-5任一项的化合物或根据权利要求6的支持物的用途，其用于制备用于测定体内的药物或毒性物质的存在的试剂盒或用于测定药物的代谢途径的试剂盒。
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