JPH06172383A

JPH06172383A - ペプチド置換ポルフィリンの製造方法

Info

Publication number: JPH06172383A
Application number: JP8538492A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Yamamura; 剛士山村
Original assignee: ICHIKAWA GOSEI KAGAKU KK
Current assignee: ICHIKAWA GOSEI KAGAKU KK
Priority date: 1992-04-07
Filing date: 1992-04-07
Publication date: 1994-06-21

Abstract

(57)【要約】【目的】システイン含有ペプチド置換ポルフィリン類
の製造方法において、簡便かつ好収率な方法を得る。【構成】式（１）で表されるヘマトポルフィリンと、
式（２）で表されるプロトポルフィリンと、これらの混
合物とからなる群より選ばれた物質を臭化水素酸−超強
酸溶液中でシステイン含有ペプチドと反応させることに
より、式（３）（ただし、式中Ｒはアミノ基の遊離した
システインを含有するペプチドである）で表されるペプ
チド置換ポルフィリン類を得る。【化９】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生体内の金属タンパク
質の活性中心を有する人工金属タンパク質を形成するこ
とのできる、システイン含有ペプチドで置換されたポル
フィリン類の製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】生体内に存在するチトクロム類はヘムタ
ンパク質であり、中心金属である鉄の価数の可逆反応に
より、生体内での電子伝達系の構成成分をなしている。
このうち、Ｃタイプチトクロムはポルフィリン骨格であ
るヘムとタンパク質の結合部分にＣｙｓ−Ｘ−Ｙ−Ｃｙ
ｓ−Ｈｉｓ（ＸおよびＹはアミノ酸残基、Ｃｙｓはシス
テイン基、Ｈｉｓはヒスチジン基を表す）のアミノ酸配
列が普遍的に存在し、システインの硫黄原子とメソポル
フィリンのメチレン側鎖のα炭素がチオエーテル結合を
介して連結していることが知られている（Z. R. Korzum
等、Proc. Natl.Sci. USA., 74, 5246 (1977). ）。こ
のようなＣタイプチトクロムの機能と性質を解明するた
めに様々な研究がなされており、これらの化合物の合成
研究は機能解明のために重要な意味を有している。現
在、チトクロム全体を合成することは困難であるが、活
性中心を合成し、この機能を解明することは可能である
と本発明者は考えた。

【０００３】Ｃタイプチトクロムコアの合成は従来から
試みられてきた。しかしながら、ポルフィリンとシステ
イン含有ペプチドの硫黄原子のカップリングに関しては
好収率で簡便な方法は未だ見出されていない。これまで
Ｃタイプチトクロムコアの合成法として、ポルフィリノ
ーゲンをナトリウムアマルガムで処理した後、水素化ホ
ウ素ナトリウムと反応させ、ついで液体アンモニアで処
理し、ついでシステインあるいはシステイン含有ペプチ
ドと反応させる方法が知られている（Sano andGranick,
J. Biol. Chem., 236, 1173 (1961); Goff and Morga
n, Inorg. Chem., 15, 2062 (1976); Sano 等、Bioche
m. Biophis. Res. Commun., 15, 284 (1964). ）。しか
しながら、これらの方法は、不安定なポルフィリノーゲ
ンを使用すること、多量のナトリウムアマルガムを使用
すること、ペプチドを大過剰に使用すること等の欠点を
有している。また、ポルフィリンとシステインのカップ
リングの例としては、（ｉ）式（１）で示されるヘマトポルフィリンの臭素
置換、あるいは式（２）で示されるプロトポルフィリン
の臭化水素付加によって製造が可能な、式（５）で示さ
れる２α，４α−ジブロモメソポルフィリンを中間体と
し、ついで、システインを反応させる方法（Neilands a
nd Tuppy, Biochim. biophys. acta, 38,351 (196
0)）、および

【０００４】

【化２】

【０００５】（ii）式（１）で示されるヘマトポルフ
ィリンを臭化水素−酢酸中でシステインと反応させる方
法（Scourides 等、J. Chem. Soc., Chem. Commun., 19
86, 1817）が知られている。このうち、（ｉ）の方法は
高純度のジブロモポルフィリン（５）を得るのが困難で
あること、反応時間が長い、収率が低い等の問題があっ
た。

【０００６】（ii）の方法は、比較的入手の容易なヘマ
トポルフィリンを原料として用い、簡便に高収率で所望
のシステイン置換ポルフィリンが得られるものであり、
優れた方法である。

【０００７】以上のように、ポルフィリンへのシステイ
ンの導入については有効な方法が見出されてはいるもの
の、生体機能により近いと思われる、システイン含有ペ
プチドを連結したポルフィリンコアの満足できる製造方
法は、これまで知られていなかった。

【０００８】また、ポルフィリンとシステイン含有ペプ
チドとのカップリングを用いず、天然型チトクロムＣの
加水分解による、式（４）（式中、Ｍは鉄原子であり、
ＲはＶａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕで示される
ペプチド１分子がそれぞれのシステイン基で架橋されて
いる。ただし、Ｖａｌはバリン基、Ｇｌｕはグルタミン
酸基、Ｌｙｓはリジン基、Ａｌａはアラニン基、Ｈｉｓ
はヒスチジン基、Ｔｈｒはチロシン基を表す）で示され
るヘムウンデカペプチド（ＭＰ−11）の単離が報告され
ている（Mazumder等、Inorg. Chem., 30, 700 (199
1)）。

【０００９】

【化３】

【００１０】しかしながら、天然物を原料とするこの方
法は、十分な物質量が得られない欠点があった。

【００１１】このため、きわめて興味ある機能が期待さ
れるにもかかわらず、チトクロムＣの研究は停滞せざる
を得なかった。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、天然型チト
クロムＣの活性中心を有する人工金属タンパク質を形成
することのできるシステイン含有ペプチド置換ポルフィ
リン類を経済的かつ簡便に製造する方法を提供すること
を課題とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の要望
を満たすシステイン含有ペプチド置換ポルフィリン類を
製造するにあたり、鋭意研究を進めた結果、本発明を完
成するに至った。すなわち、式（１）で示されるヘマト
ポルフィリン、あるいは式（２）で示されるプロトポル
フィリンあるいはそれらの混合物を臭化水素−超強酸溶
液中でシステイン含有ペプチドと反応させることによ
り、所望のシステイン含有ペプチド置換ポルフィリンを
簡便に、好収率で製造できることを見出した。以下に本
発明を詳細に説明する。

【００１４】本発明者は、最初に前述のスクーライズ(S
courides) 等の方法（臭化水素−酢酸法）をシステイン
含有ペプチドとのカップリングに適用してみた。すなわ
ち、市販のヘマトポルフィリン（通常、式（１）で示さ
れるヘマトポルフィリンと式（２）で示されるプロトポ
ルフィリンの混合物である）をシステイン含有ペプチド
である、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ（ただし、Ｂ
ｏｃはタ−シャリブチルオキシカルボニル基、Ｃｙｓは
システイン基、Ｈｉｓはヒスチジン基、ＯＭｅはメトキ
シ基を表す）と共に30％臭化水素酢酸溶液中で処理した
が、反応は十分に進行しなかった（スキ−ム１）。

【００１５】

【化４】

【００１６】次に、前述のニーランズ(Neilands)とタピ
ー(Tuppy) の方法を参考にして、式（２）で示されるプ
ロトポルフィリンに30％臭化水素−酢酸溶液を反応させ
て式（５）で示される粗製の２α，４α−ジブロモメソ
ポルフィリンを合成し、これとＢｏｃ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ
−ＯＭｅの銀塩を反応させた。機器分析の結果、目的物
を含有しているものと推定されたが分離が困難であり、
単離はできなかった（スキ−ム２）。

【００１７】

【化５】

【００１８】本発明者は、スクーライズ等の方法で良好
な結果が得られなかったものの、より強いブロム化条件
および酸性条件を作り出すことにより反応が可能ではな
いかと考え、さらに研究を進めた。その結果、臭化水素
−超強酸条件下において、市販のヘマトポルフィリン
（ヘマトポルフィリンとプロトポルフィリンの混合物）
とＢｏｃ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅを反応させたとこ
ろ、反応は円滑に進行し目的とする、式（３）（式中、
ＲはＣｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅを表す）で示されるＰｏｒ
（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）₂を製造できた（スキ−ム
３）。

【００１９】

【化６】

【００２０】そして、この方法はＢｏｃ−Ｃｙｓ−Ｈｉ
ｓ−ＯＭｅ以外のシステイン含有ペプチドを用いた場合
にも有効であることが認められた。

【００２１】超強酸としては、トリフルオロ酢酸等のト
リフルオロメチル基を有するカルボン酸、無水トリフル
オロ酢酸等のトリフルオロメチル基を有するカルボン酸
無水物、トリフルオロメチルスルホン酸等のトリフルオ
ロメチル基を有するスルホン酸が使用できる。トリフル
オロメチルスルホン酸は、特に好適である。これらの超
強酸中にガス状の臭化水素を溶解して用いるか、酢酸等
の極性溶媒に臭化水素を溶解させ、超強酸と組み合わせ
て使用してもよい。特に、30％臭化水素酢酸溶液：トリ
フルオロメタンスルホン酸＝50：50（容積比）は良好な
結果を与える。反応は室温で進行し、スルフィド結合の
生成と同時にシステインのアミノ保護基であるＢｏｃ基
の脱保護が生じ、アミノ基が遊離する。本発明の製造方
法で得られた粗製物は、類縁物質の含有が少なく比較的
容易に精製できる。また、本法を用いることにより、シ
ステインそのものとポルフィリンのカップリングも可能
である。さらに、他のシステイン含有ペプチドとポルフ
ィリンとのカップリングによるチトクロムＣタイプのポ
ルフィリン類の製造が可能である。

【００２２】また、本発明者は、ペプチド置換ポルフィ
リンの原料であるシステイン含有ペプチドの１つである
Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅを製造する際に、先駆
体として有用である新規なペプチド塩、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ
（ＳＡｇ）−Ｈｉｓ−ＯＭｅ（ただし、ＳＡｇはシステ
インのＳＨ基が銀塩であることを示す）を見出した。こ
のペプチド塩に硫化水素を混合して硫化銀を形成し、こ
の硫化銀を除去することにより、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｈｉ
ｓ−ＯＭｅで表されるシステイン含有ペプチドを容易に
製造することができる。

【００２３】本発明の製造法で製造されたシステイン含
有ペプチド置換ポルフィリンは、公知の方法（前出のMo
rganの文献）で金属を配位させることにより、式（４）
（式中、Ｍは鉄原子、Ｒはシステイン含有ペプチドを表
す）で示される金属錯体を生成させることが可能であ
る。例えば、式（３）（式中、Ｒはシステイン含有ペプ
チドを表す）で示される置換ポルフィリンを硫酸鉄（I
I）で処理した後、空気酸化し、エチレンジアミン四酢
酸二ナトリウム塩（以下、ＥＤＴＡと略す）で処理して
過剰の鉄−ＥＤＴＡを除去することにより、式（４）で
示される、システイン含有ペプチド置換ポルフィリンの
鉄錯体が得られる。

【００２４】

【化７】

【００２５】本発明の方法で製造されたシステイン含有
ペプチドで置換されたポルフィリンは、種々の物性の測
定の結果、生体内に存在するチトクロムＣおよびチトク
ロムＣに最も近いモデルであるヘムウンデカペプチド
（ＭＰ−11）ときわめて類似した性質を示すことが見出
された。すなわち、本発明の製造方法によって得られた
ペプチド置換ポルフィリンの金属錯体は人工金属タンパ
クでありながら天然型チトクロムＣと類似の酸化還元反
応を呈することから、人工補酵素、人工血液等の医薬、
酸化還元触媒、分子素子や超小型電池等への応用が可能
であり、先端技術としてきわめて有用性が高い。

【００２６】

【実施例】以下、実施例により、本発明をさらに詳細に
説明する。

【００２７】試験例１Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｈ
ｉｓ−ＯＭｅの合成Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ 6.1382ｇ（純度91.7
％、20.07mmol 、ただし、Ｂｏｃはタ−シャリブチルオ
キシカルボニル基、Ｃｙｓはシステイン基、Ａｃｍはア
セトアミドメチル基、ＯＨはシステインのカルボキシ基
が遊離であることを表す）とＨ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ（純度
99.7％、20.08mmol 、ただし、Ｈはヒスチジンのアミノ
基が遊離であること、Ｈｉｓはヒスチジン基、ＯＭｅは
メトキシ基を表す）をアセトニトリル40mlに溶解させ
た。塩氷浴で冷却しつつ、トリエチルアミン4.0896ｇ、
40.42mmol ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド5.16ｇ
（24.0mmol）を加えて３時間かき混ぜ、さらに室温で30
分かき混ぜた。不溶物を濾過した後、アセトニトリルを
留去すると淡黄色アモルファス状物が得られた。これを
５％炭酸水素ナトリウム水溶液300ml に溶解させ、クロ
ロホルム200ml で３回抽出した。有機層をエバポレート
し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製す
ると、白色アモルファスのＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−
Ｈｉｓ−ＯＭｅ（ただし、Ｂｏｃはタ−シャリブチルオ
キシカルボニル基、Ｃｙｓはシステイン基、Ａｃｍはア
セトアミドメチル基、Ｈｉｓはヒスチジン基、ＯＭｅは
メトキシ基を表す）が得られた。収量3.2229ｇ、収率3
6.2％。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によ
る純度97.1％。

【００２８】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）270MHz δ（ｐｐｍ）＝1.38 （ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ ^t
Ｂｕ） 1.86 （ｓ，３Ｈ，ＡｃｍＣＨ₃） 2.50 （ＤＭＳＯ） 2.89〜2.83 （ｄ，２Ｈ，Ｃｙｓ β−Ｈ） 3.37 （ｄ，２Ｈ，Ｈｉｓ β−Ｈ） 3.58 （ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ₃） 4.12〜4.24 （ｍ，２Ｈ，ＡｃｍＣＨ₂） 4.27〜4.40 （ｍ，１Ｈ，Ｈｉｓ α−Ｈ） 4.42〜4.54 （ｍ，１Ｈ，Ｃｙｓ α−Ｈ） 6.84 （ｓ，１Ｈ，Ｈｉｓｒｉｎｇ） 6.95〜6.98 （ｄ，１Ｈ，ＣｙｓＮＨ） 7.52 （ｓ，１Ｈ，Ｈｉｓｒｉｎｇ） 8.12〜8.15 （ｓ，１Ｈ，ＨｉｓＮＨ） 8.55 （ｔ，１Ｈ，ＡｃｍＮＨ）実施例１Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＡｇ）−Ｈｉｓ−ＯＭｅ
の合成Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｈｉｓ−ＯＭｅ 2.3701ｇ
(5.344mmol) とトリフルオロ酢酸銀1.2052ｇ(5.456mmo
l) をメタノールに加え、２日間室温でかき混ぜた。生
成した無色ゲル状物質をエバポレートした後、エタノー
ル50mlを加えて遠心分離し、エタノールをデカントして
除いた。この操作を３回繰り返した後白色沈澱を集めて
真空乾燥すると、新規なペプチド塩である白色固体のＢ
ｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＡｇ）−Ｈｉｓ−ＯＭｅ（ただし、Ｓ
ＡｇはシステインのＳＨ基が銀塩であることを表す）が
得られた。収量2.05ｇ。収率80.01 ％。

【００２９】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）270MHz δ（ｐｐｍ）＝1.3 （ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ ^t
Ｂｕ） 2.5 （ＤＭＳＯ） 2.8 〜3.1 （２Ｈ，Ｃｙｓ α−Ｈ） 3.2 （２Ｈ，Ｈｉｓ α−Ｈ） 3.7 （ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ₃） 4.2 （１Ｈ，Ｈｉｓ β−Ｈ） 4.6 （１Ｈ，Ｃｙｓ β−Ｈ） 6.9 〜7.1 （１Ｈ，Ｈｉｓｒｉｎｇおよび１Ｈ，
ＣｙｓＮＨ） 7.8 （１Ｈ，Ｈｉｓｒｉｎｇ） 8.2 （１Ｈ，ＨｉｓＮＨ） 12.8 （１Ｈ，Ｈｉｓｒｉｎｇ−ＮＨ）実施例２Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅの合成以下の操作はすべてアルゴン雰囲気下で行い、溶媒はア
ルゴン雰囲気下で蒸留したものを脱気して用いた。

【００３０】Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＡｇ）−Ｈｉｓ−ＯＭ
ｅ 2.05ｇ(4.276mmol) をメタノール50mlに溶解した。
ついで硫化水素を３時間バブルすると硫化銀が沈澱し、
懸濁液となった。グローボックス内で黒色の硫化銀を濾
過し、メタノールを留去した。白色アモルファスのＢｏ
ｃ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅが得られた。収量1.24ｇ。
収率77.85 ％。ＨＰＬＣによる純度94.4％。

【００３１】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆） δ（ｐｐｍ）＝1.35 （ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ ^t
Ｂｕ） 2.50 （ＤＭＳＯ） 2.52〜2.77 （ｍ，２Ｈ，Ｃｙｓ β−Ｈ） 2.97〜3.14 （ｍ，２Ｈ，Ｈｉｓ β−Ｈ） 3.61 （ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ₃） 3.96〜4.07 （ｍ，１Ｈ，Ｈｉｓ α−Ｈ） 4.54〜4.65 （ｍ，１Ｈ，Ｃｙｓ α−Ｈ） 6.92〜6.95 （ｄ，１Ｈ，ＣｙｓＮＨ） 7.23 （ｓ，１Ｈ，Ｈｉｓｒｉｎｇ） 8.41〜8.44 （ｓ，１Ｈ，ＨｉｓＮＨ） 8.70 （ｓ，１Ｈ，Ｈｉｓｒｉｎｇ）実施例３Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅと市販ヘマ
トポルフィリンのカップリングによる置換ポルフィリ
ン、Ｐｏｒ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）₂の合成［臭化水素−トリフルオロメタンスルホン酸法］溶媒留
去までの操作はすべてアルゴン雰囲気下で行った。

【００３２】Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ 0.2982
ｇ (0.8005mmol) と市販ヘマトポルフィリン 0.1012ｇ
（ヘマトポルフィリン基準で0.169mmol ）に30％臭化水
素酢酸溶液1.0ml を加え、溶解させた。紫色の粘性の高
い溶液となった。これに水冷下でトリフルオロメタンス
ルホン酸1.0ml を加えた。反応液は発熱し、ガスが発生
した。密封して室温で24時間かき混ぜた。真空で臭化水
素、酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸の一部を留去
すると水飴状の粗生成物が得られた。ごく少量のアセト
ニトリルを加えて溶解し、約50mlのジエチルエーテルを
加えて再沈澱させ、デカントによりジエチルエーテルを
除いた。この操作を２回繰り返した後、結晶を真空乾燥
すると黒紫アモルファスの粗生成物を得た。これを酢酸
50mlに溶かし、蒸留水で500ml に希釈した。これをイオ
ン交換カラム、セファデックスカラムで順次精製すると
光沢のある紫黒色のＰｏｒ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）
₂が得られた。

【００３３】収率：市販ヘマトポルフィリンから46.3
％、ペプチドから19.5％。

【００３４】ＨＰＬＣ純度：100 ％。

【００３５】１）元素分析Ｐｏｒ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）₂・６Ｈ₂Ｏ、Ｃ₅₄Ｈ₇₈Ｎ₁₂Ｏ₁₈Ｓ₂ 分子量1245.51 としての計算値：Ｃ 53.36 ％，Ｈ 6.48％，Ｎ 13.83 ％，Ｓ
5.27％分析値：Ｃ 53.41 ％，Ｈ 7.43％，Ｎ 13.36 ％，Ｓ
5.85％２） ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）270MHz δ（ｐｐｍ）＝2.35 （−ＣＨ（ＳＲ）Ｃ
Ｈ ₃） 3.21 （Ｐｏｒ，ＢＣＨ₂） 3.72 （Ｈｉｓ，ＯＭｅ） 3.83 （Ｐｏｒ，１，３，５，８−Ｍｅ） 4.42 （Ｐｏｒ，ＡＣＨ₂） 5.91〜6.18 （２Ｈ，−ＣＨ（ＳＲ）−ＣＨ₃） 6.64〜6.96 （２Ｈ，Ｈｉｓｒｉｎｇ） 7.35〜7.74 （２Ｈ，Ｈｉｓｒｉｎｇ） 8.13〜8.60 （２Ｈ，ＨｉｓＮＨ） 10.17〜10.72 （４Ｈ，Ｐｏｒ，Ｍｅｓｏ）なお、Ａ、Ｂは下式に示す部位である（以下、同じ）。

【００３６】

【化８】

【００３７】３） ¹Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ） 270MHz （ポルフィリンの会合を抑えるため微量のトリフルオロ
メタンスルホン酸を添加） δ（ｐｐｍ）＝2.18 （−ＣＨ（ＳＲ）−ＣＨ
₃） 3.66 （ＨｉｓＯＣＨ₃） 3.77 （Ｐｏｒ，１，３，５，８−Ｍｅ） 4.32 （Ｃｙｓ α−Ｈ） 4.47 （Ｐｏｒ，ＡＣＨ₂） 4.86 （Ｈｉｓ α−Ｈ） 5.91 （２Ｈ，−ＣＨ（ＳＲ）−ＣＨ₃） 7.23 （２Ｈ，Ｈｉｓｒｉｎｇ） 8.56 （２Ｈ，Ｈｉｓｒｉｎｇ） 10.97, 11.20 （ｍ，４Ｈ，ＰｏｒＭｅｓｏ）４）吸収スペクトル試料2.5mg をメスフラスコに採取し、蒸留水で10mlに希
釈した。この約１mlを１mmセルに採取し、吸収スペクト
ルを測定した。ε値は、試料がＰｏｒ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ
−ＯＭｅ）₂・６Ｈ₂Ｏとして、ランバート・ベーアの
法則より算出した。その結果は以下の通りである。

【００３８】

【表１】

【００３９】吸収スペクトルには、金属フリーのポルフ
ィリンに特徴的な４つのピークが現れており、一般にエ
チオ（ｅｔｉｏ）型と呼ばれるタイプである。

【００４０】実施例４Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭ
ｅと市販ヘマトポルフィリンのカップリングによる置換
ポルフィリン、Ｐｏｒ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）₂の
合成［臭化水素−トリフルオロ酢酸法］溶媒留去までの操作
は、すべてアルゴン雰囲気下で行った。

【００４１】市販ヘマトポルフィリン0.1022ｇ（ヘマト
ポルフィリン基準で0.1707mmol）、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｈ
ｉｓ−ＯＭｅ 0.2966ｇ(0.7962mmol)をシュレンクに採
取し、30％臭化水素酢酸溶液1.0ml を加えると、発泡し
ながら溶解し、紫色溶液となった。トリフルオロ酢酸1.
0ml を加え、室温で24時間かき混ぜた。溶媒を真空留去
し、実施例３と同様に処理すると、Ｐｏｒ（Ｃｙｓ−Ｈ
ｉｓ−ＯＭｅ）₂を得た。収量0.0808ｇ。

【００４２】比較例１Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭ
ｅと市販ヘマトポルフィリンのカップリングによる置換
ポルフィリン、Ｐｏｒ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）₂の
合成［臭化水素−酢酸法（ｉ）］以下の操作は、すべてアル
ゴン雰囲気下で行った。

【００４３】シュレンクに市販ヘマトポルフィリン50m
g、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ100mg を採取し、3
0％臭化水素酢酸溶液1.0ml を加えると発泡しつつ溶解
し、粘性のある濃紫溶液となった。室温で３時間かき混
ぜた後、酢酸および臭化水素を真空留去すると紫色アモ
ルファス状の固体が得られた。１Ｎ水酸化ナトリウム４
ｍｌを加えて溶解し、５Ｎ塩酸を沈澱が生じるまで加え
た。沈澱を濾過して結晶（Ａ）と濾液（Ｂ）に分離し
た。結晶部7.8mg 。

【００４４】結晶部（Ａ）を蒸留水10ml、メタノール10
mlで洗浄し真空乾燥した。この結晶をＤＭＳＯ−ｄ₆を
溶媒として¹Ｈ−ＮＭＲ測定したところ、δ＝10.2ppm
付近にポルフィリンメソプロトンが観測されるものの、
δ＝４〜５ppm 付近にはペプチド由来のαプロトンが観
測されなかった。この結果から、この粗生成物中にはカ
ップリング生成物が含まれていないことが認められた。

【００４５】濾液部（Ｂ）は、溶媒を留去後クロロホル
ム10mlで２回洗浄し、溶媒を真空留去した。茶褐色のア
モルファスが得られた。収量63.8mg。この粗生成物をＤ
ＭＳＯ−ｄ₆を溶媒として¹Ｈ−ＮＭＲ測定したとこ
ろ、δ＝６ppm 付近のポルフィリンとペプチドのカップ
リングを示すプロトンは観測されなかった。さらにδ＝
10ppm 付近のポルフィリンのメソプロトンも観測されな
かった。シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行って
目的物の単離を試みたが、得られなかった。

【００４６】比較例２市販ヘマトポルフィリンとＢｏ
ｃ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅのカップリングによる置換
ポルフィリン、Ｐｏｒ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）₂の
合成［臭化水素−酢酸法（ii）］以下の操作はすべてアルゴ
ン雰囲気下で行った。

【００４７】シュレンクに市販ヘマトポルフィリン75.1
mg（ヘマトポルフィリン基準で0.1254mmol）、Ｂｏｃ−
Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ 130mg(0.3490mmol) を採取
し、30％臭化水素酢酸溶液2.0ml を加えると、発泡し、
粘性のある黒紫溶液となった。室温で４日間かき混ぜた
後、溶媒および臭化水素を真空留去した。黒紫アモルフ
ァスの粗生成物を得た。これを酢酸50mlに溶かし、蒸留
水を加えて500ml とし、イオン交換カラムで精製した。
溶離液を集め、真空留去し、¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−
ｄ₆）測定すると、組成物であることが認められ、δ＝
６ppm 付近にはポルフィリンとペプチドのシステイン基
のカップリングを示すピークは観測されなかった。

【００４８】比較例１および２の結果から、モーガン(M
organ)がシステインとポルフィリンのカップリングにお
いて成功している臭化水素−酢酸法はシステイン含有ペ
プチドとポルフィリンのカップリングには不適であるこ
とがわかった。

【００４９】比較例３Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＡｇ）−Ｈ
ｉｓ−ＯＭｅと２α，４α−ジブロモメソポルフィリン
（５）のカップリングによる置換ポルフィリン、Ｐｏｒ
（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）₂の合成（ａ）２α，４α−ジブロモメソポルフィリン（５）
の合成プロトポルフィリン（２） 0.1026ｇ(0.1782mmol)に30
％臭化水素酢酸溶液2.0ml を加え、２日間40℃でかき混
ぜた。臭化水素、酢酸を真空留去し、約２mlの酢酸を加
え、さらに真空留去した。この操作を３回繰り返して粗
２α，４α−ジブロモメソポルフィリンを得た。収量10
7.9mg 。収率83.6％。

【００５０】（ｂ）カップリング（ａ）の粗ジブロムポルフィリンをジメチルフォルムア
ミド（ＤＭＦ）１mlに溶かすと茶褐色溶液となった。不
溶物を濾別後、濾液にＢｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＡｇ）−Ｈｉ
ｓ−ＯＭｅ 30mg(62.6 μmol)を加え、室温で２日間か
き混ぜた。反応混合物は茶褐色溶液であり、反応中の色
相の変化や沈澱の生成は認められなかった。ＤＭＦを真
空留去し、粗生成物をセファデックスカラムを通して精
製を試みたが、単離はできなかった。混合物の¹Ｈ−Ｎ
ＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）を測定した。δ＝6.0ppmにシス
テインの硫黄原子と結合するメソポルフィリン側鎖のプ
ロトンと推察されるピーク、δ＝7.3 〜9.3ppmにヒスチ
ジンのアミドプロトンとイミダゾ−ルリングのプロトン
と推察されるピーク、δ＝10.3〜10.7ppm にポルフィリ
ンのメソプロトンが確認されたが積分比は一致しなかっ
た。一部カップリング反応が進行しているとも考えられ
るが、純粋な試料が得られないため、目的物が生成して
いる確認はできなかった。

【００５１】試験例２Ｐｏｒ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭ
ｅ）₂の鉄錯体であるＨｅｍｅ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭ
ｅ）₂の合成空気酸化まではアルゴン雰囲気下で行い、溶媒はすべて
脱気して用いた。

【００５２】Ｐｏｒ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）₂ 1
9.4mg(17.5 μmol)に酢酸５mlを加え、攪拌し、溶解さ
せた。これに硫酸鉄（II）と塩化ナトリウムの混合水溶
液0.6ml ［硫酸鉄（II）63.7mg(229.1μmol)、塩化ナト
リウム4.2mg(71.86 μmol)を含む］を加えた。こうして
得た混合溶液を60℃で２時間かき混ぜた。室温まで放冷
後、反応混合物をビーカーに注ぎ、１時間空気酸化し
た。蒸留水100ml を加え、エチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウム塩（ＥＤＴＡ）78.9mg(212.0μmol)を加え、溶
解させた。これをイオン交換カラムに通じ、10％酢酸で
過剰のＥＤＴＡ−鉄錯体を溶離後、蒸留水100ml で洗
浄、２Ｍアンモニア水で溶離した。溶離液を真空留去し
て目的物である、Ｈｅｍｅ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）
₂を得た。収率73.14 ％。

【００５３】試験例３Ｈｅｍｅ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｏ
Ｍｅ）₂の物性測定（ａ）吸収スペクトル（pH＝７）イオン交換カラムで精製直後の吸収スペクトルを測定し
た。

【００５４】試料3.0mg を10ｍｌのメスフラスコに採取
し、蒸留水で10mlにメスアップした（pH＝7.0 ）。この
溶液約1.0ml を１mmのセルに採取し、吸収スペクトルを
測定した。ソ−レ帯の吸収極大が404.4nm に、Ｑ帯の吸
収極大が522.4nm に観測された。

【００５５】（ｂ）吸収スペクトル（pH依存性、pH＝
１およびpH＝10） pH＝10およびpH＝１で、さらにpH＝１をpH＝10とした溶
液について吸収スペクトルを測定した。

【００５６】試料1.5mg を採取し、10mlメスフラスコ中
で蒸留水で10mlに希釈した。これをホ−ルピペットで１
ml採取し、メスフラスコ中で蒸留水で10mlに希釈した。
この濃度で次の３つの条件で測定した。

【００５７】１）１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でpH＝
10に調製し、吸収スペクトルを測定２）１Ｍ塩酸でpH＝１に調製し、吸収スペクトルを測
定３）１Ｍ塩酸でpH＝１に調製した後、１Ｍ水酸化ナト
リウム水溶液でpH＝10として吸収スペクトルを測定得られた吸収スペクトルを図１に示した。このスペクト
ルから、以下の知見が得られた。

【００５８】イ） pH＝10での吸収スペクトルは、ミト
ラ(Mitra) 等が報告している天然チトクロムＣの加水分
解で得られたＭＰ−11の低スピンモノヒドロキソモノヒ
スチジンタイプ（pH＝9.8 ）の吸収スペクトルと一致し
ている。

【００５９】ロ） pH＝１での吸収スペクトルは、ＭＰ
−11の高スピンモノアクアモノヒスチジンタイプ（pH＝
4.6 ）の吸収スペクトルと一致している。

【００６０】ハ） pH＝１からpH＝10に変化させた際の
吸収スペクトルは完全な平衡を示さず、この点で非可逆
的である。

【００６１】以上より、本発明の製造方法により得られ
たペプチド置換ポルフィリンは、天然型チトクロムＣモ
デルときわめて類似した吸収スペクトルを示し、水分子
を介してアクアタイプとヒドロキソタイプの２つのタイ
プを取り得ることが示された。

【００６２】（ｃ）吸収スペクトル（酸化還元による
スペクトルの変化）アルゴン雰囲気下、pH＝10で試料をソジウムジチオナイ
トで還元して吸収スペクトルを測定した。また、一度還
元したものをフェリシアン化カリウムで酸化して吸収ス
ペクトルを測定した。

【００６３】試料1.5mg をメスフラスコ中で蒸留水で10
mlに希釈した。これをホ−ルピペットで１ml採取し、メ
スフラスコ中で蒸留水で希釈して10mlとした。この溶液
の約４mlを10mmのセルに採取し、約10分間アルゴンガス
を通じ、すばやく少量のソジウムチオナイトを加えて密
封し、吸収スペクトルを測定した。測定終了後、0.01Ｍ
フェリシアン化カリウム数滴を加え、アルゴンを通じて
密封し、吸収スペクトルを測定した。

【００６４】ソジウムチオナイト還元によって測定した
Ｆｅ（II）Ｈｅｍｅ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）₂およ
び、これをフェリシアン化カリウム酸化して測定したＦ
ｅ(III) Ｈｅｍｅ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）₂の吸収
スペクトルを図２に示した。

【００６５】アルゴン下でpH＝10の高スピンヒドロキソ
Ｆｅ(III) Ｈｅｍｅ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）₂を還
元すると、Ｑ帯に特徴的な２つの極大（α，β）を有す
る、６配位低スピンタイプのＦｅ（II）Ｈｅｍｅ（Ｃｙ
ｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）₂の吸収スペクトルを示した。さ
らに、この還元種を酸化したところ、酸化型６配位低ス
ピンタイプに特有のＦｅ (III)Ｈｅｍｅ（Ｃｙｓ−Ｈｉ
ｓ−ＯＭｅ）₂の吸収スペクトルを示した。また、還元
型の吸収極大α，βは天然型チトクロムおよびＭＰ−11
のそれぞれの吸収極大α(552nm) 、β（522nm)と一致し
た。これらの事実から、本発明の製造方法により得られ
たペプチド置換ポルフィリンは、天然型チトクロムＣと
同様の酸化還元挙動を示し得ることが認められた。

【００６６】（ｄ）酸化還元電位Ｆｅ（II）Ｈｅｍｅ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）₂のサ
イクリックボルタメトリ−（ＣＶ）および微分パルスポ
ーラログラフィー（ＤＰＰ）を測定した。条件、方法は
以下の通りである。

【００６７】（測定方法）小型電気化学用セルに、試料
0.1 ｇを採取し、水酸化ナトリウムでpH＝10に調製した
0.1 Ｍテトラエチルアンモニウム過塩素酸塩（ＴＥＡ
Ｐ）水溶液１mlを加え、３０分間アルゴンを通じた。こ
れにソジウムチオナイト30mgを加え、さらに10分間アル
ゴンを通じた後ＣＶおよびＤＤＰを測定した。

【００６８】（測定条件）参照電極：Ａｇ−ＡｇＣｌ掃引速度：ＣＶ 50mV/sec、ＤＰＰ５mV/sec 得られたＣＶおよびＤＰＰを図３に示した。

【００６９】図３に示したように、Ｆｅ（II）Ｈｅｍｅ
（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）₂のＣＶは、ほぼ可逆波で
あった。また、ＤＰＰでは掃引方向を逆にしても対応す
る同様のピークが観察された。これよりＦｅ（II）／Ｆ
ｅ(III) は可逆であることが確認された。その酸化還元
電位はｖｓ．Ａｇ−ＡｇＣｌで−0.353 Ｖ（標準水素電
極（ＮＨＥ）換算で−0.154 Ｖ）であった。以上の事実
から、本発明の製造方法によって得られた化合物は天然
型チトクロムＣと比較して酸化還元電位が若干高い（天
然型チトクロムＣで−0.2 〜−0.3 Ｖｖｓ．ＮＨＥと
報告されている）ものの、類似の可逆的酸化還元能を有
することが示された。

【００７０】

【発明の効果】本発明の製造方法は、所望のシステイン
含有ペプチド置換ポルフィリンを簡便に、好収率で製造
できるものであり、産業上、極めて有用なものである。

【００７１】また、本発明の新規なペプチド塩であるＢ
ｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＡｇ）−Ｈｉｓ−ＯＭｅはシステイン
含有ペプチド置換ポルフィリンの原料となるシステイン
含有ペプチドＢｏｃ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅを容易か
つ効率的に製造するための先駆体となるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の製造方法により得られたペプチド置換
ポルフィリンの１例に由来する鉄錯体Ｈｅｍｅ（Ｃｙｓ
−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）₂の吸収スペクトルを示すグラフ

【図２】前記鉄錯体Ｈｅｍｅ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭ
ｅ）₂の酸化型および還元型の吸収スペクトルを示すグ
ラフ

【図３】前記鉄錯体の１種であるＦｅ(II)Ｈｅｍｅ（Ｃ
ｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅ）₂のサイクリックボルタメトリ
ー（ＣＶ）および微分パルスポーラログラフィー（ＤＰ
Ｐ）を示すグラフ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（１）で表されるヘマトポルフィリン
と、式（２）で表されるプロトポルフィンと、これらの
混合物とからなる群より選ばれた物質を臭化水素酸−超
強酸溶液中でシステイン含有ペプチドと反応させること
からなる式（３）（ただし、式中Ｒはアミノ基の遊離し
たシステインを含有するペプチドである）で表されるペ
プチド置換ポルフィリンの製造方法。【化１】
【請求項２】前記超強酸が、トリフルオロメチル基を
有するカルボン酸と、トリフルオロメチル基を有するカ
ルボン酸無水物と、トリフルオロメチル基を有するスル
ホン酸とからなる群より選ばれたものであることを特徴
とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】前記超強酸が、トリフルオロメタンスル
ホン酸と、トリフルオロ酢酸と、トリフルオロ無水酢酸
とからなる群より選ばれたものであることを特徴とする
請求項２記載の製造方法。
【請求項４】前記システイン含有ペプチドがＢｏｃ−
Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅで表されるものであり、前記ペ
プチド置換ポルフィリンがＰｏｒ（Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｏ
Ｍｅ）₂で表されるものであることを特徴とする請求項
１記載の製造方法（ただし、Ｂｏｃはターシャリブチル
オキシカルボニル基、Ｃｙｓはシステイン基、Ｈｉｓは
ヒスチジン基、ＯＭｅはメトキシ基、Ｐｏｒはポルフィ
リン骨格を示す）。
【請求項５】前記Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅで
表されるシステイン含有ペプチドをＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｓ
Ａｇ）−Ｈｉｓ−ＯＭｅで表されるペプチド塩から製造
することを特徴とする請求項４記載の製造方法（ただ
し、Ｂｏｃはターシャリブチルオキシカルボニル基、Ｃ
ｙｓはシステイン基、Ｈｉｓはヒスチジン基、ＯＭｅは
メトキシ基、ＳＡｇはシステインのＳＨ基が銀塩である
ことを示す）。
【請求項６】Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＡｇ）−Ｈｉｓ−Ｏ
Ｍｅで表されるペプチド塩に硫化水素を混合して硫化銀
を形成し、この硫化銀を除去することからなるＢｏｃ−
Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−ＯＭｅで表されるシステイン含有ペプ
チドの製造方法（ただし、Ｂｏｃはターシャリブチルオ
キシカルボニル基、Ｃｙｓはシステイン基、Ｈｉｓはヒ
スチジン基、ＯＭｅはメトキシ基、ＳＡｇはシステイン
のＳＨ基が銀塩であることを示す）。
【請求項７】Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＡｇ）−Ｈｉｓ−Ｏ
Ｍｅで表されるペプチド塩（ただし、Ｂｏｃはターシャ
リブチルオキシカルボニル基、Ｃｙｓはシステイン基、
Ｈｉｓはヒスチジン基、ＯＭｅはメトキシ基、ＳＡｇは
システインのＳＨ基が銀塩であることを示す）。
【請求項８】請求項１記載の製造方法により製造され
たペプチド置換ポルフィリン。