JPH05249113A

JPH05249113A - 分離・分析方法及び装置

Info

Publication number: JPH05249113A
Application number: JP4306014A
Authority: JP
Inventors: Ramadan A Abuknesha; アービーアブクネシャーラマダーン
Original assignee: G II C MAAKONI Ltd; GEC Marconi Ltd; Marconi Co Ltd
Current assignee: G II C MAAKONI Ltd; BAE Systems Electronics Ltd
Priority date: 1991-10-18
Filing date: 1992-10-19
Publication date: 1993-09-28
Also published as: GB9122180D0; DE69232902D1; DE69232902T2; US6225043B1; EP0538053A1; GB9221578D0; GB2260609B; EP0538053B1; GB2260609A; ATE231615T1

Abstract

(57)【要約】【目的】免疫学的検出に使用できる分離方法、検出方
法、検出器及び試験器具の提供。【構成】被分析種を検出する免疫検定法に好適な、一
次種の分離方法であり、第１の補助種を使用して、これ
を第２の補助種にし、この第２の補助種を第３の種と相
互作用させて、分離を促進する。また、免疫検定による
被分析種の検出方法、免疫センサー及び試験器具も提供
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は免疫学的検査等に適用できる分離
方法、検出方法、検出器、試験器具に関する。

【０００２】

【発明の要約】本発明の一態様によれば、一次種の分離
方法であって、被分析種を検出する免疫検定方法に好適
で、そして第１の補助的種を使用して、これを第２の補
助種にし、この第２の補助種を第３の種と相互作用させ
て、分離を促進できる方法を提供できる。

【０００３】本発明の一の実施例では、この分離方法は
第１の補助種から第２の補助種を生成する工程、この第
２の補助種と第３の種を反応させて分離を促進する工程
を含む。

【０００４】本発明の別な態様によれば、免疫検定によ
り被分析種を検出する方法であって、一次種を分離する
分離方法を含むを方法を提供できる。この分離方法で
は、第１の補助種を使用して、これを第２の補助種に
し、この第２の補助種を第３の種と相互作用させて、分
離を促進できる。

【０００５】本発明の別な実施例では、この免疫検定に
よる被分析種の検出方法は一次免疫反応を起こしてか
ら、第１の補助種を第２の補助種にし、この第２の補助
種を第３の種と反応させて、免疫検定の分離工程を促進
する。

【０００６】本発明の第三態様によれば、免疫学的検出
により被分析種を検出するのに好適な検出器を提供でき
る。この検出器の構成は、一次種を分離する分離方法、
あるいは一次種を分離する分離方法を含む検出方法を実
施できるようになっている。既に述べたように、後者の
検出方法では、第１の補助種を第２の補助種にし、この
第２の補助種を第３の種と反応させて、分離工程を促進
できる。

【０００７】本発明の第四態様によれば、一次種を分離
する分離方法を含む検出方法を実施する試験器具を提供
できる。本発明によれば、この試験器具は第１の補助種
を使用して、これを第２の補助種にし、この第２の補助
種を第３の種と相互作用させて、分離を行うことができ
る。

【０００８】第２の補助種は、例えば、配位子であれば
よい。第２の補助種が配位子の場合、第３の種は、例え
ば、配位子に対する結合体種であればよい。

【０００９】第１及び第２の補助種が“補助的”である
のは、これら種がいずれも一次免疫反応に関与しないと
いう意味においてである。従って、第１及び第２の補助
種は一次種ではないと考えることができる。なお、本発
明において、一次種とは、一次免疫反応に関与すること
ができる種である。

【００１０】一例として、一次免疫反応（一次免疫結合
反応と記述することもできる）は、被分析種が特異的な
結合反応を受けるか、あるいは（定義は後述する）真正
な被分析種が特異的な結合反応を受けるか、あるいは被
分析種及び真正な被分析種が共に特異的な結合反応を受
ける反応である。（なお、被分析種及び真正な被分析種
が特異的な結合反応するのは他の種であって、相互反応
ではない。）

【００１１】一例として、一次種は一次抗体か配位子
（例えば抗原）であればよい。なお、例えば、一次種は
被分析種に対する抗体でもよく、あるいは真正な被分析
種に対する抗体でもよい。即ち、ある所定の免疫検定の
場合、被分析種に対する抗体及び真正な被分析種に対す
る抗体は同じ抗体である。

【００１２】またなお、一次種は、例えば、被分析種か
真正な被分析種であればよい。

【００１３】一例として、一次免疫反応に関与しない種
を第３の種として選択することは可能である。換言すれ
ば、このような第３の種は第３の補助種として考えるこ
とができる。例えば、（後述するように）、第３の補助
種である第３の種を一次種に結びつけてもよく、あるい
は（後述するように）支持物質に支持してもよい。

【００１４】あるいは、一例ではあるが、第３の種を選
択して、第２の補助種と相互作用する種となる部分をも
つようにしてもよく、そして一次種に対する結合体であ
る一次種となる部分をもつようにしてもよい。このよう
な第３の種の例は１価以上の抗体（例えば２価抗体）で
ある。なお、例えば、第３の種が第２の補助種と相互作
用する種となる部分をもつ場合、当該部分が、それが第
２の補助種と相互作用することができる点で“補助的
価”をもつ考えることができる。なお、例えば、第３の
種が補助的価をもち、そしてそれ自体が一次種となる部
分をもつ場合には、第３の種が、それが一次種となる部
分をもつ点で一次種として考えることができる。

【００１５】また、第３の種が第２の補助種に対する抗
体の場合には、第３の種は、例えば、“抗第２補助種
剤”であると考えることができる。

【００１６】第１の補助種は、例えば、第２の補助種の
前駆体とみなすことができる。例えば、第１の補助種は
化学的合成により第２の補助種にすることができる。あ
るいは、一例としてではあるが、第１の補助種は第２の
補助種と本質的に同じであってもよい。ただし、第１の
補助種は第２の補助種の第３の種と相互作用（例えば、
反応）できる能力を妨害する“遮断独立体”を備えてい
る。遮断独立体を外すと、（即ち、第２の補助的独立体
を取り除くと）、第１の補助種が第２の補助種になり、
次にこれを第３の種と相互作用（例えば、反応）させる
ことができる。

【００１７】なお、遮断独立体の取り外しは、“マスク
された”補助種のマスクを外すことと、あるいは補助種
の相互作用（例えば、反応）能力を“スイッチ・オン”
することと同義であると考えてもよい。

【００１８】また、一例としてではあるが、本発明に従
い適当な構造変化を利用して、第１の補助種から第２の
補助種を得ることもできる。

【００１９】また、一例としてではあるが、本発明の場
合、第１及び第２の補助種を与えるのに好適なものは、
配位子として作用でき、かつ一つ以上の形又は構造で存
在できる任意の物質（例えば、有機物質）である。

【００２０】従って、また一例としてではあるが、配位
子である第２の補助種を得るためには、当該配位子を形
成できる好適な第１の補助種（前配位子と考えることが
できる）を利用することもできる。

【００２１】例えば、第２の補助種として抗原配位子
（例えば、ハプテン）を選択してもよく、そしてこの配
位子に対する（単クローン性か多クローン性のいずれか
である）抗体を（例えば、従来から公知の適当な方法
で）育成してもよい。この場合、これら抗体は第２の補
助種と反応する第３の種を生成する結合体種である。

【００２２】化学的手段や生化学的手段（例えば、酵素
手段）等の適当な手段によって第１の補助的手段から第
２の補助種を生成することができる。

【００２３】なお、第１の補助種からの第２の補助種の
生成は適当な方法により達成できる（即ち、補助種の相
互作用能力のスッチング・オンは適当な方法により実施
できる。）。このためには、例えば、第１の補助種に加
えるか、第１の補助種からなにかを除くか、あるいは第
１の補助種の配位子（例えば、抗原決定基）を（例え
ば、立体配座変化）にさらすか等によればよい。

【００２４】好ましくは、第１の補助種の第３の種に対
する親和力を第２の補助種と第３の種との間の親和力よ
りもかなり小さく（例えば、３倍以下、好ましくは１％
以下に）する。

【００２５】第１の補助種はその保存及び使用条件下で
十分な安定性をもつように選択する。

【００２６】本発明の場合、第２の補助種及び第３の種
は、例えば任意の適当な配位子−結合体種対であればよ
く、この場合、配位子が第２の補助種であり、結合体種
が第３の種である。配位子−結合体種対の例には、抗原
−抗体対、非抗原配位子−結合体種対や補助因子−蛋白
質対がある。

【００２７】一例としてではあるが、第２の補助種とし
て任意の適当な配位子が使用できる。これら配位子の例
には、（ハプタン等の）抗原配位子や非抗原配位子があ
る。

【００２８】抗原配位子の例には、２，４−ジニトロフ
ェノール、フルオレセイン、ジギトキシン、クマリンや
シバクロンブルーがある。非抗原配位子の例には、特異
的配位子−結合体種対の配位子（例えば、特異的配位子
−結合体種対ビオチン−アビジンの場合における配位子
ビオチン）がある。

【００２９】一例としてではあるが、第３の種としては
任意の適当な結合体種を使用することができる。即ち、
結合体種は、例えば、結合蛋白質（例えば、抗体や配位
子の結合パートナー）であればよい。

【００３０】従って、例えば、第２の補助種が抗原配位
子の場合、結合体種は配位子に対する抗体であればよ
い。

【００３１】従って、例えば、第２の補助種が２，４−
ジニトロフェノール、フルオレセイン、ジギトキシン、
クマリンやシバクロンブルーの場合、結合体種はそれぞ
れ抗−２，４−ジギトキシン抗体、抗−フルオレセイン
抗体、抗−ジギトキシン抗体、抗−クマリン抗体や抗−
シバクロンブル−抗体である。

【００３２】例えば、第２の補助種が非抗原配位子の場
合、配位子については、例えば、結合体種が非免疫グロ
ブリン（例えば、天然蛋白質）である結合パートナーに
なるようなものであればよい。即ち、結合パートナーは
配位子の結合体と考えることができる。このような結合
パートナーの例はビオチン−アビジン錯体からなる特異
的配位子−結合体種対におけるアビジンである。

【００３３】従って、本発明による分離方法では、例え
ば、２，４−ジニトロフェノール／抗−ジニトロフェノ
ール抗体、フルオレセイン／抗−フルオレセイン抗体、
ジギトキシン／抗−ジギトキシン抗体、クマリン／抗−
クマリン抗体、シバクロンブルー／抗−シバクロンブル
ー抗体やビオチン／アビジン錯体からなる分離系を利用
する。

【００３４】前述したように、任意の適当な方法で第１
の補助種から第２の補助種を生成することができる。例
えば、第１の補助種は酵素基質（例えば、ヒドラーゼに
対する基質）であればよく、これ基質は酵素により第２
の補助種として振る舞うことのできる成分や生成物フラ
グメントに変換することができる。酵素基質及び酵素作
用により生成した成分は、例えば、構造変化させて、第
３の種とは親和力が大きく異なるように配位してもよ
い。

【００３５】酵素／酵素基質系に使用するのに好適な酵
素の例には、ガラクトシダーゼ、グルコシーダーゼやホ
スファターゼがあり、具体例にそくしていえば、ガラク
トシル−７−ヒドロキシクマリンはガラクトース＋７−
ヒドロキシクマリンに、グルコシル−７−ヒドロキシク
マリンはグルコース＋７−ヒドロキシクマリンに、ホス
フェート＋７−ヒドロキシクマリンはホスフェート＋７
−ヒドロキシクマリンにすることができる。さらにいえ
ば、（例えば、ニトロフェノール誘導体の転換により）
ニトロフェノールを生成する酵素／酵素基質系も使用す
ることができる。この例では、酵素基質が（配位子前駆
体である）第１の補助種を構成し、そして配位子７−ヒ
ドロキシクマリン及びニトロフェノールが第２の補助種
を構成する。

【００３６】さらに例示すれば、本発明の場合、第１及
び第２の補助種は、補助因子Ｉ→補助因子ＩＩ等の補助
因子系を使用しても得ることができる。このように、例
えば、ＮＡＤ→ＮＡＤＨやＮＡＤＰ→ＮＡＤも使用する
ことができる。

【００３７】また例示としてではあるが、本発明の場
合、第１及び第２の補助種を得るために、還元クロマト
フォア染料や酸化クロマトフォア染料も使用することが
できる。

【００３８】また、第１及び第２の補助種を得るために
使用することができる系の例には、光分解が影響するこ
とがある紫外光（ＵＶ）感受性物質や、キレート化剤／
キレート−金属錯体がある。

【００３９】一例としてではあるが、本発明の場合、免
疫学的手法により使用する任意の所望補助種は適宜支持
物質に担持することもできる。例えば、所望ならば、第
１の、あるいは第２の、あるいは第３の補助種を支持物
質に支持することができる。一例としてではあるが、支
持物質それ自体に第１の、あるいは第２の補助種を担持
してもよく、あるいは支持体を直接間接をとわず、第１
の、あるいは第２の、あるいは第３の種に結合しておい
てもよい。

【００４０】このように、本開示で“支持物質に担持す
る”という表現を第１、第２、あるいは第３の補助種に
関連して使用する場合、支持物質それ自体が第１、ある
いは第２の補助種を担持する場合も、そして支持物質
に、直接間接を問わず、第１、第２、あるいは第３の補
助種を結合（固定化）しておく場合も含む。したがっ
て、第１、あるいは第２の補助種は化学的群又は単位の
支持物質によって与えてもよく、あるいは例えば（共有
結合や吸着等によって）支持物質に第１、第２、あるい
は第３の補助種を結合してもよい。支持物質が、例え
ば、ポリマーの場合、このポリマーの単位は第１、ある
いは第２の補助種として振る舞う。また例示としてでは
あるが、支持物質に存在するポリスチレンや変性シリカ
等の表面基も第１、あるいは第２の補助種として振る舞
うことがある。

【００４１】例示としてではあるが、所望ならば、支持
物質によってオリゴマー又はポリマーの第１、第２ある
いは第３の補助種を与えることもできる。

【００４２】第１、第２あるいは第３の補助種を支持物
質に結合する場合、支持物質に直接結合してもよく、あ
るいは他の種（例えば、担体物質）を介して間接的に支
持物質に結合してもよい。

【００４３】本発明の一つの実施例によれば、第１、第
２あるいは第３の補助種を支持物質に直接かあるいは間
接に結合する工程を含む方法も提供できる。

【００４４】またこれも例示としてではあるが、支持物
質の表面を活性化し、これによって第１、第２あるいは
第３の補助種を結合することもできる。例えば、好適な
支持物質の表面を化学的処理によって活性化し、遊離ア
ミノ基を生成し、これに第１、第２あるいは第３の補助
種を結合することもできる。

【００４５】さらにまた例示としてではあるが、（前述
のようにして生成した）遊離アミノ基に第１、第２ある
いは第３の補助種を結合するかわりに、オリゴマー又は
ポリマーの第１、第２あるいは第３の補助種を支持物質
に直接間接をとわず結合することもできる。

【００４６】上述してように、例えば、オリゴマー又は
ポリマーの第１、第２あるいは第３の補助種を（例え
ば、遊離アミノ基を介して）支持物質に結合することが
できる。

【００４７】また例示としてはあるが、第１、第２ある
いは第３の補助種を別な種（例えば、担体蛋白質やポリ
マー等）に（共有結合やそのたの結合手段により）結合
することができ、またこの別な種を適当な手段（例え
ば、吸着、共有結合等により、あるいは別な配位子−結
合体対を使用する等）によって支持物質に結合して、第
１、第２あるいは第３の補助種を支持物質に間接に担持
してもよい。

【００４８】同様に例示としてではあるが、支持物質に
単独の第１、第２あるいは第３の補助種を間接に結合す
るかわりに、オリゴマーやポリマーのこれら複数の種を
別な種（例えば、担体蛋白質やポリマー等）に（共有結
合やそのたの結合手段により）結合することができ、ま
たこの別な種を適当な手段（例えば、吸着、共有結合等
により、あるいは別な配位子−結合体対を使用する等）
によって支持物質に結合して、第１、第２あるいは第３
の補助種を支持物質に間接に担持してもよい。

【００４９】なお、第２の補助種を最初に支持物質に担
持する場合には、この第２の補助種を処理して、本発明
に使用できる第１の補助種に転換することもできる。

【００５０】本発明に使用できる（例えば、第１、第２
あるいは第３の補助種に直接間接に結合しておくことが
できる）支持物質を例示すれば、反応器壁等の固相物
質、（粒状形を取ることもできる）不溶性多糖類、（粒
状ミクロセルロース等の）微粒子、酸化鉄を取り込んだ
不溶性多糖類（例えば、磁化できる微粒子状物質等の磁
化性粒子）、（例えば、ビーズ、チューブ、ウエル、微
滴定プレート、ディスク、あるいは浸漬スティック等の
を形をとる）ポリスチレン、（Ｓｅｐｈａｄｅｘ等の）
架橋デキストラン、不溶性ポリマー構造体、（例えば、
免疫センサー装置等の）ガラス表面、（例えば、化学的
機能の付与されたシリル基をもつ）誘導体合成シリカ表
面、（例えば、オプチカルファイバー表面等のガラス表
面等の）適当な表面に結合した可溶性ポリマー、ナイロ
ンやポリアミド等である。また、支持物質は反応器表面
でもよい。

【００５１】以上から理解できるように、支持物質は、
例えば、酵素基質、酵素補助因子、紫外線感受性独立
体、あるいはキレート化剤からなる第１の補助種に金
属、金属キレート化合物、あるいは還元クロマトフォア
染料を与えるものであり、この第１の補助種はそれぞれ
酵素処理、紫外線照射処理、金属イオン処や酸化条件処
理すると、第３の種と反応できる第２の補助種を与える
ことができる。

【００５２】本発明は任意の適当なサンプル中の被分析
種の検出に使用できる。本発明の場合、被分析種を含む
サンプルは水、土壌、生物種（例えば、植物や動物）や
空気等である。本発明により被分析種を検出することが
できる生物学的サンプルは血液、血漿、血清、尿、唾
液、乳汁等である。被分析種は、例えば、水、水溶液や
抽出液等に存在しているものでもよい。また例えば、被
分析種は（ハプテン等の）配位子や（抗体等の）結合体
でもよい。

【００５３】本発明により検出することができる被分析
種を以下に例示する。（ａ）（例えば、血液サンプル、血清サンプル、唾液サ
ンプル、尿サンプルや乳汁サンプルに含まれている）プ
ロゲステロン、１７−α−ヒドロキシプロゲステロンや
エストラジオール等のステロイドホルモン、（ｂ）（チ
ロキシンやトリヨードチロニン等の）甲状腺ホルモン、
（ｃ）（固体抽出物や液体抽出物等の）抽出物中のステ
ロイド類、（ｄ）例えば、血液サンプル、血清サンプ
ル、唾液サンプルや尿サンプル等に含まれている（フェ
ノバルビタール等の常習薬等の）薬剤や（ダイオキシン
等の）治療薬、（ｅ）例えば、血液サンプルや尿サンプ
ル等に含まれている（ｈＣＧ等の）ポリペプチドホルモ
ン、（ｆ）（例えば、血液サンプルや血清サンプル等に
含まれている）マーカー蛋白質等の腫瘍マーカー、
（ｇ）蛋白質抗原、（ｈ）（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、（ＩｇＧ等の）免疫グロブリン、酵素マーカーや受
容体）、（ｉ）組織疾患や臓器疾患等のマーカー蛋白
質、（ｊ）（例えば、水や土壌に含まれている）殺虫剤
や除草剤、（ｋ）（飼料や食品から抽出される毒物等
の）毒物、（ｌ）（ウィルスや細菌等の）微生物、及び
（ｍ）微生物に対する抗体。

【００５４】本発明により検出することができる被分析
種の例にはまた金属錯体がある。

【００５５】このように、本発明は、例えば、（環境中
に存在している場合生物学的にみて）有毒とみなすこと
ができる強金属錯体等の金属の錯体の検出に適用するこ
とができる。

【００５６】本発明により検出することができる金属錯
体の例はメチル水銀である。

【００５７】さらに例示としてではあるが、本発明の場
合、（キレート化剤等の）錯化剤を使用して金属イオン
を金属の錯体にすると、生成したこの錯体を被分析種に
することができる。従って、例えば、本発明は金属イオ
ンの検出に適用することができる。

【００５８】なお、本発明により金属錯体を検出しよう
とする場合には、例えば、この金属錯体に対して抗体を
使用することができる。

【００５９】同様に、本発明は被分析種の定量・定性分
析・検出（測定・同定）にも適用することができる。

【００６０】同様に例示としてではあるが、本発明は、
（標識種でもある）トレーサー種の結合及び非結合画分
の分離が必要な任意の免疫学的手法やセンサー装置にも
適用することができる。このような手法やセンサーに
は、低分子量や高分子量物質のヘテロジーニアスな抗原
標識化免疫検定やヘテロジーニアスな抗体標識化免疫検
定等の拮抗的免疫検定手法や（抗体による固定化が必要
な高分子量物質や微生物のヘテロジーニアス検定等の）
非拮抗的手法、そして（光信号を発信する光学的検出モ
ード装置や電気信号を発信する電気化学的検出モード装
置等の）あらゆる形式の免疫センサー装置が含まれる。

【００６１】本発明の場合、任意の好適な、検出可能な
種やトレーサー種を使用することができる。

【００６２】これらトレーサー種の例には、（アルカリ
性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼやセイヨウ
ワサビオキシダーゼ等の）酵素類、（フロオレセイン、
クマリンやローダミン等の）蛍光団、化学ルミネッセン
ス化合物、生物発光性化合物、ラジオアイソトープや染
料がある。

【００６３】実質的には、本発明は公知免疫学的手法の
問題を解決するために適用するものである。即ち、例示
としてではあるが、抗原や抗体からなる一次種を使用し
て、これを支持物質に結合し、トレーサー種の結合及び
非結合画分を分離する必要がある、ある種の公知免疫検
定の場合、検定中に支持物質を追加しなければならない
ことが多い。一部の検定の場合、支持物質を手早く取り
扱い、そして追加しなければならないので、これは不利
である。また、自動システムの場合にも、支持物質の使
用には問題がある。さらに、これも一例としていうのだ
が、一次抗体を支持物質に固定化する場合、この一次抗
体と被分析種、あるいはトレーサーやその他の種を伴う
（定義は後述する）真正な被分析種との間の免疫学的反
応の平衡状態、あるいは反応の任意の所望点に達するの
が遅い。即ち、一次免疫反応が平衡点やその他の所望点
に達するのが遅い。

【００６４】同じような問題は、一次免疫反応を行うさ
いに固定化抗原（例えば、固定化した真正な被分析種）
を使用する場合に認められる。

【００６５】本発明の一実施例では、溶液中で平衡点
か、あるいは任意の所望反応点まで一次免疫反応を進め
るため、固定化種が関与していても反応は抑制されな
い。本発明の場合、次に、所定の時点において、支持物
質に担持された第１の補助種から第２の補助種を生成
し、支持物質に結合する。換言すれば、支持物質に担持
された補助種の反応能力をスイッチング・オンするとい
ってもよい。このように、例えば、一次免疫反応に関与
する適当な種を支持物質に結合することができる。

【００６６】第３の種を（一次抗体、又は抗原等の）一
次種に結合する場合、支持物質への結合が生じるのは、
例えば、支持物質上の（第１の補助種から生成した）第
２の補助種が一次種に結合した第３の種と（結合等の）
反応する結果である。また、第１の補助種からの第２の
補助種の生成は支持物質に担持された種の反応能力の
“スイッチング・オン”とみなすことができる。従っ
て、例えば、本発明に従って配位子−結合体対を用い、
このために抗原部位を使用したとすると、本発明は“ス
イッチング可能な”抗原部位を使用するものとみなすこ
とができる。

【００６７】本発明の別な実施例によれば、溶液中で平
衡点か、あるいは任意の所望反応点まで一次免疫反応を
進めるため、固定化種が関与していても反応は抑制され
ない。本発明の場合、次に、所定の時点において、一次
種に結合された第１の補助種から第２の補助種を生成
し、支持物質に結合する。換言すれば、一次種に結合さ
れた補助種の反応能力をスイッチング・オンするといっ
てもよい。このように、例えば、一次免疫反応に関与す
る適当な種を支持物質に結合することができる。

【００６８】第１の補助種を（一次抗体、又は抗原等
の）一次種に結合する場合、支持物質への結合が生じる
のは、例えば、支持物質上の（第１の補助種から生成し
た）第２の補助種が一次種に結合した第３の種と（結合
等の）反応する結果である。また、第１の補助種からの
第２の補助種の生成は支持物質に担持された種の反応能
力の“スイッチング・オン”とみなすことができる。

【００６９】なお、第３の種が一次種の結合体である一
次種になる部分をもたない場合、第３の種が第３の補助
種になり、これを適当な結合によって一次種に結合すれ
ばよい。またなお、第３の種を支持物質に担持する場合
には、第３の種は第３の補助種とみなすことができる。

【００７０】さらに例示としてではあるが、複数の一次
種を第１の単一補助種、あるいはオリゴマー又はポリマ
ーの第１の補助種と結合してもよい。

【００７１】あるいは、さらに例示としてではあるが、
一種の一次種を第１の単一補助種、あるいはオリゴマー
又はポリマーの第１の補助種と結合してもよい。

【００７２】第１の補助種（又はこれから生成した第２
の補助種）、あるいは第３の補助種を任意の適当な連鎖
によって一次種に結合してもよい。このような連鎖に
は、一つ以上の結合連鎖（例えば、一つ以上の共有連
鎖、あるいは吸着等の）一つ以上の非特異的結合連鎖、
あるいは一つ以上の特異的結合連鎖、あるいはこれら連
鎖の任意の組み合わせがある。

【００７３】本発明の場合、一次免疫反応が溶液中で進
行するため、この反応の速度は従来法に比較して速く、
また支持物質が反応中ずっと存在しているため、検定時
に固体物質を加える必要はない。

【００７４】本発明の場合、一次免疫反応が生起するま
で、支持物質への種の結合を遅らせることによって、例
えば、免疫検定手法の速度、感受性及び精度を改善する
ことができる。なお、免疫検定の精度は被分析種をフェ
ムトモルかピコモル単位の濃度まで検出できるような程
度である。

【００７５】酵素標識化免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）と
して知られているある形式の公知検定手法の場合、（ウ
エルか微滴定プレートの表面等の）検定容器の方面を使
用して、検定成分を吸着し、分離工程を実施できるよう
になっている。このような検定手法を使用する培養時間
は２〜２４時間であり、検定合計時間は４〜２４時間で
ある。これら時間は本発明を使用すると短縮できる。従
って、例えば、本発明は酵素標識化免疫吸着検定に使用
することができる。

【００７６】第２の補助種の生成は、例えば、適当な試
薬を加えるか、エネルギーを導入すると実施することが
できる。

【００７７】このように、例えば、第２の補助種は酵
素、化学試薬や、（紫外光源等の）光源等の外部要因に
よって第１の補助種から生成することができる。さらに
例示としてではあるが、第２の補助種を生成するため
に、ｐＨ変化や（例えば、金属イオンを含む）化学溶液
の添加を使用することも可能である。

【００７８】なお、本発明の場合、一次免疫反応の開始
後、所定の時間が経過するまで、分離の開始を遅らせる
ように制御することもできる。

【００７９】またなお、第２の補助種に生成できる第１
の補助種については、支持物質に担持する必要はない。
というのは、免疫検定に関与する任意の選択された種を
支持物質に担持することができるからである。これにつ
いては後述する。

【００８０】本開示で、“真正な被分析種”とは、実質
的に同じ条件下で検出される被分析種の場合と実質的に
同じ方法で反応できる種を意味する。例えば、真正な被
分析種は検出すべき被分析種と実質的に同じ方法で検定
に使用される抗体に結合する（被分析種の誘導体等の）
抗原であればよい。

【００８１】なお特記すれば、真正な被分析種は較正
器、即ち基準としても使用することができる。

【００８２】例示としてではあるが、事情が許すなら、
（標識種としても考えられる）トレーサー種の場合、ト
レーサー種か標識種としてだけでなく、第１の補助種を
第２の補助種にする手段としても使用することができ
る。

【００８３】このように、例えば、事情が許し、かつト
レーサー種か標識種が酵素の場合、この酵素はトレーサ
ー又は標識種として作用するだけでなく、第１の補助種
を第２の補助種に酵素転換するもの（即ち、第１の補助
種から第２の補助種を生成するもの）としても作用す
る。

【００８４】従って、例えば、トレーサー又は標識種は
トレーサー又は標識種を与えるだけでなく、第１の補助
種の相互作用（例えば、反応）能力を“スイッチング・
オン”するためにも使用することができる。

【００８５】例示としてではあるが、ガラクトシダーゼ
（例えば、β−ガラクトシダーゼ）やアルカリ性フォス
ファターゼを使用すると、それぞれガラクトシダーゼク
マリンやフォスフェートクマリンからなる前駆体（即
ち、前配位子）から配位子を生成することができる。

【００８６】以上の説明から理解できるように、第１の
補助種（例えば、前配位子）を少なくとも１種の試薬で
処理すると、他の相互作用（例えば、一次免疫反応）を
起こす少なくとも１種以上の試薬が所望時間反応した後
に、第１の補助種から第２の補助種を生成することがで
きる。

【００８７】ところが、事情が許す場合には、他の相互
作用（例えば、一次免疫反応）を起こす１種以上の試薬
と同時に、第１の補助種から第２の補助種を生成する１
種以上の試薬をすることができる。

【００８８】例えば、第１の補助種（例えば、前配位
子）を支持物質に担持する場合、第１の補助種から第２
の補助種を生成する少なくとも１種以上の試薬（即ち、
第１の補助種の相互作用（例えば、反応）能力を“スイ
ッチング・オン”できる少なくとも１種以上の試薬）
と、他の相互作用（例えば、一次免疫反応）を起こす少
なくとも１種以上の試薬を同時に使用することができ
る。他の相互作用（例えば、一次免疫反応）は溶液中で
生じ（従って反応速度は比較的速い）るが、一方、第１
の補助種が支持物質に結合している理由等により、第１
の補助種からの第２の補助種の生成速度は比較的遅い。
従って、場合によっては、一部の、あるいは殆どの、あ
るいはすべての必要な試薬を同時に結合できる能力を維
持した状態で、比較的速い溶液反応を行ってから、分離
工程を“スイッチング・オン”する利点を享受すること
ができる。

【００８９】以下、本発明を利用した免疫検定法の例に
より本発明をさらに詳しく説明する。（Ａ）例えば、本発明では、次のものを使用する。（ｉ）配位子の前駆体となる支持物質。（ｉｉ）配位子の結合体種（例えば、配位子に対する
抗体）と共役した真正な被分析種。（ｉｉｉ）被分析結合種（例えば、一次抗体）に共役し
た（後述する）トレーサー種（即ち、真正な被分析種又
は被分析種を結合する種）。

【００９０】なお、この実施例では、配位子の前駆体は
第１の補助種で、配位子は第２の補助種である。そし
て、この配位子の結合体種は第３の種で、本実施例で
は、これは第３の補助種である。

【００９１】検定を行うさいには、結合体種に共役した
真正な被分析種をサンプルに被分析種が存在する場合
（例えば、“既知”量、あるいは“未知”量、あるいは
“基準”量）には、これを拮抗させることによって一次
免疫反応を起こし、トレーサー種と共役した被分析結合
種と結合する。一次免疫反応が所望の点（例えば、平衡
点）まで進行すると、配位子の前駆体が配位子に転換
し、配位子と結合体が結合する。この結果、（真正な被
分析種と被分析結合種とが結合することにより）結合種
に結合したトレーサー種が支持物質に結合する。

【００９２】公知の適当な方法や手段により支持物質に
結合したトレーサー種があるならば、これを検出するこ
とができる。

【００９３】なお、本開示で、被分析種の量について
“未知”量という場合は、サンプルの当該種の検出量が
未知であることを意味し、また“既知”量、あるいは
“基準”量という場合は、例えば、標準被分析種溶液に
よって、被分析種の量が既にわかっているか、基準量に
なっていることを意味する。

【００９４】標準被分析種の既知量を含むサンプルを使
用して求めた較正曲線を使用することによって、“未
知”サンプル中の被分析種の量を求めることができる。

【００９５】（Ｂ）また、本発明は次のものを使用す
る。（ｉ）配位子の前駆体になる支持物質。（ｉｉ）被分析結合種（例えば、一次抗体）と共役し
た配位子の結合体種（例えば、配位子に対する抗体）か
らなるハイブリッド。（ｉｉｉ）トレーサーに共役した真正な被分析種。

【００９６】なお、この実施例では、配位子の前駆体は
第１の補助種で、配位子は第２の補助種である。そし
て、この配位子の結合体種は第３の種で、本実施例で
は、これは第３の補助種である。

【００９７】検定を行うさいには、結合体種に共役した
真正な被分析種をサンプルに被分析種が存在する場合
（例えば、“既知”量、あるいは“未知”量、あるいは
“基準”量）には、これを拮抗させることによって一次
免疫反応を起こし、トレーサー種と共役した被分析結合
種と結合する。一次免疫反応が所望の点（例えば、平衡
点）まで進行すると、配位子の前駆体が配位子に転換
し、配位子と結合体が結合する。この結果、（真正な被
分析種と被分析結合種とが結合することにより）結合種
に結合したトレーサー種が支持物質に結合する。

【００９８】公知の適当な方法や手段により支持物質に
結合したトレーサー種があるならば、これを検出するこ
とができる。

【００９９】なお、本実施例では、サンプルに被分析種
が存在しない場合、本発明に従い検定を実施した後、支
持物質に結合することができるトレーサー種の量が最大
量になる。即ち、支持物質に結合することができるトレ
ーサー種の量は、サンプルの被分析種の量が増加するに
つれ減少する。

【０１００】標準被分析種の既知量を含むサンプルを使
用して求めた較正曲線を使用することによって、“未
知”サンプル中の被分析種の量を求めることができる。

【０１０１】（Ｃ）また、本発明は次のものを使用す
る。（ｉ）配位子の前駆体に共役した真正な被分析種。（ｉｉ）トレーサー種に共役した被分析結合種（例え
ば、一次抗体）。（ｉｉｉ）配位子の結合体種になる支持物質。

【０１０２】なお、この実施例では、配位子の前駆体は
第１の補助種で、配位子は第２の補助種である。そし
て、結合体種は第３の種で、本実施例では、これは第３
の補助種である。

【０１０３】検定を行うさいには、結合体種に共役した
真正な被分析種をサンプルに被分析種が存在する場合
（例えば、“既知”量、あるいは“未知”量、あるいは
“基準”量）には、これを拮抗させることによって一次
免疫反応を起こし、トレーサー種と共役した被分析結合
種と結合する。一次免疫反応が所望の点（例えば、平衡
点）まで進行すると、配位子の前駆体が配位子に転換
し、配位子と結合体が結合する。この結果、（真正な被
分析種と被分析結合種とが結合することにより）結合種
に結合したトレーサー種が支持物質に結合する。

【０１０４】公知の適当な方法や手段により支持物質に
結合したトレーサー種があるならば、これを検出するこ
とができる。

【０１０５】なお、本実施例では、サンプルに被分析種
が存在しない場合、本発明に従い検定を実施した後、支
持物質に結合することができるトレーサー種の量が最大
量になる。即ち、支持物質に結合することができるトレ
ーサー種の量は、サンプルの被分析種の量が増加するに
つれ減少する。

【０１０６】標準被分析種の既知量を含むサンプルを使
用して求めた較正曲線を使用することによって、“未
知”サンプル中の被分析種の量を求めることができる。

【０１０７】（Ｄ）また、本発明では次のものを使用す
る。（ｉ）分析物結合種（例えば、一次抗体）に共役し
た配位子の前駆体。（ｉｉ）トレーサー種に共役した真正な被分析種。（ｉｉｉ）配位子に結合体種になる支持物質。

【０１０８】なお、この実施例では、配位子の前駆体は
第１の補助種で、配位子は第２の補助種である。そし
て、結合体種は第３の種で、本実施例では、これは第３
の補助種である。

【０１０９】検定を行うさいには、結合体種に共役した
真正な被分析種をサンプルに被分析種が存在する場合
（例えば、“既知”量、あるいは“未知”量、あるいは
“基準”量）には、これを拮抗させることによって一次
免疫反応を起こし、トレーサー種と共役した被分析結合
種と結合する。一次免疫反応が所望の点（例えば、平衡
点）まで進行すると、配位子の前駆体が配位子に転換
し、配位子と結合体が結合する。この結果、（真正な被
分析種と被分析結合種とが結合することにより）結合種
に結合したトレーサー種が支持物質に結合する。

【０１１０】公知の適当な方法や手段により支持物質に
結合したトレーサー種があるならば、これを検出するこ
とができる。

【０１１１】なお、本実施例では、サンプルに被分析種
が存在しない場合、本発明に従い検定を実施した後、支
持物質に結合することができるトレーサー種の量が最大
量になる。即ち、支持物質に結合することができるトレ
ーサー種の量は、サンプルの被分析種の量が増加するに
つれ減少する。

【０１１２】標準被分析種の既知量を含むサンプルを使
用して求めた較正曲線を使用することによって、“未
知”サンプル中の被分析種の量を求めることができる。

【０１１３】（Ｅ）また、本発明では次のものを使用す
る。（ｉ）第１の分析物結合種（例えば、被分析種に対
する第１抗体）に共役した配位子の前駆体。（ｉｉ）第２の分析物結合種（例えば、被分析種に対
する第２抗体）に共役したトレーサー種。（ｉｉｉ）配位子の結合体種になる支持物質。

【０１１４】なお、この実施例では、配位子の前駆体は
第１の補助種で、配位子は第２の補助種である。そし
て、結合体種は第３の種で、本実施例では、これは第３
の補助種である。

【０１１５】検定を行うさいには、第１の分析物結合種
をサンプルに被分析種が存在する場合（例えば、“既
知”量、あるいは“未知”量、あるいは“基準”量）に
は、これと結合し、かつ第２の分析物結合種を任意の被
分析種に結合することによって一次免疫反応を起す。

【０１１６】一次免疫反応が所望の点（例えば、平衡
点）まで進行すると、配位子の前駆体が配位子に転換
し、配位子と結合体が結合する。この結果、（第１の分
析物結合種、（第１の分析物結合種により結合した）任
意の被分析種、及び（第２の分析物結合種）が結合する
ことにより配位子が支持物質に結合することになる。

【０１１７】公知の適当な方法や手段により支持物質に
結合したトレーサー種があるならば、これを検出するこ
とができる。

【０１１８】なお、本実施例では、サンプルに被分析種
が存在しない場合、支持物質にトレーサー種が結合する
ことはない。というのは、第１と第２の分析物結合種と
の間に“橋”を生成する被分析種がないからである。し
かし、サンプルの被分析種濃度が高くなると、支持物質
に結合するトレーサー種の量が増加する。標準被分析種
の既知量を含むサンプルを使用して求めた較正曲線を使
用することによって、“未知”サンプル中の被分析種の
量を求めることができる。

【０１１９】さらに、前記Ｅの（ｉ）、（ｉｉ）及び
（ｉｉｉ）は別な方法でも使用することができる。

【０１２０】従って、例えば、第１の分析物結合種をサ
ンプルに被分析種が存在する場合（例えば、“既知”
量、あるいは“未知”量、あるいは“基準”量）には、
これと結合することによって一次免疫反応を起す。一次
免疫反応が所望の点（例えば、平衡点）まで進行する
と、配位子の前駆体が配位子に転換し、配位子と結合体
が結合する。

【０１２１】次に、第２の分析物結合種を導入して、間
接的に支持物質に結合している第１の分析物結合種に被
分析種が結合している場合には、これと結合させること
ができる。

【０１２２】本実施例では、被分析種が存在すると、
（第２の分析物結合種に共役している）トレーサー種が
支持物質に結合することになる。サンプルの被分析種の
濃度増加は支持物質上のトレーサー種の量が増加するの
でわかる。

【０１２３】被分析種が存在しない場合、トレーサー種
は実質的に支持物質に結合することはない。

【０１２４】標準被分析種の既知量を含むサンプルを使
用して求めた較正曲線を使用することによって、“未
知”サンプル中の被分析種の量を求めることができる。

【０１２５】以下、本発明を拮抗的免疫検定についてさ
らに詳しく説明する。使用する試薬は次の通りである。（ａ）適当なトレーサー種（例えば、酵素）で標識かし
た（精製一次抗体である）被分析種の結合体。（ｂ）（ハプテン等の配位子からなる第２の補助種の前
駆体である）第１の補助種を担持する支持物質。（ｃ）第３の種、この実施例では（配位子に対する精製
抗体である）第３の補助種に共役した真正な被分析種。（ｄ）標準被分析種。

【０１２６】試薬を結合した場合に、試薬（ｄ）が試薬
（ｃ）と拮抗して、試薬（ａ）の結合体に結合するよう
に、試薬（ｂ）を過剰に使用すると共に、試薬（ａ）及
び（ｂ）を“限られた”量で存在させる。

【０１２７】この反応、即ち一次免疫反応が所定程度進
行したなら、試薬（ｂ）を処理して、第１の補助種から
第２の補助種を生成し、試薬（ｃ）の全部、あるいは実
質的な部分及びこれに結合した錯体を（ｂ）に結合す
る。

【０１２８】可溶性の非結合物質の除去後、（ｂ）に結
合したトレーサー種（例えば、酵素）活性を測定する
が、これは（ｄ）の量に反比例している。

【０１２９】較正曲線を得るためには、例えば、異なる
量の標準被分析種を使用して、前記拮抗免疫検定を繰り
返せばよい。即ち、例えば、標準被分析種の量について
は、０と特定の検定に必要な範囲をカバーする最大レベ
ルとの間でかえればよい。

【０１３０】標準被分析種がゼロの場合に、支持物質上
のトレーサー種の活性が最大になり、この活性は、標準
被分析種の量が増加するにつれ低下する。

【０１３１】試薬（ｄ）のかわりに未知量の被分析種を
含むサンプルを使用し、前記免疫検定を繰り返すと、較
正曲線との対比によりこのサンプルに含まれる被分析種
の量を求めることができる。

【０１３２】前記免疫検定に使用する支持物質は、例え
ば、磁化可能な粒子か反応器の表面であればよい。

【０１３３】例示としてではあるが、本発明の検出器は
所望に応じて再使用できるように構成することができ
る。このためには、例えば、第１免疫検定の終了後、第
１の補助種に再度転換できる第２の補助種を用意して、
第２免疫検定を実施すればよい。

【０１３４】なお、本開示で使用する“免疫学的検出”
とは、例えば、免疫化学的相互作用を伴う任意の検出や
分析を意味する。

【０１３５】本発明に使用する抗体（例えば、所定配位
子に対する抗体）を調製することが望ましい場合、この
抗体は多クローン性や単クローン性抗体を調製するのに
知られている任意の適当な方法により調製することがで
きる。例えば、配位子の適当な誘導体及びウシ血清アル
ビミンやキーホール・リンピット・ヘモシアニン等の免
疫原性担体蛋白質からなる複合体を用いて動物を免疫化
することにより抗体を調製すればよい。動物の免疫化処
理により得られる産生物については、所望に応じて、
（例えば、アフィニティークロマトグラフィー等によ
り）すれば、所要抗体を得ることができる。

【０１３６】本開示で使用する“抗体”には全抗体やＦ
ａｂや（Ｆａｂ）₂等の抗体画分が含まれ、従って本発
明で使用する“抗体”は全抗体や抗体画分も含まれる。

【０１３７】本発明に従って免疫検定を実施する場合、
所望ならば、一つ以上の洗浄工程を使用することができ
る。

【０１３８】以下、本発明を実施例によりさらに詳しく
説明する。実施例１７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン−３−プロピオン
酸の調製本実施例では、本発明で第２の補助種として使用する配
位子の一例として７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン
−３−プロピオン酸を調製した。濃硫酸（５０ｍｌ）中
でレゾルシン（１１ｇ）とジエチル２−アセチルグルタ
レート（２３ｇ）を縮合することにより７−ヒドロキシ
−４−メチルクマリン−３−プロピオン酸エチルエステ
ルを調製した。室温で２４時間放置した後、低温の蒸留
水（２リッター）に反応混合物を注ぎ、クリーム状の白
色沈澱物を得た。このクリーム状の白色沈澱物を蒸留水
（４リッター）で洗浄し、中間生成物として回収した。
シリカプレートを使用する薄層クロマトグラフィーによ
ると、この中間生成物は純度が高かった。メタノール
（５％）中で水酸化カリウムを使用してエチルエステル
を除去して、この中間生成物から７−ヒドロキシ−４−
メチルクマリン−３−プロピオン酸を調製した。標準酸
−塩基沈澱−溶解法によって最終生成物を単離した。

【０１３９】実施例２７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン−３−プロピオン
酸に対する抗血清の調製本実施例では、実施例１で調製した配位子に対する抗体
を調製した。この抗体は本発明における第３の種として
使用するために調製した。即ち、実施例１で調製した最
終生成物のサンプル（０．４８ｇ）をまづテトラヒドロ
フラン（ＴＨＦ）（２４ｍｌ）に溶解してから、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミド（０．２４ｇ）を加え、ジシク
ロヘキシルカルボジイミド（０．４１ｇ）を加えた。２
４時間放置した後、生成物、即ち、７−ヒドロキシ−４
−メチルクマリン−３−プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステルをそのまま使用した。（前記の
ようにして調製した）エステルを牛血清アルブミンに結
合することによって免疫原を調製した。０．１ＭのＮａ
ＨＣＯ₃（１０ｍｌ；ｐＨ８．６）及びジオキサン（６
ｍｌ）に溶解したＢＳＡ（８０ｍｇ）にエステルのＴＨ
Ｆ溶液２ｍｌ（エステル５０ｍｇ）を加えた。生成した
複合体を３日間にわたり４リッターの１％ＮａＯＣＯ3
（３回取り替えた）で透析した。標準方法を使用して、
約１．５ｍｇの上記複合体（即ち、免疫原）でヒツジを
免疫化した。９ヶ月にわたり免疫化を繰り返すことによ
って７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン−３−プロピ
オン酸に高い結合活性を示す抗血清を得た。

【０１４０】実施例３実施例２で調製した抗体の抗体結合活性の滴定実施例２で調製した抗体の抗体活性を評価するために、
次のようにしてプレート・コーティング抗原試薬を調製
した。０．１ＭのＮａＨＣＯ3（５ｍｌ；ｐＨ８．６）
及びジメチルホルムアミデ（５ｍｌ）にオバルブミン
（２０ｍｇ）を溶解して、オバルブミン溶液を調製し
た。実施例２で調製したＮ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル（５ｍｌ）をジメチルスルホキシド（０．５ｍ
ｌ）に溶解し、生成溶液をオバルブミン溶液に加えた。
生成混合物を完全に混合してから、２４時間放置した。
（複合体である）生成プレート・コーティング抗原試薬
を４リッターの１％ＮａＨＣＯ3を使用し、これを３回
取り替えて透析し、次に１％のＮｏｒｉｔＡ活性炭で処
理して、精製した。ＥＬＩＳＡを使用して、実施例２で
調製した抗体の抗体結合活性の滴定を行った。即ち、結
合活性のＥＬＩＳＡ評価は次のように行った。前記のよ
うにして調製したプレート・コーティング抗原試薬で微
滴定用ＥＬＩＳＡプレート（ポリスチレン）をコーティ
ングした。即ち、プレート・コーティング抗原試薬１５
０μｌの１％ＮａＨＣＯ３溶液（プレート・コーティン
グ抗原試薬０．５μｇ／ｍｌ）をプレートの各孔に加
え、プレートを４℃で一夜放置した。余計な部分は０．
５ｍｇ／ｍｌの馬ヘモブグロビン溶液（２００μｌ）で
遮断した。検定緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣＬ緩衝
液、ｐＨ７．４、０．１ＭＮａＣｌ、０．１％ゼラチ
ン、０．０１％チメロサール及び０．１ｍｇ／ｍｌのロ
0ーダミンＢ塩基を含む）で（実施例２で調製した）抗
血清を順次希釈した。滴定検定は、１５０μｌ）の抗血
清（各種希釈液、範囲：１／１００〜１／１０⁶）を加
え、室温で１時間振とうし、洗浄緩衝液（０．１ＭＮａ
Ｃｌ及び０．０５％ツイーン２０を含有する０．１ＭＮ
ａＨＣＯ₃溶液からなる）で洗浄（×３）し、（ウサギ
抗−ヒツジＩｇＧ−ＨＲＰ）からなる第２の抗体−酵素
複合体を加え、３７℃で１時間培養し、洗浄緩衝液で洗
浄（×３）し、そしてＨＲＰ基質及び色素原（０．５ｍ
ｇ／ｍｌのＡＢＴＳを含む、１．３ｍＭＨ₂Ｏ₂のクエン
酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．１）を加えて行っ
た。４１５ｎｍにおける光学的濃度を、基質と２０分間
反応させた後、微滴定プレートＥＬＩＳＡ読み取り器で
読み取った。抗体力値は１／３８０，０００であった。
即ち、抗血清の希釈液は４１５ｎｍで１．７のＥＬＩＳ
Ａ光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を与えた。

【０１４１】実施例４７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン−３−プロピオン
酸前駆体の調製本実施例では、実施例１で調製した配位子の前駆体を調
製した。本発明の場合、この前駆体を第１の補助種とし
て使用した。この前駆体はβ−ガラクトピラノシド−ｏ
−（４−メチルクマリン−３−プロピオン酸であった。
即ち、０．５ｇの無水炭酸カリウムと共に、テトラアセ
チル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド（５ｇ）を
７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン−３−プロピオン
酸エチルエステル（０．７５ｇ）のアセトン（５０ｍ
ｌ）溶液に加えた。生成混合物を１０時間還流して、後
反応混合物を得た。生成物、即ち７−ヒドロキシ−４−
メチルクマリン−３−プロピオン酸エチルエステルのテ
トラアセチルガラクトピラノシド誘導体を標準抽出法に
より単離した。即ち、後反応混合物のクロロホルム溶液
（３００ｍｌ）を、微量の出発物質がクロロホルム層か
らすべて除去されるまで、０．５Ｍ水酸化ナトリウムで
反復洗浄した。生成物はクロロホルム層から回収した。
５％水酸化カリウムのメタノール溶液でアセチル基及び
エチルエステルを除去した。５％水酸化カリウム（４０
ｍｌ）のメタノール溶液中で、テトラアセチル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド−ｏ−（４−メチルクマリン−３
−プロピオン酸エチルエステル（０．７ｇ）を５０℃で
１６時間放置した。シリカゲル・プレートを使用する調
製的液体クロマトグラフィーにより遊離グリコシデオ生
成物を精製した。拮抗ＥＬＩＳＡを使用して、β−Ｄ−
ガラクトピラノシド−ｏ−（４−メチルクマリン−３−
プロピオン酸）と抗−ヒドロキシ−４−メチルクマリン
−３−プロピオンさん抗血清との交差反応について評価
した。７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン−３−プロ
ピオン酸の抗−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン−
３−プロピオン酸抗血清に対する結合を１００％とする
と、β−Ｄ−ガラクトピラノシド−ｏ−（４−メチルク
マリン−３−プロピオン酸）と抗血清の交差反応は０．
０１６％であった。

【０１４２】実施例５ β−Ｄ−ガラクトピラノシド−ｏ−（４−メチルクマリ
ン−３−プロピオン酸）のデキストランへの結合デキストランを次のようにして活性化した。１％ＮａＨ
ＣＯ３（５０ｍｌ）中のデキストラン（例えば、Ｓｉｇ
ｍａ；ＭＷ５００，０００）（２ｇ）を過ヨウ素酸ナト
リウムで酸化した。生成した混合物を暗所に６時間放置
し、４リッターの蒸留水を用いて４℃で１６時間透析し
た。デキストランを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する
と、デキストラン構造にアルデヒド基が導入される。ア
ルデヒド基は遊離アミノ基と反応して、共有結合連鎖を
形成する。共有結合連鎖はホウ水素化ナトリウムとの反
応により安定化することができる。連鎖アームは次のよ
うにして酸化デキストランに導入した。０．１ＭＮａＨ
ＣＯ₃（２５ｍｌ；ｐＨ７．４）中の酸化デキストラン
（０．５ｇ）をビス（ヘキサチレン）トリアミン（Ｈ₂
Ｎ−（ＣＨ₂）₆−ＮＨ−（ＣＨ₂）₆−ＮＨ₂））０．２
５ｇ）と反応させた。濃ＨＣＬで、生成した反応混合物
を７．２に調節し、反応混合物を室温で２４時間攪拌し
た。ボロ水素化ナトリウム（０．２ｇ）を加え、４時間
混合した後、生成混合物を１％ＮａＨＣＯ₃で透析し、
低分子量物質を除去した。β−Ｄ−ガラクトピラノシド
−ｏ−（４−メチルクマリン−３−プロピオン酸）とデ
キストランの結合は次のようにしておこなった。β−Ｄ
−ガラクトピラノシド−ｏ−（４−メチルクマリン−３
−プロピオン酸）をβ−Ｄ−ガラクトピラノシド−ｏ−
（４−メチルクマリン−３−プロピオン酸）−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステルに転換した。則ち、β−
Ｄ−ガラクトピラノシド−ｏ−（４−メチルクマリン−
３−プロピオン酸）（０．４ｍｇ）をメタノール（２０
ｍｌ）及びジオキサン（３０ｍｌ）に溶解した。次に、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．１２ｇ）及びジシ
クロヘキシルカルボジイミド（０．２２ｇ）を加えた。
生成した反応混合物を冷所に少なくとも７日間放置し
た。このようにした得たエステル（１００ｍｇ）のサン
プルを前記のデキストラン−ＮＨ−（ＣＨ₂）₆−ＮＨ−
（ＣＨ₂）₆−ＮＨ₂（２００ｍｇ）（０．１ＭＮａＨＣ
Ｏ₃（１０ｍｌ；ｐＨ８．６）中）を加えた。生成した
反応混合物を反応させ、２４時間、ハプテン誘導体を、
実施例６に記載するように、加えた。

【０１４３】実施例６ポリスチレンに結合するためのデキストランの調製（デキストラン等の）一部の担体物質は、例えば、配位
子や配位子前駆体を結合することができる好適な親水性
物質であるが、別な一部の担体物質は（例えば、ポリス
チレン微滴定プレート表面等の）ポリスチレン表面に十
分吸着しない。ところが、（デキストラン等の）担体物
質は、例えば、吸着性蛋白質を介して任意の適当な共有
結合連鎖によってポリスチレン表面に結合することがで
きる。あるいは、例示としてではあるが、配位子−結合
体種対によって（ポリスチレン表面等の）表面に（デキ
ストラン等の）担体物質を結合することができる。例え
ば、（抗体からなる）結合体種を表面に吸着することが
でき、そして結合体種の配位子表面を（デキストラン等
の）担体物質に結合することができる。本実施例で
は、それぞれが５（６）−カルボキシフオレセインから
なる複数の配意をデキストラン−ＮＨ−（ＣＨ₂）₆−Ｎ
Ｈ−（ＣＨ₂）₆−ＮＨ₂に結合した。２４時間後、５
（６）−カルボキシフオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド（１０ｍｇ）を、実施例５に示した反応混合
物を反応させることにより生成した混合物に加え、反応
混合物を４時間放置した。このようにして得た後反応混
合物を低所で３日間透析して、低分子量物質を除去し
た、最終沈澱を１％ＮｏｒｉｔＡ活性炭で処理すること
によりおこなった。β−Ｄ−ガラクトピラノシド−ｏ−
（４−メチルクマリン−３−プロピオン酸）独立体に対
する５（６）−カルボキシフオレセイン独立体に対する
比は、例えば、１：１以上で、例えば、１００：１であ
るのが遊離である。

【０１４４】実施例７実施例２と同様にして調製した抗体の精製（実施例２と同様にして調製した）抗血清のＩｇＧ画分
をイオン交換クロマトグラフィーによって調製した。精
製は免疫アフィニティークロマトグラフィーによって行
った。この免疫アフィニティークロマトグラフィーの免
疫吸着剤は、臭化シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ
に７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸／オバル
ブミン複合体を結合することによって調製した。抗血清
を免疫吸着剤に接触させた後、免疫吸着剤に結合した抗
体を２０％アセトニトリル及び１％プロピオン酸の蒸留
水溶液のグラジエントで溶離した。このようにして溶離
した抗体を、０．１ＭＮａＣｌを含んだ、０．０５ＭＮ
ａリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。ＥＬＩＳ
Ａに結合活性の滴定によると、生成した抗体は力値は高
かった。０．５ｎｇの抗体により１．７のＯ．Ｄ．（４
１５ｎｍ）が得られた。

【０１４５】実施例８１７β−エストラジオール及び抗−７−ヒドロキシ−４
−メチルクマリン−３−プロピオン酸抗体の調製例示としてではあるが、本発明による検出を説明するた
に被分析種として１７β−エストラジオールを選択し
た。１７β−エストラジオール及び抗−７−ヒドロキシ
−４−メチルクマリン−３−プロピオン酸抗体を調製し
た。即ち、１７β−エストラジオール−３−ｏ−カルボ
キシブチリルエーテル−Ｎ−ヒドロキシシクシンイミド
エステル（０．１５ｍｇ）のジオキサン（７５μｌ）溶
液を０．１ＭＮａＣｌを含む０．１ＭＮａＨＣＯ₃（４
ｍｌ；ｐＨ８．６）中の、実施例７と同様にして調製し
た抗体（ＩｇＧ画分）に加えた。４時間放置した後、生
成した反応混合物を０．５％ＮｏｒｔｉＡ活性炭で処理
し、生成溶液を一夜冷所で５０ｍＭＮａリン酸（ｐＨ
７．４）で透析した。

【０１４６】実施例９抗−１７β−エストラジオール抗体の調製７ヶ月にわたる免疫化により、１７β−エストラジオー
ル−３−カルボキシメチルエーテルとＫＬＨ（キーホル
・リンピット・ヘモシアニン）の複合体である免疫原で
ウサギ抗−１７β−エストラジオール抗血清を育成し
た。この抗血清を標準法により回収した。

【０１４７】実施例１０抗−５（６）−カルボキシフルオレセイン抗体の調製７ヶ月にわたる免疫化により、５（６）−カルボキシフ
ロオレセインとＫＬＨの複合体である免疫原でヒツジ抗
−フロオレセイン抗血清を育成した。ヒツジ抗血清のＩ
ｇＧ画分をイオン交換クロマトグラフィーによって精製
した。免疫アフィニティークロマトグラフィーにより
羊抗血清のＩｇＧ画分を回収し、精製した。この免疫ア
フィニティークロマトグラフィーの免疫吸着剤は、臭化
シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂに２’，７’−ジ
クロロー５（６）ーカルボキシフルオレセイン／オバル
ブミン複合体を結合することによって調製した。抗血清
を免疫吸着剤に接触させた後、免疫吸着剤に結合した抗
体を２０％アセトニトリル及び１％プロピオン酸の蒸留
水溶液のグラジエントで溶離した。このようにして溶離
した抗体を、０．１ＭＮａＣｌを含んだ、５０ｍＭＮａ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。

【０１４８】実施例１１第１の補助種、第２の補助種及び第３の種を用いる１７
β−エストラジオール−３−ｏ−カルボキシブチリルエ
ーテル−Ｎ−ヒドロキシシクシンイミ酵素免疫検定本実施例の場合、第１の補助種はβ−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド−ｏ−（４−メチルクマリン−３−プロピオン
酸）であり、これは７−ヒドロキシ−４−メチルクマリ
ン−３−プロピオン酸出ある第２の補助種にすることが
できる。本実施例の場合、第３の種は７−ヒドロキシ−
４−メチルクマリン−３−プロピオン酸に対する抗体で
ある。（ポリスチレン微滴定プレートの形をとる）支持
物質を実施例１０と同様にして調製した、精製５（６）
−カルボキシフルオレセイン抗体（ＩｇＧ画分）でコー
ティングした。このために、実施例１０と同様にして調
製した抗体（ＩｇＧ画分）を、この抗体を含む溶液１５
０μｌを微滴定プレートの孔に容れることによりプレー
トに導入した。この溶液は、１０μｇ／ｍｌの抗体とＰ
ＢＳ（０．９％ＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７．４））で構成した。溶液を４℃で１６時
間放置してから、孔を空にし、余計な部分を孔をウマの
ヘモグロビン１時間さらすことにより遮断した（孔１個
につき０．５ｍｇ／ｍｌのウマヘモグロビンの１％Ｎａ
ＨＣＯ₃溶液２００μｌ）。次に、第１の補助種をも
ち、そして（前期のようにして調製した）５（６）−カ
ルボキシフルオレセインからなる複数の配位子をもつデ
キストランを孔に導入して、プレート上の抗体とデキス
トランの配位子とを結合することによってプレートにデ
キストランを結合した。即ち、実施例６の場合と同様
に、（第１の補助種に、そして５（６）−カルボキシフ
ルオレセイン配位子に結合した）デキストランの溶液
（１５０μｌ）の検定緩衝溶液（５μｇ／ｍｌ）を微滴
定プレートの孔に導入し、振とうしながら３０分間放置
して、デキストランをプレートに結合した。使用した検
定緩衝液は実施例６と同じものである。洗浄緩衝液でプ
レートを４度洗浄した。この洗浄緩衝液は実施例３と同
じものである。次に、（１７β−エストラジオールを含
まない検定緩衝液からなる）ブランク（５０μｌ）及び
１７β−エストラジオールを含む１７β−エストラジオ
ー標準液（それぞれ５０ｍｌ）の検定緩衝液（濃度：検
定緩衝液５０μｌにつき１７β−エストラジオール１０
ｐｇ〜２５０ｐｇ）を孔に導入した。また、各孔には実
施例８と同様にして調製し、好適には（免疫検定法に従
い１／８０００に）検定緩衝液で希釈した複合体からな
る溶液５０μｌ及び実施例９と同様にして調製し、好適
には（免疫検定法に従い１／１８，０００に）検定緩衝
液で希釈した溶液５０μｌを導入した。なお、この点で
一次免疫反応は、実施例８と同様にして調製した複合体
と拮抗する１７β−エストラジオールが存在するなら
ば、これに対して生じて、実施例９と同様にして調製し
た抗体に結合する。２０分間（プレートを振とうするこ
とによって）混合した安登、試薬を加えて、第１の補助
種を第２の補助種に転換した（本実施例の場合、β−Ｄ
−ガラクトピラノシド−ｏ−（４−メチルクマリン−３
−プロピオン酸の７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン
−３−プロピオン酸への転換）。この転換のための試薬
は、ＭｇＣｌ₂（１０μＭ）及びメタノール（１５％）
ｖ／ｖ）を加えた、Ｅ．ｃｏｌｉβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ（例えば、Ｓｉｇｍａ）（検定緩衝液中０．５単
位）であった。プレートを２０分間振とうした後、プレ
ートを洗浄緩衝液で６回洗浄した。この点で、実施例８
と同様にして調製した複合体が（これに結合した任意の
兎抗−１７β−エストラジオール抗体と共に）、抗−７
−ヒドロキシ−４−メチルクマリン−３−プロピオン酸
抗体とβ−Ｄ−ガラクトピラノシド−ｏ−（４−メチル
クマリン−３−プロピオン酸）への酵素作用により精製
した７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン−３−プロピ
オン酸配位子との間に生じる結合によりプレートに結合
する。次に、市販の第２の抗体−酵素複合体（ヤギ抗−
ウサギ−ＨＲＰ複合体（Ｓｉｇｍａ））を加え（孔１個
につき１５０μｌ）、放置して、プレートに結合した任
意の−１７β−エストラジオール抗体と反応させた。プ
レートを洗浄緩衝液で洗浄し、０．５ｍｇ／ｍｌのＡＢ
ＴＳを含む、１．３ｍＭＨ₂Ｏ₂の酢酸／クエン酸緩衝液
（ｐＨ４．１）からなるＨＲＰ基質（孔１個につき１５
０μｌ）を使用して、検定信号を発信した。結果を以下
の表に示す。（光学的濃度）Ｏ．Ｄ．結果は２つの測定
値の平均である。

【表１】表１７β−エストラジオール濃度（ｐｇ）Ｏ．Ｄ．（４１５ｎｍ）０１．３０１０１．１０２５０．８０５００．５５１０００．３５２５００．０６以上の結果から、被分析種（本実施例では、１７β−エ
ストラジオール）の濃度が増加するにつれ、支持物質に
結合することができる一次抗体量を低下することが確認
できる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一次種の分離方法であって、被分析種を
検出する免疫検定方法に好適な方法において、第１の補
助種を使用して、これを第２の補助種にし、この第２の
補助種を第３の種と相互作用させて、分離を促進させる
ことを特徴とする分離方法。
【請求項２】第１の補助種から第２の補助種を生成す
る工程、この第２の補助種と第３の種を反応させて分離
を促進する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載
の分離方法。
【請求項３】免疫検定により被分析種を検出する方法
において、一次種を分離する分離方法を含み、この分離
方法において第１の補助種を使用して、これを第２の補
助種にし、この第２の補助種を第３の種と相互作用させ
て、分離を促進促進させることを特徴とする検出方法。
【請求項４】一次免疫反応を起こしてから、第１の補
助種を第２の補助種にし、この第２の補助種を第３の種
と反応させて、免疫検定の分離工程を促進させることを
特徴とする請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】第３の種が補助種であることを特徴とす
る請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】第２の補助種が配位子であることを特徴
とする請求項１〜５項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】第３の種が配位子の結合体種であること
を特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項８】第３の種がひとつ以上の機能をもつ抗体
であることを特徴とする請求項１、２、３、４、６又は
７に記載の方法。
【請求項９】抗原−抗体対、あるいは非抗原性配位子
−結合体種対、あるいは蛋白質−補助因子対が第２の補
助種及び第３の補助種を与えることを特徴とする請求項
１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】第２の補助種を第１の補助種から酵素
により生成することを特徴とする請求項１〜９のいずれ
か１項に記載の方法。
【請求項１１】酸化条件及び還元クロモフォア染料／
酸化クロモフォア染料系を使用するか、あるいは紫外光
を使用するか、あるいは金属イオン又はｐＨ変化を使用
することによって第１の補助種から第２の補助種を生成
することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記
載の方法。
【請求項１２】支持物質を使用することを特徴とする
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】支持物質が反応器の表面、不溶性多糖
類、微粒子、酸化鉄を取り込んだ不溶性多糖類、ポリス
チレン、架橋デキストラン、不溶性ポリマー構造体、ガ
ラス表面、誘導体合成シリカ表面、適当な表面に結合し
た可溶性ポリマー、ナイロン又はポリアミドであること
を特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】被分析種がホルモン、ステロイド、薬
剤、ポリペプチドホルモン、腫瘍マーカー、蛋白質抗
原、血液蛋白質、マーカー蛋白質、殺虫剤、毒物、微生
物又は微生物に対する抗体であることを特徴と請求項１
〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】トレーサー種を使用することを特徴と
する請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】拮抗免疫検定法、あるいは非拮抗免疫
検定法を含む請求項３〜１５のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項１７】請求項１〜１６のいずれか１項に記載
の分離方法、あるいは検出方法を実施できるように構成
した検出器。
【請求項１８】第１の補助種を使用して、これを第２
の補助種にし、この第２の補助種を第３の種と相互作用
させて、分離を促進させるようにした、請求項３〜１６
のいずれか１項に記載の検出方法を実施するための試験
器具。